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Dokumentenidentifikation DE60210451T2 01.02.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001397481
Titel KOMBINIERT KONTINUIERLICHER / STAPELWEISER VERGÄRUNGSPROZESS
Anmelder Labatt Brewing Co. Ltd., London, Ontario, CA
Erfinder PILKINGTON, Heather, Phyllis, London, Ontario N6B 2H8, CA;
MENSOUR, Anthony, Normand, London, Ontario N6B 2H8, CA
Vertreter Patent- und Rechtsanwälte Kraus & Weisert, 80539 München
DE-Aktenzeichen 60210451
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 20.06.2002
EP-Aktenzeichen 027449834
WO-Anmeldetag 20.06.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/CA02/00970
WO-Veröffentlichungsnummer 2021002961
WO-Veröffentlichungsdatum 27.12.2002
EP-Offenlegungsdatum 17.03.2004
EP date of grant 05.04.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 01.02.2007
IPC-Hauptklasse C12C 11/02(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12C 11/07(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12C 11/09(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von trinkbaren Alkoholprodukten, besonders Bier, und insbesondere unter Verwendung eines Hybridverfahrens, das kontinuierliche und Chargengärungsverarbeitungsstufen umfasst.

Hintergrund der Erfindung

Die erhebliche Anzahl an neuen Publikationen in diesem Gebiet belegt das große Interesse der Brauindustrie an Immobilisierung. In mehreren Reviews (Enari, 1995; Iserentant, 1995; Masschelein, 1997; Mensour et al., 1997; Stewart, 1996; Virkajarvi & Linko, 1999) über den allgemeinen Zustand der Brauindustrie wurde die mögliche revolutionäre Rolle von Immobilisierung in der Bierherstellung hervorgehoben. Zusätzlich zu den in Abschnitten 3.1 bis 3.5 erwähnten Gruppen waren viele andere Institutionen an R&D von immobilisierten Zellen für Brauanwendungen beteiligt. Die Miller Brewing Company (Duncombe et al., 1996; Tata et al., 1999) aus den Vereinigten Staaten führte einige vorläufige Bewertungen sowohl auf einer Meura Delta-Testeinheit, wie auch auf dem durch Schott Engineering vertriebenen Wirbelschichtbioreaktor durch. Auch Coors Brewing führte vorläufige Versuche mit dem Meura Delta-System durch.

Die Slowakische Technische Universität untersuchte die Verwendung von Calciumpektatgel in einem Airliftsystem zur Herstellung von Bier in Zusammenarbeit mit Heineken (Domeny, 1996). Erst vor kurzem publizierte die Gruppe von der slowakischen Technischen Universität mehrere Artikel über ihre gegenwärtige Forschung (Smogrovicova et al., 1997; Smogrovicova & Domeny, 1999). Guinness untersuchte zunächst die Verwendung verschiedener Adsorptionsträgerstoffe für Immobilisierung und nachfolgende Fermentation in einem Wirbelschichtbioreaktor (Donnelly, 1998). 1999 publizierten Donnelly und Kollegen einen Artikel, der die Kinetik von Zuckermetabolismus in ihrem Wirbelschichtbiorektor beschrieb (Donnely et al., 1999). Ihr Versuchsaufbau umfasste die Verwendung von porösen Glaskügelchen (Siran) als Immobilisierungsträgerstoff für eine obergärige Hefe. Guinness ist Teil des Immocon Konsortiums, das in Abschnitt 2.2.5 beschrieben wurde, geworden.

Holsten Brauerei AG und Lurgi AG, beide aus Deutschland, haben gemeinsam eine Pilotanlage zur kontinuierlichen Herstellung von alkoholfreiem Bier entwickelt und betrieben (Dziondziak, 1995). Calciumalginatkügelchen wurden in einem einstufigen Schleifenwirbelschichtfermenter (130 l) zur Fermentation verwendet, während eine Siebbodensäule (7 Siebböden) verwendet wurde, um das Bier zu entalkoholisieren. Bei diesem Verfahren war die gesamte Herstellungszeit 8,5 h.

Ein Team der Sapporo Breweries Ltd. Brewing Research Laboratories, angesiedelt in Japan, untersuchte die Verwendung von immobilisierten Zellen in einem Wirbelschichtreaktor zur Hauptgärung von Bier. Ihre Untersuchungen betrafen die Verwendung von Polyvinylalkohol-Gelkügelchen (Shindo & Kamimur, 1990), Ca-Alginat-Gelkügelchen (Shindo et al., 1994a), doppellagigen Gelfasern (Shindo et al., 1994b) und Chitosan-Gelkügelchen (Shindo et al., 1994c) als Immobilisierungsmatrizes. In der letzten Studie wurde ein Bioreaktor mit einem Liter Arbeitsvolumen, der 25 Vol.-% Chitopearl® Typ II-Kügelchen (Chitosan-Kügelchen) enthielt, auf einer kontinuierlichen Basis mit mit Glucoamylase behandelter Würze betrieben. Diese Enzymbehandlung ermöglichte, dass Essigsäureesterbildung im System mit immobilisierten Zellen der von konventioneller Chargenfermentation ähnlich war, daher ein Schritt näher zum Übereinstimmen der Produkte hin.

Die Forschungsgruppe von Sapporo hat jetzt ihre Aufmerksamkeit auf die Entwicklung eines Wirbelschichtfermenters mit Chitosan-Kügelchen, der im wiederholten Chargenbetrieb arbeitet, gerichtet. Das System war für 75 Tage ohne größere Probleme betriebsfähig, und das entstehende Bier war in der Qualität zu einem kommerziellen Produkt ähnlich. Es wurde gezeigt, dass ein nicht-flockender Stamm viel wirksamer als ein flockender Stamm ist (Maeba et al., 2000; Umemoto et al., 1998).

Zwei andere Ansätze zur Diacetyl-Reduzierung wurden auf dem 1997 in Maastricht abgehaltenen EBC-Kongress vorgestellt. Forscher in Frankreich (Dulieu et al., 1997) schlugen die Verwendung von verkapselter &agr;-Acetolactatdecarboxylase vor, um &agr;-Acetolactat schnell zu Acetoin umzusetzen. Meura Delta hat vorläufige Ergebnisse über die Verwendung eines Aluminosilicat-Zeoliths als Katalysator zur kalten und direkten Umwandlung von Acetolactat zu Acetoin hervorgehoben (Andries et al., 1997). Wenn sich solche Behandlungen als wirksam und für den Konsumenten akzeptabel herausstellen, könnten preiswertere Alternativen zu den von Cultor und Alfa Laval vorgeschlagenen Reifungssystemen Wirklichkeit werden.

Andere nicht-industrielle Forschung im Gebiet der Immobilisierung für Bierherstellung schließt die des Singapure Institute of Standards and Industrial Research ein, bei der die Verwendung eines Fadentyps von Alginatgelpartikeln zur Verwendung in einem Festbettreaktor untersucht und für günstiger als Alginat-Kügelchen befunden wurde (Que, 1993). Mafra und Kollegen von der Universidade do Minho in Portugal haben die Verwendung eines superflockenden Hefestamms in der kontinuierlichen Reifung von Bier diskutiert (Mafra et al., 1997). Die gleiche Forschungsgruppe hat auch Arbeiten über die Verwendung ihrer flockenden Hefe in einem Airliftbioreaktor zur Herstellung von Ethanol publiziert (Vicente et al., 1999; Domingues et al., 2000).

Forscher an verschiedenen akademischen Institutionen haben ebenfalls kürzlich die Anwendung von Immobilisierung zur Herstellung von Bier untersucht (Argiriou et al., 1996; Bardi et al.; 1996; Cashin, 1996; Moll & Duteurtre, 1996; Nedovic et al., 1996a; Nedovic et al., 1996b; Norton et al., 1995; Scott et al., 1995; Wackerbauer et al., 1996a; Wackerbauer et al., 1996b). Forschungsgruppen aus China (Chao et al., 1990; Yuan, 1997; Zhang et al., 1988), Russland (Kolpachki et al., 1980; Sinitsyn et al., 1986) und aus der Tschechoslowakei (Chladek et al., 1989; Curin et al., 1987; Polednikova et al., 1981) hatten ebenfalls mit Technologie immobilisierter Zellen zu tun und publizierten in den 1980ern Ergebnisse.

Zahlreiche Referenzen wurden während der Hintergrundarbeiten zu den Studien, auf denen die vorliegende Erfindung basiert, in Betracht gezogen. Diese schließen ein:

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Zusammenfassung der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Herstellung von trinkbaren Alkoholen, bei dem ein Gasliftbioreaktor unter Anwendung von Innenzirkulation eingesetzt wird, um eine kontinuierliche Fermentationsstufe durchzuführen, in der zuerst Würze, die fermentierbare Zucker enthält, unter Verwendung von durch Selbstaggregation immobilisierten, flockenden Hefezellen bei eingeschränkter Sauerstoffzufuhr fermentiert wird, und die wenigstens partiell fermentierte Entnahme aus dem kontinuierlichen Verfahren zu einer Chargenbearbeitungsstufe zur Endbearbeitung geleitet wird (welche im Kontext der Ansprüche der vorliegenden Erfindung den Abschluss des Gärungsprozesses, durch den fermentierbare Kohlenhydrate zu Alkohol werden, einschließen kann, aber nicht darauf beschränkt ist).

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Bier (einschließend insbesondere helle Typen von Bier (pale styles of beer), Lager-Biere und vorzugsweise Biere des nordamerikanischen Typs (North American style beer)). In diesem Zusammenhang siehe z.B. Essentials of Beer Style – F. Eckhardt.

Insbesondere wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, in dem die Hefe eine hochflockende oder superflockende Hefe ist.

Im Lauf der detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden noch mehr Details, wie bevorzugte Praktiken und Vorteile, die mit dem kontinuierlichen Verfahren verbunden sind, beigefügt. Dieses schließen die Verwendung von künstlichen (z.B. kontrollierten) Gasmischungen und die Verwendung von Stickstoff, Kohlendioxid und Sauerstoff, wie auch von Luft, ein. Zusätzlich werden hierbei genauere Details, betreffend die Chargenhaltebearbeitungsstufe, bereitgestellt. Es ist zu bemerken, dass in gewissen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung der Fokus des Chargenhalteverfahrens über Sachverhalte des "Abschlusses" der Umwandlung von fermentierbaren Kohlenhydraten zu Alkohol (die in jedem Fall in der kontinuierlichen Stufe der Bearbeitung nahezu abgeschlossen sein kann) hinausgeht. In solchen Ausführungsformen liegt der primäre Fokus der Chargenhalteverarbeitungsstufe auf Geschmacksabstimmung (oder Sanierung), besonders in Verbindung mit Diacetyl und Acetaldehyd. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sehen bei der postkontinuierlichen Stufe Verteilung der angestellten und/oder wenigstens teilweise fermentierten Würze durch einen Verteiler (ob als ein fixierter Verteiler oder durch selektives Verbinden und Unterbrechen von Leitungen) auf eine Vielzahl von Chargenhaltetanks vor. In einem seriellen Verteilungsverfahren wird ein Tank gefüllt, gefolgt vom nächsten, und so weiter. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Kapazität des kontinuierlichen Reaktors und Chargenhaltekapazität hinsichtlich Größe und Anzahl von Reaktoren/Chargenhaltebehältern abgestimmt, so dass die aktuelle Produktionsrate („production now rate") bezüglich Kapazität über Zeit abgestimmt ist. Idealerweise wird das fertiggestellte Produkt gerade rechtzeitig aus einem Chargenhaltebehälter abgelassen, damit dieser gereinigt, wieder angeschlossen und aus der laufenden Entnahme der kontinuierlichen Fermentationsstufe wieder befüllt wird.

In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden gewisse Ausführungsformen in Bezug auf den Sauerstoffgehalt der Würze/des Bieres besonders gesteuert. Dies bezieht sich sowohl auf die kontinuierlichen, wie auch auf die Chargenhaltestufen des Verfahrens. Im Hinblick auf die kontinuierliche Stufe hat die Sauerstoffkonzentration eine Vielzahl von Wirkungen, aber es kann vor allem wünschenswert sein, sie zu minimieren, um die Umwandlung höherer Alkohole in geruchsaktive Ester zu optimieren. In diesem Zusammenhang wird bemerkt, dass Konzentrationen höherer Alkohole durch die Chargenhalteverarbeitungsstufe weitgehend unbeeinflusst bleiben können, wenn gewünschte stringente O2-Kontrolle verwendet wird, um die Fuselester-Aromabalance zu steuern. Vorreinigung der Würze mit CO2 vor der kontinuierlichen Fermentation kann in diesem Zusammenhang nützlich sein.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der hauptsächliche Zweck der kontinuierlichen Stufe, das Anstellen der nachgelagerten chargenweisen Fermentation zu gewährleisten, die dann im Chargenhalteverfahren auftritt.

Für größere Sicherheit sind die Inhalte der Prioritätsdokumente hierin im Ganzen eingeschlossen und stellen ebenso sehr einen Teil der vorliegenden Beschreibung dar, als wenn sie hierin vollständig wiedergegeben worden wären.

Detaillierte Beschreibung

Das Folgende ist eine zweiteilige detaillierte Beschreibung von Aspekten der vorliegenden Erfindung.

Die Beschreibung enthält und/oder bezieht sich auf Graphen, Formeln, Figuren und dergleichen, auf die jeweils durch den Begriff "Figur", gefolgt von einer spezifischen identifizierenden Zahl und begleitenden Zeichnungen, von denen jede beschrieben ist und/oder auf die durch den Begriff "FIG", gefolgt von einer spezifischen identifizierenden Nummer, Bezug genommen wird. Die in diesen Zeichnungen dargestellten Objekte können nicht exakt skaliert sein.

In den begleitenden Zeichnungen:

1 ist ein Prozessflussbild für das kontinuierliche Fermentationssystem im Pilotmaßstab, die einzelnen gezeigten Ausrüstungsgegenstände sind in Tabelle 5.1 zusammengefasst.

2 ist ein schematisches Diagramm des 50 l-Pilotmaßstab-Gaslift-Leitrohr(„draft-tube")-(GLDT) Bioreaktors.

3 ist eine Querschnittsansicht des Reaktors von 2, einschließlich der Lage des internen Leitrohrs („draft-tube"), wie auch der des internen Abscheiders.

4 ist eine detaillierte Zeichnung der Kopfplatte des Bioreaktors von 2.

5 ist eine detaillierte Zeichnung des Rumpfs des Bioreaktors von 2.

6 ist eine detaillierte Zeichnung des konischen Bodens des Bioreaktors von 2.

7 ist eine detaillierte Zeichnung des Gaseinblaserohrs des Bioreaktors von 2. Eine Gesamtzahl von 160 Löchern (0,16 cm Durchmesser) wurden in das Einblaserohr mit 1,27 cm Durchmesser mit einem longitudinalen Abstand von 0,8 cm Mitte-zu-Mitte und einem seitlichen Abstand von 0,6 cm gebohrt.

8 ist ein Diagramm der kontinuierlichen Kügelchenherstellung unter Verwendung statischer Mixer (Labatt Patent Application No. 2 133 789).

9 ist ein Bild von Siran® Glaskügelchen, bezogen von Schott Engineering.

10 ist ein Bild von Celite® Kieselgur-Kügelchen, bezogen von World Minerals.

11 ist ein Bild von &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchen, hergestellt in den Laboratorien der Labatt Brewing Company Limited ("Labatt").

12 ist eine Serie von Bildern, die nicht-flockende Hefe, Ketten-bildende Hefe bzw. flockende Hefe darstellen. Diese Bilder wurden unter Verwendung einer mikroskopischen fokussierenden Kamera bei einer Vergrößerung von 100× aufgenommen.

13 ist ein mikroskopisches Bild des mittelflockenden Hefestammes LCC3021 bei einer Vergrößerung von 100×.

14 ist ein mikroskopisches Bild des superflockenden Hefestammes LCC290 bei einer Vergrößerung von 100×.

15 ist ein schematisches Diagramm des statischen Mischer-Verfahrens für die Herstellung von kappa-Carrageenan-Gelkügelchen. Im statischen Mischer wandert das Fluid durch den Mischer (eher als der Mischer durch das Fluid), was Mischen von Fluiden erlaubt, wenn sie durch die Rohrleitung gepumpt werden.

16 ist ein weiteres Schema eines Gaslift-Leitrohr-Bioreaktorsystems für primäre Fermentation bzw. Primärfermentation von Bier.

17 ist eine Photographie des gegenwärtigen Gaslift-Leitrohr-Bioreaktorbehälters von 15.

18 ist eine detaillierte Zeichnung eines 13 l (d.h., 8 l Arbeitsvolumen) Gaslift-Rohr-Reaktorbehälters von 16.

19 ist eine detaillierte Zeichnung einer Bioreaktor-Behälter-Kopfplatte, wobei: 1 – Flüssigkeitsentnahmestutzen für Sauerstofffühler; 2 – Temperaturmessstutzen für Temperaturfühler, verknüpft mit thermostatischem Regler; 3 – Temperaturfühler; 4 – Flüssigkeitsrücklaufstutzen für Sauerstofffühler; 5 – Inokulationsstutzen; 6 – Membran-Probennahmestutzen mit Kappe aus rostfreiem Stahl, ist.

20 ist ein Profil des Flüssigkeitsentnahmestutzens für Sauerstofffühler mit in Flüssigphase des Bioreaktors untergetauchter Füllereinheit.

21 ist ein detailliertes Ausrüstungsgegenstände- und Vorderansichts-Diagramm für kontinuierliche Hauptgärung von Bier, verwendend ein Gasliftbioreaktorsystem (siehe Tabelle 5.1 für detaillierte Beschreibung der Ausrüstungsgegenstände).

22 ist ein Schema des Gelbildungsmechanismus von Carrageenan (bearbeitet nach Rees, 1972).

23 ist ein Schema der Verwendung von Würzebestandteilen durch immobilisierte Hefe während der Hauptgärung.

24 ist ein Bild von kappa-Carrageenan-Gelkügelchen, enthaltend immobilisierte Lager-Hefe zum Zeitpunkt null der Fermentation.

25 ist ein Bild einer Kapsel von Lager-Hefe, eingeschlossen in kappa-Carrageenan-Gelkügelchen nach zwei Tagen von Chargenfermentation, die Sprossnarben aus einzelnen Hefezellen zeigt.

26 ist ein Bild einer Außenkante eines kappa-Carrageenan-Gelkügelchens, die Lager-Hefezellen nach zwei Monaten kontinuierlicher Fermentation zeigt.

27 ist ein Bild von Lager-Hefezellen an einer äußeren Region eines kappa-Carrageenan-Gelkügelchens nach zwei Monaten kontinuierlicher Fermentation.

28 ist ein Bild von Lager-Hefezellen im Zentrum eines kappa-Carrageenan-Gelkügelchens nach zwei Monaten kontinuierlicher Fermentation.

29 ist ein Bild eines gesamten kappa-Carrageenan-Gelkügelchens nach sechs Monaten kontinuierlicher Fermentation; viele zerbrochenen Kügelchen hatten hohle Zentren.

Detaillierte Beschreibung – Teil 1: HEFESTAMM UND HERSTELLUNG DES INOKULUMS

Die in dieser wissenschaftlichen Arbeit durchgeführten Fermentationen verwendeten eine polyploide Hefe aus der Saccharomyces cerevisiae-Familie (auch bezeichnet als Saccharomyces uvarum und/oder Saccharomyces carlsbergensis). Die brauende Gemeinde wird diese Hefen üblicherweise als untergärig, einen Lager-Biertyp produzierend, bezeichnen. Diese Charakterisierung ist der Fähigkeit von Lager-Hefe, sich aus dem Flüssigmedium nach Abschluss der Fermentation abzusetzen, zuzuschreiben. Ale-Hefe, im Gegensatz zur Lager-Hefe, wird zum oberen Ende des Fermentationsbehälters aufsteigen und war daher als obergäriger Stamm bekannt. Die Fähigkeit von Hefe, sich abzusetzen oder aufzusteigen, ist nicht notwendigerweise davon abhängig, ob die Hefe ein Lager- oder Ale-Typ ist, sondern sie ist Stamm-spezifisch. Lager-Hefe gärt typischerweise nicht bei Temperaturen über 34°C, während Ale-Hefe Melibiose nicht vergären kann. Wissenschaftler werden diese Charakteristiken verwenden, um Lager-Stämme von Ale-Hefen zu unterscheiden (McCabe, 1999).

Der mittelflockende Hefestamm Saccharomyces cerevisiae-Stamm 3021 aus der Labatt Culture Collection wurde sowohl in den selbstaggregierten Fermentationen mit freien Zellen und den &kgr;-Carrageenan-immobilisierten Fermentationen verwendet. Eine Variante des LCC3021-Stammes, nämlich LCC290, wurde für Versuche, die die Verwendung von superflockender Hefe als das immobilisierende Agens einschlossen, verwendet.

Reine Hefekulturen wurden in einem –80°C-Gefrierschrank kryogen gelagert, der im Labatt Technology Development Department stand. Wenn erforderlich, wurden sterile Ösen der Hefekultur aerob bei 21°C auf PYG-Agarplatten (3,5 g Pepton, 3,0 g Hefeextrakt, 2,0 g KH2PO4, 1,0 g MgSO4·7H2O, 1,0 g (NH4)SO4, 20,0 g Glucose und 20,0 g Agar in destilliertem Wasser aufgelöst und auf ein Volumen von ein Liter aufgefüllt) vorkultiviert.

Isolierte Hefekolonien wurden dann in Teströhrchen, die 10 ml pasteurisierte Würze enthielten, transferiert und bei 21°C für eine Dauer von 24 Stunden unter Schütteln inkubiert. Dieses Inokulum wurde schrittweise auf ein Volumen von 5 l durch Zusetzen der vorherigen Kultur zu dem geeigneten Würzevolumen (10 ml zu 190 ml, 200 ml zu 800 ml und 1 l zu 4 l) vergrößert. Das Hefeinokulum wurde dann in Zentrifugenbehälter überführt, und Zentrifugation bei 10000 U/min und 4°C für 10 Minuten unterzogen. Die gewünschte Masse an Hefe für alle nachfolgenden Fermentationen wurde den resultierenden nassen Hefepellets entnommen (30% G/V).

FERMENTATIONSMEDIUM

Lager-Würze großtechnischer Qualität, hergestellt von dem Labatt-London-Brauhaus, wurde als Nährmedium für alle Fermentationen verwendet. In dieser wissenschaftlichen Arbeit wird auf das spezifische Gewicht der Würze, ausgedrückt als Grad Plato (°P) Bezug genommen. Formel 4.1 beschreibt die Beziehung zwischen spezifischem Gewicht und °P. °P = 135,997·SG3 – 630,272·SG2 + 1111,14·SG – 616,868(4.1)

Die während dieser ganzen wissenschaftlichen Arbeit verwendete Würze hatte 17,5°P, was dem spezifischen Gewicht von 1,072 entspricht.

Tabelle 4.1 gibt das typische Kohlenhydratprofil dieser Würze, gemessen durch die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Methode, die in Abschnitt 4.7.2 beschrieben wird, an. Ungefähr 73% der Kohlenhydrate in dieser Würze sind vergärbar, während die in dieser Studie verwendete Brauhefe 27% der längerkettigen Kohlenhydrate nicht einfach aufnehmen kann.

Der Variationskoeffizient der meisten analysierten Substanzen lag zwischen 10% und 20%. Diese Variabilität liegt zum großen Teil am verwendeten industriellen Herstellungsverfahren, wie auch an der Variabilität der Rohstoffe von einem Brauvorgang zum nächsten.

IMMOBILISIERUNGSARTEN

Drei Arten der Immobilisierung – Einschließen, Adsorption und Selbstaggregation – wurden während dieser Ph. D.-Untersuchungen erprobt. Bei den Trägerstoffen aus industriellen Quellen werden zunächst die Herstellerangaben gezeigt und dann durch laboreigene Analyse ergänzt. Bilder und Größenverteilungen der untersuchten Trägerstoffe (sofern verfügbar) sind hierin an anderer Stelle gezeigt.

Zwei Arten von Adsorptionsmatrizes wurden im pilotmaßstäblichen Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor getestet. Bilder beider dieser Trägerstoffe sind hierin gezeigt. Schott Engineering lieferte einen gesinterten Glaskügelchen-Trägerstoff, Siran®. Die ausgewählten Partikel hatten 1–2 mm Durchmesser, hatten offene Poren zur Hefe-Immobilisierung mit einem Porenvolumen von 55–60% und eine Porengrößenverteilung zwischen 60 und 300 &mgr;m, eine geeignete Größe für Hefezellen. Es wird berichtet, dass diese Art von Trägerstoff biologisch und chemisch stabil, leicht zu reinigen, wiederverwendbar, mit Dampf sterilisierbar, nicht kompaktierend und neutral im Geschmack ist, und sie ist daher für Lebensmittel freigegeben.

World Minerals aus Kalifornien lieferte einen sphärischen Trägerstoff, zusammengesetzt aus Kieselgur. Dieser Trägerstoff bot die Vorteile thermischer und chemischer Stabilität, mechanischer Festigkeit und Steifigkeit. Diatomit, der grundlegende Rohstoff, wird in der Brauindustrie üblicherweise zur Filtration von Bier verwendet. Der Celite® R-632-Trägerstoff wurde spezifisch für Immobilisierung ganzer Zellen entworfen.

Spezifikationen des Herstellers waren wie folgt: Größenbereich: 0,595 mm bis 1,41 mm (14/30 Mesh-Ausschluss) Mittlerer Porendurchmesser: 7,0 &mgr;m Gesamtes Porenvolumen: 1,19 cm3/g Dichte des verdichteten Betts: 0,334 kg/m3
kappa-Carrageenan-Gelkügelchen, ein Trägerstoff, basierend auf Einschluss, wurden in den Laboratorien der Labatt Brewing Company Ltd. hergestellt. Das Herstellungsverfahren wird in Abschnitt 5.2 beschrieben, und die Ergebnisse dieses Herstellungsverfahrens werden in Abschnitt 6.2.1 gezeigt.

Die einfachste Weise der Immobilisierung, Selbstaggregation, war durch die Auswahl von Hefestämmen, die zur Flockung fähig sind, möglich. Die industrielle Lager-Hefe LCC3021 besitzt die natürliche Fähigkeit zur Flockung und wird als mittelflockender Stamm angesehen. Wenn die Fermentation voranschreitet, werden sich kleine Hefeklumpen, die 0,5 mm bis 1,0 mm groß sind, im Flüssigmedium bilden. Die LCC290-Hefe, eine Variante der LCC3021-Lager-Hefe, wird viel größere Flocken (von 1,0 mm bis 5,0 mm, abhängig vom Grad der Bewegung) bilden und ist daher als superflockende Hefe eingeordnet. Bilder der verschiedenen Hefeflocken sind hierin gezeigt.

PROBENAHMEPROTOKOLL

Als die Fermentationen voranschritten, war es nötig, Proben aus der fermentierenden Flüssigkeit in zahlreichen Zeitabschnitten zu entnehmen. Ventile zur sterilen Probenahme wurden von Scandi-brew® erworben, um diese Aufgabe zu erfüllen. Diese Ventile sind aus rostfreiem Stahl gebaut und mit einer Kammer (begrenzt durch einen oberseitigen und unterseitigen Stutzen) ausgerüstet, in der Ethanol aufbewahrt werden kann, um eine aseptische Umgebung aufrecht zu erhalten. Vor dem Ziehen einer Probe wird das Ethanol aus der Kammer durch Entfernen der Rückhaltekappe des unteren Auslaufrohrs abgelassen. Frisches Ethanol (75 Vol.-%) wird durch die Kammer laufen gelassen, und die Kappe wird dann auf den oberen Stutzen des Ventils aufgesetzt. Dann wird der Ventilhebel gezogen, und ungefähr 50 ml der flüssigen Probe werden in einen sterilen Behälter aufgefangen. Bei den Fermentationen mit superflockender Hefe wird eine zweite Probe gezogen, so dass sachgerechte Entflockung vor der Zellzahlbestimmung durchgeführt werden kann. Sobald die Probenahme vollständig ist, wird die Ventilkammer mit heißem Wasser und Peressigsäure und dann abschließend mit Ethanol gespült. Die Rückhaltekappe wird auf das untere Ausflussrohr gesetzt, und die Kammer wird mit Ethanol zur Vorbereitung auf die nächste Probenahme gefüllt.

MIKROBIOLOGISCHE ÜBERWACHUNG Auszählung freier Hefezellen und Lebensfähigkeit durch Methylenblau-Methode

Flüssigkeitsproben, die frei suspendierte Hefezellen enthalten, werden zuerst aus dem Fermentationsmedium durch die oben beschriebene Probenahmeprozedur entnommen. Ein Hämazytometer von Hauser Scientific Company mit einem Volumen von 10–4 ml wird in Verbindung mit einem Lichtmikroskop verwendet, um die Zellauszählungen auszuführen. Die Flüssigkeitsproben sollten mit destilliertem Wasser verdünnt werden, um eine gesamte Hefenzahl von 150 bis 200 Zellen im Zählfeld zu erreichen. Heggart et al. (1999) beschreiben all die Faktoren, die Merkmale der Lebensfähigkeit und Vitalität von Hefe beeinflussen.

Um den Grad der Lebensfähigkeit innerhalb der Probe zu beurteilen, wurde die von der American Society of Brewing Chemists beschriebene Methylenblau-Färbetechnik verwendet (Technical Committee and Editorial Committee of the ASBC, 1992). Lebende Zellen können den Methylenblau-Farbstoff durch Oxidieren farblos machen. Andererseits werden sich tote Zellen blau färben. Die folgenden Reagentien wurden zur Herstellung von Methylenblau zur Beurteilung der Lebensfähigkeit verwendet:

Lösung A: 0,1 g Methylenblau in 500 ml destilliertem Wasser

Lösung B: 13,6 g KH2PO4 in 500 ml destilliertem Wasser

Lösung C: 2,4 g Na2HPO4·12H2O in 100 ml destilliertem Wasser

Das gepufferte Methylenblau nach Fink-Kuhles wurde dann durch Mischen von 500 ml der Lösung A mit 498,75 ml der Lösung B und 1,25 ml der Lösung C hergestellt, was eine endgültige Mischung mit einem pH von 4,6 ergibt.

Eine Mischung aus verdünnter Zellsuspension und Methylenblau wurde in einem Teströhrchen hergestellt und dann gründlich gemischt. Nachdem dieser Mischung erlaubt wurde, für einige Minuten zu ruhen (sichert Kontakt zwischen Zellen und dem Farbstoff), wurde ein Tropfen der Flüssigkeit zwischen dem Zählglas des Hämazytometers und dem Deckglas (definiertes Volumen) platziert. Der Prozentsatz lebensfähiger Zellen wurde durch Zählen sowohl der lebensfähigen als auch der toten Zellen innerhalb des Zählfeldes und dann Teilen der Anzahl lebensfähiger Zellen durch die Gesamtzahl an Zellen bestimmt.

4.5.2 Zellzahlen immobilisierter Hefen – Selbstaggregation

Beim Verwenden von Hefezellen mit einer Neigung zu Flockenbildung wird es schwierig, die Anzahl an Zellen, die in einer Flüssigprobe vorhanden sind, genau zu bestimmen, weil die Zellen dazu neigen werden, sich im Probenbehälter abzusetzen. Um eine repräsentative Probe zu erhalten, wurde ein Entflockungsmittel benutzt. In diesen Experimenten wurde eine Schwefelsäurelösung (0,5 Vol.-%) verwendet, um die ausgeflockten Zellen zu destabilisieren, was eine repräsentative Zellauszählung ermöglicht. Die gleiche Auszählungs- und Lebensfähigkeits-Prozedur, die in Abschnitt 4.5.1 dargelegt wurde, wurde unter Ersetzen von destilliertem Wasser durch die Schwefelsäure als Verdünnungsmittel angewendet.

Zellzahlen immobilisierter Hefen – Gelkügelchen

Es war notwendig, die Gelmatrix unter Verwendung eines Polytron®-Apparats (Brinkmann Instruments) aufzubrechen, bevor Hefeauszählungen an von Gel eingeschlossenen Zellen durchgeführt wurden. Eine Probe der Kügelchen wurde zuerst durch ein steriles Sieb (500 &mgr;m Maschenweite) passiert und dann mit sterilem Wasser gespült. Ein Milliliter der Kügelchen mit von Gel eingeschlossenen Zellen und 19 ml destilliertes Wasser wurden in einen 50 ml-Probenbehälter gegeben. Das Polytron® wurde dann verwendet, um das Gel physikalisch aufzubrechen und damit die Hefe in Lösung freizusetzen. Die in Abschnitt 5.5.1 beschriebenen Auszählungs- und Lebensfähigkeits-Methoden wurden dann auf die Proben der aufgebrochenen Gele angewendet.

Überwachung von Kontamination

Alle während dieser wissenschaftlichen Arbeit durchgeführten Fermentationen wurden regelmäßig bezüglich Kontamination überwacht. Das Überwachungsprogramm bestand aus wenigstens einer Überprüfung der Flüssigkeit in den kontinuierlichen 50 l-Fermentern und der. Würze in den Lagerbehältern pro Woche. Flüssigkeitsproben wurden aseptisch entnommen und dann auf Kulturplatten, bestehend aus Universal Beer Agar (UBA, Difco Laboratories) und 10 mg/l Cycloheximid, ausplattiert. Diese Untersuchungsproben wurden dann bei 28°C für bis zu 10 Tage sowohl unter aeroben wie auch anaeroben Bedingungen inkubiert. Einstellen der ausgewählten Platten in Behälter, die ein AnaeroGen®-Paket (Oxoid) enthalten, welches jeglichen im Behälter verbleibenden Sauerstoff entfernt, schuf die erwünschte anaerobe Wachstumsumgebung. Die Verwendung eines Indikatorstreifens (wird rosa, wenn Sauerstoff anwesend ist) erlaubte uns zu verifizieren, dass die Umgebung tatsächlich anaerob war. Bakterielle Kontaminanten würden dann durch diese Methode erfasst werden, sofern sie in der Flüssigkeitsprobe vorhanden sind.

Detektion von Wildhefen oder Nicht-Brauhefen erforderte ein gesondertes Wachstumsmedium, das bakterielles und/oder Brauhefe-Wachstum nicht fördern würde. Mit Hefemedium (YM, Difco Laboratories), angereichert mit 0,4 g/l CuSO4, hergestellte Gussplatten wurden verwendet, um das Wachstum von jeglichen potentiellen Wildhefen zu ermöglichen (Inkubation bei 25°C für 7 Tage). Inkubieren der auf PYN-Agar (Peptone Yeast-Extract Nutrient, Difco Laboratories) ausplattierten Flüssigkeitsprobe für 7 Tage bei 37°C ermöglichte die Detektion von Nicht-Lager-Brauhefen. Wachstum von Lager-Hefe ist bei Temperaturen über 34°C gehemmt, daher würde jegliches Wachstum auf diesen Platten eine Kontamination mit Ale-Hefe anzeigen.

ANALYTISCHE METHODEN

Entsprechende Kalibrationen wurden für all die relevanten Ausrüstungsgegenstände, wie durch industrielle Standardarbeitsanweisungen vorgeschrieben, durchgeführt.

Ethanol

Ethanolkonzentration in Bier und gärenden Proben wurde unter Verwendung der durch das Technical Committee und das Editorial Committee der American Society of Brewing Chemists (1992) beschriebenen gaschromatographischen Methode analysiert. Eine entgaste Probe der Flüssigkeit wurde mit 5% V/V internem Isopropanol-Standard kombiniert, gefolgt von der Injektion von 0,2 &mgr;l dieser Mischung in einen Perkin Elmer 8500 Gaschromatographen. Die folgende Liste gibt weitere Details hinsichtlich des exakten Aufbaus der GC an:

Flammenionisationsdetektor (FID)

Dynatech-Autosampler

Trägerpackung Chromosorb 102, 80–100 Mesh

Helium-Trägergas, fließend mit 20 ml/min

Injektortemperatur von 175°C, Detektortemperatur von 250°C und Säulentemperatur von 185°C isotherm.

Kohlenhydrate

Die Glucose-, Fructose-, Maltose-, Maltotriose-, Maltotetraose („maltotetrose")-, Polysaccharide- und Glycerin-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystems (Spectra-Physics SP8100XR HPLC) gemessen. Eine Kationenaustauschersäule (Bio-Rad Aminex HPX-87K) mit Dikaliumphosphat als der mobilen Phase wurde verwendet, um diese Kohlenhydrate zu trennen, während sie aus dem System eluierten. Die Menge der Verbindungen wurde dann unter Verwendung eines Brechungsindex-Detektors, um die entsprechenden Verbindungs-Peaks zu erstellen, bestimmt. Die HPLC wurde bei einem Gegendruck von 800 psi, einer Säulentemperatur von 85°C und einer Detektortemperatur von 40°C betrieben. Die Proben waren entgast und auf die geeigneten Konzentrationen verdünnt. Eine 10 &mgr;l-Injektion wurde dann in das System bei einer Flussrate von 0,6 ml/min eingeführt.

Die Brauindustrie verwendet üblicherweise eine andere Messung, um die insgesamte Kohlenhydratkonzentration der Flüssigkeit zu bestimmen. Das spezifische Gewicht der Flüssigkeit, ausgedrückt in Grad Plato, wurde unter Verwendung eines Anton Paar DMA-58-Densitometers gemessen. Filtrierte und entgaste Proben wurden in ein spezielles U-Rohr aus Glas überführt, das dann einer elektronischen Oszillation unterzogen wurde. Die Frequenz der Oszillation durch das Medium wurde gemessen und dann mit einem spezifischen Gewicht der Flüssigkeit (g/100 g oder °P) korreliert. Es sollte beachtet werden, dass diese Messung eine Näherung der Gesamtkohlenhydratkonzentration (oder des spezifischen Gewichts) der Probe ist, da die Kalibrationen mit wässrigen Saccharoselösungen bei 20°C durchgeführt werden, deren spezifisches Gewicht das gleiche ist wie das der fraglichen Würze.

Vizinale Diketone

Gesamtdiacetyl- (2,3-Butandion) und Gesamt-2,3-Pentandion-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines mit einem Elektroneneinfangdetektor ausgestatteten Perkin Elmer 8310-Gaschromatographen bestimmt. Als das Trägergas wurde 5% Methan in Argonträgergas, fließend bei 1,0 ml/min, verwendet, und die Probe wurde durch eine J & W DB-Wax-Säule hindurchgeleitet. Die Injektor-Temperatur wurde bei 105°C gehalten, während die Detektortemperatur auf 120°C eingestellt war. Ein Hewlett Packard 7694E Headspace-Autosampler erleichterte bzw. ermöglichte die Analyse. Die Quantifizierung wurde durch Auswerten der Peakfläche der ausgewählten Probenkomponente und dann Rückbeziehen auf den Kalibrationswert des internen 2,3-Hexandion-Standards berechnet.

Um die "Gesamt"-Konzentration dieser Verbindungen zu bestimmen, war es zuerst nötig, diese Proben bei 65°C zu äquilibrieren und sie dann für 30 Minuten bei dieser Temperatur zu halten. Diese Probenbehandlung vor der Analyse ermöglichte die Umwandlung von &agr;-Acetolactat und &bgr;-Hydroxybutyrat in ihre jeweiligen Diketone, Diacetyl und 2,3-Butandion.

Ester und höhere Alkohole

Einige der wichtigsten im Bier bestimmten Aromaverbindungen wurden mittels eines gaschromatographischen Headspace-Verfahrens gemessen. Acetaldehyd, Ethylacetat, Isobutanol, 1-Propanol, Isoamylacetat, Isoamylalkohol, Ethylhexanoat und Ethyloctanoat wurden unter Verwendung von n-Butanol als internem Standard quantifiziert. Ein Hewlett Packard 5890-Gaschromatograph, ausgestattet mit einem Flammenionisationsdetektor, einem HP 7994-Headspace-Autosampler und eine J & W DB-Wax-Kapillarsäule wurden verwendet. Die Injektortemperatur war auf 200°C eingestellt, und die Detektortemperatur betrug 220°C. Das Temperaturprofil des Ofens war wie folgt: 40°C für 5 min, Steigung von 40°C auf 200°C bei einer Rate von 10°C/min, Steigung von 200°C auf 220°C bei einer Rate von 50°C/min und schließlich ein Halteschritt bei 220°C für 5 min. Helium-Make up-Gas mit 30 ml/min (28 psig) und ein Wasserstoffstrom mit 50 ml/min (25 psig) und ein Luftstrom mit 300 ml/min (35 psig) ergänzten einen Helium-Trägergasfluss von 6,0 ml/min. Der gesamte GC-Zyklus betrug 40 Minuten bei einer Probenschleife von 1 ml.

Andere Analysen

Etliche andere analytische Messungen wurden auf einer Bedarfsbasis an Fermentationsflüssigkeit, die Alterung und Verpackung unterzogen wurde, durchgeführt. Analysen des fertiggestellten Produkts wurden durch das Labatt Quality Control Department gemäß Standards für fertiggestelltes Bier durchgeführt. Die durch das Technical Committee und das Editorial Committee der American Society of Brewing Chemists (1992) beschriebenen Methoden waren die Grundlage für diese Messungen. Eine Liste der Analysen, wie auch eine kurze Beschreibung der Bedeutung dieser Messungen wird in Tabelle 4.2 bereitgestellt.

HEFE-SEDIMENTATIONSPROTOKOLL – LCC290 Herstellung der Hefetestprobe

Superflockende Hefe (LCC290) wurde wie in Abschnitt 4.1 beschrieben in Würze wachsen gelassen. Dieses Inokulum wurde dann bei 4°C und 10000 U/min für 15 Minuten zentrifugiert, um ein Hefepellet zur weiteren Inokulation zu erhalten. Würze wurde wie in Abschnitt 4.2 beschrieben bei 100°C für 60 Minuten pasteurisiert, und dann wurde ein Liter aseptisch in 6 sterilisierte 2 l-Schüttelkolben transferiert. Jeder Schüttelkolben wurde mit 4 g zentrifugierter Hefe inokuliert. Die Kolben wurden auf einen mit 135 U/min betriebenen Schüttler (21°C umgebende Raumtemperatur) platziert und fermentieren gelassen. Bei den folgenden Zeitabschnitten wurde ein Kolben entnommen: 24 h, 40 h, 48 h, 64 h, 71 h und 192 h. Bei jedem Intervall wurde eine kleine Flüssigkeitsprobe zur Kohlenhydratanalyse und für Messungen der Hefekonzentration und der Lebensfähigkeit (tatsächliche Verfahren in Kapitel 4 beschrieben) entnommen. Die verbleibende Flüssigkeit/Hefe-Mischung wurde dem in Abschnitt 4.7.2 beschriebenen Hefe-Sedimentationsprotokoll unterworfen.

Hefe-Sedimentationsprotokoll

Die Sedimentationsrate für superflockende LCC290-Hefestämme wurde unter Verwendung der folgenden Methode gemessen. Jeder Probe wurde es erlaubt, bis zum gewünschten Zeitabschnitt, wie in Abschnitt 4.7.1 beschrieben, zu fermentieren. Zur vorgeschriebenen Zeit wurde der entsprechende Probenkolben entnommen. Die Proben wurden geschüttelt, um sicherzustellen, dass alle Partikel suspendiert waren. Der Inhalt des Kolbens wurde dann unverzüglich in einen graduierten 1000 ml-Zylinder überführt. Wenn die Flocken sedimentierten, wurde die Distanz zwischen der Flüssigkeitsoberfläche und der Flocken-Flüssigkeits-Grenzfläche in 30 Sekunden-Intervallen gemessen. Die Sedimentationsrate wurde durch Anwenden der folgenden Gleichung berechnet:

Durch Verwenden des Standard-Kynch-Verfahrens (1952) wurde eine Kurve der Sedimentationsrate gegen Zellkonzentration aus den Sedimentationskurven, die für jeden Fermentationsabschnitt erhalten wurden, gebildet.

UMWÄLZUNGS- UND MISCHUNGSRATEN-VERFAHREN

Um die Mischungszeit und Umwälzrate im dreiphasigen Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor zu messen, wurde ein Säureinjektionssystem, verknüpft mit einem Datenerfassungssystem, verwendet. Durch Zuführen eines Stoßes einer starken Säure zum Bioreaktor war es möglich, sowohl die Umwälzrate als auch die Mischungszeit zu berechnen, indem die Änderung von pH über die Zeit überwacht wurde und dann mit den in Abschnitt 3.2.2 wiedergegebenen Gleichungen in Beziehung gesetzt wurde. Das Datenerfassungssystem bestand aus:

einer Ingold-pH-Sonde (Cole-Parmer, Kat. #P-05990-90), verbunden mit einem Ingold Microprozessor-Based pH Transmitter (Modell 2300)

einer Datenwandlerkarte DT2805

einem 386DX Personalcomputer

und einem Quick Basic-Datenerfassungsprogramm (geschrieben von C. Hudson und J. Beltrano 1994 und modifiziert durch N. Mensour 1998).

Zehn Milliliter 10 N Salzsäure wurden in den Ringkammer-Abschnitt des Gaslift-Leitrohr-Bioreaktors (Diagramm in Figur 5.5 wiedergegeben) gerade unterhalb der Position der pH-Sonde injiziert. Diese Distanz entsprach einer Höhe von 26 cm unterhalb der Kopfplatte. Die pH-Sonde wurde vor allen Mischungsexperimenten einer Zwei-Punkt-Kalibration mit zertifizierten Standardpuffern (Beckman pH 7,0 grüner Puffer, und Beckman pH 4,0 roter Puffer) unterzogen. Der durch das pH-Meter gebildete Strom von 4–20 mA wurde mit einem Schraubklemmenbrett verbunden, wo der Strom in eine Spannung umgewandelt wurde, die dann von der im Computer befindlichen Datenerfassungskarte gemessen wurde. Das Datenerfassungsprogramm wurde gleichzeitig mit der Säureinjektion gestartet. Die Länge der Datenerfassung betrug 5 Minuten bei einer Abtastfrequenz von 50 Hz. Die Datenfeldgröße im Programm wurde auf 3750 (Gesamtzahl von 15000 gesammelten Punkten) mit einer für die Datenerfassungskarte eingestellten Verstärkung von 1 eingestellt.

Die gesammelten Daten wurden vom Labor auf einen leistungsfähigeren Computer (Pentium II-Mikroprozessor) zur weiteren Analyse übertragen. TableCurve 2D (Jandel Scientific Software, Labtronics, Kanada) wurde zur Datenanalyse wegen seiner Fähigkeit, mit großen Datensätzen umzugehen, wie auch wegen seiner vielen eingebauten Datenhandhabungsfunktionen (Datenglättung, Kurvenanpassung, etc.) ausgiebig verwendet. Der Savitzky-Golay-Algorithmus, ein Zeitbereich-glättendes Verfahren, basierend auf biquadratischer Polynomanpassung mittels der Methode kleinster Fehlerquadrate in einem sich bewegenden Fenster, wurde auf die ursprünglichen Daten angewandt, um Rauschen zu eliminieren. Die geglätteten Daten wurden dann angepasst, um eher als die tatsächliche pH-Messung eine Änderung im pH widerzuspiegeln. Eine sinusförmige Zerfallsfunktion wurde den angepassten Daten angepasst. Die Mischungszeiten und Umwälzungsraten wurden dann aus den Anpassungsparametern berechnet.

Diese Mischungsversuche wurden bei tatsächlichen Fermentationen im 50 l-Gasliftbioreaktor unter Anwesenheit von einem der drei Immobilisierungsträgerstoffe (entweder superflockende Hefe LCC290, mittelflockende Hefe LCC3021 oder &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchen) durchgeführt. Die Flüssigphase war fermentiertes Bier mit einem spezifischen Gewicht von 2,5°P, und die Gasphase umfasste Kohlendioxid-Einblasegas. Die Fermentationstemperatur wurde auf 15°C geregelt. Die Oberflächengeschwindigkeiten des Einblasegases wurden zwischen 2,0 und 6,0 mm/s variiert. Dem System wurde es bei einer gegebenen Gasflussrate ermöglicht, sich für 10 Minuten zu äquilibrieren. Der Säureinjektionsversuch würde dann starten und dreimal wiederholt werden. Die nächste Gasflussrate würde gewählt werden, und der pH-Wert der Mischung im Behälter würde auf den Startwert wieder eingestellt werden.

DESIGN EINES GASLIFT-ZENTRALROHR-BIOREAKTORSYSTEMS IM PILOTMASSSTAB GASLIFT-ZENTRALROHR-BIOREAKTOR-FERMENTATIONSSYSTEM

Leitrohr-Wirbelschicht-(DTFB)-Systeme haben ihren Wert in der Anwendung in Drei-Phasen-Systemen gezeigt. Zwei identische Gaslift-Leitrohr-Bioreaktoren im Pilotmaßstab wurden entworfen, gebaut und in der Versuchsbrauerei der Labatt Brewing Company Ltd. installiert, um die experimentellen Arbeiten für diese wissenschaftliche Arbeit auszuführen. Zusätzlich wurden etliche vorhandene Behälter, sowohl für Würzelagerung wie auch für Biersammlung, modifiziert. Das Flussbild in 1 bildet das in den pilotmaßstäblichen kontinuierlichen Fermentationsexperimenten verwendete insgesamte Verfahren ab, und Tabelle 5.1 listet eine detailliertere Beschreibung der in 1 wiedergegebenen Ausrüstungsgegenstände auf.

Würze wurde vom Londoner Sudwerk über Edelstahlrohre mit 5,08 cm geliefert und in Würze-Lagertanks (WT1 & WT2) mit 16001 Arbeitsvolumen überführt. Mit einem Zwei-Tank-System war es möglich, eine kontinuierliche Versorgung der pilotmaßstäblichen kontinuierlichen Fermenter (R1 & R2) mit Nährmedium sicherzustellen. Jeder Aufbewahrungstank ist mit einem Kohlendioxid-Einblasesystem zur Steuerung von Sauerstoff und Homogenität und einem Glykol-Kühlmantelsystem zur Temperatursteuerung ausgerüstet. Diese zentrale Quelle für Nährmedium wurde errichtet, um bis zu 3 unabhängige Fermenter über ein Ventilverteilerrohrsystem (V7, V8 & V9) zu speisen. Peristaltische Masterflex-Pumpen (P1 & P2) wurden verwendet, um einen vorgeschriebenen Würzefluss zu den pilotmaßstäblichen Bioreaktoren (R1 & R2) zu liefern.

Kohlendioxidgas und Luft wurden in das Gasliftsystem durch Gaseinblaserohre aus rostfreiem Stahl (7) eingeblasen. Rotameter (RM3, RM4, RM5 und RM6) wurden verwendet, um die in das System injizierten Flussraten zu überwachen. An den Gasleitungen wurden Sterilfilter (0,2 &mgr;m Maschenweite) installiert, um sicherzustellen, dass keine Kontaminanten in die Bioreaktoren eingeschleppt wurden. Produkt floss aus dem Reaktor durch ein Überlaufsystem (4) aus. Die Speisepumpe steuerte daher allein die Flüssigkeitsverweilzeit. Beide Reaktoren (R1 und R2) waren mit einem Abfallbiertank (WBT1) verbunden, um die Überlaufflüssigkeit zu sammeln. Zur Produktsammlung und Bearbeitung wurden spezielle 50 l-Tanks auf einer Bedarfsbasis verwendet.

Detailliertere Diagramme und exakte Dimensionen des pilotmaßstäblichen 50 l-Bioreaktors werden in Abschnitt 5.1.1 zur Verfügung gestellt. Die Protokolle zur Würzehandhabung und -lagerung werden in Abschnitt 5.1.2 vorgestellt, während die Reinigungs- und Sterilisationsprotokolle für das kontinuierliche Fermentationssystem in Abschnitt 5.1.3 diskutiert werden. Abschnitt 5.1.4 deckt die Fermentationsprotokolle, die während dieser wissenschaftlichen Arbeit befolgt wurden, ab.

Reaktorentwurf & Spezifikationen

Der für diese Arbeit entworfene Bioreaktor mit 50 l Arbeitsvolumen wurde ausschließlich aus 304L-Edelstahl mit 4 im Gehäuse des Reaktors positionierten Plexiglassichtfenstern gebaut, so dass Partikel- und Fluidbewegung beobachtet werden konnten. Das Material der Konstruktion wurde wegen seiner Widerstandsfähigkeit gegenüber Desinfektionschemikalien (Lauge und Säure), wie auch wegen seiner Dauerhaftigkeit gegenüber Dampfsterilisation, ausgewählt. Ein weiterer wichtiger Aspekt des Entwurfs war die Minimierung von Gewindefittingen in direktem Kontakt mit dem Fermentationsmedium. Statt dessen wurden Stutzen angeschweißt und, wo nötig, TriClover-Hygienefittinge verwendet. Der Reaktor wurde mit einer aufgeweiteten Kopfregion entworfen, um Gasentbindung zu maximieren und daher besseren Flüssig-Fest-Stoffübergang zu fördern (Chisti & Moo-Young, 1993). Der Reaktorboden wurde mit einem Konuswinkel von 90 Grad entworfen, um das Ansammeln von Feststoffen am Boden zu minimieren. 2 ist ein schematisches Diagramm der pilotmaßstäblichen 50 l-Systeme, die in der Labatt-Versuchsbrauerei installiert wurden. Dieses Diagramm zeigt die Positionen des Einblasegas-Einlasses, des Flüssigkeitseinlasses, des Glykolkühlmantels, des Produktauslasses, des Temperaturmess- und Steuerungssystems, wie auch die Position der zwei hygienischen Probenahmestutzen. 3 ist ein Schema des gleichen GLDT-Bioreaktors mit in Zentimeter angegebenen Dimensionen. 4 bis 6 sind detaillierte Schnittzeichnungen des 50 l-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktors, und 7 ist ein Schema des in diesen Experimenten verwendeten Gaseinblase-Bauteils.

Das interne Leitrohr und der Partikelabscheider (Prallfläche) sind in 3 gezeigt. Ein Verhältnis von Leitrohrdurchmesser zu Reaktordurchmesser von 2/3 wurde basierend auf Literaturdaten (Chisti, 1991) gewählt. Der Partikelabscheider wurde bemessen, um bessere Trennung des Gases von der Fest-Flüssigmischung zu ermöglichen. Durch Steigern des Durchmessers dieses Prallelements (20,32 cm, verglichen mit einem Leitrohrdurchmesser von 10,16 cm) ist es möglich, einen größeren Unterschied zwischen der Aufstiegsgeschwindigkeit der Blasen und der Abstiegsgeschwindigkeit des Flüssig-Fest-Fluids zu erhalten. Gaseinzug in die Ringkammer des Leitrohrsystems wird verlängert werden, und ein besserer Fest-Flüssig-Stoffübergang wird sich ergeben.

Ein Einblaserohr (7) wurde für die Injektion von Kohlendioxid-Mischgas in den Leitrohrabschnitt entworfen. Eine Gesamtzahl von 160 Löchern, die 0,16 cm im Durchmesser messen, wurde in das Einblaserohr mit 1,27 cm Durchmesser gebohrt. Die Löcher wurden mit einem longitudinalen Abstand von 0,8 cm Mitte-zu-Mitte und einem seitlichen Abstand von 0,6 cm Mitte-zu-Mitte (8 Reihen von 20 Löchern) angeordnet. Da Mischen die Hauptfunktion des eingeblasenen Gases war, wurde ein Durchmesser der Einblaselöcher von 0,16 cm gewählt.

Protokoll zur Würzehandhabung und -lagerung

In traditionellen Fermentationspraktiken wird Würze nicht für längere Zeitabschnitte vorgehalten, ohne mit Hefe angestellt zu sein. Sauerstoff-angereicherte Würze ist ein exzellentes Wachstumsmedium für viele Organismen, einschließlich Hefe. Da das Fermentationsprotokoll für die kontinuierlichen Gasliftsysteme erforderte, große Mengen Würze vorzuhalten, war es nötig, Protokolle für Würzetransfer und -aufbewahrung zu entwickeln. Es war die Meinung der Forscher, dass nicht-Sauerstoff-angereicherte kalte Würze für bis zu zwei Wochen aufbewahrt werden könnte, ohne durch Kontamination beeinträchtigt zu werden, falls die Würze auf geeignete Weise zum Aufbewahrungsbehälter transferiert wurde.

Es wurde auch für nötig erachtet sicherzustellen, dass die Temperatur der Würze auf geeignete Weise kontrolliert würde, sobald diese im Würzeaufbewahrungsbehälter war. Das zur Verfügung stehende Tankvolumen in der Versuchsbrauerei war ursprünglich eher für Fermentation als für Würzeaufbewahrung gedacht. Ein Test der Fähigkeit dieser Tanks, die Temperatur stehender Flüssigkeit aufrecht zu erhalten, wurde durchgeführt. 2 zeigt deutlich, dass diese Behälter nicht ohne Umwälzung verwendet werden können, wenn eine konstante Temperatur von 4°C aufrecht erhalten werden soll. Würze wurde in diese Behälter ursprünglich bei einer Temperatur von 4°C eingebracht. Temperaturmessungen wurden an mehreren Punkten über den Tank hinweg durchgeführt, um ein besseres Verständnis der wirklichen Temperatur zu erreichen. Wenn die Flüssigkeit für 24 Stunden ohne Umwälzung im Behälter gelassen wurde, stieg die Flüssigkeitstemperatur nahe der Oberkante auf etwa 20°C. Die Flüssigkeit in der Mitte des Tanks stieg ebenfalls leicht an (&Dgr;T von ~3°C), während die im Konus des Tanks nahe der ursprünglichen 4°C blieb.

Durch Einbringen einer leichten Umwälzung durch die Injektion von Kohlendioxid bei einer Flussrate von 0,133 cm3/Stunde war es möglich, die Temperatur der Würze im Aufbewahrungsbehälter bei 4°C zu halten. Als Ergebnis dieser Befunde wurden beide Würzeaufbewahrungsbehälter an der Basis des Konus mit einer hygienischen Verrohrung mit Durchmesser 2,54 cm ausgestattet, die zur Würzeumwälzung verwendet wurde.

Nachfolgend wurde unbelüftete Würze von der Anlage von Labatt London durch die 5,08 cm-Edelstahl-Rohrleitung in einen Puffertank transferiert. Aus diesem Tank wurde die Würze über einen Blitz-Pasteurisierungsapparat in einen der Würzeaufbewahrungstanks (WT1 oder WT2) geleitet, wo sie für bis zu 2 Wochen bei 2°C gelagert wurde. Dieser Pasteurisationsschritt wurde als eine Vorsichtsmaßnahme eingerichtet, um sicherzustellen, dass unerwünschte Mikroorganismen während der gesamten Aufbewahrungszeit aus der Würze eliminiert waren. Die Beschädigung der Heißwürze durch Sauerstoff (Bildung von Alterungsaldehyden) würde durch Verwenden nicht-Sauerstoff-angereicherter Würze minimiert werden. Zusätzlich könnte daher die mit dem Einblasegas eingebrachte Luft die Beherrschung von Sauerstoff in den Fermentern genau erfüllen.

Messungen des gelösten Sauerstoffs wurden durchgeführt, sobald die Würze im Würzeaufbewahrungsbehälter war. Figur 5.9 zeigt die drei Transferprotokollen folgende Konzentration von gelöstem Sauerstoff der Würze über der Zeit. Im ersten Fall wurde Würze in den Aufbewahrungsbehälter transferiert, und das Einblasen von Kohlendioxid wurde gestartet (0,085 m3/h), um einwandfreie Temperatursteuerung sicherzustellen. Die Konzentration des in der Würze gelösten Sauerstoffs stieg während des ersten Tages an, um etwa 1,3 mg/l zu erreichen, und wurde danach auf ungefähr 0,1 mg/l ab dem 5. Tag reduziert. Im zweiten Versuch wurde der Würzeaufbewahrungsbehälter für 3 Stunden mit 0,85 m3/h Kohlendioxid vor dem Füllen gespült. Die anfängliche Sauerstoffaufnahme war stark reduziert, und Würze, die innerhalb des gewünschten Sauerstoffgehalts (< 0,1 mg/l) war, wurde in 2 Tagen erreicht.

Im letzten Versuch wurde der Tank wie oben vorgespült und während des Füllvorgangs, wie auch während der Aufbewahrungsdauer, wurde eine kontinuierliche Kohlendioxideinblasung (0,085 m3/h) eingeleitet. Der Gehalt an gelöstem Sauerstoff wurde während der gesamten Aufbewahrungsphase auf einem Minimum (< 0,1 mg/l) gehalten. Dieses Verfahren wurde folglich als das Protokoll für alle zukünftigen Würzesammlungen angenommen.

5.1.2 Reinigungs- und Sterilisationsprotokoll

Die Würzeaufbewahrungstanks wurden einem Reinigungszyklus, bestehend aus einer Vorspülung mit heißem Wasser (85°C), einer alkalischen Reinigungsspülung (40%ige Lauge bei 60°C), gefolgt von einer Nachspülung mit heißem Wasser (85°C), unterzogen. Desinfektion dieser Behälter wurde durch Kontaktieren der Wände mit einer Peressigsäurelösung (2% G/V) erreicht. Auch die Verrohrung für den Würzetransfer durchlief das gleiche Reinigungs- und Desinfektionsregime.

Die 50 l-Bioreaktoren folgten einem unterschiedlichen Reinigungs- und Sterilisationsprotokoll. Die Systeme wurden mit heißem Wasser (60°C) gespült und dann bis oben mit 40°C warmem Wasser gefüllt. Dann wurde zu diesem Wasser ein industrielles Reinigungsmittel, Diversol CX/A (DiverseyLever, Kanada), zugegeben, um eine Lösung mit 2% G/V zu ergeben. In den Boden des Reaktors wurde Luft bei einer Oberflächengeschwindigkeit des Gases von 5 mm/s eingeblasen, um einwandfreies Auflösen und einwandfreies Kontaktieren im Reaktor sicherzustellen. Nach einer Stunde Kontaktzeit wurde der Reaktor geleert und mit frischem Stadtwasser gespült. Diese Reinigungsprozedur wurde ein zweites Mal wiederholt, gipfelnd in zwei abschließenden Füllungs-Entleerungszyklen mit kaltem Stadtwasser.

Der Abfallbierbehälter wurde unter Verwendung einer 2% G/V Diversol CX/A-Lösung gereinigt. Im Gegensatz zu den Gasliftbioreaktoren wurde kein Einblasen angewandt, da der WBT nicht mit einem Einblaserohr ausgestattet war. Durch Rollen dieses Behälters auf seiner Seite wurde mechanische Bewegung bewerkstelligt. Dieser Zyklus wurde zweifach wiederholt und wurde von zwei Füllungs-Entleerungszyklen mit Wasser gefolgt.

Vor Dampfsterilisation wurden die 50 l-Bioreaktoren mit dem Abfallbierbehälter verbunden, und die Würzespeiseleitung war, wie auch die Gaseinblaseleitung, unterbrochen. Ventile V10, V11, V12, V13, V14, V15, V16, V17 und V18 wurden geöffnet, und Filter F5, F6 und F7 wurden entfernt. Diese Gasleitungen und Filter wurden separat für 15 Minuten bei 121°C autoklaviert. Die Dampfversorgung wurde mit Ventilen V12 und V16 verbunden. Das Dampfventil wurde langsam geöffnet, um Schaden an den Ausrüstungsgegenständen zu minimieren, und die Temperatur im Reaktor wurde genau überwacht. Sobald eine interne Temperatur von 100°C erreicht war, wurde eine 1-stündige Sterilisation durchgeführt. Als Erstes wurden Ventile V10, V11, V14, V15 und V18 geschlossen. Die Dampfversorgung wurde dann abgesperrt, und sterilisierter Filter F7 wurde angeschlossen. Die sterilisierten Filter F5 und F6 wurden unverzüglich mit der Gasversorgungsleitung verbunden, und eine Oberflächengeschwindigkeit des Kohlendioxidgases von 3 mm/s wurde begonnen. Dieser Gasstrom stellte nicht nur sicher, dass die Reaktoren nicht während des Abkühlens kollabieren würden, sondern ersetzte auch jegliche in den 50 l-Gasliftbioreaktoren vorhandene Luft.

Die Würzespeiseleitung wurde mit dem Bioreaktor verbunden, nachdem eine interne Temperatur von 20°C erreicht war. Die Dampfversorgung wurde abhängig von der verwendeten Würzeversorgung bei Ventilen V2, V5, V10 und V14 noch in der geschlossenen Stellung und bei offenen Ventilen V6, V7, V8, V9, V11 und V15, entweder an V3 oder V6, angeschlossen. Der Dämpfungszyklus dauerte 1 Stunde, nach dieser Zeit wurden Ventile V9, V11 und V15 gleichzeitig mit der Dampfversorgung abgesperrt. Sobald diese Leitungen Raumtemperatur (20°C) erreicht hatten, wurden Ventile V3 und V6 geschlossen, und die Dampfversorgung wurde abgetrennt. An diesem Punkt war das gesamte kontinuierliche Fermentationssystem, einschließlich der Würzeversorgung, der 50 l-Bioreaktoren und des Abfallbiertanks sterilisiert und bereit zur Fermentation.

5.1.3 Fermentationsprotokoll

Die Gaslift-Leitrohr-Bioreaktoren in 50 l-Pilotmaßstab wurden für die kontinuierliche primäre Fermentation (Hauptgärung) von Brau-Würze zu Bier verwendet. Ein Glykol-Thermomantel sorgte für Temperatursteuerung mit einer Flüssigkeitstemperatur von 15°C, auf die während der Fermentationsversuche abgezielt wurde. Jeder Reaktor war mit einem Temperaturfühler für Messzwecke und einem Temperatur-Thermoelement und einem Glykol-Magnetventil zur Einstellung von Glykolzufuhr zum Reaktor ausgestattet. Die Gasliftfermenter waren auch mit einer Primärmischungsgas- (Kohlendioxid oder Stickstoff) wie auch einer Luftversorgung zur Sauerstoffdosierung ausgestattet. Die gewünschte Mischung von Gas wurde ausgewählt durch Einstellen der entsprechenden Rotameter/Nadelventil-Kombination und dann Leiten dieser Gasmischung durch den Sterilfilter (Millipore, Millex®-FG50, 0,2 &mgr;m Filtereinheit) und in das Leitrohr des Bioreaktors. Eine Oberflächengeschwindigkeit der Luft von 0,39 mm/s (0,4 scfh) wurde bei all den Fermentationen in den Reaktor injiziert, während die Primärmischungsgas-Flussrate angepasst wurde, um zum spezifischen Immobilisierungstyp zu passen.

Der 50 l-Gasliftbioreaktor folgte einem traditionellen Chargenbeginn, bevor eine kontinuierliche Betriebsweise gestartet wurde. Nach Reinigung und Sterilisation, wie in Abschnitt 5.1.2 beschrieben, wurde der Gasliftbioreaktor mit 50 l Würze aus den Würzeaufbewahrungstanks (WT1 oder WT2) gefüllt, und dann wurden 200 g Hefe (4 g/l) durch den sterilen Scandi-Brew®-Probenstutzen injiziert. Im Falle von &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchen wurden 20 l Kügelchen, die eine Anfangskonzentration von 4 Gramm pro Liter mittelflockender LCC3021-Hefe ergeben, in den Reaktor injiziert. Aus den Bioreaktoren wurden täglich Proben entnommen, und die Entwicklung von Diacetyl und spezifischem Gewicht der Flüssigkeit wurden genau überwacht. Sobald das spezifische Gewicht seinen Minimalwert erreicht hatte und die Diacetylkonzentration unter 30 &mgr;g/l gefallen war, wurde angenommen, dass das System in kontinuierlichen Betrieb gesetzt werden konnte. Das Fermentationsmedium (Würze) wurde kontinuierlich durch den Boden des Reaktors eingespeist, während "grünes" Bier (Jungbier) durch den Trichter am Oberteil des Reaktors überlief. Da das Arbeitsvolumen des Reaktors festgelegt war, steuerte Auswählen der Flussrate der Frischwürze-Einspeisung in den Reaktor die mittlere Flüssigkeitsverweilzeit. Sowohl für chemische wie auch für mikrobiologische Analysen (Methoden beschrieben in Kapitel 4) wurden dem Reaktor täglich am Auslauf durch das sterile Probenahmeventil (Scandi-Brew®) Flüssigkeitsproben entnommen.

Produkt der kontinuierlichen Fermentation wurde an ausgewählten Zeiträumen in größeren Mengen (sterile 40 l-Edelstahlkanister) gesammelt und Nach-Fermentationsbehandlung unterzogen, um ein fertiggestelltes verkaufsfähiges Bier zur Bewertung und zum Vergleich mit industriell hergestelltem Kontrollbier herzustellen. Der ausgewählte 50 l-Bioreaktor wurde vom Abfallbierbehälter abgetrennt und sofort mit dem Biersammelbehälter verbunden. Sobald die gewünschte Flüssigkeit aufgesammelt worden war, wurde der Bioreaktor wieder mit dem Abfallbierbehälter verbunden. Um den Diacetylgehalt der Flüssigkeit unter 30 &mgr;g/l zu reduzieren, wurde das gesammelte „grüne" Bier bzw. Jungbier einer Nach-Fermentations-Aufbewahrungszeit unterworfen. Es wurde der mit der Flüssigkeit verschleppten Hefe ermöglicht, sich abzusetzen und die Flüssigkeit (Zellkonzentration von ~1–5 Millionen Zellen/ml) wurde zur Alterung (7 Tage bei 2°C) im Kühllager platziert. Nach der Alterungsperiode wurde die Flüssigkeit filtriert, auf 5 Vol.-% Alkohol verdünnt und vor dem Abpacken in 341 ml-Bierflaschen carbonisiert. Die abgepackte Flüssigkeit wurde dann einer Pasteurisation durch Labatt-Anlagenausstattung unterzogen.

5.2 KONTINUIERLICHES GELKÜGELCHEN-HERSTELLUNGSVERFAHREN

Das Ziel dieses Abschnitts experimenteller Arbeit war es, ein kontinuierliches Kügelchenherstellungsverfahren zur Herstellung von Hefe-inokulierten Gelkügelchen zu beurteilen und immobilisierte LCC3021-Hefezellen für die in Abschnitt 5.1 beschriebenen kontinuierlichen 50 l-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktoren bereitzustellen.

Das Herstellungsverfahren (8) bedingte zunächst die Bildung einer Emulsion zwischen der nicht-wässrigen kontinuierlichen Phase (Pflanzenöl) und der wässrigen dispergierten Phase (&kgr;-Carrageenan-Gellösung gemischt mit Hefezellen) unter der Verwendung statischer Mischer. Diesem Schritt folgte schnelle Abkühlung, um Polymergelbildung zu induzieren. Die gebildeten Kügelchen wurden dann in eine Kaliumchloridlösung eingebracht, die sowohl Härtung wie auch Trennung der Kügelchen in der Ölphase förderte.

Die Bildung der &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchenemulsion wurde in einem Temperaturgeregelten Wasserbad mit 37°C durchgeführt, um vorzeitiges Gelieren des Carrageenan-Gels zu verhüten. Das sterilisierte Polymer wurde in einem Temperatur-geregelten Wasserbad auf 37°C gehalten, und das Hefe-Inokulum wurde vor der Immobilisierung bei 20°C gehalten. Das Gel und der Hefebrei wurden unter Verwendung von peristaltischen Masterflex-Pumpen (Cole Parmer Company, USA) durch 24 Elemente des statischen Mischers mit 6,4 mm Durchmesser gepumpt, um die Zellen gleichmäßig im Gel zu verteilen. Das bei Raumtemperatur gelagerte sterilisierte Öl wurde in das Heißwasserbad gepumpt (peristaltische Masterflex-Pumpe), um ebenfalls eine Temperatur von 37°C zu erreichen.

Das inokulierte Polymer (wässrige Phase) wurde dann mit dem Öl (kontinuierliche Phase) durch eine weitere Serie statischer Mischer gemischt, um die gewünschte Emulsion zu schaffen. Die resultierende Emulsion wurde in einem Wasser-Eis-Bad schnell auf 5°C abgekühlt, was Gelieren der Polymertropfen zu Kügelchen hervorruft. Die Kügelchen gingen dann in eine sterile Kaliumchloridlösung (22 g/l) weiter, die ihrer Härtung half und ihre Trennung von der Ölphase ermöglichte. Das Verfahrensöl wurde in das Verfahren zurückzykliert, und die wässrige Phase (Kügelchen und Kaliumchloridlösung) wurden vor dem Laden in die 50 l-Bioreaktoren zur Größenklassierung in einen separaten Tank transferiert.

5.2.1 Statischer Mischer – Kenics-Typ

Das Herz dieses neuen Kügelchenherstellungsverfahrens sind statische Kenics-Mischer (Cole Parmer Instrument Company, Niles, Illinois, USA). Sie sind aus einer Reihe stationärer Elemente, platziert in einem Rohr mit einem Innendurchmesser, gleich dem der statischen Mischerdurchmesser, zusammengesetzt. Diese Elemente bilden gekreuzte Kanäle, die die Teilung und die longitudinale Wiedervereinigung der durch den statischen Mischer fließenden Flüssigkeit fördern. Die transversale Trennung dieser genau geschaffenen Stromlinien in eine zunehmend homogene Emulsion wird durch dieses Mischungssystem zudem bewirkt. Tabelle 5.2 listet die drei Typen statischer Mischer auf, die in dieser Studie verwendet wurden.

5.2.2 Materialien zur Gelherstellung

Die zwei hauptsächlichen Materialien in der Herstellung der Gelkügelchen waren das Öl und Polymer. &kgr;-Carrageenan (Typ X-0909, Charge 330360, Copenhagen Pectin, Dänemark), ein aus Rotalgen extrahiertes Polysaccharidpolymer, war eine großzügige Spende von Copenhagen Pectin A/S. Dieses Polymer besitzt die einzigartige Eigenschaft der Thermogelierung, wobei seine Gelbildungstemperatur von den Konzentrationen von sowohl &kgr;-Carrageenan ([Car]) als auch von Kaliumchlorid ([KCl]) abhängt. Das Polymer wurde zu einer Konzentration von 30 g/l in destilliertem Wasser bei 80°C, enthaltend 2,0 g/l KCl, gelöst. Die resultierende Gellösung hatte eine Gelbildungstemperatur von 28°C. Das Gel wurde für 1 Stunde bei 121°C autoklaviert und anschließend in ein 40°C-Wasserbad gestellt, so dass es nicht aushärten würde. Maisöl handelsüblicher Qualität (Pasquale Bros. Inc., Kanada) wurde ebenfalls für 1 Stunde bei 121°C sterilisiert und dann bei Raumtemperatur (20°C) bis zu seiner Verwendung gelagert. Ein Hefebrei wurde wie in Abschnitt 4.1 beschrieben vorbereitet.

5.2.3 Messung des Kügelchendurchmessers

Kügelchenproben wurden am Auslauf des 5°C-Wärmeaustauschers in Kolben, enthaltend 100 ml 22 g/l KCl-Lösung, gesammelt. Den Kügelchen wurde es ermöglicht, in dieser Lösung für 2 Stunden zu wässern, um ihre Härtung zu fördern. Durch schrittweise Waschungen mit Kaliumchloridlösung wurde das Öl aus der restlichen Phase entfernt. Die Proben wurden dann bei 4°C gelagert, um mikrobiologischer Kontamination vor der Analyse vorzubeugen.

Die Messung des Kügelchendurchmessers wurde unter Verwendung der Bildanalysen-Software Optimas (Version 4.02, BioScan, Inc., USA), verknüpft mit einer Videokamera (Pentax Macro 50 mm), durchgeführt. Eine Kügelchenprobe wurde in eine einen Feinwasserfilm- (verwendet, um die Kügelchen zu separieren) enthaltende Petrischale überführt und dann unter der Kamera platziert. Eine Gesamtzahl von 300 bis 400 Kügelchen wurde unter Verwendung dieses Systems vermessen. Die Fähigkeiten der Optimas-Software liegen zwischen 100 &mgr;m und etlichen mm mit einem maximalen absoluten Fehler von 30 &mgr;m. Die von Optimas erhaltenen Daten wurden unter Verwendung von Microsoft Excel weiter analysiert. Die resultierenden Probengrößenverteilungen wurden durch ihren mittleren Probendurchmesser (DB) und Variationskoeffizient (COV) charakterisiert.

5.2.4 Kügelchensystembewertung – Versuchsplan

Eine Gesamtzahl von 3 Durchmessern (DS = 6,4 mm, 9,5 mm und 12,7 mm) statischer Mischer wurden verglichen, um festzustellen, welcher Typ von Kügelchenpopulation, gemessen am mittleren Kügelchendurchmesser und Variationskoeffizienten der Größenverteilung der Probe, hergestellt würde. Die Anzahl statischer Mischelemente (NS) wurde zwischen 12 und 120 Elementen variiert, während der Polymervolumenanteil (&egr;C) zwischen 8,3% V/V und 50% V/V Gel in Öllösung untersucht wurde. Über einen &egr;C von 50% wurden die dispergierte (Gel) und kontinuierliche (Öl) Phase umgekehrt, d.h., Öltröpfcheneinschluss innerhalb der Polymermatrix ergab sich statt Geltröpfchen innerhalb der Ölmatrix. Die Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit der Öl/Gel-Emulsion durch die Emulsionssektion wurde im Bereich von 3,6 cm/s und 17,8 cm/s eingestellt. Die Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit (VSL) durch den statischen Emulsionsmischer wurde mittels der folgenden Gleichung berechnet: VSL = (QÖl + Qcar)/S wobei S die Querschnittsfläche der Rohrleitung, die den statischen Mischer enthält, ist, QÖl ist die volumetrische Flussrate der Ölphase und Qcar ist die volumetrische Flussrate der Carrageenan-Gellösung.

ERGEBNISSE UND DISKUSSION: FERMENTATIONS- UND MISCHUNGSDYNAMIKEN IN 50 l-GASLIFTBIOREAKTOREN

Die Verwendung immobilisierter Zellen zur Herstellung von Ethanol ist publiziert worden. In den letzten zwei Dekaden haben Forscher versucht, die Ethanolherstellungsverfahren durch Kuppeln der Technologie immobilisierter Zellen mit kontinuierlichem Betrieb zu optimieren (Kuu, 1982; Gil, 1991; Maiorella, 1983). Viele fanden großen Erfolg, und die Verwendung kontinuierlicher System-immobilisierter Zellen zur Ethanolproduktion ist industriell geworden. Die Implementierung solch eines kontinuierlichen Verfahrens für die primäre Fermentation von Bier in der Brauindustrie ist jedoch nicht so einfach. Bier besteht nicht nur aus Ethanol, sondern auch aus einer Myriade von Aromaverbindungen, die dem Endprodukt sowohl Komplexität als auch Tiefe hinzufügen. Die folgenden Kapitel beschreiben die vom Autor im Bestreben, ein ausgewogenes Bier im pilotmaßstäblichen GLDT-Fermenter herzustellen, erhaltenen Ergebnisse.

6.1 CHARGENFERMENTATIONEN IN DEM PILOTMASSSTÄBLICHEN GLDT-SYSTEM

In dem pilotmaßstäblichen 50 l-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor wurden chargenweise Fermentationen unter Verwendung frei suspendierter Hefezellen durchgeführt. Diese Versuche boten die Möglichkeit, die Machbarkeit der Verwendung solch eines Systems für die Fermentation von Würze zu Bier zu beurteilen. Zusätzlich dienten diese Versuche dazu, eine Richtgröße für zukünftigen Vergleich mit kontinuierlichen Fermentationsflüssigkeiten zu ermitteln. In dem 50 l-Bioreaktor wurden zwei chargenweise Fermentationen unter Verwendung eines Lager-Hefestamms aus der Labatt-Culture-Collection (LCC3021) unternommen. Die Hefe-Wachstumsrate, wie auch der Verbrauch von Nährstoffen und die Freisetzung von Produkten, wurden während der Fermentationen überwacht.

Figuren 6.1 und 6.2 zeigen die Hefekonzentrations- und Lebensfähigkeitsprofile für Chargenfermentation 1 bzw. 2. In beiden Fällen folgte das Hefewachstum den in der Literatur berichteten klassischen Raten. Lebensfähigkeiten, gemessen durch Methylenblau, blieben durchwegs hoch, mit Werten, die nahe 90% blieben. Die Kohlenhydratkonzentrationsprofile für Charge 1 und 2 sind in Figuren 6.3 und 6.4 wiedergegeben. Die einfachen Zucker, Glucose und Fructose wurden durch die Hefe zuerst aufgenommen, gefolgt von Verbrauch von Maltose und Maltotriose. Die Konzentrationen der Maltotetrose, wie auch der größeren Polysaccharide, blieben durch die Fermentation unverändert. Ethanol ist eines der wichtigsten Nebenprodukte des Hefemetabolismus. Eine optimierte anaerobe Fermentation wird etwa 48 g Ethanol und 47 g Kohlendioxid pro 100 g metabolisierter Glucose ergeben. Es werden auch kleine Mengen von Glycerin gebildet werden (3,3 g pro 100 g Glucose), da dieses Nebenprodukt am Erhalt des Redoxgleichgewichts in der fermentierenden Hefe beteiligt ist, wie auch an der Unterstützung der Zelle in ihrem osmotischen Gleichgewicht, insbesondere in hypertonischen Medien. Figuren 6.5 und 6.6 zeigen die Entwicklung der Ethanol- und Glycerinkonzentrationen während der Fermentationszeit. Die Ethanolkonzentrationen steigen am Beginn der Fermentation sehr langsam, da die Hefezellen aufgrund der Anwesenheit von Sauerstoff im Fermentationsmedium in ihrer aeroben Wachstumsphase sind. Sobald der Sauerstoff verbraucht worden ist, steigen Ethanolkonzentrationen exponentiell an, bis die fermentierbaren Zucker verbraucht sind, an diesem Punkt pendeln sich die Konzentrationen ein. Vizinale Diketone sind ebenfalls sehr wichtige Nebenprodukte des Hefemetabolismus. Die Gesamtdiacetyl- und Pentandion-Konzentrationen der Chargen 1 und 2 sind in Figuren 6.7 und 6.8 wiedergegeben. Diese Verbindungen stiegen, entsprechend zu den Spitzenwerten der Hefekonzentration, bis ungefähr 40 Stunden in die Fermentation hinein und sind ein Ergebnis der Aminosäuresynthesen, die Hefe während ihrer Wachstumsphase durchführt. Während des letzten Teils der Fermentation werden Diacetyl, Pentandion und ihre Vorläufer &agr;-Acetolactat und &bgr;-Ketobutyrat durch die Hefe in ihre entsprechenden weniger aromaaktiven Diole umgewandelt. Aufgrund der in diesem Abschnitt gezeigten Ergebnisse schien es, dass die zwei chargenweisen Fermentationen im Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor normal verliefen. Hefewachstum und Kohlenhydrataufnahme folgten den erwarteten Faden, was auch die Nebenprodukte Ethanol, Diacetyl und Pentandion taten. Ein Vergleich der individuellen Chargendaten zeigt, dass die zwei Chargen in sehr ähnlicher Weise fermentierten. Figur 6.9 vergleicht die Ethanolkonzentration der Chargen 1 und 2. Die individuellen Kurven folgen mit vielen einander überlappenden Datenpunkten dem gleichen Profil, was einen Grad der Wiederholbarkeit zeigt. Obwohl die Folge des Verbrauchs von Substraten und nachfolgender Ertrag an Produkten sich in dem Gasliftsystem nicht änderten, tat dies die Fermentationsrate. Der Abschluss der primären Fermentation, repräsentiert durch die Spitzenkonzentration von Ethanol, wurde in beiden Chargen bei etwa 80–85 Stunden erreicht. Diacetyl-Reduktion unter 30 &mgr;g/l wurde in zusätzlichen 20 Stunden erreicht. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass primäre Fermentation von high gravity-Würze in etwa 100 Stunden abgeschlossen sein könnte, im Vergleich zu 120–168 Stunden bei traditioneller chargenweiser Lager-Fermentation. Die durch den Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor bereitgestellte Umwälzung trug durch den durch solche Systeme ermöglichten gesteigerten Massentransfer zu dieser Abnahme der Fermentationszeit bei. Mit dieser Information wurden zukünftige Fermentationsversuche vertrauend darauf durchgeführt, dass der Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor den Fermentationsmetabolismus der Hefe nicht signifikant änderte und das Fermentieren mit frei suspendierter Hefe die Chargenfermentationszeit in diesem System um wenigstens 20 Stunden verkürzen konnte.

6.2 IMMOBILISIERUNGSTRÄGERSTOFFE

Etliche Trägerstoffe wurden während dieses Forschungsprojekts erforscht, um die für zukünftige Entwicklungsarbeit vielversprechendsten Alternativen zu identifizieren. Drei unterschiedlichen Weisen der Immobilisierung wurden in dem 50 l-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor getestet. Zwei kommerziell verfügbare Adsorptionsträgerstoffe mit zwischen 1 und 2 mm rangierenden Größen wurden bewertet. Siran®, ein von Schott Engineering gelieferter Glaskügelchen-Trägerstoff (9), und Celite®, ein durch World Minerals zur Verfügung gestelltes Kieselgur-Kügelchen (10), wurden wegen seiner zugesagten Leichtigkeit der Handhabung und seiner kommerziellen Verfügbarkeit getestet. Adsorptions-basierte Trägerstoffe bieten die Möglichkeit zu aseptischerem Betrieb, da der Reaktor zuerst mit dem Trägerstoff beladen werden kann, gefolgt von Sterilisation am Platz, und schließlich Inokulation von Hefe direkt in den Reaktor. Von einem industriellen Standpunkt her ist diese Option sehr attraktiv, da der Trägerstoff keine spezielle Lagerung erfordern würde und die Anlage ihre Inokulationspraktiken nicht signifikant zu ändern haben würde.

Die anfänglichen Fermentationsergebnisse mit beiden dieser Trägerstoffe im 50 l-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor waren unvorteilhaft. Die Probleme, die auftraten, lagen hauptsächlich an den hohen Partikeldichten von Siran® und Celite im Vergleich zum Flüssigmedium. Drei-Phasen-Gaslift-Leitrohr-Systeme arbeiten am besten, wenn das Verhältnis der Trägerstoff- und der Flüssigkeitsdichten nahe 1 gehalten wird. Im Fall von Siran® war das Verhältnis 1,34, wohingegen das Verhältnis für Celite® 1,31 war. Ein signifikanter Anstieg der zum Betreiben des 50 l-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktors erforderlichen minimalen Fluidisationsgasgeschwindigkeit war die Folge des Auftretens solch hoher Dichteunterschiede zwischen der Feststoff- und Flüssigphase. Für 4 Liter Siran®-Trägerstoff (8% V/V) Feststoffbeladung war eine Gasgeschwindigkeit von 21,5 mm/s (basierend auf Leitrohrdurchmesser) erforderlich, um Umwälzung zu erreichen. Diese höhere Gasgeschwindigkeit war nicht ein signifikantes Problem, wenn das Testen in einer Wasserlösung durchgeführt wurde, sobald jedoch das Flüssigmedium Würze war, trat in dem Gaslift-Leitrohr-(GLDT)-System katastrophales Fehlverhalten auf. Die erforderliche Gasgeschwindigkeit bewirkte exzessives Schäumen im Reaktor, das schlussendlich den Flüssigkeitsspiegel bis unter das Leitrohr absenkte, was Flüssigkeits- und Feststoff-Umwälzung wirksam stoppt. Fehlverhalten, das dem bei Siran® angetroffenen gleich war, trat auf, als Celite® stattdessen als das Immobilisierungsmaterial eingesetzt wurde. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden beide dieser Adsorptions-basierten Trägerstoffe in dem zukünftigen Gaslift-Fermentationsversuchen aufgegeben.

Verwenden eines Einschluss-basierten Trägerstoffs, wie &kgr;-Carrageenan, erlaubt es dem System, auf einer 40% (V/V)-Basis mit Feststoff beladen zu sein und erforderte etwa 0,17 Standardkubikmeter pro Stunde Gas (5,8 mm/s oberflächliche Gasgeschwindigkeit) zu seiner Fluidisation und nachfolgenden Umwälzung. Die durch Betreiben des Systems mit Kügelchen Carrageenan-eingeschlossener Hefezellen wahrgenommenen positiven Ergebnisse lagen an der niedrigeren Dichte des Trägerstoffs (etwa 1100 kg/m3) und der folglichen Leichtigkeit der Fluidisation. Gleichermaßen wurden gewünschte Feststoffbeladungen mit der selbstaggregierenden Hefe LCC3021 (mittelflockend) und LCC290 (superflockend) bei den zum Sichern einwandfreier Umwälzung erforderlichen Fluidisationsgasgeschwindigkeiten von ungefähr 3 mm/s erreicht. Abschnitt 6.2.1 beschreibt den &kgr;-Carrageenan-Gelträgerstoff detaillierter, und Abschnitt 6.2.2 beschreibt die selbstaggregierende Hefe, LCC3021-Flocken und LCC290-Flocken, die als Immobilisierungsmatrizes für kontinuierliche primäre Fermentation im 50 l-GLDT-Fermenter bewertet wurden.

6.2.1 &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchen

Einschluss-basierte Immobilisierungsverfahren erfordern die Inklusion von Hefezellen in die Matrix vor ihrer Einführung in den Fermentationsbehälter. Da Reaktorinokulation in situ zu dieser Zeit nicht machbar ist, ist es nötig, diese Gelkügelchen vor dem Beginn der Fermentation herzustellen. Es ist nicht klar, welche Effekte Langzeitlagerung auf inokulierte Gelkügelchen hat. Es wurde entschieden, große Mengen von Gelkügelchen in einem kurzen Zeitabschnitt (8 Stunden) herzustellen, um jegliche mögliche negativen Lagerungseffekte zu minimieren. Das in Abschnitt 5.2 beschriebener statische Mischer-Kügelchen-Verfahren wurde deshalb für diesen Zweck verwendet. Die idealen Kügelchen hätten Partikeldurchmesser (DB) zwischen 0,8 mm und 1,4 mm mit auf einem Minimum gehaltenen Variationskoeffizienten (COV) der Größenverteilung. Um die gewünschte Menge und Konsistenz der Kügelchen herzustellen, war es nötig, etliche Parameter des Kügelchenherstellungsverfahrens anzupassen. Der folgende Abschnitt stellt eine Zusammenfassung der Parameterauswahl des Kügelchenverfahrens dar, und Abschnitt 6.2.1.2 beschreibt die in den kontinuierlichen Fermentationsversuchen verwendeten Kügelchen.

6.2.1.1 Kügelchenherstellungsverfahren: Auswahl von Variablen

In Zusammenarbeit mit anderen Forschern wurde die Charakterisierung des Kügelchenherstellungsverfahrens mit Betonung der folgenden Prozessparameter unternommen: Durchmesser des statischen Mischers (DS), Anzahl statischer Mischelemente (NS), oberflächliche Flüssigkeits-Strömungsgeschwindigkeit (VSL) und Polymervolumenanteil (&egr;C). Figuren 6.12 bis 6.21 fassen die durch Experimentieren erhaltenen Ergebnisse zusammen.

Figur 6.12 veranschaulicht eine unter Verwendung des statischer Mischer-Verfahrens zur Immobilisierung von Hefe im Carrageenan-Gel erhaltene typische Größenverteilung. In diesem Beispiel wurden die folgenden Parameter verwendet: Durchmesser des statischen Mischers von 12,7 mm, 60 statische Mischelemente, oberflächliche Flüssigkeitsgeschwindigkeit von 10,5 cm/s und Polymervolumenanteil von 0,25. Der mittlere Kügelchendurchmesser wurde gemessen bei 701 &mgr;m mit einem Variationskoeffizienten von 45%. Die in Figur 6.13 dargestellte kumulative Größenverteilung schien einer mit dem Mittelwert und der Standardabweichung der Probe berechneten normalen kumulativen Verteilung angepasst zu sein. Das de Kolmorogof-Smirnov-Verfahren (Schaeffer et McClave, 1990) wurde verwendet, um die Normalität zu testen. Die maximale Distanz zwischen den Versuchsdaten und den angepassten Daten (K-S-Statistik D) wurde zu 0,0274 berechnet. Der sich auf einer Normalverteilung folgenden Daten beziehende modifizierte D-Wert muss bei einem 95%-Konfidenzniveau unter 0,895 liegen. In unserem Fall wurde der modifizierte D-Wert mit 0,174, deutlich unterhalb des Limits von 0,895, berechnet, und es kann gefolgert werden, dass unsere Daten einer Normalverteilung angepasst sind. Alle in diesem Kügelchenherstellungsverfahren gesammelten Daten zeigen Größenverteilungen mit nur einem Gipfel. Poncelet et al. (1992) zeigten jedoch das Auftreten von Satellitengipfeln und/oder eines sekundären Gipfels, entsprechend Kügelchen mit Durchmessern kleiner als 200 &mgr;m bei durch Dispersion in einem Rührtank hergestellten Alginatkügelchen. Es ist möglich, dass die in unserem Verfahren hergestellten kleineren Kügelchen einfach während des Kügelchen-Waschschritts verloren gingen und deshalb nicht in unseren Größenverteilungsdaten auftreten würden.

Die Auswirkungen von Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit und Durchmesser statischer Mischer auf den durchschnittlichen Kügelchendurchmesser und auf den Variationskoeffizienten der Größenverteilung sind in Figuren 6.14 bzw. 6.15 abgebildet. Der mittlere Kügelchendurchmesser sinkt mit einer Steigerung der Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit bei allen drei Durchmessern statischer Mischer mit einer stärker ausgeprägten Auswirkung auf den statischen Mischer mit 12,7 mm. Mit den statischen Mischern kleineren Durchmessers (6,4 mm und 9,5 mm) wurden bei allen getesteten Flüssigkeitsgeschwindigkeiten keine Kügelchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser größer als 700 &mgr;m hergestellt, wohingegen der statische Mischer mit 12,7 mm Durchmesser bei Flüssigkeitsgeschwindigkeiten unter 11 cm/s Kügelchen herstellte, die größer waren als 700 &mgr;m. Alle drei Durchmesser statischer Mischer stellten Kügelchen mit Variationskoeffizienten zwischen 38% und 58% her. Es schien auch, dass der Variationskoeffizient in allen drei Fällen abnahm, wenn die Geschwindigkeit stieg. Der Variationskoeffizient variierte mit dem Durchmesser statischer Mischer, wobei die niedrigsten Werte mit dem statischen Mischer des niedrigsten Durchmessers erzeugt wurden.

Bei einer Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit von 3,5 cm/s schien der Polymervolumenanteil den durchschnittlichen Kügelchendurchmesser zu beeinflussen, während Geschwindigkeiten ab 7 cm/s relativ keine Unterschiede bei zwischen 0,083 und 0,5 variierenden Werten von &egr;C ergaben (Figur 6.16). Es schien wenig oder keine Auswirkungen des Polymervolumenanteils auf den Variationskoeffizienten mit steigenden Oberflächengeschwindigkeiten der Flüssigkeit zu geben (Figur 6.17).

Figuren 6.18 und 6.19 veranschaulichen die Auswirkungen der Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit und der Anzahl statischer Mischelemente auf den durchschnittlichen Kügelchendurchmesser. Als die Flüssigkeitsgeschwindigkeit anstieg, nahm der mittlere Kügelchendurchmesser bei allen Variationen der Anzahl statischer Mischelemente ab (Figur 6.18). Der durchschnittliche Kügelchendurchmesser war bei einer gegebenen Flüssigkeitsgeschwindigkeit für 24 Elemente bis 120 Elemente gleich, während die Konfiguration mit 12 Elementen größere Kügelchendurchmesser als die fünf anderen getesteten Konfigurationen ergab. Figur 6.19 zeigt auch, dass der durchschnittliche Kügelchendurchmesser bei über 24 statischen Mischelementen ein Minimum erreicht.

Figur 6.20 stellt die Wirkung der Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit auf den Variationskoeffizienten für etliche statische Mischelemente-Anzahlen. Die Auswirkung der Anzahl statischer Mischelemente auf den Variationskoeffizienten war stärker ausgeprägt (Figur 6.21). Der Variationskoeffizient nahm mit einer Steigerung der statischen Mischelemente ab und erreichte ein Minimum von 45% bei 60 Elementen und darüber. Diese Ergebnisse waren für sich zwischen 3,6 cm/s und 17,8 cm/s erstreckende Oberflächengeschwindigkeiten der Flüssigkeit konsistent.

Es ist vermutet worden, dass eine Steigerung des Durchmessers des statischen Mischers (DS) Heterogenität der Scherkräfte im Mixer schaffen würde, die eine durch den Variationskoeffizienten gemessene Erhöhung der Größenstreuung bewirkt. Gleichzeitig würde eine Erhöhung von DS die Intensität der Scherkräfte verringern und daher den mittleren Kügelchendurchmesser erhöhen. Beide dieser Effekte wurden in den Versuchen mit dem statischen Mischer kleinsten Durchmessers beobachtet, der Kügelchen mit dem geringsten durchschnittlichen Kügelchendurchmesser (400 &mgr;m–500 &mgr;m) und dem kleinsten (der kleinsten) Variationskoeffizienten (ungefähr 40%) oder Größenstreuung herstellte.

Die zum Schaffen einer Emulsion erforderliche Energie ist proportional zu der durch die Polymer- und die Ölphase geschaffenen Grenzfläche. Je kleiner die Kügelchengröße, desto größer die zur Bildung erforderliche Energie. Berkman und Calabrese (1988) haben gezeigt, dass ein Anstieg der durchschnittlichen Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit (VS) einen Anstieg der pro Einheitsmasse des Fluids dissipierten Energie hervorruft, und daher eine Reduktion der Kügelchengröße begünstigt. Ein Anstieg in der durchschnittlichen Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit (getestet zwischen 3,6 cm/s und 17,8 cm/s) ergab eine Verringerung der durchschnittlichen Kügelchengröße. Solch ein Geschwindigkeitsanstieg resultiert in einer Druckdifferenz zwischen dem Einlass und Auslass des statischen Mischers. Diese Druckdifferenz ist proportional zu der pro Einheitsmasse der Flüssigkeit dissipierten Energie. Ein Anstieg der Geschwindigkeit bewirkt daher einen Anstieg der dissipierten Energie des Systems, der eine Verringerung der Kügelchengröße begünstigt. Die Verringerung des Kügelchendurchmessers, DB, wurde beobachtet, als die Oberflächengeschwindigkeiten der Flüssigkeit stiegen. Al Taweel und Walker (1983) haben gezeigt, dass bei hohen, signifikanten Turbulenzgraden entsprechenden Geschwindigkeiten ein dynamisches Gleichgewicht zwischen der Bildung von Kügelchen und der Koaleszenz zwischen Kügelchen aufgebaut wird. Bei konstantem (konstanter) Durchmesser statischer Mischer (DS) und Anzahl an Elementen (NS) hatte die Oberflächengeschwindigkeit geringe Auswirkung auf den Variationskoeffizienten. Geschwindigkeit ist daher ein Parameter, der die Manipulation und Auswahl des durchschnittlichen Kügelchendurchmessers erlaubt, ohne die Größenstreuung signifikant zu modifizieren.

Im Rahmen dieser Forschung hatte der Carrageenan-Gel-Volumenanteil (&egr;C) entweder auf den durchschnittlichen Kügelchendurchmesser oder den Variationskoeffizienten geringe Auswirkungen, außer bei der niedrigsten untersuchten Geschwindigkeit von 3,6 cm/s, wo der durchschnittliche Kügelchendurchmesser mit einer Abnahme von &egr;C abnahm. Audet und Lacroix (1989) untersuchten diesen Parameter für die Herstellung von Carrageenan-Kügelchen in einem zweiphasigen Dispersionssystem (chargenweise gerührter Tank, nicht-kontinuierliches Verfahren mit statischem Mischer), und sie folgerten, dass &egr;C für eine Polymerlösung mit einer Carrageenan-Konzentration von 3% (G/V) keine Auswirkungen auf den mittleren Kügelchendurchmesser hatte. Die spezifische Auswirkung der &kgr;-Carrageenan-Gelkonzentration auf die Kügelchengrößenverteilung wurde von Audet und Lacroix (1989) untersucht, die zeigten, dass dieser Parameter die Größenverteilung stark beeinflusste. Steigende Gelkonzentrationen resultierten in steigendem durchschnittlichen Kügelchendurchmesser (DB) und Variationskoeffizienten (COV). Der bemerkte Effekt wurde der gesteigerten Viskosität des Gels bei höheren Konzentrationen, resultierend in niedrigeren Scherkräften auf die Emulsion, und daher größeren Kügelchen, zugeschrieben. Obwohl die Auswirkung der Gelkonzentration auf Kügelchengröße in dieser wissenschaftlichen Arbeit nicht untersucht wurde, könnte sie, falls nötig, als weiteres Mittel zum Steuern der Kügelchengröße verwendet werden.

Ein Anstieg der Anzahl von Mischelementen (NS) steigert die durchschnittliche Verweilzeit, die ein Flüssigkeitselement im statischen Mischer verbringt, was eine homogenere Mischung, und daher die Bildung kleinerer und enger verteilter („more tightly dispersed") Kügelchen bewirkt. In den Versuchen wurde um 60 bis 72 Elemente ein Gleichgewicht in der Dispersion (gemessen durch den Variationskoeffizienten) erreicht. Middleman (1974) hat gezeigt, dass 10 Elemente ausreichend waren, um solch ein Gleichgewicht im Fall von Emulsionen mit niedriger Viskosität (0,6 bis 1,0 cP) zu erlangen. Die in diesen Experimenten verwendete Carrageenan-Lösung [3% G/V] hatte eine durchschnittliche Viskosität von 200 cP, und die Viskosität des Öls war 25 cP. Folglich erforderte diese höhere Viskosität eine längere Verweilzeit im Mischer, um Pseudohomogenität zu erreichen.

6.2.1.2 Kügelchenherstellungsverfahren: Charakteristiken von &kgr;-Carrageenan-Kügelchen

Es war möglich, aus den im vorigen Abschnitt beschriebenen Daten Kügelchenherstellungs-Prozessparameter auszuwählen, um Kügelchen mit den für die Fermentationsversuche erwünschten Charakteristiken herzustellen. Um den Variationskoeffizienten für einen bestimmten Durchmesser des statischen Mischers zu minimieren, wurden 60 Mischelemente gewählt, um die Öl-Gel-Dispersion zu schaffen. Kügelchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr einem mm wurden ausgewählt, um äußeren Massentransport zu minimieren und die Abtrennung von der Fermentationsflüssigkeit durch mechanische Mittel zu erleichtern bzw. zu ermöglichen. Um dies zu erreichen, wurden der größte getestete statische Mischer (12,7 mm) und die niedrigste getestete Geschwindigkeit (3,6 cm/s) ausgewählt. Da der Polymeranteil geringe Auswirkung auf den Variationskoeffizienten hatte, wurde ein 50/50-Verhältnis (&egr; = 0,5) von Gel zu Öl eingesetzt, um Kügelchen-Produktivität zu maximieren.

In dem Labor wurden etliche Chargen von Gelkügelchen mit eingeschlossener LCC3021-Hefe unter Verwendung des in Abschnitt 5.2 beschriebenen Prozesses mit DS = 12,7 mm, NS = 60, VSL = 3,9 cm/s und &egr;C = 0,5 hergestellt. Die resultierenden Kügelchen (11) wurden durch eine Serie von Sieben geleitet, um Kügelchen größer als 2,0 mm und jene kleiner als 0,5 mm zu entfernen. Die resultierende Partikel-Größenverteilung ist in Figur 6.23 gezeigt. Figur 6.24 veranschaulicht die kumulative Größenverteilung dieser Kügelchen. Dies war die typische, während der 50 l-Gaslift-Fermentationsversuche verwendete Verteilung.

6.2.1.3 Beschränkungen des Kügelchenverfahrens im Hinblick auf Anwendungen in industriellem Maßstab

Ein 10 l-Kügelchen pro Stunde pro statischer Mischer („per static mixer") herstellendes Verfahren wurde entwickelt und auf einem Pilotanlagen-Niveau implementiert. Etliche Aspekte dieses Verfahrens erfordern weitere Entwicklung und/oder Optimierung, bevor Kügelchenherstellung in industriellem Maßstab in Erwägung gezogen werden kann. Eine Steigerung der volumetrischen Produktivität des Systems ist notwendig, um das zum Speisen eines großmaßstäblichen Bioreaktors erforderliche Volumen immobilisierter Zellen zu liefern. Z.B. würde ein 2000 hl-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor ungefähr 800 hl Kügelchen erfordern. Eine Steigerung beider Flüsse von Gel und Öl ist notwendig, um solche Volumina zu erhalten. Die Daten weisen darauf hin, dass die resultierende gesteigerte Geschwindigkeit unter Verwendung der statischen Mischer von 6,4 mm bis 12,7 mm Durchmesser die Bildung von Kügelchen induzieren würde, die zu klein sind, um im Fermentationssystem verwendet zu werden. Es wäre daher notwendig, die Durchmesser der statischen Mischer zu steigern, was daher den durchschnittlichen Kügelchendurchmesser steigert. Allerdings wird die Verwendung von statischen Mischern mit einem größeren Durchmesser auch die Kügelchengrößenstreuung steigern, was einen größeren Prozentsatz von Kügelchen außerhalb des erwünschten Bereichs ergibt.

Eine andere Alternative wäre die Implementierung eines parallel angeordnete statische Mischer mittlerer Größe (12,7 mm) verwendenden Systems. Mit einem System aus zehn statische Mischern sind 100 l/h erreichende Produktivitäten vorstellbar. Für das industrielle 2000 hl-Beispiel würde das Verfahren kontinuierlich für 800 Stunden oder ungefähr 34 Tage laufen, um das erforderliche Kügelchenvolumen herzustellen. Mehrere Systeme könnten implementiert werden, um die Produktionszeit zu reduzieren, aber dies würde noch einen weiteren Grad der Komplexität hinzufügen. Die Produktionszeit könnte weniger zur Frage stehen, wenn es möglich wäre, die Kügelchen für längere Zeitabschnitte unter Erhalt der Hefe-Lebensfähigkeit zu lagern. Es ist denkbar, dass ein Verfahren zum Trocknen der Kügelchen oder Lagern der Kügelchen in einem vakuumverschlossenen Container entwickelt werden könnte.

Poncelet und Mitarbeiter (1993) haben Arbeiten publiziert, die darauf hindeuten, dass der zum Bilden der Dispersion verwendete Typ des statischen Mischers in Betracht gezogen werden muss. Mit ihrem, im Gegensatz zu dem in dieser Forschungsarbeit verwendeten Kenics-Typ, einen anderen Typ von statischen Mischer verwendenden System kann es möglich sein, einen größeren Mischerdurchmesser einzusetzen, ohne die Größenverteilung der Kügelchen zu gefährden (einen niedrigen Variationskoeffizienten erhaltend).

Zusätzliche Bedenken hinsichtlich des existierenden Pilotverfahrens schließen Betreiben des Systems bei 40°C und die Verwendung von Pflanzenöl und Kaliumchloridlösung zur Kügelchenherstellung ein. Aufgrund der hohen Herstellungstemperatur sind in dem Verfahren sowohl Heiz- als auch Kühlsysteme erforderlich. Der potentielle Temperaturschock, dem die Hefezellen ausgesetzt sind, erfordert zusätzliche Untersuchung, so dass eine Bewertung bezüglich potentieller negativer Auswirkungen gemacht werden kann. In dieser Studie wurden Kügelchen mit immobilisierten Zellen mit hohen Hefe-Lebensfähigkeiten (über 90%) hergestellt, aber irgendwelche anderen Effekte, die der Prozess an der Hefepopulation verursacht haben kann, wurden nicht untersucht.

Da Öl verwendet wird, um die gewünschte Emulsion, und folglich die Bildung der Kügelchen, zu bewirken, und da Öl als ein oberflächenaktiver Stoff wirken wird, wobei Schaumbildung unterdrückt wird, ist der Ölrückstand auf der Kügelchenoberfläche ein Problem. Obwohl dieser Rückstand während der Fermentationsstufe helfen würde, wäre jegliche Verschleppung in das endgültige Bier nachteilig, da Schaum im fertiggestellten Produkten wünschenswert ist. Die zum Trennen der Feststoffphase (Kügelchen) vom Öl verwendeten großen Volumina an Kaliumchloridlösung und die Verfahren zum Entfernen dieser Salzlösung aus der Kügelchenaufschlämmung vor der Einführung der Kügelchen in den Bioreaktor erfordern Aufmerksamkeit. Anderenfalls kann es nötig sein, diese Lösung nach der Zugabe der Kügelchen zum Reaktor aus dem Reaktor auszuspülen.

Weil die Kügelchen mit immobilisierten Zellen außerhalb des Bioreaktors hergestellt werden, müssen aseptische Techniken während des Kügelchenherstellungsverfahrens eingesetzt werden, und Sterilität muss aufrecht erhalten werden, bis die Kügelchen in den Bioreaktor eingeführt sind. Die verschiedenen Transferpunkte zwischen Tanks bieten eine Möglichkeit für Kontamination und müssen aufgrund der Tatsache, dass die Anwesenheit einer Kontaminante in ihrer Co-Immobilisierung in dem Kügelchen resultieren könnte, überwacht werden. Als Ergebnis der Sorgfalt im Labor war es möglich, durchwegs aseptische Kügelchen herzustellen. Die Umgebung in einem Anlagenrahmen kann jedoch nicht so günstig wie das Labor sein, wodurch viel strengere Kontrolle erforderlich ist.

6.2.2 Flockende Hefezellen

Eine der natürlichsten Formen der Immobilisierung ist die Selbstaggregation von Mikroorganismen zu Flocken von Zellen. Calleja und Johnson (1977) haben drei mögliche Gründe für Zellen für Inkontaktkommen miteinander, um Aggregate zu bilden, vorgeschlagen, mit völlig unterscheidenden Bindungseigenschaften. Der erste betrifft Zellen unterschiedlicher Geschlechter, die durch die Freisetzung von Pheromonen (&agr;- und a-Faktoren) voneinander angezogen werden. Dieser Bindungstyp ist temporär und betrifft Protein-Protein-Bindungen zwischen ⎕- und a-Agglutininen, verankert in den komplementären Zellwänden. Zellen können auch durch ihr Versagen, sich von der Mutterzelle während des Sprossungsprozesses zu trennen, aggregieren. Dieses Versagen kann bei dem bestimmten Hefestamm inhärent sein oder kann durch Nährstoffentzug oder Mutation einer Anzahl von Genen verursacht sein. Dieses Phänomen wird als Kettenbildung und nicht als Flockung bezeichnet. Die Bindungen zwischen diesen Zellen können durch mechanische Scherung irreversibel zerstört werden (Stratford, 1996).

Das dritte Szenario ist häufiger allgemein als Flockung bekannt. Stewart und Russell (1981) haben Flockung als ein reversibles "Phänomen, wobei Hefezellen in Klumpen zusammenhaften und entweder rasch aus dem Medium, in dem sie suspendiert sind, sedimentieren oder zur Oberfläche des Mediums aufsteigen" definiert. Umfangreiche Beweise zeigen, dass Flockung genetisch kontrolliert ist und der Mechanismus der Flockung auf ausgewählten, als Brücken zwischen benachbarten Zellwänden wirkenden, Molekülen beruht. Spezieller wird angenommen, dass spezifische Lectine in der Gegenwart von Ca2+-Ionen an die &agr;-Mannane der aneinandergrenzenden Zellen gebunden sind (Calleja und Johnson, 1977). Es wurde herausgefunden, dass diese Protein/Kohlenhydrat-Bindung durch Chelat-bildende Wirkstoffe oder durch spezifische Zucker reversibel gehemmt wird. 12 bildet drei mögliche Hefezellkonfigurationen ab, namentlich nicht-flockende Hefe, Ketten-bildende Hefe und flockende Hefe. Im Falle der Ketten-bildenden Hefe wird dies, obwohl die Zellen aggregiert haben, nicht als eine Art der Flockung angesehen, da diese Zellen niemals einzeln waren, um damit zu beginnen, und Flockung einzelne Zellen voraussetzt, die zueinander kommen, um aufgrund günstiger Umweltbedingungen (Ca2+-Ionen und niedrige Konzentrationen von inhibierenden Zuckern) eine Masse zu bilden. Im Falle flockender Zellen kann die spezifische Größe der Flocken von genetischen, wie auch von den hydrodynamischen Bedingungen, denen die Zelle ausgesetzt ist (Scherungs-Umgebung), abhängig sein.

13 und 14 heben zwei Labatt-Lager-Hefestämme mit variierenden Graden von Flockung hervor. Der mittelflockende Hefestamm, LCC3021, ist in 13 gezeigt. In Anwesenheit von Calciumionen wird dieser Stamm 0,5 mm- bis 1,0 mm-Aggregate bilden, sobald Glucose aus dem Flüssigmedium abgereichert wurde. 14 ist ein Bild des superflockenden Hefestammes, LCC290, der Flocken, die größer als 1 mm in Größe sind, bilden wird, und in einer Umgebung niedriger Scherung zu bis zu 5 mm im Durchmesser messenden Klumpen aggregieren wird. Unter moderat bewegten Bedingungen wird der Flockendurchmesser von LCC290 zwischen 1 und 2 mm sein.

Etliche Messverfahren wurden für die Bewertung von Hefeflockung vorgeschlagen (Speers & Ritcey, 1995; Akiyama-Jibiki et al., 1997; Teixera et al. 1991; Stewart & Russell, 2000). In "Brewer's Yeast" (Stewart & Russell, 2000) ist vorgeschlagen worden, dass Hefeflockungsverfahren in drei Kategorien, nämlich Sedimentationsverfahren, statische Fermentationsverfahren und direkte Beobachtung von Flockenbildung im Wachstumsmedium, unterteilt werden können.

Das zuerst von Burns 1937 beschriebene Sedimentationsverfahren wurde von Helm und Kollegen 1953 modifiziert und ist gegenwärtig Teil der durch das Technical Committee und das Editorial Committee der American Society of Brewing Chemists (1992) anerkannten Standardanalysenverfahren. Diese Technik wird als eine in vitro-Technik bezeichnet, da die Sedimentationseigenschaften der Hefe in einen Calciumsulfatpuffer und nicht in dem tatsächlichen Fermentationsmedium beurteilt werden. Das statische Fermentationsverfahren (auch als das Gilliland-Verfahren bekannt) beinhaltet Züchten der Hefe in gehopfter Würze und Messen ihrer Flockungseigenschaften in vivo. Diese beiden Verfahren beinhalten Messungen der Absorption sedimentierter Hefeproben gegen Hefeproben, die entflockt worden sind, unter Verwendung eines UV/Licht-Spektralphotometers.

Stewart und Russell (2000) stellen ein Messverfahren für Hefeflockung durch visuelles Beschreiben des Grades der Flockung, der in in schraubverschlossenen 20 ml-Glasflaschen gezüchteten Hefeproben auftritt, vor. Sie verwendeten ein subjektives Maß, um den Grad der Flockung auszudrücken, z.B.: 5 – extrem flockend, 4 – sehr flockend, 3 – moderat flockend, 2 – schwach flockend, 1 – ungleich („rough"), und 0 – nicht-flockend. Der superflockende Hefestamm LCC290 erhielt eine Klassifizierung von 4 – sehr flockend, wohingegen der Hefestamm LCC3021 als 3 – moderat flockend, klassifiziert wurde.

Flockigkeit ist eine bedeutende Eigenschaft in der Brauindustrie, da die natürliche Tendenz der Hefe, entweder zu sedimentieren oder zur Oberfläche aufzusteigen, üblicherweise als Trennungsverfahren für diese Hefe von der Fermentationsflüssigkeit verwendet wird. Dennoch ist ein Hefestamm, der flockt, bevor die Fermentation abgeschlossen ist, nicht wünschenswert, da die Flüssigkeit ihren idealen Alkohol- und Restzucker-Gehalt nicht erreicht haben wird. In kontinuierlicher Fermentation, und insbesondere kontinuierlicher Gaslift-Leitrohr-Fermentation, wirkt flockende Hefe als die Immobilisierungsmatrix. Ihre Tendenz, zu sedimentieren, wird durch die Injektion des Einblasegases kompensiert, das sie in Suspension hält. Die Befürchtung der Unterfermentation des flüssigen Mediums bei einem solchen System ist eliminiert, seit die Feststoffpartikel kontinuierlich umgewälzt und in engem Kontakt mit der Fermentationsflüssigkeit gehalten werden.

In Abschnitt 6.2.2.1 wurden die Sedimentationseigenschaften und die Fermentationsleistung der superflockenden Hefe, LCC290, charakterisiert. Das Interesse lag auf dem Identifizieren des Beginns der Flockung bei diesem besonderen Hefestamm. Zusätzlich wurde die Sedimentationsgeschwindigkeit der Hefe bestimmt, um wertvolle Informationen zu liefern, die in der Zukunft im Entwurf von Hefe-Sedimentationsbehältern verwendet werden konnten.

6.2.2.1 Charakterisierung superflockender Hefe, LCC290

Vor Durchführung kontinuierlicher Fermentationen mit der superflockenden Hefe LCC290 im Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor wurde beschlossen, die Hefe in labormaßstäblichen Schüttelkolben-Fermentationen zu charakterisieren. Figur 6.28 zeigt die Entwicklung der Hefepopulation über die Zeit. Wie erwartet, stieg die Konzentration in den ersten 48 Stunden scharf an, pegelte sich dann mit einer leichten Abnahme am Ende der Fermentation ein. In den ersten 48 Stunden waren genug Nährstoffe und Sauerstoff in der Würze vorhanden, um Hefewachstum zu ermöglichen. Wenn die Hefe jedoch fortfährt, Kohlenhydrate in der Abwesenheit von Sauerstoff zu konsumieren, wird sie sich nicht reproduzieren, sondern vielmehr in ihre anaerobe fermentative Phase eintreten. Sobald der Kohlenhydratvorrat erschöpft war, begann eine kleine Population der Hefe abzusterben. Dieses Phänomen ist in Figur 6.29 abgebildet, wo die Zelllebensfähigkeit von ungefähr 97% auf knapp über 90% abnahm.

Figur 6.30 zeigt den Verbrauch von Kohlenhydraten während des Verlaufs der Fermentation. Die Hefezellen verbrauchten zuerst die Einfachzucker Glucose und Fructose, nahmen dann nacheinander Maltose und Maltotriose auf. Brauhefe kann jedoch weder Maltotetraose noch die längerkettigen Polysaccharide (Poly 1 & 2) metabolisieren. Als die insgesamte Kohlenhydratkonzentration abnahm (dargestellt durch Kurve des spezifischen Gewichts in Figur 6.31), stieg die Ethanolkonzentration proportional an. Ethanol- und Kohlenhydratkonzentrationen waren bei ungefähr 37 Stunden in der Fermentation gleich.

Aus einer Wachstums- und Kohlenhydratmetabolismus-Perspektive schien es, dass sich die superflockende Hefe LCC290 verhielt, wie es der industrielle Hefestamm LCC3021 tun würde. Die Fermentation schien Vollständigkeit zu erreichen, wenn das spezifische Gewicht der Flüssigkeit ungefähr 2,7°P erreichte. Es ist für flockende Hefestämme üblich, große Klumpen (Flocken) zu bilden und vor Endfermentieren aus der Lösung zu sedimentieren; dieses Phänomen ist in der Brauindustrie als eine "hängengebliebene" Fermentation bekannt. In unseren Chargenversuchen waren wir fähig, zu endfermentieren, weil die Kolben geschüttelt wurden, und daher die Hefe in Suspension und in engem Kontakt mit dem Nährstoffvorrat hielten.

Eine weitere wichtige Eigenschaft, die untersucht wurde, war die Fähigkeit der Hefe, zu flocken. Insbesondere waren wir daran interessiert, die Geschwindigkeit festzustellen, mit der die Hefe sedimentieren würde, wie auch daran, einen Hinweis darauf zu erhalten, wann dieser besondere Hefestamm mit der Flockung beginnen würde. Diese beiden Eigenschaften sind für die kontinuierlichen Fermentationsversuche von Bedeutung, da sie in der Erhaltung einer gesunden Hefepopulation im Gasliftfermenter eine Rolle spielen. Figur 6.32 zeigt Hefe-Sedimentationskurven über den Verlauf der Fermentation. In der bei 24 Stunden in der Fermentation getesteten Probe trat sehr wenig Sedimentation auf. Flockung ist durch die Anwesenheit von gewissen Zuckern gehemmt; Glucose ist ein bekannter Inhibitor, daher wird Flockung nur beginnen, sobald dieser Inhibitor abgereichert bzw. aufgebraucht wurde. In der Probe bei 40 Stunden Chargenfermentation begannen die Zellen zu flocken und sedimentierten aus der Lösung, wenn unter Verwendung der in Abschnitt 4.7 beschriebenen Methode getestet wurde. Sedimentation war bei allen getesteten Intervallen sehr schnell, außer bei 24 Stunden, als keine Sedimentation auftrat. Während des langsamsten Sedimentationsversuchs, durchgeführt bei 40 Stunden, benötigte die Hefe 90 s, um vollständig aus dem Testapparat zu sedimentieren. Bei 71 Stunden waren weniger als 50 s für Sedimentation erforderlich.

Forscher haben vorgeschlagen, dass die Sedimentationsrate eine Funktion der Feststoffkonzentration ist (Coe und Clevenger, 1916). Figur 6.33 zeichnet die Sedimentationsgeschwindigkeit der Feststoffe bei einer gegebenen Hefezellkonzentration auf. Die Datenpunkte für diese Kurve wurden unter Verwendung des von Kynch (1952) vorgeschlagenen Verfahrens aus den bei jedem Fermentationsintervall gesammelten Sedimentationsdaten gebildet. Die Ergebnisse liegen, das gleiche Phänomen, das Coe und Clevenger (1916) beobachtet hatten, bestätigend auf ungefähr der gleichen Kurve.

Die während des Sedimentationstests gesammelten Ergebnisse wiesen darauf hin, dass der superflockende Hefestamm LCC290 bei spezifischen Gewichten der Flüssigkeit von 6°P und weniger flocken wird. Dieser Wert kann bei kontinuierlichen Fermentationen als Richtwert verwendet werden, um anzuzeigen, wo das spezifische Gewicht der Flüssigkeit im Pseudostationärzustand gehalten werden sollte, wenn es erwünscht ist, die Zellen geflockt zu halten. Betreiben des Reaktors über 6°P würde Destabilisieren der geflockten Zellen riskieren und möglicherweise zum Auswaschen der immobilisierten Hefepopulation führen. Die Sedimentationseigenschaften der superflockenden Hefe weisen darauf hin, dass die Hefepopulation recht schnell sedimentieren wird, wenn sie stehen gelassen wird. Mit einem Drei-Phasen-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor wird es möglich sein, diese Zellen in Zirkulation zu halten, jedoch würde die Zellpopulation im Falle eines Versagens im Gasversorgungssystem schnell sedimentieren und möglicherweise zusätzliches Einblasegas erfordern, um die Feststoffe zu resuspendieren. Diese schnelle Sedimentationseigenschaft ist für Postfermentationsbearbeitung vorteilhaft, da Feststoff-Abtrennungseinrichtungen, wie Schwerkraftabscheider, zur Feststoffentfernung bei großen Mengen verwendet werden können. In der Brauindustrie würde dies die Feststoffbelastung der Zentrifugenausrüstung verringern, und daher längere Laufzeiten zwischen Zentrifugentrommelentleerungen ermöglichen. Geringere Bierverluste wären zu erwarten, und die dem Bier durch die Zentrifuge vermittelten Konzentrationen an Fehlaromen (obwohl minimal) würden wegen der niedrigeren Konzentrationen der durch die Zentrifuge geleiteten Hefe-Biomasse minimiert werden.

6.3 BEWERTUNG DER GASLIFT-TECHNOLOGIE FÜR KONTINUIERLICHE FERMENTATION VON BIER

Das erste und wichtigste Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit war es, die Machbarkeit des Betreibens des pilotmaßstäblichen 50 l-Gasliftbioreaktors in kontinuierlicher Weise unter Verwendung von &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchen zum Einschließen von Saccharomyces carlsbergensis-Zellen (beschrieben in Abschnitt 6.2.1) zu beurteilen. Es war zusätzlich unser Wunsch zu untersuchen, ob ein Lager-Bier des nordamerikanischen Typs mit akzeptabler Aromaqualität mit solch einem System hergestellt werden könnte. Wir begannen auch die für vollständige Extraktabnahme der high gravity-Würze (17,5°P) erforderliche minimale Verweilzeit zu bestimmen, wie auch einen Arbeitsbereich für Sauerstoff im kontinuierlichen Fermentationssystem zu etablieren.

Die minimale Verweilzeit, in der alle Würzezucker verbraucht wurden, war 24 Stunden. Dies kann mit einer klassischen Chargenfermentationszeit von fünf bis sieben Tagen verglichen werden. Die durch die eingebaute Ingold-Sauerstoffsonde im Bioreaktor gemessene Konzentration des gelösten Sauerstoffs war, ungeachtet des zum Einblasegas zugesetzten Sauerstoffs (reichend von 0 bis 20% V/V), nahe null. Dies zeigte, dass der in die Würze eingespeiste Sauerstoff entweder schnell durch die Hefen verbraucht oder einfach im Abgas abgegeben wurde. Die Konzentration von freien Zellen im Überlauf des Bieres war in der Größenordnung von 108 Zellen pro ml Jungbier. Die Konzentrationen der vizinalen Diketone, von Diacetyl und 2,3-Pentandion, wie auch die Konzentration des Acetaldehyds, nahmen mit abnehmenden Sauerstoffanteilen im Einblasegas ab (Figuren 6.34 und 6.35). Die gemessenen Ester (Ethylacetat und Isoamylacetat) und höheren Alkohole (Propanol, Isobutanol, Isoamylalkohol) schienen durch die Änderung in der Sauerstoffversorgung nicht beeinflusst zu sein (Figur 6.36).

Figur 6.37 vergleicht verschiedene Aroma-aktive Verbindungen in zwei mit dem kontinuierlichen immobilisierten Zellsystem hergestellten, fertiggestellten Testbieren mit einem industriell hergestellten Kontrollbier (Chargenfermentation mit freien Zellen). Zwischen dem kontinuierlich fermentierten Bier und der Kontrolle wurden ungeachtet der Höhe der Sauerstoffversorgung durchgängig einige Unterschiede bei Estern (Ethylacetat, Isoamylacetat) und bei höheren Alkoholen (Propanol) beobachtet. Der Geschmack des mit 2% Sauerstoff hergestellten, fertiggestellten Bieres wurde durch ein trainiertes Verkostungsgremium als relativ nahe zum Kontrollbier (industrielles Produkt) befunden. Das mit 20% Sauerstoff hergestellte Bier wurde jedoch als nicht-akzeptabel mit Zeichen von Aromaoxidation und einem "papierartigen" und "weinartigen" Geschmack befunden.

Der pilotmaßstäbliche Bioreaktor wurde im Pseudostationären Zustand mit einer Verweilzeit von 24 Stunden über eine 6 Wochen-Periode betrieben. Das Jungbier hatte ein akzeptables Aromaprofil, und es wurden keine größeren Fehler (schweflige Fehlaromen) bemerkt. Die Menge an Sauerstoff im Einblasegas erwies sich als ein kritisches Element in diesen Versuchen. Mit 2 bis 5% Sauerstoff im Einblasegas hergestellte Biere ergaben die besten Geschmacksprofile. Dieser kritische Lenkungspunkt erfordert weitere Aufmerksamkeit mit dem Fokus auf genaueren Sauerstoffmesstechniken mit an einen größeren Satz von Präfermentations- und Postfermentationsanalyten durchgeführten Messungen.

In traditioneller chargenweiser primärer Fermentation wird die Würze mit Sauerstoff behandelt, bevor sie in den Fermenter überführt wird. Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs nimmt nach der Inokulation des Mediums rasch ab, da die Hefe ihn verbraucht (erste 24 Stunden der Fermentation, in denen Hefewachstum auftritt). Der verbleibende Rest der Fermentation wird daher unter vorwiegend anaeroben Bedingungen ausgeführt. Die Verwendung eines kontinuierlichen homogenen Systems zur primären Fermentation ermöglicht diese Änderung der Sauerstoffkonzentration über die Zeit nicht. Aus diesem Grund kann es sehr schwierig sein, eine vollständige Aromaübereinstimmung von unter Verwendung kontinuierlicher und chargenweiser Fermentationen hergestelltem Bier zu erreichen. Die in dieser anfänglichen Bewertung getestete Bioreaktor-Konfiguration stellte, ungeachtet dieser Unterschiede, ein Bier mit einer akzeptablen Aromaqualität und einem akzeptablen analytischen Profil her. Durch Verwenden eines Gasliftbioreaktors mit relativ klein bemessenen Kügelchen (~1 mm) war es möglich, die volumetrische Bioreaktor-Produktivität durch Reduzieren der Zeit für die Primärfermentation um etliche Tage zu steigern. Die im austretenden Bier freigesetzte Biomassekonzentration zeigte, dass die Höhe des Hefewachstums im Bioreaktor mit immobilisierten Zellen zu der einer Chargenfermentation mit freien Zellen unter gleichen Bedingungen gleichwertig war. Diese Beobachtungen bestätigen die Verlässlichkeit der Aromabildung bei der Höhe des Hefewachstums. Dies könnte das Versagen früherer Versuche, akzeptables Bier mit wachstumsbeschränkten immobilisierten Zellsystemen herzustellen, erklären. Die Zufuhr einer kontrollierten Gasmischung kann ein mächtiges Werkzeug in der Feinabstimmung organoleptischer Eigenschaften von Bier in kontinuierlichen Fermentationen mit immobilisierten Zellen sein.

Die hohe Konzentration von Diacetyl in der austretenden Flüssigkeit wurde auch von anderen Forschern beobachtet (Virkajarvi & Pohjala, 1999; Kronlof et al., 2000). In Lager-Bieren des nordamerikanischen Typs ist die Zielkonzentration von Diacetyl 30 &mgr;g/l im Vergleich zu den Konzentrationen von 400–800 &mgr;g/l in der austretenden kontinuierlichen Fermentationsflüssigkeit. Die Verwendung traditioneller Alterungstechnologie (kalte Alterung bei 2°C für 14 Tage) senkte Diacetyl auf den erwünschten Bereich, aber zum Schaden der insgesamten Prozessproduktivität. Die Anwendung der in Kapitel 2 berichteten Technologie zur schnellen sekundären Fermentation würde helfen, Diacetyl ohne signifikantes Senken der Produktivität (2-Stunden-Verfahren) zu reduzieren. Die zusätzlichen Kosten können jedoch prohibitiv sein, und alle Brauer mögen ihr Bier nicht hohen Temperaturen (80°C bis 90°C) unterwerfen.

6.4 MISCHUNGS- UND UMWÄLZRATEN VON FERMENTATIONEN IN EINEM DREI-PHASEN-GASLIFT-ZENTRALROHR-BIOREAKTOR

Mischungsexperimente wurden unter Verwendung des in Abschnitt 4.8 dargelegten Säureinjektionsverfahrens durchgeführt. Die Ziele dieser Phase der Versuche waren zweifache. Wir wollten zuerst durch Berechnen der Flüssigkeitsumwälzrate und der resultierenden Mischungszeit für eine Anzahl von Immobilisierungsträgerstoffen bei unterschiedlichen Fluidisationsgasoberflächengeschwindigkeiten („superficical fluidizing velocities") beurteilen, ob das Gasliftsystem gut gemischt war. Die Abgrenzung dieser Versuche von den in der Literatur berichteten war, dass die ganzen Versuche im tatsächlichen Fermentationsmedium mit aktiven Hefezellen statt in Modelllösungen (Wasser-Feststoff-Gas-Systeme) durchgeführt wurden. Diese Mischungsexperimente waren auf die Berechnung von Oberflächengeschwindigkeiten der Flüssigkeiten, die für zukünftiges Scale-up des Pilotsystems verwendet werden könnten, abgestellt.

6.4.1 Sondenkalibrierung

Die in den Mischungsuntersuchungen verwendete pH-Sonde wurde unter Verwendung des in Abschnitt 4.8 beschriebenen Verfahrens kalibriert. Das von der pH-Sonde emittierte 4–20 mA-Signal wurde durch einen 250 Ohm-Widerstand geleitet und in ein 1–5 Volt-Signal umgewandelt, das mit der Datenerfassungskarte (DAC) aufgenommen werden konnte. Die pH-Sonde wurde wie folgt sequentiell in eine Reihe von Puffern getaucht: Puffer mit pH 4,6, Puffer mit pH 4,0, Puffer mit pH 5,0, Puffer mit pH 6,0 und schließlich in Puffer mit pH 7,0 (Beckman zertifizierte Standards, Cole Parmer). Figur 6.38 zeigt die durch das Erfassungssystem gesammelten Daten für die Reaktion der Ingold-pH-Sonde auf die 5 Standard-pH-Lösungen. Figur 6.39 ist die den tatsächlichen pH-Wert gegen die gemessene Signalspannung auftragende pH-Sonden-Kalibrationskurve. Die bestangepasste Kalibrationskurve für dieses System (Korrelationskoeffizient von 0,9996) wurde durch die folgende Gleichung definiert: pH = 3,68 × Spannung – 3,53(6.1)

Die gesammelten Mischungsdaten wurden unter Verwendung der Gleichung 6.1 transformiert, um tatsächliche pH-Werte, wie im Gasliftbioreaktor gemessen, widerzuspiegeln.

Die Reaktionszeit der pH-Sonde auf eine Änderung im pH wurde auch gemessen. Figuren 6.40 bis 6.43 bilden die typische Reaktion der pH-Sonde auf vier unterschiedliche Stufenänderungen im pH, nämlich 0,6, 1,2, 2,3 und 3,4 Einheiten, ab. Die Originaldaten wurden unter Verwendung der eingebauten Fähigkeiten von TableCurve 2D- (Jandel Scientific) Datenauftragungs- und Analysensoftware einer Impulsfunktion angepasst. Die resultierenden Kurvenanpassungen hatten Korrelationskoeffizienten größer als 0,994. Aus diesen Kurven wurde die Zeit für die Probe, um auf 98% der Stufenänderung (Reaktionszeit) zu reagieren, berechnet und gegen die pH-Stufenänderung aufgetragen (Figur 6.44). Reaktionszeit nahm mit pH-Stufenänderung in den getesteten Bereichen ab. Für die kleinste Stufenänderung von 0,6 war die pH-Sondenreaktionszeit ~6,4 Sekunden. Die Reaktionszeit verringerte sich auf ungefähr 4,2 Sekunden für eine pH-Stufenänderung von 3,4.

Diese Art der Probencharakterisierung ist wichtig, insbesondere wenn das System zur Bewertung von Mischungszeit und Umwälzraten verwendet wird. Die Probe sollte dafür eine niedrige Reaktionszeit haben, um die Änderungen im Medium, die sie misst, widerzuspiegeln. Insbesondere muss die pH-Sondenreaktionszeit niedriger als die Umwälzrate im Reaktor sein, wenn sie in solch einer Messung akkurat verwendet werden soll. Eine quasi-instantane Reaktion ist dennoch nicht notwendig, da eine kurze Verzögerung in der Reaktion in aufeinanderfolgenden Umwälzratenmessungen einfach widergespiegelt und daher aufgehoben wird.

6.4.2 Mischungszeit und Umwälzraten

Mischungszeit- und Umwälzraten-Experimente wurden an drei Typen von Fermentationen mit immobilisierten Zellen durchgeführt. Die Versuche wurden innerhalb des pilotmaßstäblichen 50 l-Leitrohr-Bioreaktors an einer keine Feststoffe enthaltenden Modell-Wasserlösung und dann an Fermentationsbrühe mit einem spezifischen Gewicht von 2,7°P, enthaltend entweder &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchen, superflockende LCC290-Hefe oder mittelflockende LCC3021-Hefe, durchgeführt. Figuren 6.45 und 6.46 sind Musterdarstellungen der unter Verwendung des pH-Sondensystems nach Injektion eines Säureimpulses (Verfahren beschrieben in Abschnitt 4.8) gesammelten Rohdaten. Figur 6.45 veranschaulicht die pH-Sondenreaktion auf eine Säureinjektion in eine keine Feststoffe enthaltende Wasserlösung, wohingegen Figur 6.46 die Reaktion auf die Säureinjektion in eine die hochflockende Hefe LCC290 enthaltende Fermentationsbrühe ist. Die Signale wurden an eine abklingende sinusförmige Kurve angepasst und Korrelationskoeffizienten von 0,96 bzw. 0,90 wurden für die entsprechenden Gleichungen berechnet. Die Anpassungsparameter "b" und "c" auf den Bildern entsprechen den in der abklingenden sinusförmigen Gleichung (3.1) beschriebenen "a"- und "⎕"-Werten. Diese numerischen Werte wurden in Gleichungen 3.2 und 3.3 verwendet, um die Umwälzrate und die Mischungszeit für das gegebene System zu berechnen. Anhang B enthält die verbleibenden Mischungsdaten und Kurvenanpassungen für alle der Experimente.

Figuren 6.47 und 6.48 sind Mischungszeit- und Umwälzraten-Graphen für eine Säureinjektion in eine keine Feststoffe enthaltende Wasserlösung. Figuren 6.49 und 6.50 sind die entsprechenden Graphen für die Mischungsexperimente unter Verwendung der hochflockenden Hefe LCC290, während die Resultate der &kgr;-Carrageenan-Mischungsversuche in Figuren 6.51 und 6.52 gezeigt werden. Abschließend werden in Figuren 6.53 und 6.54 die Mischungszeit und Umwälzzeit für die mittelflockende Hefe LCC3021 gezeigt. Ungeachtet des getesteten Feststofftyps nahmen sowohl Mischungszeit als auch Zirkulationsrate bzw. Umwälzrate mit entsprechenden Anstiegen bei der Oberflächengeschwindigkeit des Gases ab. Die Beziehung zwischen Zirkulationsrate und Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit folgte bei allen vier getesteten Systemen der von Kennard und Janekah (1991) vorgeschlagenen Gleichung 3.11. Die Mischungszeit folgte für das Wasser/keine Feststoffe-System und das &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchensystem der Beziehung in Gleichung 3.11. Beide Systeme mit flockender Hefe als der Immobilisierungsmatrix zeigten keine starke Korrelation mit dem theoretischen Modell von Kennard und Janekah. Die LCC290- und die LCC3021-Systeme hatten niedrigere anfängliche Mischungszeiten (bis die Oberflächengeschwindigkeit des Gases 4 mm/s überschritt), als durch das Modell vorhergesagt. Die Rate der Abnahme der Mischungszeit verlangsamte sich jedoch bei Oberflächengeschwindigkeiten des Gases größer als 4 mm/s, während das Modell Werte vermindert. Tabelle 6.1 gibt die abgeleiteten Gleichungen für Umwälzzeit und Mischungszeit, wie sie sich auf Oberflächengeschwindigkeit des Gases beziehen, an.

Figur 6.55 veranschaulicht die Beziehung Mischungszeit gegen Oberflächengeschwindigkeit des Gases für alle vier Systeme. Das Wasser/keine Feststoffe-Szenario zeigte die höchste Mischungszeit für 98%-Mischung eines pH-Impulses (~220 Sekunden bei Vsg von 3 mm/s), und das LCC290-System zeigte die beste Kapazität zum Minimieren der Auswirkung eines Säureimpulses im System (~110 Sekunden bei Vsg von 3 nm/s). Die Werte für das LCC3021- und das &kgr;-Carrageenan-System waren zwischen den Wasser/keine Feststoffe- und den LCC290-Systemen. Feststoffe im Gasliftbioreaktor helfen bei der Dispergierung von Flüssigphasenfluidelementen durch Stimulieren der Bildung von Wirbeln und Fördern koaxialer Mischung. Die superflockende Hefe LCC290 ermöglichte, trotz der gleichen Feststoffbeladung (16% G/V) wie die mittelflockende Hefe LCC3021, bei allen getesteten Oberflächengeschwindigkeiten des Gases schnellere Mischungszeiten.

Figur 6.56 beschreibt die Umwälzzeit gegen Oberflächengeschwindigkeit des Gases für alle vier getesteten Systeme. Bei einer Oberflächengeschwindigkeit des Gases von 2 mm/s bewegte sich Umwälzzeit zwischen 28 Sekunden und 35 Sekunden, wobei das Wasser/keine Feststoffe-System die schnellste Umwälzrate hat und das LCC290-System die niedrigste Umwälzrate zeigt. Bei den höheren Gasgeschwindigkeiten war der Unterschied zwischen den vier Systemen auf ungefähr 3 Sekunden reduziert. Bei allen getesteten Geschwindigkeiten wies das LCC290-System jedoch geringfügig niedrigere Umwälzraten auf, während das Wasser/keine Feststoffe-System die schnellsten Umwälzraten hatte.

Figur 6.57 veranschaulicht die Beziehung zwischen Oberflächengeschwindigkeit des Gases und Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit. Gleichung 3.7, vorgeschlagen von Livingston und Zhang (1993), wurde verwendet, um die Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit für eine gegebene Umwälzrate und einen gegebenen Feststofftyp zu berechnen. Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit stieg mit entsprechenden Anstiegen der Oberflächengeschwindigkeit des Gases. Das LCC3021- und das Wasser/keine Feststoffe-System hatten ähnliche Trends, während das LCC290- und das &kgr;-Carrageenan-System einige Ähnlichkeit zeigten. Die von Kennard und Janekah vorgeschlagene Modellgleichung wurde den Kurven für Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit gegen Oberflächengeschwindigkeit des Gases in Figur 6.57 angepasst. Figur 6.58 trägt die experimentell berechnete Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeit gegen die unter Verwendung von Gleichung 3.10 theoretisch berechnete Oberflächengeschwindigkeit der Flüssigkeiten auf. Alle vier Systeme passen, wie durch die lineare Funktion mit Steigung 1 und Ursprung bei y = 0 gezeigt, auf die vorgeschlagene Gleichung. Tabelle 6.1 listet die Korrelationen auf, die für die Systeme abgeleitet wurden, die in dieser Forschungsarbeit untersucht wurden.

Kennard und Janekah (1991) schlugen für die Oberflächenkorrelation der Flüssigkeit („superficial liquid correlation") einen Exponenten von 0,41 in destilliertem Wasser und 0,64, wenn die Lösung Carboxymethylcellulose und Ethanol enthielt, vor. Die LCC290- und die LCC3021-Systeme hatten Exponenten von 0,419 bzw. 0,427, während das &kgr;-Carrageenan-System und das Wasser/keine Feststoffe-System einen Exponenten von 0,283 hatten.

Eine grundlegende Annahme der Gaslift-Leitrohr-Technologie ist, dass das System adäquate Mischung liefern kann, so dass das den Reaktor verlassende Fluidelement vollständig gemischt ist. Im Betrieb der pilotmaßstäblichen 50 l-Systeme als kontinuierliche Fermenter wurde frisches Nährmedium am Boden des Reaktors bei einer Flussrate von 36 ml pro Minute in ein gesamtes Reaktorvolumen von 50 l injiziert. Dies stellt ungefähr eine 1000-Fach-Verdünnung in Einspeisekomponenten dar. Mit den für das LCC290-Hefe-System berechneten Mischungseigenschaften wird ein Fluidelement in ungefähr 3 Reaktorumwälzungskreisläufen vermischt, wohingegen bei dem Wasser/keine Feststoffe-Szenario 10 Reaktor-Umwälzungskreisläufe nötig sind. Zusätzlich ist die Verweilzeit (24 Stunden) ungefähr 1000 größer als die Mischungszeit (180 Sekunden). Die mit der Verdünnung von Nährstoffen im System gekoppelte schnelle Mischung und der große Unterschied in Mischungszeit gegen Verweilzeit weisen stark auf ein adäquat durchmischtes System hin. Die ursprüngliche Voraussetzung für die Verwendung eines Gasliftbioreaktors war, dass er eine ideal durchmischte Umgebung für die Bierfermentation bot. Die Ergebnisse der an allen drei Fermentationsträgerstoffen durchgeführten Mischungsstudien unterstützen diese Voraussetzung.

6.5 BEWERTUNG MEHRERER IMMOBILISIERUNGSVERFAHREN FÜR KONTINUIERLICHE PRIMÄRE FERMENTATION IN EINEM GASLIFTSYSTEM

Kontinuierliche Fermentationen wurden unter Verwendung von drei Typen von Immobilisierungsträgerstoffen – &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchen, superflockende LCC290-Hefe und mittelstark flockende LCC3021-Hefe – in dem pilotmaßstäblichen 50 l-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor durchgeführt. Alle Fermentationen wurden anfänglich mit derselben Konzentration an Hefe-Inokulum (4 g/l) angestellt, und industrielle Lager-Würze wurde als Nährmedium verwendet. Die Fermentationen wurden in Charge begonnen, um die schnelle Verminderung von Würzezuckern zu ermöglichen, wie auch, um Hefewachstum im Fermenter zu fördern. Im Falle der flockenden Hefe ermöglichte diese Chargen-Phase die Bildung von Hefeflocken, die dann im Bioreaktor zurückgehalten werden konnten, sobald eine kontinuierliche Einspeisung gestartet wurde. Sobald die Diacetylkonzentration in der Fermentationsflüssigkeit unter 30 &mgr;g/l gefallen war, wurde kontinuierliche Würzeeinspeisung gestartet. Die folgenden Abschnitte beschreiben die sich aus diesen drei Typen von Immobilisierungsmatrizes ergebenden Fermentationsanalysen detaillierter.

6.5.1 Verwendung von &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchen: Einschluss

Die Verwendung von &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchen als eine Immobilisierungsmatrix half in der Machbarkeitsbewertung von Gaslifttechnologie zur kontinuierlichen Primärfermentation von Bier (Abschnitt 6.3). Es war noch nötig, zu bewerten, ob solch ein System für ausgedehnte Zeitperioden (bis zu 2 Monaten) betrieben werden konnte, ohne größere Betriebsschwierigkeiten, einschließlich Fermentationsinstabilität und Kontamination, zu erfahren. Die Betriebsparameter für diesen Fermentationsversuch sind in Figur 6.59 dargestellt. Die Oberflächengeschwindigkeit des Gases Kohlendioxid wurde auf 5,5 mm/s eingestellt, während 0,9 mm/s Luft in den Reaktor in diesem Einblasegas eingeführt wurden. Die Sauerstoffanreicherungsrate wurde daher auf 3% des gesamten Einblasegases eingestellt, um mit den Ergebnissen in Abschnitt 6.3 übereinzustimmen, die die Herstellung des bevorzugten Bieres anzeigten, wenn 2–5% Sauerstoff in das System eingeführt wurden. Die Fermentationstemperatur wurde auf 15°C geregelt. In den Daten sind einige Fluktuationen sichtbar, und sie hängen mit der Natur der Kontrollschleife, die verwendet wurde, zusammen.

Figur 6.60 spiegelt die Entwicklung der Population freier Hefezellen über die Zeit wie auch der Lebensfähigkeit der Hefe wider. Lebensfähigkeit blieb während der 2-monatigen Fermentation relativ hoch, mit einer um 200 Stunden gemessenen temporären Abnahme. Dies entspricht dem Punkt gerade vor dem Start der kontinuierlichen Würzeeinspeisung. In Chargenfermentation ist es für die Lebensfähigkeit üblich, am Ende der Fermentation abzunehmen, da die Zellen der Nährstoffe beraubt sind. Sobald die kontinuierliche Würzeeinspeisung gestartet wurde, kletterte Lebensfähigkeit zurück auf über 90%. Die Population freier Hefezellen war während der ersten 400 Stunden der Fermentation niedrig und stieg dann über die nächsten 300 Stunden etwa zehnfach von ~100 Millionen Zellen pro ml auf ~1,5 Milliarden Zellen pro ml an. Einmal bei dieser Maximalkonzentration erhielt die Population freier Hefezellen diesen Wert des pseudostationären Zustands für den verbleibenden Rest der Fermentationsperiode.

Der plötzliche Anstieg der Konzentration freier Hefe ist wahrscheinlich mit der Population immobilisierter Hefezellen verknüpft. Am Beginn der Fermentation wird die im Gel eingeschlossene Hefe innerhalb des Gels wachsen, bis aller verfügbarer Raum eingenommen wurde. Sobald die Gelkügelchen mit Hefe gefüllt sind, wird die expandierende Population in das Flüssigmedium überfließen. Unsere Ergebnisse scheinen zu zeigen, dass die immobilisierte Hefe während der ersten 400 Stunden innerhalb des Gels wuchs und die Hefe bei ~700 Stunden keinen Raum mehr zum Wachsen innerhalb des Kügelchens hatte, und daher begann größere Mengen von Zellen in die Fermentationsbrühe freizusetzen.

Diese Instabilität in der Hefepopulation wird von den Ethanol- und spezifische Gewicht-Profilen widergespiegelt (Figur 6.61). Während der anfänglichen 200 Stunden Fermentation wurde erwartet, dass Ethanol über der Zeit ansteigen würde und dass das spezifische Gewicht, traditionellen Chargen-Kinetiken folgend, abnehmen würde. Zwischen 200 und 600 Stunden erreichte Ethanol ein Plateau bei 45 g/l, und das spezifische Gewicht blieb bei ~6°P. Dieses Ergebnis wurde nicht erwartet, da eine endfermentierte Flüssigkeit ein spezifisches Gewicht von ~2,5 bis 2,7°P haben würde. Bei ungefähr 600 Stunden, als die Population freier Hefen gerade ihr Maximum erreicht hatte, stieg die Ethanolkonzentration auf etwa 70 g/l und das spezifische Gewicht der Würze fiel auf etwa 2,2°P. Ein genauerer Blick auf die spezifischen Kohlenhydratprofile über die Zeit (Figur 6.62) zeigt, dass sich die Maltosekonzentration bis ungefähr 600 Stunden in dem Verfahren nicht einpendelte. Die anderen Zucker wurden wie erwartet verringert.

Zwei andere Schlüsselanalyten – Diacetyl und 2,3-Pentandion – wurden während des 2-monatigen kontinuierlichen Laufs überwacht (Figur 6.63). Die niedrigen Punkte bei ungefähr 180 Stunden entsprechen dem Ende der Chargenbeginnphase. Sobald die kontinuierliche Einspeisung gestartet wurde, stiegen sowohl Diacetyl als auch 2,3-Pentandion rasch auf etwa 500 &mgr;g/l bzw. 400 &mgr;g/l. Dieser anfängliche Anstieg wurde erwartet, da die Zufuhr frischer Nährstoffe Hefewachstum stimulieren, und daher die Konzentration von Überflussmetaboliten steigern würde, was zu Diacetyl und 2,3-Pentandion führt. Über den Fermentationslauf hinweg blieben 2,3-Pentandionkonzentrationen über 400 &mgr;g/l, während Diacetylkonzentrationen von 500 &mgr;g/l auf 275 &mgr;g/l auf halbem Weg durch den kontinuierlichen Fermentationslauf hindurchfielen. Dieser Punkt fiel damit zusammen, dass die Diacetylkonzentration unter die 2,3-Pentandion-Konzentration fiel, wie in der in Abschnitt 6.3 berichteten Machbarkeitsbeurteilung beobachtet.

6.5.2 Verwendung eines superflockenden Hefestammes: Selbst-Flockung

Kontinuierliche Fermentationen unter Verwendung des mit LCC290-superflockender Hefe beladenen pilotmaßstäblichen 50 l-Gasliftbioreaktors wurden über eine 3-monatige Periode durchgeführt. Das CO2-Einblasegas wurde auf ~2,5 mm/s eingestellt, während Luft bei ~0,4 mm/s eingeführt wurde, um etwas Hefewachstum zu fördern (dies entspricht einer Gesamtmenge von 1,51 l eingeführtem Gas pro Minute, von dem 3% Sauerstoff sind). Die Fermentationstemperatur im Reaktor wurde während des gesamten Verlaufes auf ~15°C gehalten. Eine Unterbrechung der Spannungsversorgung zwang uns, die Temperatur des Fermenters während einer Periode von drei Tagen (etwa 1700 Stunden in der Fermentation) auf 4°C zu reduzieren (Figur 6.64). Diese Abkühlung des Reaktors wurde durchgeführt, um Hefemetabolismus zu verlangsamen und Hefelebensfähigkeit während der Spannungsunterbrechung zu erhalten. Dieses unerwartete Ereignis bot eine Möglichkeit, die Widerstandsfähigkeit des Systems gegenüber Ereignissen, die in industriellen Situationen üblich sein könnten, zu bewerten. Sobald die Elektrizität wieder hergestellt war, wurde die Reaktortemperatur wieder auf 15°C eingestellt und die Fermentation schritt für weitere 30 Tage voran.

Sobald die Chargenbeginnphase abgeschlossen war (~180 Stunden), wurde dem System kontinuierlich Würze bei einer Flussrate von 2,16 l pro Stunde zugeführt, was eine 24-stündige Verweilzeit, basierend auf einem Reaktorarbeitsvolumen von 50 L, gewährleistet. Nach der anfänglichen Chargenperiode stieg die Zellkonzentration, erreichend 3 Milliarden Zellen/ml bei etwa 750 Stunden in der Fermentation (Figur 6.65) Diese Hefemasse nahm dann auf ungefähr 1 Milliarde Zellen pro ml bei etwa 1000 Stunden ab und verblieb auf dieser Konzentration bis zum Ende der Fermentation. Hefelebensfähigkeit war über 90% während des Fermentationslaufs (Figur 6.65).

Die Ethanolkonzentration und das spezifische Gewicht der Fermentationsbrühe erreichten pseudostationären Zustand kurz nachdem die kontinuierliche Einspeisung gestartet wurde (Figur 6.66). Ethanolkonzentration stieg auf ungefähr 70 g/l, und das spezifische Gewicht der Flüssigkeit war ~2,3°P für den Rest der Fermentation. Die Kohlenhydratprofile in Figur 6.67 bestätigen diesen pseudostationären Zustand bei ungefähr 270 Stunden im kontinuierlichen Fermentationslauf. Die Polysaccharidkonzentration fiel von ~42 g/l auf ~33 g/l bei ungefähr 1400 Stunden in der Fermentation. Dieses Ergebnis lag an einer Variation in Würzechargen. Da Lager-Hefe diese Polysaccharide nicht verwerten kann, hatte diese Anomalie in Würzenährstoffen keine merkliche Auswirkung auf die Leistung des Primärfermentationsbehälters. Dieser Unterschied im Anteil nicht-fermentierbarer Zucker würde von trainierten Verkostungsgremiumsteilnehmern detektiert werden, die bemerken würden, dass das Produkt einen "dünnen" Körper hätte.

Die Diacetyl- und 2,3-Pentandionkonzentrationen über die Zeit sind in Figur 6.68 dargestellt. Wie bei den kontinuierlichen Fermentationen mit &kgr;-Carrageenan stiegen die Diacetyl- und 2,3-Pentandionkonzentrationen, sobald die kontinuierliche Würzeeinspeisung gestartet wurde. Diacetyl erreichte ungefähr 375 &mgr;g/l, wohingegen die 2,3-Pentandion-Konzentration ungefähr 600 &mgr;g/l war. Diese Konzentrationshöhen wurden während des Fermentationslaufs bis zu der Leistungsunterbrechung bei ~1700 Stunden aufrecht erhalten. Da die Flüssigkeit für 3 Tage ohne weiteren Hefemetabolismus (aufgrund Fehlens von Nährstoffversorgung) saß, wurden die Konzentrationen vizinaler Diketone verringert. Sobald die Würzeeinspeisung wieder gestartet wurde, kehrten sowohl Diacetyl als auch 2,3-Pentandion auf ihre Werte des pseudostationären Zustandes zurück.

6.5.3 Verwendung einer mittelflockenden Hefe: Selbst-Flockung

Mehrere Fermentationsläufe wurden unter Verwendung des mittelflockenden Hefestammes LCC3021 als der Immobilisierungsmatrix im pilotmaßstäblichen 50 l-Gasliftbioreaktor durchgeführt. Die anfängliche Hefekonzentration wurde auf 4 g/l, wie bei den zwei vorherigen Weisen der Immobilisierung, gesetzt. Industrielle Lagerwürze wurde mit dieser Hefe angestellt (beschrieben in Abschnitt 4.2), und sie ermöglichte das Fermentieren in Charge, bis alle fermentierbaren Zucker verbraucht waren und die Diacetylkonzentration unter 30 &mgr;g/l gefallen war. Die Fermentationstemperatur wurde auf 15°C geregelt, und die Einblasegas-Rate wurde auf den gleichen Pegel wie bei der LCC290-Fermentation geregelt (Oberflächengeschwindigkeit des Kohlendioxiddases von ~2,5 mm/s und ~0,4 mm/s Luft, ungefähr 3% Sauerstoff im gesamten Einblasegas ergebend) (Figur 6.69).

Diese anfängliche Chargenstufe erlaubte es den Hefezellen zu flocken, und daher leichter im Gasliftsystem zurückgehalten zu werden. Am Ende des Chargenbeginns wurde die Würzeeinspeiserate auf 2,16 l pro Stunde eingestellt, was einer Verweilzeit von ~24 Stunden, basierend auf einem Reaktorarbeitsvolumen von 50 Litern, entsprach. Die Hefepopulation (Figur 6.70) stieg auf etwa 1 Milliarde Zellen pro Milliliter und blieb für gerade etwas mehr als 1000 Stunden auf diesem Level (zwischen 500 und 1500 Stunden im kontinuierlichen Fermentationsablauf). Die Hefepopulation verdoppelte sich plötzlich bei ~1500 Stunden in der Fermentation und pegelte sich dann bei 2 Milliarden Zellen/ml ein. Diese Änderung der Hefepopulation war unerwartet. Die Lebensfähigkeit der Hefe während des Fermentationslaufs wurde bei über 90% gehalten (Figur 6.70).

Figur 6.71 zeigt die Daten für Ethanolkonzentration und spezifisches Gewicht der Fermentationsbrühe über den 3-monatigen kontinuierlichen Lauf. Kurz nach dem Chargenbeginn (180 Stunden) pegelte sich die Ethanolkonzentration bei 70 g/l ein, und das spezifische Gewicht erreichte ein Minimum von ~2,2°P. Der oben diskutierte plötzliche Anstieg der Hefepopulation wurde nicht in einer Abnahme der Ethanolkonzentration widergespiegelt. Die logischste Erklärung für diesen Hefepopulationsanstieg ist, dass ein größerer Anteil der insgesamten Hefepopulation in Wachstumsphase eintrat, was diese Verdoppelung der Hefekonzentration ergab. Es wäre erwartet worden, dass eine Abnahme der Ethanolkonzentration mit dem Anstieg der Hefekonzentration einhergeht, aber dies war eindeutig nicht der Fall, da Ethanol auf seinem Wert des pseudostationären Zustands von 70 g/l während des kontinuierlichen Laufs blieb. Die Kohlenhydratkonzentrationsprofile gegen Fermentationszeit (Figur 6.72) offenbarten den gleichen Schluss wie die Ethanol- und spezifische Gewicht-Kurven. Dieser Lauf hatte seinen pseudostationären Zustand bei ungefähr 250 Stunden in der kontinuierlichen Fermentation erreicht.

Figur 6.73 liefert die Diacetyl- und 2,3-Pentandion-Konzentrationskurven gegen kontinuierliche Fermentationszeit. Wie die Ergebnisse für vizinale Diketone bei &kgr;-Carrageenan-Gel und LCC290, stiegen die Diacetyl- und 2,3-Pentandion-Konzentrationen der Chargenbeginnphase folgend, um pseudostationäre Zustandswerte von ~225 &mgr;g/l bzw. 400 &mgr;g/l zu erreichen.

6.5.4 Vergleich verschiedener Trägerstoffe

Die Fermentationsleistungen von &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchen, superflockender LCC290-Hefe und mittelflockender LCC3021-Hefe als Immobilisierungsmatrizes wurden in Abschnitten 6.5.1 bis 6.5.3 vorgestellt. Alle drei Trägerstoffe wurden für kontinuierliche primäre Fermentation im pilotmaßstäblichen 50 l-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor geeignet befunden. Flüssigkeitsverweilzeiten von 24 Stunden wurden in allen drei Fällen erreicht. Die Fermentationsabläufe unter Verwendung von superflockender LCC290-Hefe erreichten viel schneller einen pseudostationären Zustand als die immobilisierten Zellsysteme mit mittelflockender Hefe LCC3021 und mit &kgr;-Carrageenan. Die LCC290-Fermentation erreichte ihre maximale Ethanolkonzentration von 70 g/l bei etwa 250 Stunden im Verlauf. Der LCC2021-Lauf erreichte seine Stationärzustands-Ethanolkonzentration von 70 g/l bei ~600 Stunden. Während der kontinuierlichen &kgr;-Carrageenan-Fermentation pegelte sich Ethanol während des Verlaufs des Laufes an zwei unterschiedlichen Punkten ein. Zuerst erreichte Ethanol 45 g/l zwischen 200 und 500 Stunden und stieg dann auf 70 g/l bei etwa 575 Stunden und blieb bei dieser Konzentration bis zum Ende des Versuchs.

Die drei Fermentationssysteme schienen eine maximale freie Hefezellkonzentration von ~1 Milliarde Zellen pro Milliliter zu erreichen. Die Inkonsistenz der Hefekonzentration wirkte negativ auf die Ethanolproduktivität des &kgr;-Carrageenan-Systems ein (niedrigere anfängliche Pseudostationärzustands-Ethanolkonzentration im Vergleich zum LCC290-Hefesystem). Die Hefekonzentration gipfelte an unterschiedlichen Zeitintervallen in jedem System. Bei dem LCC290-Lauf erreichte Ethanol sein Maximum zwischen 500 und 1000 Stunden in der kontinuierlichen Fermentation, während die LCC3021-Fementation eine maximale Zellzahl zwischen 1500 und 2000 Stunden in ihrem kontinuierlichen Lauf hatte. Das &kgr;-Carrageenan-immobilisierte System erreichte eine maximale Zellkonzentration zwischen 700 und 1000 Stunden kontinuierlichen Betriebs. Die pseudostationären Zustandskonzentrationen von Diacetyl und 2,3-Pentandion waren in den drei Arten Fermentation mit immobilisierten Zellen – superflockende Hefe LCC290, mittelflockende Hefe LCC3021 und &kgr;-Carrageenan-immobilisierte Hefe – verschieden. Bei der LCC290-Fermentation stellte sich Diacetyl auf 375 &mgr;g/l ein, während die Konzentration in der LCC3021-Fermentation bei etwa 225 &mgr;g/l eingepegelt war. Im Falle der &kgr;-Carrageenan-Fermentation erreichte die Diacetylkonzentration 500 &mgr;g/l, und auf halben Weg im kontinuierlichen Lauf nahm die Konzentration schrittweise auf etwa 200 &mgr;g/l in einem 500 Stunden-Zeitrahmen ab. Die 2,3-Pentandionkonzentration spiegelte die Diacetylkonzentration in allen drei Läufen mit höheren Konzentrationen von 2,3-Pentandion als Diacetyl während der LCC290- und LCC3021-Fermentationen wider. Der &kgr;-Carrageenan-Lauf stellte ein unterschiedliches Muster zur Schau mit höheren Diacetylkonzentrationen als 2,3-Pentandion während seines ersten pseudostationären Zustandes, nach welcher Zeit die Diacetylkonzentration unter die 2,3-Pentandionkonzentration fiel. Die Hefekonzentrationsdaten und die Ethanolproduktionsdaten legen ebenfalls nahe, dass zwei unterschiedliche und einzigartige pseudostationäre Zustände während der &kgr;-Carrageenan-Fermentationen erreicht wurden.

Die Aufgabe des Vergleichens unterschiedlicher Fermentationssysteme und Bewertens, welches sich besser verhalten hat, kann komplex werden, wenn die Verdienste des Systems auf mehr als einem Kriterium basiert sind. Wenn z.B. die insgesamte Ethanolproduktivität alleine als Maß für Erfolg verwendet würde, würden alle drei getesteten Systeme gleich bewertet werden, da die Produktion von 70 g/l Ethanol pro 50 l Reaktorvolumen über eine 24 Stunden-Verweilzeit in allen Fällen erreicht wurde.

Die Herstellung eines verkaufsfähigen Bieres erfordert mehr als einfache Ethanolherstellung. Das vorgeschlagene Fermentationssystem sollte bewertet werden hinsichtlich seiner Fähigkeit, ein akzeptables Bier (unter anderen Ethanolproduktivität und Diacetylkonzentrationen) herzustellen, hinsichtlich der potentiellen inkrementellen Kosten des Trägerstoffs, hinsichtlich der Verfügbarkeit des Trägerstoffs, hinsichtlich der Einfachheit des Betriebs des Systems, hinsichtlich Umweltangelegenheiten, wie Entsorgung des Trägerstoffs, hinsichtlich der Stabilität des Trägerstoffs wie auch der durch das Trägerstoffsystem gebotenen Flexibilität. Die Geschäftswelt verwendet einen "Balanced Scorecard" genannten dimensionslosen Analysenvorgang (Kaplan and Norton, 1996), um solch ein vielfältiges Szenario zu bewerten. Der erste Schritt umfasst die Identifizierung von Kriterien, hinsichtlich denen das System bewertet werden muss. Jedem Kriterium wird eine Bewertung auf einer Skala von 1 bis 5 gegeben, wobei 1 am wenigsten bevorzugt ist und 5 das Bevorzugteste ist. Am Ende der Analyse wird die Punktezahl für jede Option summiert, und die Alternative mit der höchsten Punktezahl ist unter den gegebenen Umständen die beste Wahl.

Tabelle 6.2 stellt die Ergebnisse der an den Immobilisierungsträgerstoffen, die als potentielle Alternativen zur Verwendung in dem pilotmaßstäblichen 50 l-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor zur Fermentation angesehen wurden, durchgeführten Balanced Scorecard-Analyse dar. Eine Gesamtzahl von 6 Trägerstoffen – Chitopearl® Chitosan-Kügelchen, Celite®-Kieselgur-Kügelchen, Siran®-Glaskügelchen, &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchen, mittelflockende LCC3021-Hefe und superflockende LCC290-Hefe – wurden mit der hauptsächlichen Zielsetzung der Herstellung eines verkaufsfähigen Bieres bewertet. Jedes Trägerstoffsystem wurde unter Verwendung der zuvor genannten Skala bewertet. Insgesamt leistete die superflockende LCC290-Hefe dies am besten, dicht gefolgt von der mittelflockenden Hefe, LCC3021. Die vier anderen Trägerstoffe erhielten Punkteanzahlen zwischen 16 und 20. Dem &kgr;-Carrageenan-System wurde dritte Präferenz gegeben, weil in der Piloteinheit eine verkaufsfähige Flüssigkeit hergestellt wurde. Diese Trägerstoffbeurteilung deutet stark darauf hin, dass der zukünftige Fokus in der Entwicklung kontinuierlicher Fermentationssysteme auf Selbstaggregation als Weise der Immobilisierung abgestellt werden sollte. Die Verfügbarkeit (einfach verfügbar), Kosten (geringe Kosten, da keine zusätzliche Ausrüstung zum Betreiben benötigt wird), Einfachheit des Betriebs (passt in bestehende Anlagen-Betriebsabläufe), die durch solch eine Alternative geboten werden, überwiegen die potentielle Instabilität der Hefeflocken in einem umgewälzten System. Es kann möglich sein, die Scherempfindlichkeit des Selbstaggregats zu verwenden, um die Flockengröße während des Fermentationsverfahrens zu steuern und möglicherweise Massentransfersteigerung zu erreichen, und daher weitere Steigerungen der volumetrischen Produktivität des Bioreaktors zu erreichen.

6.6 Herstellung eines Lager-Biers des nordamerikanischen Typs unter Verwendung der Gaslift-Leitrohr-Technologie

Die Herstellung eines sauber schmeckenden Lager-Biers des nordamerikanischen Typs (NA) stellt dem Brauer zahlreiche Herausforderungen. NA-Typ-Lager-Biere sind charakterisiert durch eine helle Farbe und ein Geschmacksprofil mit geringer Bittere, niedrigem Restzucker (dünn), keinem dominanten Aroma, und daher relativ keinem Nachgeschmack. Aufgrund dieser inhärenten Eigenschaften kann der Brauer sehr wenige Aromafehler maskieren. Hohe Konzentrationen von Diacetyl (butterig), Acetaldehyd (grüne Äpfel), wie auch schwefliger Fehlnoten (verbrannter Gummi, Stinktier-artig, verfaulte Eier, gekochte Gemüse), sind die häufigsten heutige Brauer-plagenden Aromaprobleme. Obwohl bakterielle Kontamination des Fermentationsmediums auch eine Ursache dieser Fehlaromen in Bier sein kann, bewirkt ungeeignete Steuerung des Fermentationsvorgangs oft höhere Fehlaromakonzentrationen als erwartet.

Während der ganzen als Teil dieser wissenschaftlichen Arbeit durchgeführten kontinuierlichen Fermentationsversuche wurden Kontaminationslevel, sowohl in der Würze als auch den Fermentationsbehältern durch gewissenhafte Anwendung aseptischer Techniken gesteuert. Die Fermentationsversuche mit allen drei Trägerstofftypen, die mehrere Monate dauerten, zeigten keine detektierbaren Konzentrationen von Kontaminanten (überwacht durch in Kapitel 4 berichtete Verfahren). Höhere Konzentrationen von Diacetyl als erwünscht (Ziel weniger als 30 &mgr;g/l) und Acetaldehyd (Ziel weniger als 10 mg/l) plagten die Produkte der kontinuierlichen primären Fermentationen, aber diese Konzentrationen lagen nicht an bakterieller Infektion. Diese Befunde weichen nicht von den in der Literatur berichteten ab (Pajunen et al., 2000; Kronlof et al., 2000). Eine belgische Brauerei verwandelte ihre hohen Konzentrationen von Acetaldehyd in Bier aus einem kontinuierlichen Fermentationsverfahren in ein Verkaufsmerkmal und vermarkteten das Produkt als ein Apfel-aromatisiertes Ale (Andries et al., 1996b).

Hohe, primärer Fermentation folgende Konzentrationen von Diacetyl sind in der Brauindustrie ebenso normal. Einige Brauer haben eine "freier Temperaturanstieg" genannte, dem Abschluss ihrer primären Fermentation folgende Praxis angenommen, um bei der Verringerung von Diacetyl zu helfen. Andere haben sich dafür entschieden, ihre Produkte einfach für längere Zeitperioden während des Alterungsverfahrens aufzubewahren, um die Verringerung der vizinalen Diketone (Diacetyl und 2,3-Pentandion) auf die gewünschten Konzentrationen zu erreichen. In einem anderen Ansatz entwickelten mehrere Forschungsgruppen die in Kapitel 2 diskutierte Schnellalterungstechnologie, um mit hohen Diacetylkonzentrationen umzugehen bzw. damit fertig zu werden. Obwohl dieser Ansatz sehr wirksam ist, fügt er dem insgesamten Brauverfahren einen weiteren Grad der Komplexität hinzu, den manche schwierig zu akzeptieren finden können.

Die Wirtschaftlichkeit des Schnellalterungsverfahrens ist recht klar, jedoch kann es in diesen frühen Tagen kontinuierlicher Behandlung in der Brauindustrie ratsam sein, technologische Komplexität zu minimieren, um den Übergang von traditioneller Chargenfermentation zu kontinuierlicher Herstellung zu erleichtern. Aus diesem Grund wurde entschieden, die Verwendung einer auf kontinuierliche primäre Fermentation in den pilotmaßstäblichen 50 l-Gaslift-Systemen folgende Chargenaufbewahrung zum Steuern der hohen Konzentrationen von Diacetyl in fertiggestelltem Bier zu untersuchen. Dieser zusätzliche Bearbeitungsschritt war am Beginn dieses Ph. D.-Programms nicht vorgesehen, dennoch war es nötig, solch eine Maßnahme zu implementieren, um die kontinuierlich hergestellten Biere mit Chargen-Kontrollbieren zu vergleichen.

6.6.1 Verwendung von kontinuierlicher primärer Fermentation folgender Chargenaufbewahrung

Ein kritischer Parameter beim Bestimmen des Abschlusses der primären Fermentation ist die Diacetylkonzentration in der endfermentierten Flüssigkeit. Die Umwandlung des Diacetyl-Vorläufers, &agr;-Acetolactat, zu Diacetyl ist der Geschwindigkeits-limitierende Schritt im Diacetyl-Pfad (Figur 3.5). Diese erste Reaktion ist chemischer Natur und stark von Temperatur abhängig. Wenn das Jungbier in den Kaltalterungsprozess kommt, bevor die chemische Umwandlung von &agr;-Acetolactat zu Diacetyl stattgefunden hat, kann das resultierende Bier Konzentrationen von Diacetyl über der Geschmacksschwelle von 20 &mgr;g/l haben, sofern nicht verlängerte Kaltalterungsperioden verwendet werden, um der langsamen Umwandlung des Vorläufers zu erlauben, stattzufinden. In allen drei in Abschnitt 6.5 beschriebenen kontinuierlichen Fermentationen war die aus dem Reaktor austretende Diacetylkonzentration über dem erwünschten Zielwert von 30 &mgr;g/l im unverdünnten Bier. Wenn die Flüssigkeit in dieser Stufe filtriert worden wäre, um die Hefe zu entfernen, würde das Diacetyl hoch bleiben, daher wurde eine warme Chargenperiode verwendet wurde, um den Diacetylwert unter das akzeptable Limit zu verringern.

Das kontinuierlich fermentierte Bier wurde gesammelt und in 40 l-Edelstahl-Bierbehältern bei 21°C aufbewahrt. Der Flüssigkeit wurden regelmäßig kleine Proben (100 ml) entnommen und bezüglich Diacetyl, Ethanol, spezifischem Gewicht, Estern und Fuselalkoholen analysiert. Figur 6.74 zeigt die Verringerung von Diacetyl gegen Warmaufbewahrungszeit für eine kontinuierlich mit LCC290-Hefe als der Immobilisierungsmatrix fermentierten Biercharge. Die Warmaufbewahrungsperiode war wirksam beim Reduzieren der Konzentration von Diacetyl von ~600 &mgr;g/l auf unter 30 &mgr;g/l, was in der Brauindustrie als das "pre-drop"-Limit angesehen wird.

In einem anderen Test wurde die Auswirkung von Umwälzung auf die Verringerung von Diacetyl während der Aufbewahrungsperiode untersucht. Ein Kohlendioxid-Einblasegas (0,14 m3/h) wurde durch eine 1,27 cm-Edelstahlverrohrung in den Boden des Biersammelbehälters eingeführt, um die Flüssigkeit während der Aufbewahrungsperiode umgewälzt zu halten. Figur 6.75 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments. Es schien, dass die durch das CO2-Einblasen gelieferte Umwälzung sehr wenig Auswirkung auf die Rate der Diacetylverringerung in diesem sekundären Aufbewahrungstank hatte. Dieses Ergebnis kann darauf schließen lassen, dass die durch das CO2-Einblasegas gelieferte Umwälzung inadäquat ist, und daher die Reaktionsrate bzw. -geschwindigkeit der ersten chemischen Reaktion (&agr;-Acetolactat-Umwandlung zu Diacetyl) nicht steigert oder die Stoffaustauschrate bzw. Massentransferrate für schnelleres Stattfinden der zweiten Reaktion nicht steigert (Umwandlung von Diacetyl zu Acetoin durch Hefe). Es kann auch möglich sein, dass der nicht-umgewälzte Behälter genügend Zellen in Suspension hatte, um weiter Diacetyl zu Aroma-inaktivem Acetoin zu reduzieren, sobald die Geschwindigkeits-limitierende chemische Umwandlung (erster Schritt) stattgefunden hatte.

Die Auswirkungen dieser auf kontinuierliche primäre Fermentation folgenden warmen Chargenaufbewahrung auf die Konzentrationen von Estern und Fuselalkoholen und die Ethanolkonzentration und das spezifische Gewicht der Flüssigkeit sind in Figuren 6.76 bzw. 6.77 dargestellt. Aus diesen Ergebnissen erscheint es, dass die Warmaufbewahrungsperiode nur eine geringe Wirkung auf die Konzentrationen von Acetaldehyd, Ethylacetat, Propanol, Isobutanol, Isoamylalkohol und Isoamylacetat hatte (Figur 6.76). Das spezifische Gewicht der Flüssigkeit im Aufbewahrungsbehälter nahm in den ersten 12 Stunden der Aufbewahrungsperiode von 2,7°P auf 2,0°P ab und pegelte sich dann bei diesem niedrigeren Wert ein. Ethanolkonzentration war während der 65 Stunden-Testperiode beständig bei 70 g/l. Diese Resultate zeigten, dass die Aufbewahrungsperiode hauptsächlich die Konzentration von Diacetyl und 2,3-Pentandion beeinflussen würde, während die Auswirkung auf Ester, Fuselalkohole und Ethanol minimal sein würde.

Das Chargenaufbewahrungs-Protokoll wurde durchgeführt an Flüssigkeit, hergestellt durch die kontinuierlichen Fermentationen im 50 l-Gasliftbioreaktor unter Verwendung von superflockender LCC290-Hefe, mittelflockender LCC3021-Hefe oder &kgr;-Carrageenan-mobilisierter Hefe. Die Diacetyl-Reduktionsprofile dieser drei Testläufe sind in Figur 6.78 gezeigt. Diacetyl wurde in allen drei Fällen erfolgreich unter seinen Zielwert von 30 &mgr;g/l reduziert. Die Zeit, die nötig war, um diese Reduktion zu erreichen, variierte jedoch in allen drei Fällen. In der LCC290-Situation war die Reduktion von 600 &mgr;g/l auf 30 &mgr;g/l in ungefähr 48 Stunden erfüllt, wohingegen die LCC3021-Fermentation und die &kgr;-Carrageenan-Fermentation nur ~24 Stunden und ~40 Stunden benötigten, um diesen Zielwert zu erreichen. Es wurde postuliert, dass diese Diskrepanz mit dem anfänglichen Startwert von Diacetyl und nicht mit dem Typ der verwendeten Immobilisierungsmatrix verknüpft war.

Figur 6.79 veranschaulicht die gleichen Diacetyl-Ergebnisse aus Figur 6.78 mit einer bei den Ergebnissen von LCC3021- und &kgr;-Carrageenan-Fermentationen durchgeführten Zeitanpassung. Die ursprünglichen Diacetyl-Reduktionskurven der letzten zwei Fermentationen wurden verschoben, so dass ihre anfänglichen Werte auf die durch die superflockende LCC290-Hefe gebildete Diacetyl-Reduktionskurve fielen. Mit dieser Transformation schien das Diacetyl-Reduktionsprofil für alle drei Systeme auf der gleichen Linie zusammen zu fallen. Diese Ergebnisse wurden unter Verwendung der TableCurve2D-Software an eine kinetische Gleichung erster Ordnung (Levenspiel, 1972) angepasst (Figur 6.80). Es wurde berechnet, dass sich die angepassten experimentellen Daten von Figur 6.79 der folgenden Gleichung anpassen: [Diacetyl] = 648,54e(–0,0426t)(6.1) mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,96.

Dieses Ergebnis unterstützt die Theorie stark, dass alle drei Immobilisierungssysteme das gleiche Diacetyl-Reduktionspotential zeigten. Die Ergebnisse sollten nicht überraschend sein, da Diacetyl-Reduktion oft mit dem Hefestamm verknüpft ist (Nakatani et al., 1984). Das &kgr;-Carrageenan-System immobilisierte die LCC3021-Hefe innerhalb seiner Gelstruktur, und die LCC290-Hefe war eine ausgewählte Variante des LCC3021-Stammes.

Sobald die Diacetylkonzentration unter der Zielkonzentration von 30 &mgr;g/l war, wurden die resultierenden Biere in Kaltlagerung (2°C) für 7 Tage gealtert, bevor sie endgültige Produktzubereitung durchliefen (Filtration, Verdünnung, Carbonisierung und Verpackung). Tabelle 6.3 fasst die Analysen der in den pilotmaßstäblichen 50 l-Systemen entweder mit LCC290-Hefe, LCC3021-Hefe oder &kgr;-Carrageenan-immobilisierter Hefe als den Immobilisierungsmatrizes-hergestellten Bieren zusammen. Figur 6.81 ist ein Netzdiagramm („radar-graph"), der Ester und Fuselalkohole von drei kontinuierlich hergestellten Bieren und von einem industriell in Charge hergestellten Kontrollbier. Im Vergleich zu der industriell hergestellten Chargenflüssigkeit (Kontrolle) hatten die kontinuierlichen Flüssigkeiten niedrigere Ester (Ethylacetat, Isoamylacetat) und höheres Propanol und niedrigeres Isobutanol, primären Amylalkohol und Isoamylalkohol. Die Acetaldehydkonzentrationen in den kontinuierlichen Fermentationsprodukten waren höher als in der Kontrollflüssigkeit. Der Aufschäumgrad, anfängliche Kältetrübung, Warmtrübung, Dimethylsulfid-, Schwefeldioxid-, Kohlendioxid- und Luftkonzentrationen waren innerhalb der Spezifikationen.

Etliche andere Parameter (scheinbarer Extrakt, wahrer Extrakt, berechneter ursprünglicher Extrakt, Farbe, Bittere), die durch die Verdünnung des Produkts von seiner ursprünglichen Ethanolkonzentration auf den endgültigen Wert von 5,0% V/V eng betroffen sind, waren von der Kontrolle unterschieden, weil die kontinuierlichen Produkte aufgrund höherer ursprünglicher Ethanolkonzentrationen (70 g/l gegen 60 g/l in Charge) höhere Verdünnung mit Wasser erforderten, um den gewünschten Ethanolwert zu erreichen. Figur 6.82 ist ein Netzdiagramm von Alkohol, Diacetyl, pH, Farbe und Bittere der gleichen, oben beschriebenen Flüssigkeiten. Die Alkoholkonzentration, Diacetyl und pH sind gut innerhalb des Ziels, wohingegen die Farbe und Bittere außerhalb der Spezifikation sind. Die geringere Farbe ist verknüpft mit der höheren Verdünnung, der die kontinuierlichen Flüssigkeiten ausgesetzt waren, und dies kann durch Steigern der Farbe in der Würzenährstoffeinspeisung eingestellt werden. Die Bittere-Werte unterliegen diesem gleichen Verdünnungsfehler und würden ebenfalls in der Würzeeinspeisung eingestellt werden.

6.6.2 Auswahl des besten Einblasegases

Kohlendioxid ist in den meisten Brauerein leicht verfügbar, da es ein natürliches Nebenprodukt der Hefefermentation ist. Brauerein sammeln das entwickelte CO2 und waschen dann den Gasstrom, um leichte Verunreinigungen, die in den Sammelstrom verschleppt worden sein könnten (typischerweise schweflige Verbindungen) zu entfernen. Dieser gereinigte Strom wird dann komprimiert und als Flüssigkeit für zukünftige Verwendung in der Brauerei (99,95% rein) gelagert. Die Verwendung von Kohlendioxid als ein Einblasegas in kontinuierlicher Fermentation schien von einer Betriebsperspektive her eine logische Wahl zu sein. Die Anlage wäre fähig, deren Sammelsystem zu verwenden und das aus dem kontinuierlichen Fermenter austretende CO2 zurückzugewinnen. Die Verwendung anderer Gase würde nur einen weiteren Komplexitätsgrad zu den bestehenden Anlagenoperationen hinzufügen.

Dennoch ist es notwendig, ein Produkt herzustellen, das eine enge Übereinstimmung mit bestehenden Marken ist, damit kontinuierliche Fermentation eine brauchbare Alternative zu bestehenden Chargenverfahren wird. Es wird angenommen, dass es durch Minimieren der biologischen/biochemischen Auswirkungen, denen die Hefe während kontinuierlicher Fermentation ausgesetzt ist, möglich sein kann, solch eine Produktübereinstimmung zu erreichen. Kohlendioxid ist bekannt dafür, Hefemetabolismus während primärer Fermentation nachteilig zu beeinflussen. Dieser Effekt ist in hohen zylindrokonischen Behältern verstärkt, wo der dem System inhärente Kopfdruck die Freisetzung von CO2 aus dem Flüssigmedium unterdrückt. Diese Bedingungen neigen dazu, Biere mit niedrigen Estern („lower esters") und höheren Fuselalkoholen („higher fusel alcohols") herzustellen. Erfolgreiche Versuche wurden gemacht, um einiges von diesem CO2 durch periodisches Injizieren eines Hilfsgasstromes in den Boden des zylindrokonischen Behälters zu entfernen. Die Auswirkungen von CO2-Hemmung schienen bei den resultierenden, weniger Fuselalkohole und höhere Ester-Konzentrationen enthaltenden Produkten verringert worden zu sein.

Aufbauend auf diesem Wissen wurde die Verwendung von Stickstoffgas anstatt von Kohlendioxid als Einblasegas im Gasliftsystem untersucht. Mehrere in den 50 l-Aufstiegs-Reaktoren („uplift reactors") fermentierte Flüssigkeiten wurden gesammelt und in der Labatt-Versuchsbrauerei unter Verwendung der folgenden Schritte bearbeitet. Nach 14 Stunden Flüssigkeitssammlung aus dem Reaktor (24 h Verweilzeit) wurde das Jungbier von der Hefe dekantiert. Diese Flüssigkeit wurde dann einer 48-stündigen Aufbewahrungsperiode bei Raumtemperatur (21°C) unterzogen, die es sowohl Diacetyl als auch Acetaldehyd ermöglichte, Labatt-Spezifikationen (Diacetyl < 30 &mgr;g/l und Acetaldehyd < 10 mg/l) zu erreichen. Diese Flüssigkeit wurde dann für 7 Tage kalt gealtert und unter Verwendung industrieller Standardpraktiken bearbeitet.

Tabelle 6.4 vergleicht die Ergebnisse von fertiggestellten Bieren, erhalten durch kontinuierliche Fermentation mit LCC290-Hefe unter CO2-eingeblasenen und N2-eingeblasenen Systemen mit einer industriell hergestellten Standardflüssigkeit (Kontrolle). Die Stickstoff-eingeblasene Flüssigkeit vergleicht sich vorteilhaft mit der industriell hergestellten Flüssigkeit. Analysen zeigten, dass dort zweimal soviel 1-Propanol in der Flüssigkeit war, wohingegen die Dimethylsulfidkonzentration ungefähr dreimal niedriger war. Sowohl Farb- als auch Bittere-Werte schienen höher zu sein als die der industriellen Flüssigkeit wie auch das durch den NIBEM-Test gemessene Schaumpotential. Das CO2-eingeblasene Bier hatte weniger Ester (Ethylacetat, Isoamylacetat) und mehr 1-Propanol als die Stickstoff-eingeblasene Flüssigkeit. Die Verhältnisse von Estern (Ethylacetat, Isoamylacetat, Ethylhexanoat, Ethyloctanoat, Ethyldecanoat) zu Fuselalkohol (1-Propanol, Isobutanol, Isoamylalkohol) wurden für die Kontrollflüssigkeit, die Stickstoff-eingeblasene Flüssigkeit und die CO2-eingeblasene Flüssigkeit berechnet und gefunden, 0,30, 0,27 bzw. 0,15 zu sein.

Figur 6.83 ist das die Ester-, Fuselalkohole- und Acetaldehydkonzentrationen für die drei Flüssigkeiten darstellende Netzdiagramm. Das Profil der Stickstoff-eingeblasenen Flüssigkeit folgt dem des Kontrollbieres, außer einer höheren Propanolkonzentration, eng. Die CO2-eingeblasene Fermentation zeigte viel niedrigere Ester- und Fuselalkohol-(gehalte), die nicht mit der Kontrolle übereinstimmten. In beiden kontinuierlichen Fermentationsflüssigkeiten waren die Diacetyl- und Acetaldehydkonzentrationen unter den Labatt-Spezifikationen.

Diese Ergebnisse legen nahe, dass Stickstoffeinblasung die Produktion von Estern auf ähnliche Höhen wie jene von kommerziellen Bieren steigerte, wohingegen Kohlendioxideinblasung Flüssigkeiten mit relativ niedrigen Esterkonzentrationen herstellte. Diese Ergebnisse weisen auf einen unter der CO2-eingeblasenen Umgebung geänderten Hefemetabolismus hin. Die Propanolkonzentrationen waren ungeachtet des Einblasegases in den kontinuierlich fermentierten Bieren viel höher als jene, die in industriell fermentierten Kontrollbieren gemessen wurden. Obwohl die Propanolkonzentrationen weit unter der Geschmacksschwelle von 100 mg/L sind, können die bemerkten Unterschiede ein Indikator eines, in kontinuierlicher Fermentation im Vergleich zu Chargenfermentation auftretenden, leicht veränderten Metabolismus sein. Es ist auch möglich, dass die höhere Propanolkonzentration an der kontinuierlichen Zufuhr der Aminosäure Threonin liegt, welche Propanol durch den Oxasäure-Abbaupfad ergeben wird.

KAPITEL 7.0 SCHLUSSFOLGERUNGEN

Die folgenden Schlussfolgerungen können aus der während dieser wissenschaftlichen Arbeit geleisteten Forschung gezogen werden. Ein akzeptables Bier ohne größere Aromadefekte kann unter Verwendung eines pilotmaßstäblichen 50 l-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktors als dem kontinuierlichen primären Fermenter hergestellt werden, wenn eine 2-tägige Chargenaufbewahrung zur Steuerung von Diacetyl folgt. Eine minimale Verweilzeit von 24 Stunden oder 1 Reaktorvolumen-Umsatz pro Tag ist für die Fermentation von high gravity-Würze (17,5°P) zu einer endfermentierten Brühe (2,5°P) erreichbar. Die Verwendung von superflockender Hefe LCC290, mittelflockender Hefe LCC3021 und &kgr;-Carrageenan-immobilisierter Hefe sind alle brauchbare Trägerstoffe im Gasliftsystem. Die Verwendung von schwereren vorgeformten Trägerstoffen, wie Siran®-Glaskügelchen und Celite®-Kieselgurkügelchen sind keine praktischen Alternativen in einem Gaslift-Leitrohr-System. Ein Minimum von 2 Monaten kontinuierlichem Betrieb im Fall von &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchen und ein Minimum von 3 Monaten kontinuierlichem Betrieb im Fall von LCC290- und LCC3021-Fermentationen sind ohne Erfahren jeglicher mikrobieller Kontaminationen oder Instabilitäten der Reaktorleistung erreichbar. Zusätzlich war das kontinuierliche System fähig, mögliche und angenommene Variationen in der industriellen Würzeversorgung während der ausgedehnten Laufperioden zu handhaben.

Kontinuierliche Fermentation unter Verwendung der superflockenden Hefe LCC290 mit Stickstoff als dem Einblasegas, gefolgt von einer 2-tägigen Chargenaufbewahrung, ergab die engste Aromaübereinstimmung mit einem industriellen Kontrollbier. Die um mit den hohen Konzentrationen von Diacetyl in der Auslaufflüssigkeit des kontinuierlichen primären Fermenters umzugehen entworfene 2-tägige Chargenaufbewahrung war ein wirksamer, wenngleich nicht optimaler Steuerungsmechanismus. Die Diacetyl-Reduktionskapazität der drei getesteten kontinuierlichen Fermentationssysteme war sehr ähnlich und, wie zuvor vermutet, kann dieses Merkmal dem Stammtyp zugeschrieben werden. Die Chargenaufbewahrungsperiode beeinflusste die Konzentrationen von Estern und Fuselalkoholen im Bier während der Aufbewahrungsstufe nicht.

Verwenden von 3% Sauerstoff in dem Einblasegas lieferte adäquate Sauerstoff-Nährstoff-Konzentrationen in der Würze, resultierend in der Erhaltung einer lebensfähigen Hefepopulation (über 90%) über die Fermentationsläufe hinweg, während Biere mit einem akzeptablen Aromaprofil hergestellt werden. Die LCC290-Hefe und LCC3021-Hefe als die Immobilisierungsmatrizes verwendenden kontinuierlichen Fermentationen erreichten einen pseudostationären Zustand viel schneller als das &kgr;-Carrageenan-Gelkügelchen-System. die Instabilität von &kgr;-Carrageenan-immobilisierten Fermentationen, möglicherweise resultierend aus einem Anstieg der immobilisierten Hefepopulation, verursachte die Fermentation von Produkt unterhalb von Zielwerten. Für ideale kontinuierliche Herstellung ist dieses Phänomen höchst unerwünscht, da der verlängerte Beginn die Zeit erhöht, die nötig ist, um auf ein katastrophales Versagen folgend zu reagieren und wieder zu beginnen. Eine längere Beginnphase wird auch eine längere kontinuierliche Laufphase erfordern, um attraktiv zu werden.

Das kontinuierliche Gelkügelchen-Herstellungsverfahren stellte die benötigten Mengen von Kügelchen zum Testen in den pilotmaßstäblichen Anlagen her. Es ist jedoch nötig, das Kügelchenherstellungsverfahren weiter zu optimieren, um Kügelchen mit einer engeren Größenverteilung herzustellen. Das Verfahren erfordert ebenso weitere Untersuchung, um seine Tauglichkeit in einem industriellen Maßstab zu bestimmen. Statt dem in dieser Forschung untersuchten Kenics-Typ muss ein neuer Typ eines statischen Mischers, bei dem Scale-up durch Steigern des Durchmessers eher als einzig und allein der Anzahl statischer Mischer erreicht werden kann, gefunden und getestet werden, damit diese Option realisierbar wird.

Die in dieser wissenschaftlichen Arbeit angewendete Säureimpuls-Tracer-Technik erlaubte uns, die Mischungszeit und Umwälzrate im pilotmaßstäblichen 50 l-Bioreaktor während tatsächlicher, superflockende Hefe LCC290, mittelflockende Hefe LCC3021 und &kgr;-Carrageenan-immobilisierte Hefe umfassender Fermentationen festzustellen. Die Mischungsdaten wurden einer abklingenden sinusförmigen Funktion angepasst, aus der die Mischungszeit und Umwälzrate berechnet wurden.

In dem Gaslift-Leitrohr-System ist schnelle Mischung mit zu weniger als 200 Sekunden für alle drei Typen von Immobilisierungsträgerstoffen berechneten Mischungszeiten gewährleistet. Mischungszeit nahm in allen drei getesteten Szenarien leicht mit Steigerungen der Oberflächengeschwindigkeit des Gases ab. Bei allen getesteten Oberflächengeschwindigkeiten des Gases (2 mm/s bis 6 mm/s) zeigte das LCC290-System die schnellsten Mischungszeiten (zwischen 100 s und 120 s). Die Flüssigkeitsumwälzungszeiten waren bei allen drei Trägerstofftypen ungeachtet der Oberflächengeschwindigkeit des Gases sehr ähnlich. Ebenso nahmen sie linear mit entsprechenden Anstiegen der Gasgeschwindigkeit ab. Vollständige Flüssigkeitsmischung (98% Reaktion auf einen Impuls) trat innerhalb von drei bis sechs Reaktor-Umwälzungszyklen bei allen getesteten Immobilisierungsträgerstoffen auf. Diese Ergebnisse bestätigten, dass das getestete pilotmaßstäbliche 50 l-System eine adäquate Mischung für kontinuierliche Fermentation bereitstellte. Schlechte Mischungszeiten hätten auf mögliche Totzonen hingewiesen, die für Bierfermentation nicht wünschenswert gewesen wären.

Diese Ph. D.-Forschungsarbeit hat die Machbarkeit des Fortsetzens eines weiteren Scale-ups des in der Labatt-Versuchsbrauerei entworfenen, gebauten und betriebenen Herstellungssystems klar gezeigt. Die Verwendung eines Gaslift-Leitrohr-Bioreaktors mit superflockender Hefe LCC290 und Stickstoff als dem Einblasegas, gefolgt von einer 2-tätigen Chargenaufbewahrung bei 21°C, wird als das System der Wahl empfohlen.

Detaillierte Beschreibung – Teil 2: KAPITEL 4. MATERIALIEN UND METHODEN 4.1 Hefestamm und Eigenschaften

Während dieser ganzen Arbeit wurde ein Lager-Braustamm von Saccharomyces cerevisiae, Labatt Culture Collection (LCC) 3021, verwendet. Saccharomyces cerevisiae ist synonym mit Saccharomyces uvarum Beijerinck var. carlsbergensis Kudryavtsev, 1960 (Kurtzman, 1998). LCC3021 wird bei 37°C nicht wachsen. Dies hilft dabei, LCC3021-Lager-Hefe von den meisten Ale-Hefen zu unterscheiden, die bei 37°C und höheren Temperaturen wachsen werden. LCC3021 ist ein untergäriger Stamm, wie es die meisten Lager-Hefen sind, aber es gibt Ausnahmen. Dieser Stamm wird ebenfalls Glucose, Galactose, Saccharose, Maltose, Raffinose und Melibiose, aber nicht Stärken fermentieren. Die Fähigkeit, Melibiose zu fermentieren, ist ein von Taxonomen verwendetes Werkzeug, um sie von Ale-Hefe zu unterscheiden.

Wie die meisten Braustämme ist LCC3021 polyploid und reproduziert sich durch mitotische Teilung. Unter normalen Braubedingungen reproduziert sich Lager-Hefe nicht durch Meiose. Dies hat den Vorteil, dass es den Braustamm genetisch stabil macht, weil Kreuzung von genetischem Material weniger wahrscheinlich ist (Kreger-van Rij, 1984).

4.2 Herstellung von Hefe-Inokulum

Hefe wurde aus einem kryogen in einem –80°C-Gefrierschrank konservierten Fläschchen entnommen und auf Pepton-Hefeextrakt-Nährstoff (PYN)-Agar (Pepton, 3,5 g/L; Hefeextrakt, 3,0 g/l; KH2PO4, 2,0 g/l; MgSO4·7H2O, 1,0 g/l; (NH4)2SO4, 1,0 g/l; Glucose, 20,0 g/l; Agar, 20,0 g/l in dH2O)-Wachstumsmedium ausgestrichen, um gut separierte Kolonien zu erhalten. Eine aus mehreren Kolonien bestehende sterile Öse wurde von der 3–4 Tage alten Platte wachsender Hefe entnommen, und diese Kolonien wurden in ein 10 ml-Volumen Würze in ein Teströhrchen inokuliert. Diesem wurde ermöglicht, bei 21°C über Nacht zu wachsen, daher die Bezeichnung "Über-Nacht-Kultur", und wurde dann zu dem größeren Volumen von Würze, üblicherweise 200 ml, zugesetzt, um Hefe-Biomasse zu steigern. In darauffolgenden Tagen wurde diese Mischung einem weiteren größeren Volumen von Würze zugesetzt, usw., bis die erwünschte Menge Hefe-Biomasse propagiert war. Allgemein erwartet man, ungefähr 20 g Lager-Hefe pro Liter Würze herzustellen. Um Hefe-Inokulation vorzubereiten, wurde die Kultur bei 4°C und 1,0 × 104 U/min (Radius = 0,06 m) für 10 min zentrifugiert. Nach Zentrifugieren wurde die Flüssigkeit dekantiert, und das zweckmäßige Nassgewicht Hefe wurde aus dem Pellet zum Anstellen erhalten.

4.3 Würze-Fermentationsmedium

Labatt Breweries of Canada lieferte Brauereiwürze mit einem spezifischen Gewicht von 17,5°P. Die Konzentration fermentierbarer Kohlenhydrate, spezifisches Gewicht und freier Aminostickstoff in der für die Fermentationen während dieser ganzen Arbeit verwendeten Brauwürze ist in Anhang A2.1 angegeben. Zusätzliche Einzelheiten der Würzezusammensetzungen werden von Dale et al., 1986, Hoekstra, 1975, Hough et al., 1982, Klopper, 1974, und Taylor, 1989, angegeben.

Chargenfermentationen: Würze wurde in einem Autoklaven für 45 min bei 100°C erhitzt und dann vor Inokulation mit immobilisierten Zellkügelchen oder frei suspendierter Hefe abgekühlt.

Kontinuierliche Fermentationen: Die für die kontinuierlichen Fermentationen verwendete Würze wurde vor dem Einspeisen in den Gasliftbioreaktor Blitz-pasteurisiert (Fisher Plattenwärmeaustauscher, Combi-flow Typ Eurocal 5FH), und diese Würze wurde regelmäßig, wie in Abschnitt 4.6 beschrieben, auf mikrobielle Kontaminanten überwacht. Falls Kontamination in der Würze detektiert wurde, wurde sie unverzüglich verworfen, und neue Würze wurde von der Anlage gesammelt.

Der Blitz-Pasteurisator wurde bei einer volumetrischen Flussrate von 0,8 m3/h betrieben. Die Einheit hatte eine röhrenförmige Haltesektion, wo die Würze auf einer durchschnittlichen Temperatur von 85°C mit einer minimalen Temperatur von 80°C gehalten wurde. Das Volumen der Haltesektion war 1,13 × 10–2 m3, eine Verweilzeit von 51 Sekunden in der Haltesektion ergebend. Dem Erhitzungsschritt folgend, wurde die Würze beim Austritt aus der Einheit rasch auf eine Temperatur von 2°C abgekühlt.

4.4 Immobilisierungsmethodik

kappa-Carrageenan-Gel X-0909 war ein großzügiges Geschenk von Copenhagen Pectin A/S. Eingeschlossene Lager-Hefezellen-enthaltende kappa-Carrageenan-Kügelchen wurden unter Verwendung des statischen Mischer-Verfahrens, wie im Detail von Neufeld et al. (1996) beschrieben, mit anfänglichen Zellbeladungen von 107–108 Zellen/ml Gel hergestellt, die für jedes Experiment vorgeschrieben sind. Wie in 15 dargestellt, beruht das statische Mischer-Verfahren auf der Bildung einer Emulsion zwischen einer nicht-wässrigen kontinuierlichen Phase, Pflanzenöl (Mazola Maisöl), und einer wässrigen dispergierten Phase, kappa-Carrageenan (3% G/V) in KCl-Lösung (0,2% G/V), inokuliert mit Hefe, unter Verwendung statischen Mischern aus Polyacetal in Reihe („in-line")(Cole-Parmer Instrument Co., USA). In der Erwärmungssektion des Schemas, wo die Hefe rasch mit der Carrageenan-Lösung gemischt wurde und die Emulsion gebildet wurde, war die Temperatur 37°C. Gelierung der kappa-Carrageenan-Tröpfchen in der Emulsion wurde durch rasches Abkühlen in einem Eisbad und nachfolgendes Härten in einem Kaliumchloridbad (22 g/L) induziert. Ein statischer Mischer mit 6,4 mm Durchmesser mit 24 Elementen wurde verwendet, um die Mischung von Hefe und Carrageenan zu schaffen. Ein zweiter 42 Elemente-Mischer mit 12,7 mm Durchmesser wurde verwendet, um die Emulsion zu schaffen. Die für die Experimente in dieser Arbeit verwendeten Kügelchen waren 0,5 mm < (Kügelchendurchmesser) < 2,0 mm.

4.5 Kumulative Partikelgrößenverteilung von kappa-Carrageenan-Gelkügelchen Enthaltend immobilisierte Hefezellen

kappa-Carrageenan-Gelkügelchenproben wurden einem 30 L-Produktionslauf von Gelkügelchen zufällig entnommen, um eine Partikelgrößenverteilung auf einer Nassgewicht-Massenbasis zu berechnen. Jede Probe hatte ungefähr 500 g Nassgewicht. Um die Kügelchen-Partikelgrößenverteilung zu bestimmen, wurde Sieben verwendet. Die Kügelchen wurden durch eine Serie von Sieben mit Netzgrößen von 2,0, 1,7, 1,4, 1,18, 1,0 und 0,5 mm geleitet. Ein Volumen von 4,5 L einer KCl-Lösung (22 g/L) wurde verwendet, um das Sieben jeder Kügelchenprobe zu erleichtern. Es wurde angenommen, dass die kappa-Carrageenan-Gelkügelchen perfekt sphärisch sind, so dass der Siebdurchmesser als der Partikeldurchmesser angenommen wurde. Es wurde ebenso angenommen, dass die Partikeldichte gleichförmig und unabhängig von der Partikelgröße war.

4.6 Hefezellzählung und Lebensfähigkeit

Lebensfähigkeit frei suspendierter Hefe und Zellkonzentration: Die internationale Methylenblau-Färbetechnik der American Society of Brewing Chemists (Technical Committee and Editorial Committee of the ASBC, 1992) wurde verwendet, um Hefezell-Lebensfähigkeit zu messen. Der Farbstoff misst, basierend auf der Fähigkeit lebensfähiger Zellen, den Farbstoff zu seiner farblosen Form zu oxidieren, ob eine Hefepopulation lebensfähig oder nicht-lebensfähig ist. Nicht lebensfähigen Zellen fehlt die Fähigkeit, den Farbstoff zu oxidieren, und sie färben sich daher blau. Gepufferte Methylenblau-Lösung nach Fink-Kuhles wurde hergestellt durch Mischen von 500 ml Lösung A (0,1 g Methylenblau/500 ml dH2O) mit 500 ml Lösung B (498,65 ml von 13,6 g KH2PO4/500 ml dH2O, gemischt mit 1,25 ml von 2,5 g Na2HPO4·12H2O/100 ml dH2O), um eine endgültige gepufferte Methylenblau-Lösung mit einem pH von 4,6 zu ergeben.

Die verdünnte Hefelösung wurde mit der Methylenblau-Lösung in einem Teströhrchen zu einer Suspension von ungefähr 100 Hefezellen in einem mikroskopischen Feld gemischt. Ein kleiner Tropfen der gut gemischten Suspension wurde auf einem Mikroskopobjektträger platziert und mit einem Deckglas abgedeckt. Ein bis fünf Minuten Kontakt mit dem Farbstoff folgend, wurden die blaugefärbten Zellen und die farblos bleibenden Zellen ausgezählt. Der Prozentsatz lebensfähiger Zellen wurde als Prozentsatz der Gesamtzahl ausgezählter Zellen angegeben. Zellkonzentration wurde unter Verwendung eines Lichtmikroskops und eines Hämazytometers (Hauser Scientific Company) bestimmt.

Lebensfähigkeit und Zellkonzentration immobilisierter Zellen: Gelkügelchen wurden von der fermentierenden Flüssigkeit durch Durchleitung der Mischung durch ein steriles Sieb (500 &mgr;m Porenmaschengröße) und Spülen mit 10 ml destilliertem Wasser abgetrennt. Eingeschlossene Hefe enthaltende Gelkügelchen, 1 ml, wurden zu einem 19 ml destilliertes Wasser enthaltenden sterilen 50 ml-Probenbehälter zugesetzt. Die Kügelchen wurden dann unter Verwendung eines Polytron®-Apparats (Brinkmann Instruments) aufgebrochen, um die Zellen aus dem Gel freizusetzen. Zelllebensfähigkeit und -konzentration wurden dann wie für die frei suspendierten Zellen beschrieben gemessen.

4.7 Mikrobiologische Analysen

Flüssigphasen Analysen: Mindestens einmal pro Woche wurden Proben von den kontinuierlichen Fermentationen für mikrobiologische Analysen genommen. Die Würze, die für kontinuierliche Fermentationen verwendet wurde, wurde ebenfalls vor dem Überführen in den Bioreaktor untersucht. Zum Untersuchen auf das Vorhandensein von sowohl aeroben als auch anaeroben Bakterien wurden Proben auf Universal Beer Agar (UBA, Difco Laboratories) mit dem Zusatz von 10 mg/l Cycloheximid plattiert und bei 28°C für 10 Tage inkubiert. Platten, die auf anaerobe bakterielle Kontamination untersucht wurden, wurden in einem anaeroben Behälter mit einem AnaeroGen®-Paket (Oxoid) platziert, das, eine anaerobe Umgebung schaffend, jeglichen im Behälter verbleibenden Sauerstoff aufnimmt. Ein anaerober Indikator (Oxoid), der in Anwesenheit von Sauerstoff rosa wird, wurde verwendet, um anaerobe Bedingungen im Behälter zu verifizieren. Wildhefe-Kontamination wurde untersucht durch Plattieren von Proben auf Hefemedium (YM-Agar, Difco-Laboratories) plus CuSO4 (0,4 g/l), inkubiert bei 25°C für 7 Tage. Pepton-Hefeextrakt-Nährstoff-Agar (PYN), vorher beschrieben, wurde verwendet, um Proben auf nicht-Lager-Hefe-Kontaminanten bei 37°C für 7 Tage zu durchsuchen. Die Abwesenheit von Hefewachstum auf PYN bei 37°C zeigte, dass keine Ale-Hefe oder bei 37°C wachsende Kontaminanten anwesend waren.

Gelphase-Analysen: In unserem Laboratorium wurde ein Assay entwickelt, um sicherzustellen, dass die für Fermentationen zu verwendenden immobilisierten Zellkügelchen frei von kontaminierenden Bakterien waren, bevor sie in den Bioreaktor eingebracht wurden. Das Hauptanliegen war es, Kontamination mit Bierverderbsorganismen, wie Pediococcus sp. und Lactobacillus sp. oder Wildhefe zu vermeiden. Ein 3 ml-Volumen Carrageenan-Gelkügelchen wurde in 100 ml von mehreren unten beschriebenen selektiven Flüssigmedien inokuliert und in 250 ml-Kolben bei 25°C platziert und bei 100 U/min in einem Inkubatorschüttler geschüttelt. NBB-Bouillon (Nachweis von Bier-schädlichen Bakterien) (BBL Kat# 98139, NBB-Bouillon-Basis, 0,02 g/l Cycloheximid) ist ein semi-selektives Medium, welches verwendet wird, um auf Bier-verderbende Bakterien, wie z.B. Pediococcus sp. und Lactobacillus sp., zu untersuchen. Kupfersulfat-Bouillon (16 g/l YM-Bouillon, Difco; 0,4 g/l CuSO4) ist ein semi-selektives Medium zum Untersuchen auf Wildhefe-Kontaminanten. Schließlich wird Standard Methods (STA) + Cycloheximid-Bouillon (16 g/l "Standard Methods"-Bouillon, Difco; 0,02 g/l Cycloheximid) verwendet, um auf in Wasser, Abwasser, Molkereiprodukten und Lebensmitteln gefundene Bakterien zu untersuchen (Power und McCuen, 1988). Die selektiven Medien wurden ausgewählt, um potentielle Bierverderbsorganismen innerhalb von drei Tagen zu detektieren und identifizieren. Kontaminierte Proben wurden durch Trübung in der Probe angezeigt, und eine vorläufige Identifizierung der Kontaminanten wurde durchgeführt.

Methodik zur Detektion respiratorisch defizienter („respiratory deficient") (RD) Hefezellen: Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Überschicktungstechnik: Dieses Verfahren wurde angewendet, um respiratorisch defiziente Hefen vom Rest der Population zu unterscheiden, und es basiert auf dem Prinzip, dass TTC ein farbloses Salz ist, das bei Reduktion ein rotes Präzipitat bildet. Wenn auf Hefe-Pepton-Dextrose (YPD)-Agar (Hefeextrakt, 10 g/l; Pepton, 20 g/l; Dextrose, 20 g/l, Agar, 20 g/l in dH2O)-wachsende Hefekolonien mit TTC überschichtet werden, wird Hefe mit genügender Respiration das TTC reduzieren, und diese Kolonien werden dunkelrosa bis rot werden. Respiratorisch defiziente Hefe jedoch reduziert den Farbstoff nicht und behält ihre ursprüngliche Farbe.

Kulturen wurden seriell auf eine zum Plattieren geeignete Konzentration von Mikroorganismen, ~100 Zellen/0,2 ml, verdünnt. Die YPD-Platten wurden dann für ungefähr 3 Tage bei 21°C inkubiert, bis Hefekolonien in einer aeroben Umgebung sichtbar waren. Jede Platte wurde dann mit 20 ml von 50°C TTC-Überschichtungsagar überschichtet. Nach Abkühlen der einzelnen Lösungen auf 50°C wurde TTC-Überschichtungsagar hergestellt durch Mischen von Lösung A (12,6 g/l NaH2PO4; 11,6 g/l Na2HPO4; 30,0 g/l Agar in dH2O, autoklaviert bei 121°C, 15 min) mit Lösung B (2,0 g/l 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid in dH2O, autoklaviert bei 121°C, 15 min) im Verhältnis 1:1.

Platten wurden nach 3 Stunden Inkubation bei Umgebungstemperatur abgelesen. Prozent RD wurde als Prozent ungefärbter Kolonien der beobachteten Gesamtzahl berichtet.

4.8 Rasterelektronenmikroskopie („Scanning-electronen-microscopy")(SEM) von in kappa-Carrageenan-Gelkügelchen immobilisierter Hefe

Immobilisierte Hefe-enthaltende kappa-Carrageenan-Gelkügelchen wurden aus dem Bioreaktor durch den Probenstutzen entfernt und mit in einem kleinen Volumen der Fermentationsbrühe untergetauchten Gelkügelchen in einem 10 ml-Schraubverschluss-Glasfläschchen platziert. Das Fläschchen wurde unverzüglich mit Eis bedeckt und in einem isolierten Behälter zu der SEM-Anlage transportiert. Immobilisierte Hefe-enthaltende kappa-Carrageenan-Gelkügelchen wurden fixiert in 2% (V/V) Glutaraldehyd, zubereitet in Sorensen's Phosphatpuffer, 0,07 M, pH 6,8 (Hayat, 1972). Dies wurde gefolgt von einem Nachfixieren in 1% (G/V) Osmiumtetroxid, zubereitet im gleichen Puffer, und Dehydration durch eine abgestufte Serie von Alkohollösungen 50, 70, 80, 90, 95, 100% (V/V), bei 15 min für jede und dann drei Wechseln bei 100%. Vor kritischer Punkt-Trocknung (Ladd Research Industries, Burlington, VT) durch Kohlendioxid wurden einige Kügelchen in flüssigem Stickstoff gefroren, gebrochen und in 100% Alkohol gesammelt. Gefrierbrechen erlaubt es der Innenfläche der Kügelchen, mit minimaler Verformung freigelegt zu werden. Nach kritischer Punkt-Trocknung wurden die Proben mit 30 nm Gold/Palladium Sputter-beschichtet (Polaron SC500 Sputter coater, Fison Instruments, England) und dann mit einem Hitachi S-4500-Feldemissionsrasterelektronenmikroskop (Nissei Sangyo, Tokyo, Japan) gescannt.

4.9 Bioreaktor-Probenahme-Protokoll

Das Bioreaktor-Probenstutzen-Reservoir (Scandi-Brew Typ T Membranprobenventil) war gefüllt mit 70% (V/V) Ethanollösung, um aseptische Bedingungen um die Öffnung zwischen Probennahmen zu erhalten. Um eine Probe zu nehmen, wurde vor dem Öffnen des Stutzens der Stöpsel aus der Basis des Ethanolreservoirs entfernt, es wurde abgelassen und Ester wurde gründlich mit Ethanol gespült. Proben wurden in ein Bördelfläschchen oder ein Schraubverschlussgefäß gesammelt und die Volumina variierten, abhängig von der erforderlichen Analyse, von 5–60 ml. Um auf mikrobiologische Kontamination zu untersuchen, wurden 10 ml der Fermentationsflüssigkeit mittels Vakuum durch eine sterile Membranfiltereinheit gepumpt. Die Membran, 0,45 &mgr;m Porengröße, wurde wie in Abschnitt 4.6 beschrieben auf einem geeigneten Selektivmedium platziert.

Für chemische Analysen wurden durch das Septum 60 ml Probe aus dem 100 ml-Fläschchen mit Bördelverschluss entnommen und durch ein doppellagiges Spritzenfiltersystem, 5 &mgr;m und 0,45 &mgr;m Porengrößen, Schleicher und Schull, FP-050, Spritzen-filtriert. Das erforderliche Volumen der Probe wurde dann in ein 20 ml-Headspace-Gefäß dispensiert und mit einem Teflonseptum und eine Aluminiumkappe zugebördelt. Die erforderlichen Probenvolumen sind in Tabelle 4.1 aufgelistet. Probe Volumen (ml) Ethanol 5 Kurzkettige Diole 10 Flüchtige Bierinhaltsstoffe 12 Vizinale Diketone 5 Kohlenhydrate/spezifisches Gewicht/ 12 freier Aminostickstoff/Protein 12

4.10 Messung gelösten Sauerstoffs

Der Dr. Thiedig Digox 5-Gelöst-Sauerstoff-Analysator misst gelösten Sauerstoff im Bereich von 0,001–19,99 mg/l in Würze, fermentierender Würze und Bier (Anon, 1998). Vilachá und Uhlig (1985) testeten viele Instrumente zur Messung von gelöstem Sauerstoff in Bier und fanden, dass der Digox-Analysator vertrauenswürdige, präzise Werte angibt. Das von Digox 5 verwendete elektrochemische Messverfahren basiert auf einer amperometrischen Drei-Elektroden-Anordnung mit einem Potentiometer. Die Messzelle besteht aus einer Messelektrode (Kathode) und Gegenelektrode (Anode). Diese Elektroden sind der Flüssigkeit, in der die Sauerstoffkonzentration zu messen ist, ausgesetzt. Nach Anlegen eines definierten Messpotentials tritt an der Messelektrode eine Reaktion auf. An der großen silbernen Messelektrode werden Sauerstoffmoleküle zu Hydroxylionen reduziert. Zwei Wassermoleküle reagieren in Gleichung 4.1 mit einem Molekül Sauerstoff, ergebend vier Hydroxylionen, unter Aufnahme von vier Elektronen. O2 + 2H2O + 4e → 4OH(4.1)

Die Edelstahlanode nimmt die vier an der Kathode freigesetzten Elektronen auf, um den Stromfluss zu sichern. In Gleichung 4.2 ist der Messstrom, I, direkt proportional zu der Sauerstoffkonzentration CL,O: I = K × CL,O(4.2) wobei die Konstante, K, beeinflusst ist durch die Faraday-Konstante, die Anzahl pro Molekül umgesetzter Elektronen, der Kathodenoberflächenfläche und der Breite der Grenzschicht an der Oberfläche der Messelektrode. Ein konstantes, charakteristisches Messpotential ist kritisch für die Selektivität (für Sauerstoff) und Präzision der Messung. Die Messspannung wird stabilisiert durch die Referenzelektrode, die nicht durch Strom belastet ist. Dies liefert zusammen mit dem Potentiostaten, der elektronischen Feedback liefert, ein konstantes Messpotential. Die Oberfläche der Messelektrode ist mit der Referenzelektrode über ein Diaphragma elektrolytisch verbunden.

Der Fehler, basierend auf dem Messbereich der endgültigen Konzentration gelösten Sauerstoffs, war ±3% (Anon, 1998). Der Gelöst-Sauerstoff-Analysator wurde unter Verwendung der Thiedig Active Calibration kalibriert, in der das Digox 5, basierend auf dem Faradayschen Gesetz, eine definierte Sauerstoffmenge herstellt (0,500 mg/l), und dies mit den in der Matrix gemessenen Werten querprüfte. Dies erlaubte es dem Instrument innerhalb einer Minute, unter dem Druck, der Temperatur und den Flussbedingungen, die jenen der Messung entsprechen, kalibriert zu werden. Weil der Austausch von Molekülen im Sensor ein Diffusionsvorgang ist, ist er beeinflusst durch Temperatur, resultierend in schnelleren Reaktionsraten und Anstiegen im gemessenen Strom. Deshalb ist das Digox 5 auch mit einem Sensor, der Temperatur misst und automatisch Fluktuationen kompensiert, ausgestattet.

Das Digox 5 hat einige Vorteile gegenüber Membran-basierten Sauerstoffsensoren. Weil das Digox keinen Elektrolyten verwendet, ist sein Empfindlichkeitsverlust relativ langsam, und es treten nur geringfügige Ablagerungen auf der Messelektrode auf. Auch die Empfindlichkeit kann zu jeder Zeit durch Durchführen einer aktiven Kalibrierung bestimmt werden. Es ist eine einfache Prozedur, die Elektrode zu reinigen und das Instrument zu rekalibrieren. In den meisten Membransensoren wird Silberchlorid auf der Kathode abgelagert, und die Elektrolytlösungen ändern sich, resultierend in fortschreitend niedrigeren Ablesungen. Aus diesem Grund wird empfohlen, dass Membranen und Elektrolyte alle paar Wochen getauscht und dann rekalibriert werden, eine längliche und beschwerliche Aufgabe. Kalibration der Membran-basierten Sensoren wird üblicherweise im Labor bei Sauerstoffsättigungskonzentrationen durchgeführt, die nennenswerte Fehler verursachen könnten, insbesondere in der Würze- und Biermatrix bei sehr niedrigen Sauerstoffkonzentrationen. Temperatur wird einem dreifachen Einfluss auf Membran-basierte Sauerstoffsensoren haben: Membranpermeabilität wird sich ändern, der Partialdruck von Sauerstoff wird sich ändern und die Löslichkeit von Sauerstoff im Elektrolyt wird sich ändern. Temperaturkompensation dieser drei Faktoren in Membran-basierten Sensoren ist schwierig.

Messung gelösten Sauerstoffs in der Würze während Lagerung: Flexible Tygon®-Leitung in Lebensmittelqualität (1/4 Zoll i.D.) wurde aseptisch mit einem nahe dem Oberteil der konischen Basen der Würze-Lagertanks, T-1 und T-2 (siehe Abschnitt 4.2.1), befindlichen Probenstutzen verbunden. Eine geschwindigkeitsvariable peristaltische Pumpe lieferte volumetrische Flussrate von 11 l/h durch den Gelöst-Sauerstoff-Analysatorblock (Masterflex® L/STM Digital Standard Drive, Cole-Parmer Kat. #P-07523-50). Messungen in Würze gelösten Sauerstoffs wurden dann nach 4–5 Minuten aufgenommen.

Messung gelösten Sauerstoffs im Bioreaktor: Vor Durchführen der Messungen des gelösten Sauerstoffs am Bioreaktor wurde der Digox 5-Analysatorblock desinfiziert. Der Einlass des Sensors wurde mit steriler Tygon®-Leitung in Lebensmittelqualität (1/4 Zoll i.D.) verbunden. Eine 70% (V/V) Ethanollösung wurde bei einer volumetrischen Flussrate von ungefähr 10 l/h für 15 Minuten durch den Analysator gepumpt. Der Gelöst-Sauerstoff-Analysator wurde mit einem Laborwasserhahn verbunden, und heißes Wasser wurde für ein Minimum von 2 Stunden durch den Sensor geleitet. Diese Methodik wurde statt Dampfsterilisation verwendet, weil die Analysatorblock-Materialien Temperaturen über 70°C nicht tolerieren können. Im Anschluss an die zweistündige Desinfektionsperiode wurde die Leitung am Einlass und Auslass der Einheit abgeklemmt, um Sterilität im Analysator zu erhalten. In einer Sterilwerkbank wurden die frisch sterilisierte Leitungen am Einlass und Auslass des Analysators angeschlossen. Die freien Enden der Leitungen wurden dann aseptisch an die 1/4'' I. D.-Edelstahlstutzen an der Bioreaktor-Kopfplatte angeklemmt, und die Messungen wurden vorgenommen. Wenn die Stutzen am Bioreaktor nicht in Gebrauch waren, wurden sie unter Verwendung einer kurzen Länge von sterilisierter Tygon®-Leitung in Lebensmittelqualität verschlossen. Gelöster Sauerstoff wurde online im Gasliftbioreaktor durch Abziehen von Flüssigkeit aus der Fermentation durch einen in der Bioreaktor-Kopfplatte befindlichen Stutzen gemessen. Die Fermentationsflüssigkeit verließ den Bioreaktor durch einen Edelstahlfilter (siehe Abschnitt 4.1.2), verbunden mit einem 1/4-Zoll-Edelstrahlrohr, das die Bioreaktor-Kopfplatte durchstieß. Die Flüssigkeit floss dann durch flexible Tygon®-Leitung in Lebensmittelqualität (1/4 Zoll i.D.), die mit einer eine volumetrische Flussrate von 11 l/h durch den Gelöst-Sauerstoff-Analysatorblock liefernden geschwindigkeitsvariablen peristaltischen Pumpe (Masterflex® L/STM Digital Standard Drive, Cole-Parmer, Kat. #P-07523-50) verbunden war. Die Fermentationsflüssigkeit wurde dann durch einen zweiten 1/4 Zoll-Edelstahlstutzen rezykliert, der die Bioreaktor-Kopfplatte durchstieß. Tygon®-Leitung in Lebensmittelqualität (Cole-Parmer, 1999) wurde wegen seiner Hersteller-spezifizierten niedrigen Sauerstoffpermeabilität von 30 cm3 mm/(s·cm2·cmHg) × 10–10 verwendet, um den Sensor mit dem Bioreaktor zu verbinden. Die Messung wurde nach 4–5 Minuten Zirkulation vorgenommen.

4.11 Chemische Analysen

Kalibrationen wurden unter Verwendung der geeigneten Standardreagentien durchgeführt. Alle für die Analysen verwendeten Reagentien waren > 99% rein. Wo nötig, wurde eine nachfolgende Reinigung via Destillation durchgeführt.

4.11.1 Ethanol

Ethanolkonzentration wurde bestimmt unter Verwendung des Gaschromatograph (GC)-Verfahrens mit internem Standard des Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Entgaste Proben wurden direkt behandelt mit internem Isopropanol-Standard, 5% (V/V), und in einen mit einem Flammenionisationsdetektor (FID) und einen Dynatech-Autosampler ausgestatteten Perkin Elmer 8500-Gaschromatogaphen injiziert. Eine Chromosorb 102, 80–100 Mesh-Säule wurde mit Helium als Trägergas verwendet. Chromatographische Bedingungen: Flussrate von 20 ml/min, Injektortemperatur von 175°C, Detektortemperatur von 250°C und Säulentemperatur von 185°C.

4.11.2 Kohlenhydratzusammenfassung

Glucose-, Fructose-, Maltose-, DP3- (Maltotriose), DP4- (Maltotetraose), Poly-1- (Polysaccharid Peak 1) und Glycerinkonzentrationen in Fermentationsproben wurden unter Verwendung eines Spectra-Physics (SP8100XR) Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (HPLC), ausgestattet mit einer Kationenaustauschersäule (Bio-Rad Aminex, HPX-87K) und einem Brechungsindexdetektor (Spectra-Physics, SP6040XR), quantifiziert. Die mobile Phase war Kaliumphosphat, dibasisch, 0,01 M, und das System war mit einem Spectra-Physics (SP8110)-Autosampler ausgestattet. Das Instrument wurde mit einem Gegendruck von 800 psi betrieben. Die Flussrate der Probe und des Eluenten durch die Säule war 0,6 ml/min, mit einer Säulentemperatur von 85°C und einer Detektortemperatur von 40°C. Das Injektionsvolumen war 10 &mgr;l.

4.11.3 Spezifisches Gewicht

Das spezifische Gewicht von der Würze und dem Fermentationsmedium wird in dieser Studie im Sinne von wahrem Extrakt (Grad Plato, °P) beschrieben, was die akzeptierte, in der Brauindustrie verwendete Einheit ist.

Fermentationsproben wurden wie in Abschnitt 4.8 beschrieben filtriert und vor der Analyse mit einem digitalisierten Dichtemessgerät (Anton Paar DMA-58-Densitometer) zum Messen Würze-spezifischen Gewichts (Grad Plato) gevortext. Die Fermentationsproben wurden in ein Glas-U-Rohr eingebracht, welches elektronisch zum Bestimmen des spezifischen Gewichts oszillierte, wobei somit Grad Plato indirekt angegeben wird.

Grad Plato bezieht sich auf den numerischen Wert eines Prozentanteils (G/V) Saccharoselösung in Wasser bei 20°C, deren spezifisches Gewicht das gleiche wie das der fraglichen Würze ist. Weil die Grad Plato-Skala und resultierende Lösungs-spezifisches Gewicht mit Konzentrationen gelösten Stoffes verbindende Tabellen auf wässriger Lösung von Saccharose basiert sind, ist es nur eine Näherung der Menge an Extrakt. Extrakt ist ein Begriff, der sich auf die in einem Braumaterial "wie es ist" und/oder potentiell durch Bearbeitung (Hardwick, 1995), insgesamt verfügbare lösliche Masse, wie z.B. Kohlenhydrate, Proteine, Tannine, bezieht. Extrakt wird wegen des Fehlens einer geeigneteren Referenz, die besser mit der Variabilität der Zusammensetzungen von Würzen unterschiedlicher Herkünfte verbunden ist, in der Brauindustrie gegenwärtig noch als spezifisches Gewicht in Grad Plato ausgedrückt.

4.11.4 Gesamtdiacetyl

Gesamtdiacetyl (2,3-Butandion) in Bier und Fermentationsproben wurde gemessen unter Verwendung einer Headspace-Analyt-Probenahmetechnik, gefolgt von Kapillar-GC-Separation (Hewlett-Packard 5890) und Elektroneneinfangdetektion (ECD), basierend auf dem Verfahren des Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992). Das Verfahren bezieht sich auf "Gesamtdiacetyl", weil das Verfahren die Menge von Diacetyl und seines Vorläufers, alpha-Acetolactat, misst. Das Trägergas war 5% Methan in Argon bei 1,0 ml/min, und eine J & W DB-Wax-Säule wurde verwendet. Das Splitverhältnis war 2:1, und das Hilfsgas war Helium bei 60 ml/min. Injektortemperatur war 105°C, und Detektortemperatur war 120°C.

Das System war ausgestattet mit einem Hewlett Packard 7694E Headspace-Autosampler, und 2,3-Hexandion wurde als interner Standard verwendet. Die Probenzykluszeit war 40 min mit einer Gefäßäquilibrierungszeit von 30 min bei 65°C, einer Druckbeaufschlagungszeit von 2 min bei 4,8 psig, einer Schleifenfüllzeit von 0,2 min, einer Schleifenäquilibrierungszeit von 0,1 min und einer Injektionszeit von 0,27 min. Trägerdruck war 18,8 psig, Transferleitungstemperatur war 95°C und Schleifentemperatur war 65°C.

4.11.5 Flüchtige Bierinhaltsstoffe

Flüchtige Bierinhaltsstoffe, einschließlich Acetaldehyd, Ethylacetat, Isobutanol, 1-Propanol, Isoamylacetat, Isoamylalkohol, Ethylhexanoat und Ethyloctanoat wurden gemessen unter Verwendung einer GC (Hewlett Packard 5890)-Headspace-Methode mit internem Standard (n-Butanol) und einem Flammenionisationsdetektor (FID). Das Trägergas war Helium bei 6,0 ml/min, und der GC war ausgestattet mit einem Hewlett Packard 7694-Headspace-Autosampler.

GC-Injektortemperatur war 200°C, und Detektortemperatur war 220°C. Ofentemperaturprofil: 40°C (5 min), 40–200°C (10°C/min), 200–220°C (50°C/min), 220°C (5 min). Die FID-Gase schlossen den Träger bei 6,0 ml/min, Helium-Makeup bei 30 ml/min und 28 psig, H2 bei 50 ml/min und 25 psig und Luft bei 300 ml/min und 35 psig ein.

Das Septum wurde bei einer Flussrate von 0,8 ml/min gespült. Der Kopfdruck war 4,0 psig. Wenn der Autosampler über eine Nadel mit dem Injektionsport verbunden wurde, war der Gefäßdruck 15,9 psig, der Trägerdruck war 7,1 psig, der Säulenkopfdruck war 4 psig, der Splitfluss war 18 ml/min und der Säulenfluss war 6 ml/min. Zonentemperaturen: Gefäß bei 70°C, Schleife bei 80°C, Transferleitung bei 150°C.

Die GC-Zykluszeit war 40 min mit einer Gefäßäquilibrierungszeit von 35 min, einer Druckbeaufschlagungszeit von 0,25 min, einer Schleifenfüllzeit von 0,1 min, einer Schleifenequilibrierungszeit von 0,1 min, einer Injektionszeit von 3 min und einem Probenschleifenvolumen von 1 ml.

4.11.6 Freier Aminostickstoff (FAN)

Das internationale Verfahren für freien Aminostickstoff des Technical Committee and Editorial Committee of the American Society of Brewing Chemists (1992) wurde verwendet, um die Konzentration von freiem Aminstickstoff in einer Fermentationsprobe unter Verwendung eines Perkin Elmer LS50B-Spektralphotometers zu bestimmen. Dieses spektralphotometrische Verfahren zeigt eine Farbreaktion zwischen Ninhydrin und dem in der Probe anwesenden Stickstoff. Der Betrag der Absorption ist direkt mit der Menge an vorhandenem freien Aminostickstoff verknüpft. a) Farbreagens: 19,83 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) 30,00 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) 2,78 g Ninhydrinmonohydrat 1,50 g Fructose b) Verdünnungsreagens: 2,00 g Kaliumiodat (KIO3) 596 ml destilliertes, entionisiertes Wasser 404 ml 95% (V/V) Ethanol

Lagern im Kühlschrank und Verwenden bei Raumtemperatur.

  • c) Glycin-Stammlösung: 0,1072 g/100 ml destilliertes, entionisiertes Wasser
  • d) Glycin-Standardlösung: Stammlösung wurde 1:100 (V/V) mit destilliertem, entionisiertem Wasser verdünnt. Dieser Standard enthält 2 mg/l FAN.

Die Proben wurden in einem Verhältnis von 100:1 mit destilliertem Wasser verdünnt, und 2 ml der verdünnten Probe wurden in jedes von drei Teströhrchen eingebracht. Der Leerwert wurde hergestellt durch Einbringen von 2 ml destilliertem, entionisiertem Wasser in jedes von drei Teströhrchen. Drei der jeweils 2 ml der Glycin-Standardlösung enthaltenden Teströhrchen wurden ebenfalls hergestellt. Bei allen Proben wurde 1 ml des Farbreagens zugesetzt, und sie wurden dann für exakt 16 min in ein 100°C-Wasserbad gesetzt. Die Teströhrchen wurden dann für 20 min in einem 20°C-Wasserbad gekühlt. Fünf ml des Verdünnungsreagenzes wurden dann zu jedem Teströhrchen zugegeben und gründlich gemischt. Den Proben wurde dann erlaubt, für 10–15 min zu stehen. Dann wurde unter Verwendung eines Spektralphotometers die Absorption bei 570 mm gemessen, und die Menge an FAN in einer Probe wurde unter Verwendung von Gleichung 4.3 berechnet. FAN (mg/l) = (AP – AB – AF)2d/AS(4.3), wobei FAN die Menge an freiem Aminostickstoff in der Probe in mg/l ist, AP ist der Durchschnitt der Absorptionen der Testlösungen, AB ist der Durchschnitt der Absorptionen der Leerwerte, AF ist der Durchschnitt der Absorption für die Korrektur von dunklen Würzen und Bieren, 2 ist die Menge an FAN in der Glycin-Standardlösung, d ist der Verdünnungsfaktor der Probe und AS ist der Durchschnitt der Absorptionen der Glycin-Standardlösung.

KAPITEL 5. KONTINUIERLICHE FERMENTATION UNTER VERWENDUNG EINES GASLIFTBIOREAKTOR-SYSTEMS

Ein Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor-System wurde wegen seiner publizierten exzellenten Massenübergangs- bzw. Massentransfer- (flüssig-fest) und Mischungseigenschaften für kontinuierliche Bierfermentation ausgewählt. Flüssig-fest-Massenübergang ist insbesondere wichtig, da er, Substrate für die eingekapselte Hefe liefernd, den Übergang von Nährstoffen von der Flüssigphase auf den festen Biokatalysator mit immobilisierten Zellen einschließt. Diese Bioreaktoren liefern auch gute Belüftung, niedrigen Leistungsverbrauch und sind einfach zu konstruieren. Dies hat Gasliftbioreaktor-Systeme für großmaßstäbliche Verfahren, wie jene, die kommerziell zur Abwasserbehandlung verwendet werden (Driessen et al., 1997; Heijnen, 1993), sehr attraktiv gemacht.

5.1 Beschreibung des Gaslift-Leitrohr-Bioreaktors

Dieser Abschnitt gibt eine detaillierte Beschreibung des in dieser Arbeit verwendeten Gasliftbioreaktors.

5.1.1 Bioreaktor-Rumpf

Der für diese Arbeit entworfene 13 l-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor (8 l Arbeitsvolumen) war ein dreiphasiges Wirbelbett (Flüssigkeit/Feststoff/Gas), wobei die immobilisierten Zellen durch Kohlendioxid-getriebene interne Flüssigkeitsumwälzung in Suspension gehalten wurden (Heijnen, 1996), wie in 16 gezeigt. Eine Photographie des Bioreaktorbehälters ist in 17 wiedergegeben, und eine detaillierte Zeichnung mit detaillierten Bemaßungen ist in 18 wiedergegeben. Kohlendioxid und Luft fließen durch ein gesintertes Edelstahleinblaserohr (CO2-Spüldüse, Teil #9222, Hagedorn & Gannon), 0,11 m lang, 0,013 m Außendurchmesser, in den Bodenkonus des Bioreaktors ein. Kohlendioxid wurde als das Fluidisierungsgas verwendet, und Luft wurde verwendet, um den Hefezellen Sauerstoff zu liefern. Ein Leitrohr („draft tube"), konzentrisch im säulenförmigen Bioreaktor positioniert, funktionierte als Steigrohr in diesem Wirbelbettsystem, während die äußere Ringkammer als Fallleitung diente. Das interne Leitrohr war von einem zylindrischen Partikelseparator abgehängt, auf drei Edelstahlaufhängern im aufgeweiteten Kopfbereich des Bioreaktors gelegen. Halten der Leitrohr- und Partikelseparator-Fittinge innerhalb des Bioreaktors minimierte das Risiko mikrobieller Kontamination aus der äußeren Umgebung.

Ursprünglich hatte der Bioreaktor einen Maschensieb, um die immobilisierten Zellen von der Flüssigkeit am Auslauf zu trennen. Das Sieb war jedoch anfällig für Verstopfung, so dass ein Edelstahlzylinder verwendet wurde, um die immobilisierten Zellen von der Flüssigphase zu trennen, wenn sie sich über die Oberkante des Leitrohres bewegten und die Ringkammer hinabflossen. Die Partikel würden den Zylinder treffen und eher zurück in die Haupt-Flüssigphase fallen, als den Bioreaktor im Überlauf zu verlassen. Daher gab es einen kleinen Bereich nahe des Bioreaktorauslasses, der frei von immobilisierten Zellpartikeln war. Der aufgeweitete Kopfbereich des Bioreaktors erhöhte auch die Oberflächenfläche für Gasblasenentbindung.

5.1.2 Bioreaktor-Kopfplatte

In 19 ist ein Schema der Bioreaktor-Kopfplatte wiedergegeben. Kopfplattenstutzen wurden auf einem Minimum gehalten, um das Risiko von Kontamination zu reduzieren. Die Stutzen waren entweder direkt auf die Kopfplatte geschweißt oder es wurden Kompressionsanschlüsse (Swagelok®) verwendet. Die Kopfplatte umfasste einen Inokulationsstutzen, einen Temperaturmessstutzen, ein Thermometer, ein Septum für Gasprobennahme und Flüssigkeitsentnahme- und Rücklaufstutzen für Messung von gelöstem Sauerstoff. Ein Temperaturfühler wurde in den Temperaturmessstutzen eingeführt, der mit dem Temperatursteuerungssystem rückgekoppelt war. Die Temperatursteuerung gab Rückkopplung auf ein Magnetventil, das die Glykolzufuhr zu der thermischen Ummantelung Bioreaktors öffnete und schloss. Temperatur wurde unter Verwendung eines Thermometers (Cole-Parmer, Waterproof Thermocouple thermometer, #90610-20) und einer Typ T-Sonde, die direkt in die Bioreaktor-Kopfplatte eingeschweißt war, überwacht. Gelöster Sauerstoff wurde gemessen unter Verwendung eines Gelöst-Sauerstoff-Analysators (Dr. Thiedig, Digox 5), der einen Fluss von 9–11 l/h von Flüssigkeit durch den Analysatorblock für akkurate Sauerstoffablesungen erforderte. Für Sauerstoffmessungen wurde Flüssigkeit vom Bioreaktor durch ein 1/4 Zoll i.D.-Rohr, das durch die Kopfplatte in die Fermentationsflüssigkeit ging, entnommen. Wie in 20 gezeigt, war die Spitze des Rohres mit einem Filter ausgestattet, um größere Partikel aus der Flüssigkeit zu entfernen, wenn sie durch den Gelöst-Sauestoff-Analysator gepumpt wurde. Die Flüssigkeit wurde dann durch einen weiteren 1/4 Zoll-Stutzen in der Kopfplatte in den Reaktor zurückgeführt.

5.1.3 Hygieneventile für aseptische Probenahme

Der Bioreaktor war mit einem in die Bioreaktorwand eingeschweißten Membranprobenahmeventil (Scandi-Brew®) ausgestattet. Das Ventil war für Probenahme unter aseptischen Bedingungen entworfen. Die Membran schloss direkt gegen die Fermentationsflüssigkeit ab, was dem Ventil erlaubte, voll mit Dampf und Alkohol durch die zwei Auslässe vollständig sterilisierbar zu sein (18). Ein kleines äußeres Ethanol-Reservoir umgab die Membran, um Sterilität zwischen Probenahmen aufrecht zu erhalten. Dieses Ventil wurde für alle Bioreaktor-Probennahmen verwendet, und es wurde angenommen, dass die Zusammensetzung der Flüssigkeit am Punkt der Probennahme nicht signifikant unterschiedlich zu der den Bioreaktorauslass verlassenden Flüssigkeit war. Der Bioreaktor wurde, wie in dem Material- und Methoden-Kapitel dieser Arbeit erwähnt, durch ein an der Außenwand des Bioreaktors befindliches Ventil beprobt. Um die Annahme zu validieren, dass die Zusammensetzung der den Bioreaktorauslass verlassenden Flüssigkeit die gleiche war wie die aus dem Rumpf des Bioreaktors beprobte Flüssigkeit, wurden Mischungszeitstudien durchgeführt.

Ein Impuls-Tracerverfahren wurde verwendet, um die Mischungszeit in dem Gaslift-Bioreaktor zu bestimmen (Chistie, 1989). Ein 1 ml-Volumen von 10 N HCl wurde rasch in die Ringkammer des Bioreaktors injiziert, und die Änderung in pH wurde über Zeit aufgezeichnet, mit Zeit t = 0 Sekunden zur Zeit der Injektion. Der pH wurde auf seinen ursprünglichen Wert durch Injizieren von 10 N NaOH zurückgestellt. Die pH-Elektrode (Cole-Parmer, Kat. #P-05990-90) war 277 mm in der Länge und 3,5 mm im Durchmesser. Ein Ingold Modell 2300 Prozess pH-Transmitter wurde verwendet, um pH zu überwachen. Eine Zwei-Punkt-pH-Kalibrierung wurde mit zertifizierten Standardpuffern, Beckman pH 7,0 grüner Puffer, Teil #566002, und Beckman pH 4,0 roter Puffer, Teil #566000, durchgeführt. Die Daten wurden bei einer Frequenz von 3750 Hz für 300 Sekunden unter Verwendung eines Software-Programms, entworfen von Cheryl Hudson und John Beltrano 1994, und modifiziert von Norm Mensour 1999 (University of Western Ontario, London, Ontario), aufgezeichnet.

Die pH-Daten wurden dann unter Verwendung des Savitsky-Golay-Algorithmus in TableCurve 2D (Jandel Scientific Software, Labtronics, Guelph, Ontario) geglättet. Der Savitsky-Golay-Algorithmus ist ein Zeitbereich-glättendes Verfahren zum Glätten, basierend auf biquadratischer Polynomanpassung mittels kleinster Fehlerquadrate über ein sich in den pH-Daten bewegendes Fenster (Anon, 1996). Die geglätteten Daten wurden dann normalisiert, und eine Auftragung von &Dgr;pH gegen Zeit wurde generiert. Die Mischungszeit wurde bei der nächsten Minute genommen, wenn der pH ~95% des Gleichgewichtswerts erreicht hatte. Die Mischungszeit wurde gemessen unter Verwendung von drei unterschiedlichen volumetrischen Flussraten von Kohlendioxid: 283 cm3/min, 472 cm3/min (während dieser ganzen Arbeit verwendete volumetrische Flussrate) und 661 cm3/min. In allen drei Fällen hatte sich der pH im Bioreaktor (~95% Grenze) in weniger als 2 Minuten äquilibriert, wie in Anhang 1 ersichtlich. Die Mischungszeit wurde als hinreichend kurz erachtet, um unsere ursprüngliche Annahme, dass der Bioreaktor gut durchmischt war, zu validieren. Dies erlaubte uns, bei einer durchschnittlichen Flüssigkeitsverweilzeit von 24 Stunden im Bioreaktor, anzunehmen, dass die Zusammensetzung der an der Bioreaktorwand beprobten Flüssigkeit von der, die aus dem Auslass floss, nicht signifikant unterschieden war. Aus den beigefügten Figuren war eine bei Mischung durch Dispersion überlagerte definierte Flüssigkeitsrezirkulation ersichtlich, die typisch für Gasliftbioreaktoren ist (Chisti, 1989).

5.2 Fließbild des kontinuierlichen Bier-Fermentationssystems

In 21 ist ein Fließbild für das kontinuierliche Bier-Fermentationssystem, das in der Kleinbrauerei-Pilotanlage der Labatt Brewing Company Limited in London, Ontario, untergebracht war, mit einer detaillierten Teilebeschreibung in Tabelle 5.1, wiedergegeben. Zusammenfassend wurde Brauwürze von der Londoner Labatt-Anlage gesammelt, unter Verwendung eines Blitz-Pasteurisators (Fisher Plattenwärmeaustauscher, Combi-flow Typ Eurocal 5FH) sterilisiert und in großen Aufbewahrungstanks (T-1 und T-2) gelagert. Während kontinuierlicher Fermentation wurde die Würze bei einer kontrollierten Flussrate in den immobilisierte Hefezellen-enthaltenden Gasliftbioreaktor (BR-1) überführt. Fermentierte Flüssigkeit verließ den Bioreaktor als Überlauf und wurde in einen empfangenden Behälter (T-3) gesammelt. In den folgenden Abschnitten wird der Betrieb des kontinuierlichen Bier-Fermentationssystems, wiedergegeben in 21, detailliert beschrieben.

5.2.1 Würzesammlung und -lagerung

Nicht-Sauerstoff-angereicherte Würze für kontinuierliche Fermentation wurde durch Leiten in zylindrokonische 1600 l-Lagertanks, vorgespült mit Kohlendioxid, um Sauerstoffaufnahme durch die Würze zu minimieren, von der Labatt-London-Anlage gesammelt. Alle Tanks dieses Maßstabs, einschließlich der Würzeaufbewahrungstanks T-1 und T-2 wurden vor ihrer Verwendung gemäß Labatt Best Practices gereinigt und desinfiziert. Die Würze wurde dann Blitz-pasteurisiert und bei 2°C in den verfügbaren Würzeaufbewahrungstank T-1 oder T-2 (ebenfalls mit Kohlendioxid vorgespült) überführt. Würze wurde in diesen Tanks bei 2°C für bis zu 2 Wochen aufbewahrt, um Flüssigkeit für den kontinuierlich fermentierenden Bioreaktor, B-1, zu liefern. Am Ende der Zwei-Wochen-Periode wurde die Bioreaktoreinspeisung umgestellt, so dass die Würze vom zweiten Würzetank geliefert wurde, der frische Würze enthielt. Um Stillstandzeit während des Umstellens auf frische Würze zu minimieren, wurden zwei identische Würzelagertanks, T-1 und T-2, eingesetzt. In allen Fällen wurde Würze mindestens zwei Tage, bevor sie in den Bioreaktor (BR-1) eingeführt wurde, auf Kontamination untersucht. Wenn die Würze kontaminiert war, wurde sie verworfen, und frische Würze wurde unverzüglich gesammelt und pasteurisiert.

Minimieren Würze-gelöster Sauerstoffkonzentration während Lagerung: Das Ziel war es, die Würze mit minimalem Sauerstoff, bei einer konstanten Konzentration und einer niedrigen Temperatur ohne Einfrieren der Würze zu lagern. Dies war erforderlich, um unerwünschte Alterungsreaktion der Würze aus chemischen Reaktionen mit Sauerstoff (Narziß et al., 1993) zu verhüten, um eine beständige Lieferung von Würze an den Bioreaktor zu gewährleisten und um das Risiko von Würzekontamination mit Mikroben während der Lagerung zu minimieren. Die zum Lagern der Würze für kontinuierliche Fermentationen verwendeten großen zylindrokonischen Behälter (1600 l, netto) (T-1 und T-2) wurden ursprünglich als Chargenfermenter und nicht als Würzelagertanks entworfen. Deswegen war die Kühlung für diese Behälter nicht geeignet, um die Würze bei 2°C zu halten. Nach drei Tagen der Aufbewahrung der Würze variierte die Temperatur um so viel wie 15°C von einer Region des Tanks zu einer anderen (Tabelle 5.2).

Diese warmen Regionen in den Tanks steigerten das Risiko mikrobiellen Wachstums. Deshalb wurde in diesen Tanks etwas Umwälzung benötigt, um eine gleichförmige niedrige Temperatur durchwegs zu sichern.

Aus diesen Gründen wurde ein Einblaserohr im Basiskonus jedes Würzelagertanks (T-1 und T-2) eingebaut. Experimente wurden zum Bestimmen des besten Protokolls zum Füllen des Tanks mit Würze und Aufrechterhalten konstant niedriger Konzentrationen von gelöstem Sauerstoff durchgeführt. Im ersten Experiment wurde der Lagertank mit Würze, die ohne Sauerstoffanreicherung gesammelt und Blitz-pasteurisiert worden war, gefüllt. Sobald der Tank mit 1600 l Würze gefüllt war, wurden 0,013 m3/h Kohlendioxid in die Basis des Tanks eingeblasen. Während des zweiten Experiments wurde die Würze wieder ohne Sauerstoffanreicherung gesammelt und Blitz-pasteurisiert. Diesmal wurde der Lagertank mit Kohlendioxid (0,85 m3/h) für 3 Stunden vor dem Füllen gespült, und eine kleine Menge Kohlendioxid (0,113 m3/h) wurde kontinuierlich in den Lagerbehälter eingeblasen, als die Würze in den Tank überführt wurde. Dieser niedrige Fluss von Kohlendioxid wurde kontinuierlich durch die in dem Tank gelagerte Würze geblubbert, während er Würze für die kontinuierliche Fermentation lieferte. Bei beiden Experimenten wurde Würze-gelöste Sauerstoffkonzentration auf einer regelmäßigen Basis während einer Woche Lagerung überwacht.

In Figur 5.7 ist gelöste Sauerstoffkonzentration gegen Würzelagerzeit wiedergegeben. Wenn der Aufbewahrungstank nicht mit Kohlendioxid vorgespült wurde, erlaubte die Luft im Kopfraum des Tanks einige Sauerstoffaufnahme durch die Würze. Daher wurde ohne Vorspülen des Tanks eine signifikant längere Zeitperiode benötigt, damit die Konzentration gelösten Sauerstoffs in der Würze einen minimalen und konstanten Wert erreichte. Wenn der Tank vorgespült wurde, blieb die Konzentration Würze-gelösten Sauerstoffs während der ganzen Lagerperiode auf einem konstant niedrigen Wert. Deshalb wurde Vorspülen der Würzelagertanks (T-1 und T-2) und Fortsetzen des Lieferns eines kleinen Flusses von Kohlendioxid durch die Würze während Lagerung, um einen geringfügig positiven Druck auf den Tanks zu halten, als Teil der Würzelagerprozedur für alle kontinuierlichen Fermentationen angenommen.

Das Temperaturprofil in den Lagerbehältern wurde ebenfalls mit und ohne Einblasen von 0,113 m3/h Kohlendioxid verglichen. Dies wurde an Wasser statt an Würze unter Verwendung eines Typ T-Temperaturfühlers, verbunden mit einem Thermometer (Cole-Parmer, Waterproof Thermocouple Thermometer, Kat. #90610-20) durchgeführt. Stadtwasser (1600 l) wurde in einem Würzelagertank gesammelt und für drei Tage äquilibriert, und die Temperatur des Wassers wurde in unterschiedlichen Regionen des Lagertanks aufgezeichnet. Das Wasser im Tank wurde dann für 24 Stunden mit 0,113 m3/h Kohlendioxid durchblasen, und die Temperatur wurde wieder aufgezeichnet. Umgebungstemperatur wurde in jedem Fall aufgezeichnet, und der Temperatureinstellungspunkt im Lagertank war 2,0°C.

Wie in Tabelle 5.2 ersichtlich, war die Temperatur in den Lagertanks mit Kohlendioxideinblasung gleichförmiger, mit sich zwischen 0,1 und 4,1°C in den gemessenen Regionen bewegender Temperatur, und die Inhalte des Tanks froren nicht ein. Diese niedrigere Temperatur half dabei, unerwünschtes Wachstum von Mikroben in der Würze während Lagerung zu verhüten. Gas wurde von den Würzelagertanks durch einen sterilen Gasfilter, befindlich am Oberteil des Tanks, freigesetzt. Würze wurde dann unter Verwendung einer geschwindigkeitsvariablen peristaltischen Pumpe (P-1) (Masterflex® L/STM Digital Standard Drive, Cole-Parmer, Kat. #P-07523-50) unter Verwendung flexibler Norprene® L/S 16-Leitung in Lebensmittelqualität an den Einlass des 8 l-Bioreaktors (BR-1) überführt.

5.2.2 Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor-System-verwendende kontinuierliche Fermentation

Würze wurde nahe des Bodenkonus des Bioreaktors, BR-1, durch einen 1/4''-Stutzen eingeführt. Eine Mischung von Filter-sterilisierter (Millipore, Millex®-FG50, 0,2 &mgr;m-Filtereinheit) Luft und Kohlendioxid (99,99% Reinheit) flossen durch das gesinterte Edelstahleinblaserohr in den Bioreaktor. Ein Rotameter (R-3) wurde verwendet, um die Kohlendioxid-Flussrate am STP zu regeln, und ein vorkalibrierter Massenflussregler (M-1) wurde verwendet, um die Flussrate von Luft am STP zu regeln. Fermentierte Flüssigkeit verließ den Bioreaktor als Überlauf und floss durch verstärkte PVC-Leitung (1'' I. D.) in einem 30 l-Edelstahlsammelbehälter (T-3), der mit einer externen Glykolschlange gekühlt und auf einer Temperatur von 4°C gehalten wurde.

5.2.3 Produktsammlung

Der Produktsammelbehälter (T-3) hatte einen großen Einlassstutzen (1'' I. D.), der so entworfen war, dass die fermentierte Flüssigkeit entlang der Sammelbehälterwand hinabfließen würde, um Schäumen zu minimieren. Dieser Behälter hatte auch einen sterilen Gasfilter (Millipore, Millex®-FG50, 0,2 &mgr;m-Filtereinheit) für Gasfreisetzung vom Bioreaktor (BR-1) und dem Sammelbehälter (T-3). Der Sammelbehälter wurde unter Verwendung eines 1/4''-Ventils (V-12), 2'' über der Basis des Tanks gelegen, entleert.

5.2.4 Glykolkühlschleife

Glykol wurde von der Londoner Brauerei zu der Kleinbrauerei-Pilotanlage bei einer Temperatur von –23°C und Druck von 45 psig überführt und durch die Kühlmäntel für die Würzeaufbewahrungstanks (T-1 und T-2), den Gaslift-Bioreaktor (BR-1) und den Produktsammelbehälter (T-3) umgewälzt. Die zwei Würzeaufbewahrungstanks und der Bioreaktor waren ausgestattet mit Flüssigphasen-Temperaturfühlern, die eine Rückkopplung zu den Temperaturreglern ermöglichten, die wiederum den Fluss von kaltem Glykol in die Behältermäntel regelten. Die Würzeaufbewahrungstanks lagerten die Würze bei 2°C, während die Temperatur im Bioreaktor auf Temperaturen von 12°C bis 22°C, abhängig vom spezifischen Experiment, geregelt wurde. Der Produktsammelbehälter hatte keine automatische Temperaturregelung, sondern der Fluss von Glykol wurde manuell geregelt, um den Behälter bei ungefähr 4°C zu halten. Es war nicht nötig, die Temperatur des Produktsammelbehälters (T-3) präzise zu regeln, weil die Flüssigkeit in diesem Behälter einfach verworfen und nicht analysiert oder weiterbearbeitet wurde.

Glykol wurde ebenso verwendet, um die Würzetransferleitungen von den Würzetanks (T-1 und T-2) zum Bioreaktor (BR-1) zu ummanteln und zu kühlen. Sobald das Glykol durch eine gegebenen Ummantelung umgewälzt wurde, wurde es in eine Hauptleitung in der Pilotanlagen-Kleinbrauerei zurückgeführt und wurde dann zu der Londoner Anlage zurückgeführt, üblicherweise bei einer Temperatur von –15°C und Druck von 40 psig.

5.3 Bioreaktor-Sterilisationsprotokoll

Der Bioreaktor (BR-1) wurde mit einer 2% (V/V) Lösung von Diversol® CX/A (DiverseyLever, Kanada), einem desinfizierenden Detergens, gefüllt und über Nacht mit Gaseinblasung eingeweicht. Der Reaktor wurde dann abgelassen und mit kaltem Wasser gespült. Dieser Zyklus von Reinigungslösung und Wasserspülung wurde zweimal wiederholt. Um den Bioreaktor für Dampfsterilisation vorzubereiten, wurden die Würze- und Gasleitungen unterbrochen. Die Dampfleitung wurde dann mit dem Bioreaktoreinlass verbunden, und die folgenden Ventile wurden geöffnet: Die Bioreaktoreinlass- und -spülventile (V-7, V-6), der Gaseinlass (V-17), Produktauslassventile (V-9, V-11), die Membranprobenahmeventile (V-8, V-10) und Sammelbehälterablassstutzen (V12). Das Anlagendampfventil wurde dann langsam geöffnet, und die Bioreaktorventile wurden eingestellt, so dass ein Rinnsal von Dampf am Ausgang jeder externen Öffnung beobachtet wurde. Nach 60 Minuten Dampfkontakt wurden alle äußeren Ventile am Bioreaktor geschlossen (V-17, V-8, V10, V12), außer dem Würze-Bypassventil (V-6). Wenn das Dampfventil geschlossen war, wurde das Würze-Bypassventil geschlossen, und ein Sterilfilter wurde am Sammelbehälter angeschlossen, um Kontamination durch nicht-sterile Luft zu verhüten, die in das System eintrat, wenn es abkühlte. Die Bioreaktorgasleitung wurde ebenfalls an V-17 wieder angeschlossen, als die Anlagendampfleitung geschlossen wurde, um einen positiven Druck aufrecht zu erhalten, während das System abkühlte.

5.4 Fermentationssystem-Inbetriebnahme

Brauwürze wurde aus der Anlage in einem 20 l-Edelstahldruckbehälter gesammelt und in einem Autoklaven für 45 Minuten auf 100°C erhitzt. Immobilisierte Zellen wurden aseptisch in die abgekühlte Würze überführt (40% V/V). Der verschlossene Behälter wurde in die Kleinbrauerei-Pilotanlage transportiert, wo das Bioreaktorsystem untergebracht war. Der 20 l-Behälter wurden mit einem Schnellverbindungsanschluss (Cornelius Anoka, MN, USA) verbunden, der an einer verstärkten 3/8'' PVC-Leitung (Cole-Parmer, USA) angeklemmt war. Das andere Ende der PVC-Leitung war am Membranprobenahmeventil (V-8) in der Bioreaktorwand angeklemmt. Filter-sterilisiertes Kohlendioxid wurde bei 10 psig an dem 20 l-Behälter aufgebracht, und der Membranprobenstutzen wurde geöffnet, so dass die Mischung mit immobilisierten Zellen vom Behälter in den Bioreaktor überführt wurde, ohne das Inokulum der Außenluftumgebung auszusetzen. Die inneren Bauteile des "Schnellverbindungs"-Anschlusses des 20 l-Behälters wurden entfernt, um Verstopfen mit immobilisierten Zellen beim Transfer in den Bioreaktor zu verhüten. Die kumulative Partikelgrößenverteilung (Untergröße) für die kappa-Carrageenan-Gelkügelchen ist in Figur 5.8 gezeigt. Der arithmetische mittlere Partikeldurchmesser, Dpam, wurde zu 1,252 mm berechnet, und der mittlere Partikeldurchmesser nach Sauter, Dpsm, war 1,17 mm. Der Median des Partikeldurchmessers war 1,255 mm. Die experimentellen Daten und Berechnungen mittlerer Partikeldurchmesser sind in Anhang 1 wiedergegeben.

Im Anschluss an Inokulation mit immobilisierten Zellen wurde der Bioreaktor im Chargenmodus betrieben, bis die Zucker- und Diacetyl-Konzentrationen Ziele von weniger als 3°Plato im Sinne von spezifischem Gewicht und weniger als 100 &mgr;g/l Diacetyl erreichten. Das System wurde dann für kontinuierlichen Betrieb vorbereitet. Um die Würzetransferleitung mit heißem Wasser zu spülen und zu dampfsterilisieren, wurden Ventile V-2 (oder V-4 bei T-2), V-5 und V-6 geöffnet, während V-1 (oder V-3 für T-2) und V-7 zum Isolieren der Würzeleitung geschlossen wurden. Die Würzetransferleitung wurde mit heißem Wasser bei ungefähr 80°C gespült, das durch V-2 (oder V-4 für T-2) eingeleitet wurde. Im Anschluss an den Heißwasserspülzyklus wurde die Anlagendampfleitung an derselben Stelle angeschlossen, und die Würzetransferleitung wurde für ein Minimum von 30 Minuten dampfsterilisiert. Zur gleichen Zeit, zu der die Dampfleitung geschlossen wurde, wurde das Bypassventil (V-6) ebenfalls geschlossen. Sobald sich das System abgekühlt hatte, wurden V-2 (oder V-4 für T-2) geschlossen, und die Dampfleitung wurde unterbrochen. Das Würzetankventil, V-1 (oder V-3 für T-2) und das Bypassventil (V-6) wurden geöffnet, und die Würzetransferpumpe (P-1) wurde gestartet. Die Würze wurde über das Bypassventil (V-6) zum Abflussschacht geschickt, bis das Kondensat in der Leitung durch frische kalte Würze ersetzt war. An diesem Punkt wurde das Bypassventil geschlossen, und das Bioreaktoreinlassventil (V-6) am Reaktor wurde, das kontinuierliche Fermentationsverfahren einleitend, geöffnet.

Alle zwei Wochen wurde der Tank, der die Würze lieferte, zwischen den Lagertanks (T-1 und T-2) gewechselt. Nach zwei Wochen des Lieferns von Würze aus T-1 wurde die kontinuierliche Speisepumpe P-1 gestoppt, und das Ventil (V-5) am Einlass des Bioreaktors wurde geschlossen. Die Würzetransferleitung wurde dann am zweiten Lagertank (T-2) angeschlossen, und die Leitung wurde, wie im vorherigen Absatz beschrieben, gespült und sterilisiert. Kontinuierliche Fermentation wurde dann nach nur einer kurzen Stillstandszeit von weniger als einer Stunde wieder aufgenommen.

In 21 verwendete Symbole:

KAPITEL 6. kappa-Carrageenan-Gelimmobilisierung von LAGER-BRAUHEFE

Wissenschaftler haben eine Vielfalt von Matrizes zum physikalischen Einschließen ganzer Zellen, einschließend Calciumalginat (Bejar et al., 1992; Curin et al., 1987; Masschelein und Ramos-Jeunehomme, 1985; Nedovic et al., 1996; Shindo et al., 1994; White und Portno, 1978), Agarose (Hooijmans et al., 1990; Lundberg und Kuchel, 1997) und Carrageenan-Gele (Norton et al., 1995; Wang et al., 1982) untersucht. Carrageenan ist ein Material in Lebensmittelqualität und wurde wegen seiner im Vergleich zu anderen Gelen überlegenen mechanischen Festigkeit für Zellverkapselung bevorzugt (Büyükgüngör, 1992).

Im ersten Teil dieses Kapitels wurde die Hefezellbesiedelung in kappa-Carrageenan-Gelkügelchen über drei Zyklen wiederholter Chargenfermentation überwacht. Die Lebensfähigkeit der immobilisierten Zellen und der in die Flüssigphase freigesetzten Zellen wurde untersucht. Die Ethanol, Maltose, Maltotriose, Fructose und Glucose einschließenden Fermentationsparameter wurden über die wiederholten Chargenfermentationen hinweg verfolgt und dann mit nur frei suspendierte Hefezellen unter den gleichen Nährstoffbedingungen verwendenden Kontrollfermentationen verglichen. Es gab bis jetzt wenig publizierte Information über die physikalischen Auswirkungen auf Zellen nach langzeitiger Immobilisierung (Virkajärvi und Kronlöf, 1998) und kontinuierliche Aussetzung gegenüber äußeren Stressen und Fermentationsprodukten. Der zweite Teil dieses Kapitels untersucht die Lebensfähigkeit, Zellpopulationsverteilung und physikalische Erscheinung von in Carrageenen-Gelkügelchen immobilisierten Hefezellen über eine verlängerte Periode kontinuierlicher Fermentation im Gasliftbioreaktor. Über verlängerte Zeitperioden hinweg wurden auch der relative Prozentsatz respiratorisch defizienter Hefen in der immobilisierten und frei suspendierten Zellpopulation des Bioreaktors untersucht.

Carrageenan ist aufgebaut aus sich wiederholenden 3–6-Anhydrogalactose-Einheiten, und sortierte Carrageenane unterscheiden sich durch die Anzahl und Position der Sulfatestergruppen an wiederholenden Galactose-Einheiten. Ein Schema des Carrageenan-Gelbildungsmechanismus kann in 22 gesehen werden. Wenn Carrageenan in seinem Solzustand ist, sind seine Polysaccharidketten in einer Zufallsknäuel-Konfiguration. Wenn sich genug Helices gebildet haben, um Querverbindungen für ein kontinuierliches Netzwerk zu liefern, tritt Gelbildung auf. Wenn mehr Helices gebildet sind oder wenn die Helices Aggregate bilden, wird das Gel stärker und steifer (Rees, 1972).

Drei übliche Typen von Carrageenan sind lambda, iota und kappa. Wie in Figur 6.2 dargestellt, unterscheiden sie sich im Sulfatester-Gehalt, und die Menge an Sulfatester wird die Löslichkeit der Polysaccharidkette beeinflussen. lambda-Carrageenan ist hochsulfatiert, und ihm fehlt die Fähigkeit, ein Gel zu bilden (Marrs, 1998). iota-Carrageenan bildet ein hochelastisches, schwaches Gel in Gegenwart von Calciumionen und zeigt keine signifikante Synärese. Synärese tritt auf, wenn die Tendenz des Gels, weiter Helices oder Aggregate zu bilden, so stark ist, dass sich das Netzwerk, "Nässen" („weeping") von Flüssigkeit verursachend, zusammenzieht (Rees, 1972). kappa-Carrageenan ist moderat sulfatiert und bildet deshalb ein stärkeres und steiferes Gel in Anwesenheit von Kaliumionen und wird einige Synärese durchmachen. Die durch kappa-Carrageenan hervorgebrachte gesteigerte Gelfestigkeit macht es zum Immobilisieren ganzer Hefezellen wünschenswert.

Ein bedeutendes Charakteristikum von Carrageenan ist seine reversible Thermogelierungseigenschaft. Wenn Carrageenan-Lösung abgekühlt wird, steigt Viskosität, und Gelbildung tritt auf. Wenn die Lösung erhitzt wird, sinkt Viskosität, und das Carrageenan verwandelt sich in den Solzustand zurück. Durch Steuern der Zusammensetzung der Gelierungs-Kationenlösung kann die Temperatur, bei der Carrageenan von einem Sol in ein Gel umgewandelt wird, geändert werden. kappa-Carrageenan-Gelierungstemperatur steigt mit steigender Kaliumchloridkonzentration in Lösung. Dieses Phänomen wurde verwendet, um ein Verfahren zur Zellimmobilisierung zu konstruieren, seit große Temperaturfluktuationen vermieden werden können (Neufeld et al., 1996). Die Gelierungstemperatur von Carrageenan kann so gesteuert werden, dass sie hoch genug ist, um unter Fermentationsbedingungen ein Gel zu sein, jedoch niedrig genug, dass die Hefezellen mit dem Carrageenan in seinem Solzustand ohne nachteilige Wirkungen auf Lebensfähigkeit vor der Kügelchen-Gelbildung gemischt werden können.

Nichtsdestoweniger gibt es eine Anzahl von Faktoren, die den Bedarf an weiterer Untersuchung der Auswirkungen von Immobilisierung in Gelmatrices auf Hefezell-Metabolismus und -Physiologie anzeigen. Immobilisierte Zellen sind nicht der gleichen Mikroumgebung unterworfen wie die freien Zellen in der Flüssigphase, weil es zusätzliche Barrieren durch die Gelmatrix und andere eingeschlossene Hefezellen gibt, die überwunden werden müssen, bevor Substrate zu ihren Oberflächen transportiert werden können (23). Es hat viele Untersuchungen über Stoffübergangsraten in Gelmatrices gegeben (Estapé et al., 1992; Hannoun und Stephanopoulos, 1986; Korgel et al., 1992; Kurosawa et al., 1989; Merchant et al., 1987; Øyaas et al., 1995; Venâncio und Tiexiera, 1997), um ein besseres Verständnis der möglichen negativen Auswirkungen, die die Nährstoff-Limitierung von immobilisierten Zellen auf Fermentationsleistung haben kann, zu erreichen. Die effektiven Diffusionsfähigkeiten kleiner Moleküle im Carrageenan-Gel sind vergleichbar mit den Diffusionsfähigkeiten der gleichen Moleküle in Wasser alleine, und das Gel erlaubt molekulare Diffusion von kleinen Molekülen, wie Glucose und Ethanol. In einer typischen Fermentation mit immobilisierten Zellen werden jedoch Nährstoffe rasch zu den Kügelchen mit immobilisierten Zellen transportiert, hauptsächlich durch konvektiven Transport, zusätzlich zu molekularer Diffusion (Hannoun und Stephanopoulos, 1986). Sobald die Nährstoffe in die Kügelchen eindringen, ist Transport relativ langsam, weil molekulare Diffusion dominiert. Dies bedeutet, dass die Hefezellen an der Peripherie der Gelkügelchen einen ausgeprägten Ernährungsvorteil gegenüber denen im Mittelpunkt der Kügelchen haben können.

Das Alter der immobilisierten Hefe muss auch in Betracht gezogen werden. Eingeschlossene Zellen altern, wenn eine kontinuierliche Fermentation über den Verlauf von Monaten voranschreitet, und sie fermentieren unter einer definierten Reihe von Pseudostationär-Zustandsbedingungen. Während Chargenfermentation sind Hefezellen jedoch einer Umgebung ausgesetzt, die sich mit der Zeit ändert, und die Zellen werden nur für eine begrenzte Anzahl von Fermentationen vor ihrer Entsorgung wieder verwendet. Um die langanhaltenden Auswirkungen kontinuierlicher Fermentation von sich auf Fermentationsleistung beziehende Hefezellvitalität zu untersuchen, wird mehr Forschung benötigt. Im Teil A dieses Kapitels wurden die Kinetiken der Hefebesiedelung von kappa-Carrageenan-Gelkügelchen während drei Zyklen wiederholter Chargenfermentation untersucht. Lebensfähigkeit und Zellkonzentrationen immobilisierter und frei suspendierter Hefe wurden zusammen mit Ethanol, Grad Plato und Zuckerkonzentration überwacht.

In Teil B wurden die Auswirkungen von Fermentationszeit auf Zellposition und -verteilung in den Gelkügelchen und Hefezell-Morphologie untersucht. Rasterelektronenmikroskopie (REM) wurde verwendet, um kappa-Carrageenan-immobilisierte Hefezellen in unterschiedlichen Regionen des Gelkügelchens zu vier unterschiedlichen Zeiten zu untersuchen: 1) sofort nach Kügelchenherstellung; 2) nach zwei Tagen der Chargenfermentation; 3) nach zwei Monaten kontinuierlicher Fermentation in einem pilotmaßstäblichen Gasliftbioreaktor; 4) nach 6 Monaten kontinuierlicher Fermentation in einem pilotmaßstäblichen Gasliftbioreaktor. Hefe-Lebensfähigkeit und -Konzentration wurden ebenso in immobilisierten, wie auch in Zellen der Flüssigphase gemessen. Der relative Prozentsatz respiratorisch defizienter Hefen (immobilisierte und freie Zellen in der Flüssigphase) wurde ebenso nach fünf Monaten kontinuierlicher Fermentation im Gasliftbioreaktor untersucht, und dies wurde mit den in traditionellen Chargen-Bierfermentationen gefundenen Prozentsätzen verglichen. Ein Produktions-Lager-Hefestamm wurde während der ganzen Untersuchung verwendet.

6.1 Experimentelle Prozedur

kappa-Carrageenan-Gelkügelchen Herstellung: kappa-Carrageenan-Gel X-0909 war ein großzügiges Geschenk von Copenhagen Pectin A/S. Eingeschlossene Lager-Hefezellen enthaltende kappa-Carrageenan-Gelkügelchen wurden unter Verwendung des Verfahrens mit statischen Mischern mit einer anfänglichen Zellbeladung von 2,6 × 107 Zellen/ml Gel (Patentanmeldung 2133789) (Neufeld et al., 1996) und einem Kügelchendurchmesser von 0,5 bis 2,0 mm hergestellt.

Fermentationsmedium: Labatt Breweries of Canada lieferte Brauereiwürze mit einem spezifischen Gewicht von 17,5°P, wie im Detail im Abschnitt Material und Methoden beschrieben.

Teil A: Chargenwiederholungs-Kinetiken von in kappa-Carrageenan-Gelkügelchen immobilsierter Hefe

Fermentationen wurden in 2 l-Erlenmeyer-Kolben bei 21°C mit Schütteln bei 150 U/min durchgeführt. Trägerstoffbeladung war 40% (V/V) Kügelchen mit immobilisierten Zellen, und das gesamte Fermentationsvolumen war 1 l. Jede Fermentation dauerte 7 Tage. In R1 wurde die Würze mit frischen Kügelchen immobilisierter Zellen angestellt, und am Ende der Fermentation wurden diese Kügelchen von der fermentierten Flüssigkeit durch Durchleiten der Mischung durch ein steriles Edelstahlsieb (500 &mgr;m Maschengröße) abgetrennt. Die Kügelchen wurden dann im gleichen Verhältnis zum Anstellen frischer, steriler Würze für eine zweite (R2) und dann dritte (R3) Chargenfermentation verwendet. Probenahme wurde zweimal am Tag während der ersten drei Tage und dann einmal am Tag an den vierten und fünften Tagen jeder Fermentation durchgeführt. Fermentationen wurden in Doppel- oder Dreifachbestimmung ausgeführt. Alle Fermentationen wurden mit Kontrollfermentationen mit frei suspendierten Zellen durchgeführt, die unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurden, außer dass die Fermentationen nur mit freien Zellen in einem Verhältnis von 4 g/l angestellt wurden. Proben wurden hinsichtlich der Lebensfähigkeit und Zellkonzentration freier und immobilisierter Zellen und der Flüssigphasen-Kohlenhydrat- und Ethanolkonzentrationen untersucht.

Ausbeutefaktoren, YP/S, von Produktethanol aus gesamter fermentierbarer Glucose des Substrats wurden unter Verwendung von Gleichung 3.20 für die drei Fermentationszyklen mit immobilisierten Zellen und die Kontrolle mit freien Zellen berechnet. Für alle Fermentationen wurden die Ausbeutefaktoren vom Beginn der Fermentation bis zu der Zeit, bei der Maltose-Verbrauch vollständig war, berechnet.

Ethanolproduktivität, VEthanol, die Menge an produziertem Ethanol pro gesamtem Bioreaktor-Arbeitsvolumen pro Einheitsfermentationszeit wurde unter Verwendung von Gleichung 3.25 für R1, R2 und R3 und die Kontrollen mit freien Zellen vom Beginn der Fermentation bis zu der Zeit, bei der Maltose-Verbrauch vollständig war, berechnet. Im Fall der Ausbeutefaktoren und der Ethanolproduktivität waren die Beiträge der immobilisierten und frei suspendierten Hefezellen nicht voneinander unterschieden.

Die lokal maximale spezifische Wachstumsrate, ⎕max, und Zellteilungszeit wurde unter Verwendung von Gleichungen 3.3 und 3.4 für die gemittelte Kontrolle mit freien Zellen berechnet.

Teil B: Lebensfähigkeit und morphologische Eigenschaften von immobilisierter Hefe über ausgedehnte Fermentationszeit

Chargenfermentationsbedingungen: Chargenfermentationen wurden in 2 l Erlenmeyer-Kolben bei 21°C mit Schütteln bei 150 U/min durchgeführt. Trägerstoffbeladung waren 40% (V/V) bei einem gesamten Fermentationsvolumen von 1 l.

Kontinuierliche Fermentationsbedingungen: Pilotmaßstäbliche Gaslift-Leitrohr-Bioreaktoren wurden für kontinuierliche Fermentationen verwendet. Alle gesammelten Daten stammten von einem Bioreaktor mit 8 l Arbeitsvolumen, außer den Rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen für 2 Monate, die von einem 50 L-Bioreaktor unter Verwendung des gleichen Fermentationsmediums und Immobilisierungsverfahrens gesammelt wurden. Kügelchen mit immobilisierten Zellen wurden bei 40% (V/V) in den Bioreaktoren unter Verwendung einer Mischung aus Luft und Kohlendioxid fluidisiert. Die Bioreaktoren wurden unter variierenden Bedingungen mit auf 12, 17 und 22°C geregelten Fermentationstemperaturen und zwischen 0,9 und 1,8 Tage gehaltenen Verweilzeiten betrieben. Der Gasliftreaktor erreichte eine maximale Ethanolkonzentration von 73 kg/m3 während des sechsmonatigen Experiments, mit einer durchschnittlichen Konzentration von 58 kg/m3.

Mikrobiologische Analysen: Mindestens einmal pro Woche wurden aus der Flüssigphase des Gasliftbioreaktors Proben zum Untersuchen auf Wildhefen, Nicht-Lager-Hefen und aerobe und anaerobe Bierverderbsorganismen einschließende Kontaminanten entnommen. Nach fünf Monaten wurden die Hefezellen der Flüssigphase in Doppelbestimmung auf respiratorisch defiziente Mutation getestet.

Rasterelektronenmikroskopie (REM): Immobilisierte Lager-Hefe-Zellen-enthaltende kappa-Carrageenan-Gelkügelchen (1,0–1,5 mm Durchmesser) wurden für REM-Untersuchung zu vier unterschiedlichen Zeiten beprobt: 1) nach Herstellung des Kügelchens mit immobilisierten Zellen und vor Inokulation der Kügelchen in das Fermentationsmedium; 2) nach 2 Tagen in Chargenfermentation; 3) nach 2 Monaten kontinuierlicher Fermentation in einem pilotmaßstäblichen Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor; 4) nach 6 Monaten kontinuierlicher Fermentation in einem pilotmaßstäblichen Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor. Die für REMs und die damit verbundene Probenherstellung sind in Abschnitt 4.7 beschrieben.

Hefezellkonzentration und – Lebensfähigkeit (immobilisiert und frei suspendiert) wurden unter Verwendung der in Abschnitt 4.6 beschriebenen Verfahren zur gleichen Zeit beurteilt wie die REMs.

6.2 Ergebnisse und Diskussion Teil A: Chargenwiederholungs-Kinetiken von in kappa-Carrageenan-Gelkügelchen immobilsierter Hefe

Die Fermentationszeit wurde jedes Mal, wenn mit den immobilisierten Zellen frische Würze angestellt wurde, im großen Umfang reduziert, wie ersichtlich in Figuren 6.4 (a), (b) und (c), die Maltose, Maltotriose, Glucose, Fructose und Ethanol gegen Fermentationszeit für die drei wiederholten Chargenfermentationszyklen darstellen. Aus diesen Figuren ist ersichtlich, dass die Zeit für vollständigen Zuckerverbrauch 64 Stunden bei R1, 44 Stunden bei R2 und 26 Stunden bei R3 war. Die Kontrollfermentation mit frei suspendierten Zellen, die keine Kügelchen mit immobilisierten Zellen enthielt, gezeigt in Figur 6.5, benötigte 82 Stunden für vollständigen Zuckerverbrauch. Man kann auch aus dem Graphen in 6.4 ersehen, dass die endgültigen Ethanolkonzentrationen im dritten der drei wiederholten Chargenfermentationen mit immobilisierten Zellen am höchsten waren. Da kappa-Carrageenan ein Hydro-Gel ist, wird etwas Ethanol mit den Kügelchen verschleppt, wenn mit ihnen frische Würze angestellt wird. Folglich war zur Zeit 0 bei R2 und R3 etwas Ethanol in der Fermentationsflüssigkeit vorhanden, und die anfängliche Konzentration von Glucose, Maltose, Maltotriose und Fructose war in den Fermentationen mit immobilisierten Zellen (Figur 6.4) niedriger, verglichen mit den Kontrollfermentationen mit freien Zellen, wie in Figur 6.5 ersichtlich. Deshalb wurden Ausbeutefaktoren für die Fermentationen berechnet, so dass die Ausbeute, g Ethanolbildung pro g verbrauchtem Zucker, auf einer vergleichbaren Basis untersucht werden kann.

Figur 6.6 (a) und (b) vergleichen Maltose- bzw. Ethanolkonzentrationen gegen Fermentationszeit von R1, R2 und R3. Während wiederholter R1 wurde Maltose von den Hefezellen beinahe sofort nach dem Anstellen frischer Würze aufgenommen. Ethanolkonzentrationen erreichten ihren Gipfel in wiederholter R1 früher und erreichten auch höhere Konzentrationen als die ersten zwei Chargenfermentationen. Wie in Figur 6.6 (b) gezeigt, war die anfängliche Verzögerung der Ethanolproduktion in R1 drastisch reduziert, wenn R2 mit diesen immobilisierten Zellen wieder angestellt wurde, und weiter reduziert nach Wiederanstellen von R3.

Figur 6.7 (a) zeigt Konzentration immobilisierter Zellen pro Gesamtvolumen des Bioreaktors gegen Fermentationszeit für R1, R2 und R3. Die aus der Matrix immobilisierter Zellen in die Haupt-Flüssigphase in diesen Fermentationen freigesetzten freien Zellen sind gegen die Zeit in Figur 6.7 (b) dargestellt. In Figur 6.7 (c) wird die Gesamtzahl immobilisierter und freier Hefezellen pro Gesamtvolumen des Reaktors für die drei Chargen gezeigt. Figur 6.7 (a) zeigt, dass die Konzentration immobilisierter Zellen im kappa-Carrageenan-Gel anschließend an ihre ursprüngliche Inokulation in Würze für R1 weiter anstieg. Wenn frische Würze für wiederholte R2 mit den Kügelchen wieder angestellt wurde, setzte sich das Wachstum in den Gelkügelchen fort. Beim dritten Wiederanstellen frischer Würze mit den verkapselten Zellen hatte sich die Steigerungsrate der Konzentration immobilisierter Zellen verlangsamt. Das Konzentrationsprofil von aus der kappa-Carrageenan-Gelmatrix in die Haupt-Flüssigphase freigesetzten Zellen, immobilisierten Zellen und Gesamtzahl der Zellen in der Fermentation für R1 ist in Figur 6.8 gezeigt.

In R1 stieg die Konzentration immobilisierter Zellen in dem kappa-Carrageenan-Gelkügelchen mit einer zu den Kontrollfermentationen, die nur Zellen in der Flüssigphase enthielten, gleichen Rate an. Dies wurde bestätigt durch Vergleichen der durchschnittlichen Wachstumskurve der Kontrollfermentationen mit freien Zellen in Figur 6.9 mit der gleichen Wachstumskurve von in Carrageenan immobilisierten Zellen in R1 in Figur 6.10. Während R1 waren die Gelkügelchen noch nicht vollständig besiedelt, und die Gelmatrix schien keine hemmende Wirkung auf Hefezellwachstum in den Kügelchen zu haben. Bei R2 schien die Matrix das Wachstum der Zellen in dem Gelkügelchen zu beschränken, was durch einen kleineren Anstieg der Zellzahl während dieses Fermentationszyklus angezeigt wird. Dies könnte an der Natur des Gels oder der Überbevölkerung mit Hefezellen in den Kügelchen oder an einem Mangel an Nährstoffversorgung der Zellen liegen.

In Tabelle 6.1 werden die Ethanolausbeuten aus den fermentierbaren Zuckern des Substrats, YP/S, für die drei Chargengenerationen und die Kontrolle gezeigt. In Tabelle 6.2 werden auch die volumetrischen Ethanolproduktivitäten des Bioreaktors, berechnet unter Verwendung der in Tabelle 6.1 angegebenen Daten, angegeben. Die Ethanolausbeuten aus Zuckern bei den Fermentationen unterschieden sich nicht signifikant voneinander oder von der Kontrolle. Ausbeuten waren immer über 90% der von der Gay-Lussac-Gleichung vorhergesagten theoretischen Ausbeute von 0,51. Wie früher erwähnt, hindern Biomasseproduktion und andere durch die Hefezellen gebildeten Nebenprodukte Wirkungsgrade daran, mehr als 95% des Theoretischen zu erreichen (Hardwick, 1995). Die volumetrische Ethanolproduktivität des Bioreaktors in den drei wiederholten Chargenfermentationen variierte signifikant von der Charge zur wiederholten Charge. Ethanolproduktivität stieg mit jedem Zyklus von wiederholter Chargenfermentation, und bei R3 waren die immobilisierten Zellen produktiver als die Kontrollfermentation. Die in R2 produzierte Gesamtmenge Ethanol war nicht signifikant größer als die während R1 produzierte, aber die Fermentationszeit war weniger als die Hälfte von R1 und von der Kontrollfermentation. Es gibt viele Faktoren, die zu dieser mit jeder Chargenwiederholung gesteigerten Fermentationsrate immobilisierter Zellen beitragen könnten, wie Anpassung der Hefezellen an die Fermentationsbedingungen und die fortschreitend steigende Zellkonzentration. Die Gesamtzahl der Zellen pro Bioreaktorvolumen wird nur signifikant größer als die der Kontrolle durch R3. In Figur 6.7 (b) zeigte der Graph der Konzentration frei suspendierte Zellen (freigesetzt aus der Gelmatrix) in der Hauptflüssigkeit gegen Fermentationszeit, dass die Anzahl der aus den Gelkügelchen freigesetzten Zellen mit jeder Chargengeneration stieg. Sobald die Kügelchen voller mit Hefezellen beladen wurden, schienen sie mehr Zellen in die Haupt-Flüssigphase freizusetzen. Hüsken et al. (1996) führten Untersuchungen durch, die Expansion von Bakterienzellkolonien und Ausbruch/Freisetzung aus kappa-Carrageenan-Gelplatten untersuchten. Vives et al. (1993) haben berichtet, dass die maximale Hefezellkonzentration, die diese in kappa-Carrageenan-Gelkügelchen erreicht haben, 109 Zellen pro Gramm Gel war, was die Konzentration ist, die in den Gelpartikeln bei R2 erreicht war. Während der kontinuierlichen Fermentationen in Teil B wurden ähnliche maximale Zellkonzentrationen gefunden. Maximale Zellladungen in der Gelmatrix werden jedoch von der anfänglichen Zellladung, der Zusammensetzung des Gels und anderen Faktoren abhängen.

Ein weiterer, die gesteigerte volumetrische Produktivität des Bioreaktors betreffender Faktor, der bei jeder wiederholten Chargenfermentation beobachtet wurde, umfasst die Anpassung der Hefezellen. Am Ende der ersten Fermentation hatten die Hefezellen ihre metabolische Maschinerie an die gegebenen Fermentationsbedingungen angepasst. Dies kann in einer die Fermentationsrate steigernden Abnahme der lag-Phase am Beginn der nachfolgenden Chargenfermentationen resultieren. Während dieser Untersuchung wurden alle Kontrollfermentationen mit frisch hergestellter Lager-Hefe durchgeführt. Es wäre interessant, die frei suspendierte Kontrollhefe neben den zum Wiederanstellen verwendeten Hefezellen wieder zum Anstellen zu verwenden, um diesen Effekt relativ zu den Zellkonzentrationseffekten zu untersuchen.

Figur 6.11 zeigt, dass die Lebensfähigkeit immobilisierter Zellen unter Verwendung des Methylenblau-Verfahrens als ein Indikator niedrig war (< 50%), wenn Würze in R1 ursprünglich mit den immobilisierten Zellen angestellt wurde, aber die Lebensfähigkeit der immobilisierten Zellen war über 90% nach 48 Stunden Fermentation. Die Hefezellen besiedelten die Kügelchen rasch, und die Lebensfähigkeit blieb über R3 hinweg hoch. Bei wiederholter R3 nahm die Lebensfähigkeit jedoch zum Ende der Fermentation hin leicht ab. Die freien Zellen, die in das Hauptflüssigmedium freigesetzt wurden, hatten jedoch über alle drei wiederholten Chargenfermentationen hinweg höhere Lebensfähigkeit als ihre immobilisierten Gegenstücke. Die Immobilisierungsmatrix kann eine negative Wirkung auf Hefezell-Lebensfähigkeit haben (Stoffübergangsbeschränkungen und/oder räumliche Beschränkungen), oder lebensfähige Hefezellen können bevorzugt aus der Immobilisierungsmatrix in das Hauptflüssigmedium statt nicht-lebensfähigen Zellen freigesetzt werden.

Eine Auftragung von ln(X/X0) gegen Fermentationszeit unter Verwendung der gemittelten Daten aus drei separaten Kontrollfermentationen mit frei suspendierter Hefe, die in Anhang 1 enthalten sind, ist in Figur 6.12 wiedergegeben. Die Steigung ist gleich der lokal maximalen spezifischen Wachstumsrate der Zellen bei 21°C in Brauwürze mit Schütteln bei 150 U/min. Es wurde herausgefunden, dass die lokal maximale spezifische Wachstumsrate der Hefe 0,096 h–1 ist, und die Zellteilungszeit war 7,22 Stunden. Das in dieser Arbeit festgestellte ⎕max wurde als lokales ⎕max definiert, weil, wie im Theorieabschnitt erwähnt, das in der Monod-Gleichung verwendete ⎕max nur erreichbar ist, wenn S signifikant größer als die Monod-Konstante, Ks, ist. Um die Monod-Konstante, Ks, des limitierenden Substrats in diesen Fermentationen zu beurteilen, ist mehr Arbeit erforderlich, um zu bestätigen, dass das berechnete lokale ⎕max ein wie durch die Monod-Gleichung definiertes, wahres Maximum war.

Teil B: Lebensfähigkeit und morphologische Eigenschaften immobilisierter Hefe über verlängerte Fermentationszeit

Bevor die Gelkügelchen dem Fermentationsmedium ausgesetzt wurden und anschließend an die Herstellung der Kügelchen mit immobilisierten Zellen unter Verwendung des Verfahrens mit statischen Mischern, war die Herstellung der Zellkonzentration 2,6 × 107 Zellen/ml Gelkügelchen (Tabelle 6.3, wo die Werte der Durchschnitt aus zwei Proben sind). REM-Bildgebung zeigt, dass die Zellen einzeln vorliegen und gleichförmig über die Gelkügelchen hinweg verteilt sind (24).

  • * Basierend auf einer einzelnen Probe

Lebensfähigkeit war im Anschluss an 2 Tage Chargenfermentation > 90%, und Zellkonzentration in dem Gelkügelchen war zehnfach angestiegen (Tabelle 6.3). Zellen (> 90% lebensfähig) hatten, eine Konzentration von 107 Zellen/ml Flüssigkeit ergebend, auch begonnen, aus dem Gel in die Haupt-Flüssigphase der Fermentation freigesetzt zu werden. Kleine Hefekolonien bildeten sich in den Gelkügelchen, wobei auf einzelnen Zellen, wie in 25 ersichtlich, zahlreiche Sprossnarben vorhanden waren.

Lebensfähigkeit immobilisierter Hefezellen nahm nach 2 Monaten kontinuierlicher Fermentation in einem Gasliftbioreaktor ab (Tabelle 6.3), aber die Zellen in der Haupt-Flüssigphase blieben höchst lebensfähig (> 90%), und dieser Befund wurde während mehrerer unterschiedlicher kontinuierlicher Fermentationen in pilotmaßstäblichen Gasliftbioreaktoren bestätigt. Die REM in 26 zeigte, dass sich bei zwei Monaten große Hefekolonien gegen die Peripherie des Kügelchens hin gebildet hatten, was die Ergebnisse anderer Forscher bestätigt (Bancel und Hu, 1996; Gòdia et al., 1987; Wada et al., 1979; Wang et al., 1982). Ein Vergleich der Morphologie von zur äußeren Kante eines Kügelchens immobilisierter Zellen hin befindlichen Hefe mit der im Mittelpunkt eines Gelkügelchens befindlichen Hefe wurde in mehreren Proben unter Verwendung von REM-Bildgebung gemacht. Die zur Peripherie der Kügelchen hin angesiedelten Zellen waren eiförmig und glatt mit vielen Sprossnarben (27), was Hefevermehrung anzeigt (Smart, 1995). Die Zellen, die im Mittelpunkt des Kügelchens abgebildet wurden (28) erschienen fehlgeformt und zeigten wenig Anzeichen von Sprossnarbenbildung. Das Fehlen von Sprossnarben kann ein Hinweis auf mögliche Beschränkung von Nährstoffen, wie Sauerstoff, im Mittelpunkt der Kügelchen sein. Die auf der Oberfläche der Hefe in 28 beobachtete Unregelmäßigkeit der Oberfläche kann auch ein Indikator von Zellalterung sein (Barker und Smart, 1996; Smart, 1999).

Die Lebensfähigkeit der in Carrageenan-Gel immobilisierten Hefe war nach sechs Monaten kontinuierlicher Fermentation im Gasliftbioreaktor auf unter 50% abgefallen (Tabelle 6.3). Es ist zu beachten, dass während nur ein einzelner Datenpunkt für Konzentration immobilisierter Zellen und Lebensfähigkeit bei sechs Monaten gesammelt wurde, Daten bei der Fünf-Monatsmarke gleich waren, mit einer Konzentration immobilisierter Zellen von 1,14 × 109 Zellen/ml Gel und einer Lebensfähigkeit von < 50%. Während ein stufenweiser Abfall der Lebensfähigkeit immobilisierter Zellen über die Zeit sichtbar war, blieb die Lebensfähigkeit der Zellen in der Haupt-Flüssigphase verlässlich hoch. Zusätzlich stellte der Bioreaktor während seiner sechs Monate kontinuierlichen Betriebs ein voll fermentiertes Bier her, auch wenn die Lebensfähigkeiten immobilisierter Zellen in den Kügelchen im Ganzen niedrig waren. Mögliche Gründe für diesen Befund schließen den signifikanten Beitrag der höchst lebensfähigen, frei suspendierten Hefezellen zur Fermentation ein. Zudem gibt es den potentiellen Beitrag lebensfähiger immobilisierter Zellen, die sich an der Peripherie des Gelkügelchens befinden, wo es weniger Barrieren für Stoffübergang, im Vergleich zu im Mittelpunkt der Kügelchen befindlichen Zellen, gibt. Es ist unklar, ob die immobilisierten Zellen die Fähigkeit hatten, sich selbst in der Gelmatrix wieder zu verteilen, oder ob diese Zellen dort stationär bleiben, wo sie sich zuerst befanden. Eine Konzentration von 109 Zellen/ml Gelkügelchen war das in diesen Kügelchen während der sechsmonatigen Periode kontinuierlicher Fermentation erreichte Maximum.

In 29 wurde ein ganzes Kügelchen unter Verwendung von REM abgebildet. Dieses Kügelchen hatte eine hohle Mitte, und von den vielen untersuchten Kügelchen zeigte ungefähr die Hälfte diese Struktur. Die hohle Kavität könnte ein Ergebnis der Carrageenan-Gelstruktur-Degradation sein und durch die REM-Präparation weiter gefördert worden sein. Diese hohle Kavität wurde in Präparationen frischer Kügelchen nicht beobachtet. Frühere Arbeiten anderer (Bancel et al., 1996) haben gezeigt, dass wachsende Zellen Schwächung des Gelnetzwerks induzierten. Audet et al. (1988) berichteten, dass der Zusatz von Johannisbrotgummi zu kappa-Carrageenan die mechanische Festigkeit von Gelkügelchen zur Immobilisierung von Bakterien modifizierte.

Über das gesamte sechsmonatige Bier-Fermentationsexperiment hinweg wurde der Gasliftbioreaktor mindestens einmal pro Woche auf Kontamination untersucht. Zu keiner Zeit wurden bakterielle Kontaminanten während des Experiment detektiert. In den letzten zwei Monaten des Versuchs wurde eine kontaminierende Hefe in Konzentrationen, die zwischen 1 und 5 KbE/ml schwankten, detektiert. Diese Hefe war fähig zum Wachstum auf PYN-Medium bei 37°C, wuchs aber aerob oder anaerob nicht auf DUBA-Medium (selektiv für Bakterien), fermentierte Dextrine nicht und zeigte kein Wachstum auf CuSO4-Medium (selektiv für Wildhefen).

Nach fünf Monaten war der durchschnittliche Prozentsatz respiratorisch defizienter Hefezellen 7%, was höher ist als das, was normalerweise bei Verwendung dieses Stammes während industrieller Chargenfermentationen gefunden wird (2% durchschnittlich). Andere Forscher haben ähnliche Befunde berichtet (Norton und D'Amore, 1995). Respiratorisch defiziente Hefen resultieren aus einer Mutation, die bewirkt, dass Hefen unfähig sind, Glucose zu Kohlendioxid und Wasser zu veratmen. Diese Hefen haben Mitochondrien mit dauerhaft beeinträchtigter Aktivität und treten üblicherweise wegen einer Mutation mitochondrialer DNA auf (Hardwick, 1995).

Artefakte der REM-Probenpräparation können Verwirrung verursachen. Technologien, wie magnetische Kernresonanz-(NMR)-spektroskopie (Fernandez, 1996) und konfokale Mikroskopie (Bancel und Hu, 1996) sind verwendet worden, um immobilisierte Zellen nicht-invasiv zu untersuchen. NMR-Bildgebungstechniken erlaubten es Forschern, Transport, Fluss und räumliche Verteilung von Zellen und Biochemikalien in Biofilmen zu studieren. Forscher (Bancel und Hu, 1996) haben auch gezeigt, dass konfokale Laserscanningmikroskopie verwendet werden kann, um immobilisierte Zellen in porösen Gelatine-Mikroträgern durch serielle optische Schnittdarstellung zu beobachten.

Obwohl Methylenblau in der Brauindustrie als ein Standardindikator für Zell-Lebensfähigkeit verwendet wird, hat das Verfahren viele Nachteile (Mochaba et al., 1998). Es misst, basierend auf der Fähigkeit lebensfähiger Zellen, den Farbstoff zu seiner farblosen Form zu oxidieren, ob eine Hefepopulation lebensfähig oder nicht lebensfähig ist. Nicht-lebensfähigen Zellen fehlt die Fähigkeit, den Farbstoff zu oxidierend, und sie bleiben deshalb blau (O'Connor-Cox et al., 1997). Plattenzähl- und Objektträgerkultur-Techniken beruhen auf der Fähigkeit der Zellen, zu wachsen und Makrokolonien auf Agarplatten oder Mikrokolonien auf Medien-bedeckten Mikroskopobjektträgern (Technical Committee and Editorial Committee of ASBC, 1992) zu bilden. Laufende Arbeit der Untersuchung der Lebensfähigkeit von Hefe in immobilisierten Matrizes über verlängerte Zeitperioden bei Labatt verwendet jetzt nicht nur Methylenblau, sondern auch die oben genannten Verfahren, wie auch die konfokale Mikroskopietechnik, die unter Verwendung von Lebendfärbung entwickelt wird. Zusätzlich zum Messen der Lebensfähigkeit der Zellen muss auch die Frage der "Vitalität" der immobilisierten Zellen in zukünftiger Arbeit angesprochen werden. Wo Lebensfähigkeit verwendet worden ist, um die Fähigkeit der Zellen, zu wachsen und sich zu reproduzieren, zu beschreiben, misst Vitalität Hefe-Fermentationsleistung, Aktivität oder die Fähigkeit der Hefe, sich von Stress zu erholen (Smart et al., 1999).

KAPITEL 7. AROMAPRODUKTION IN EINEM KONTINUIERLICHEN GASLIFT BIER-FERMENTATIONSSYSTEM 7.1 Experimentelles Verfahren

Verwendung kontinuierlicher Fermentation, um Bier herzustellen, unterscheidet sich stark von anderen immobilisierte Zellen verwendenden Anwendungen, weil das resultierende Produkt nicht im Hinblick auf eine Komponente von Interesse, wie Ethanol, gemessen wird. Es ist vielmehr ein Gleichgewicht zahlreicher chemischer Verbindungen, das ausgeglichen sein muss, um ein fertiggestelltes Qualitätsprodukt zu ergeben. Die Auswirkungen von Sauerstoff auf Aroma-Metabolite der Hefe während kontinuierlicher primärer Fermentation und während einer sekundären Chargenaufbewahrungsperiode wurden untersucht. Die Auswirkung der Verweilzeit auf Aroma-Metabolite wurde ebenso bei zwei Leveln untersucht. Zuletzt wurde eine kommerzielle Enzymzubereitung von alpha-Acetolactat-Decarboxylase zur Würzeversorgung der kontinuierlichen Fermentation zugesetzt, und Gesamtdiacetylkonzentration der Flüssigphase wurde überwacht.

7.1.1 Auswirkung relativer Mengen von Luft im Bioreaktor-Fluidisierungsgas auf Hefe-Metabolite während primärer kontinuierlicher Fermentation

Die Menge an Luft, und damit Sauerstoff, in dem Bioreaktor-Fluidisierungsgas wurde variiert, während Verweilzeit, Temperatur und alle anderen steuerbaren Verfahrensvariablen konstant gehalten wurden. Die gesamte volumetrische Flussrate von Gas wurde konstant bei 472 ml/min bei STP gehalten, Temperatur war 15°C und immobilisierte LCC3021-Hefe-enthaltende kappa-Carrageenan-Gelkügelchen wurden während des ganzen Versuchs mit einer anfänglichen Zellladung von 1 × 108 Zellen/ml Gel verwendet. Über den Versuch hinweg wurden dem System vier unterschiedliche volumetrische Flussraten von Luft auferlegt, und die durchschnittliche Verweilzeit des Bioreaktors, Rt, war 1,18 Tage.

Die folgenden Analysen wurden über das Experiment hinweg wiederholt durchgeführt: freier Aminostickstoff (FAN), gesamte fermentierbare Kohlenhydrate (als Glucose), Ethanol, gesamtes Gesamtdiacetyl, flüchtige Bierinhaltsstoffe (ausgewählte Ester und Alkohole) und in der Flüssigphase Hefezellkonzentration und Lebensfähigkeit. Der Bioreaktor wurde auch mindestens einmal pro Woche auf Kontamination untersucht.

Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Hauptflüssigphase des Bioreaktors wurde gemessen, wenn angenommen wurde, dass die kontinuierliche Fermentation für jede volumetrische Flussrate von Luft in einem pseudostationären Zustand ist (mindestens drei Reaktorumsatzzeiten).

7.1.2 Nachfermentations-Chargenaufbewahrungsperiode: Auswirkungen von Sauerstoffbelastung auf Hefe-Metabolite

Selbst wenn die Sauerstoffmenge im Bioreaktor-Fluidisierungsgas relativ niedrig war (34 ml/min bei STP), waren die während des in Abschnitt 7.1.2 durchgeführten Experiments gefundenen Konzentrationen von Acetaldehyd und Gesamtdiacetyl für den nordamerikanischen Lager-Biermarkt inakzeptabel hoch. Daher wurde ein neuer Vorstoß unternommen, wobei vom kontinuierlichen primären Bioreaktor entnommene Flüssigkeit für 48 Stunden bei einer leicht erhöhten Temperatur von 21°C in Charge aufbewahrt wurde, um die Konzentration dieser zwei Verbindungen zu reduzieren. Auch die Ergebnisse des vorherigen Abschnitts 7.1.2 zeigten die signifikante Wirkung, die die Luftmenge im Fluidisierungsgas auf die gemessenen Aromaverbindungen hatte. Deshalb wurde die Auswirkung von Hefe-Aroma-Metaboliten auf aerobe vs. anaerobe Bedingungen stromabwärts der primären Fermentation, wo die sekundäre Chargenaufbewahrung auftrat, untersucht. Kontinuierliche primäre Fermentation wurde in einem 50 L-Gasliftbioreaktor unter Verwendung einer hochflockenden Variante des LCC3021-Hefestammes für diesen Versuch durchgeführt, weil das Probenvolumenerfordernis für diese Studie im Verhältnis zum Volumen des 8 L-Bioreaktors zu hoch war. Betriebsbedingungen waren 1180 ml/min CO2 und 189 ml/min Luft bei STP im Fluidisierungsgas, eine durchschnittliche Bioreaktor-Verweilzeit, Rt, von 1,0 Tagen, eine Temperatur von 15°C und high-gravity-Lager-Brauwürze mit 17,5°P.

Eine Gesamtzahl von 4 Proben wurde genommen (100 ml Bördelfläschchen), wobei zwei unter anaeroben Bedingungen gehandhabt wurden, und die zwei anderen wurden der aeroben Umgebung ausgesetzt.

Das anaerobe Probenahmeverfahren war wie folgt: zwei 100 ml-Bördelfläschchen und sechs 25 ml-Bördelfläschchen wurden autoklaviert und dann in eine anaerobe Box (Labmaster 100, mbraun, USA) mit Argon als dem Spülgas gesetzt. Den 100 ml-Fläschchen wurde es ermöglicht, sich für 45 Minuten zu equilibrieren, und dann wurden sie unter Verwendung von Aluminiumkappen und Teflon®-Septen verschlossen. Eine 50 ml-Spritze, ausgestattet mit einer 3 Zoll, 16 Gauge-Nadel, desinfiziert unter Verwendung einer 70% (V/V) Ethanollösung, wurde verwendet, um die Probe aus dem Bioreaktor durch Punktieren des Septums der Membran des Pobenventils zu entnehmen, und die Probe wurde in die vorgespülten anaeroben 100 ml-Fläschchen injiziert. Es war notwendig, das Bördelfläschchen durch eine zusätzliche sterile Spritzennadel mit einer Abluftöffnung zu versehen, um Abbau des Drucks im Fläschchen während des Füllens zu erlauben. Die aeroben Proben wurden der Atmosphäre ausgesetzt, als sie vom Bioreaktor durch vollständiges Öffnen des Membranprobenventils ohne Verwendung einer Spritze und Nadel in die nicht-verschlossenen 100 ml-Probenfläschchen abgelassen wurden.

Der Probenflüssigkeit wurde es erlaubt, bei Raumtemperatur für 2 Stunden zu ruhen, um der Hefe zu erlauben, sich aus der Lösung abzusetzen, was eine Zellkonzentration von ungefähr 106 Zellen/ml in der Hauptflüssigkeit hinterlässt. Einmal abgesetzt, wurde die Flüssigkeit aus jedem 100 ml-Fläschchen in drei 25 ml-Fläschchen dekantiert. Die anaeroben Proben wurden in einer anaeroben Box gehandhabt, um Sauerstoffaufnahme zu minimieren, während die aeroben Proben in einer sterilen Werkbank bearbeitet wurden. Jede der Proben in den 100 ml-Fläschchen wurde in drei kleinere 25 ml-Fläschchen aufgeteilt, so dass Analysen der Proben durchgeführt werden konnten, ohne den Verlauf der Fermentation aufgrund der Probenentfernung zu ändern. Sobald die aeroben Proben in die kleineren Fläschchen überführt wurden, wurden sie unverschlossen bei 21°C inkubiert. Die anaeroben Proben wurden in die drei kleineren Fläschchen transferiert und unter Verwendung einer Aluminiumkappe und von Teflon®-Septen verschlossen. Um Druckaufbau durch die Kohlendioxidentwicklung in den Fläschchen zu vermeiden, während Exposition der Proben gegenüber der aeroben äußeren Umgebung verhindert wird, wurden die Septen mit einer Nadel punktiert. Das Ende der der äußeren Umgebung ausgesetzten Nadel wurde in Ethanol untergetaucht (weniger als 1 cm Kopfdruck), um jeglichen Rückfluss von Luft in die Probe zu verhüten. Proben wurden zur Analyse bei 2, 24 und 48 Stunden gesammelt. Eine Probe wurde auch direkt vom Bioreaktor genommen und sofort analysiert, um den Zustand der Fermentation im Bioreaktor zur Zeit des Protokolls zu beurteilen. Die Proben wurden auf gesamte fermentierbare Kohlenhydrate (als Glucose), Ethanol, Gesamtdiacetyl und flüchtige Bierinhaltsstoffe (ausgewählte Ester und Alkohole) untersucht.

7.1.3 Auswirkungen der Flüssigkeitsverweilzeit auf Hefe-Metabolite während kontinuierlicher primärer Bierfermentation

Um die Auswirkung der Flüssigkeitsverweilzeit auf metabolische Aktivität der Hefe zu untersuchen, wurde ein Experiment durchgeführt, in dem eine Stufenänderung der volumetrischen Würzeflussrate zum Bioreaktor während kontinuierlicher Bierfermentation unter Verwendung von in kappa-Carrageenan-Gelkügelchen immobilisierten LCC3021-Hefezellen, aufgeprägt wurde. Die Bioreaktor-Temperatur wurde über den Versuch hinweg konstant bei 17°C gehalten. Die an den Bioreaktor gelieferte volumetrische Gasflussrate war ebenfalls konstant bei 472 ml/min bei STP. Das Gas war eine Mischung von Luft (11 ml/min bei STP) und Kohlendioxid (461 ml/min bei STP). Die anfängliche Konzentration von Hefezellen im kappa-Carrageenan-Gel war 2,6 × 107 Zellen/ml Gelkügelchen, und der Bioreaktor enthielt 40% (V/V) Kügelchen.

Die folgenden Analysen wurden wiederholt über den Versuch hinweg durchgeführt: Kohlenhydrate, freier Aminostickstoff (FAN), gesamte fermentierbare Kohlenhydrate (als Glucose), Ethanol, Gesamtdiacetyl, flüchtige Bierinhaltsstoffe (ausgewählte Ester und Alkohole) und in der Flüssigphase Hefezellkonzentration und Lebensfähigkeit. Der Bioreaktor wurde auch mindestens einmal pro Woche auf Kontamination untersucht.

7.1.4 Verwendung einer kommerziellen Zubereitung von alpha-Acetolactat-Decarboxylase, um Gesamtdiacetyl während kontinuierlicher primärer Bierfermentation zu reduzieren

Hohe Diacetylkonzentrationen werden von den meisten nordamerikanischen Brauern als ein nicht-erwünschenswerter Aromafehler in ihrem Bier angesehen. In den bislang durchgeführten kontinuierlichen primären Fermentationen sind Gesamtdiacetylkonzentrationen beständig über den Schwellenwerten für traditionelle Chargenfermentationen (70–150 &mgr;g/l) in einem nordamerikanischen Lager-Bier gewesen. Während Chargenfermentation wird Diacetyl während der späteren Stufen der Fermentation, wenn Sauerstoff nicht länger anwesend ist und keine zusätzlichen Zucker eingeführt werden, reduziert. Im kontinuierlichen Fermentationssystem wird dem Bioreaktor durch ein Einblaserohr eine konstant niedrige Sauerstoffkonzentration zugeführt, und dem Bioreaktor wird kontinuierlich frische Würze zugeführt. Deshalb wurde eine neue Strategie, die eine kommerzielle Enzymzubereitung verwendet, erforscht, um Diacetylkonzentration im kontinuierlichen Bioreaktor zu steuern.

In einer Würzefermentation wird Diacetyl gebildet, wenn alpha-Acetolactat, ein Zwischenprodukt in der Valin-Synthese, außerhalb der Hefezelle oxidativ decarboxyliert wird. Die Hefezelle nimmt dann Diacetyl wieder auf und wandelt es in das weniger Aroma-aktive Acetoin um. Diese oxidative Decarboxylierung von alpha-Acetolactat zu Diacetyl ist Umsatzratenlimitierend in chargenweisen Würzefermentationen. Während der kontinuierlichen Fermentationen verlies Gesamtdiacetyl den Bioreaktor bei inakzeptabel hohen Konzentrationen (300–400 &mgr;g/l). Das kommerzielle Enzym alpha-Acetolactat-Decarboxylase (ALDC) von Novo-Nordisk A/S kann alpha-Acetolactat direkt in Acetoin umwandeln, was daher das unerwünschte Zwischenprodukt Diacetyl vermeidet (Figur 7.1) (Jepsen, 1993).

alpha-Acetolactat-Decarboxylase wurde der in einen Bioreaktor eingespeisten Würze zugesetzt, um seine Nettowirkung auf Gesamtdiacetylkonzentration zu untersuchen. Andere Strategien zum Reduzieren von Diacetyl, einschließlich einer Chargen-Warmaufbewahrungsperiode von 48 Stunden nach der Fermentation und immobilisierte sekundäre Fermentationssysteme, Technologie von Alpha-Laval (Anon, 1997), wurden ebenfalls erforscht. Beide dieser anderen Strategien haben Erfolg gezeigt im Reduzieren der Diacetylkonzentrationen nach der Fermentation, aber keine davon spricht die Konzentration von Diacetyl an der Quelle (d.h., am Bioreaktor-Auslass) an. Durch Verwendung von ALDC in der Würze zum Reduzieren der aus dem Bioreaktor kommenden Diacetylkonzentration konnten die Behandlungsperioden nach der Fermentation minimiert oder eliminiert werden.

ALDC-Aktivität ist optimal bei pH 6,0 in Lager-Würze bei 10°C. Bei pH 5,0, typisch für industrielle Würzen, ist ALDC-Aktivität bei einer Temperatur von 35°C maximiert (Anon, 1994). Unter typischen Bierfermentationsbedingungen von reduzierter Temperatur und reduziertem pH ist ALDC-Aktivität weniger als optimal.

Health Canada änderte Kanadas Food and Drug Regulations (SOR/97-81) 1997 ab, um die Verwendung von ALDC in alkoholischen Getränken zu erlauben, was die Tür für seine Verwendung in kanadischen Brauerein geöffnet hat. Bacillus subtilis, der das für ALDC (E. C. 4.1.1.5) aus Bacillus brevis codierende Gen trägt, stellt das Enzym ALDC her. Weil ALDC ein Enzym ist, das durch einen genetisch modifizierten Organismus (GMO) hergestellt wird, wäre es nötig, Fragen der öffentlichen Wahrnehmung anzusprechen, bevor so ein Enzym in einem kommerziellen Produkt verwendet wird.

Lager-Hefe, LCC3021, wurde für diese Experimente verwendet. High gravity-Lager-Brauwürze, 17,5°P, wurde von der Labatt London-Brauerei geliefert. Ethanol, gesamte fermentierbare Kohlenhydrate (als Glucose), Gesamtdiacetyl und Flüssigphasen-Zellkonzentration wurden überwacht. Hefezellen wurden, wie in Kapitel 4 beschrieben, in kappa-Carrageenan-Gelkügelchen immobilisiert. Dem Bioreaktor wurden drei Umsatzzeiten zugestanden, bevor angenommen wurde, dass er einen pseudostationären Zustand erreicht hatte. Wie früher erwähnt, wird das in dieser Arbeit verwendete Diacetyl-Verfahren als "Gesamtdiacetyl" bezeichnet, weil das Verfahren die Menge von Diacetyl und seines Vorläufers, alpha-Acetolactat, misst. Eine während dieses Experiments beobachtete Reduktion des Gesamtdiacetyls würde daher an der kombinierten Wirkung der alpha-Acetolactat direkt zu Acetoin umwandelnden Enzyme und der nachfolgend verringerten Konzentration seines Abkömmlings Diacetyl liegen.

alpha-Acetolactat-Decarboxylase (ALDC) wurde als großzügiges Geschenk für Laborzwecke von Novo Nordisk A/S, Dänemark, als Maturex® L zur Verfügung gestellt. Die Aktivität des Enzyms war 1500 ADU/g, wobei ADU die Menge des Enzyms ist, die unter Standardbedingungen, durch Decarboxylierung von alpha-Acetolactat, 1 &mgr;mol Acetoin pro Minute, wie beschrieben in Novo Nordisk Method AF27 (Anon, 1994) produziert.

Kontinuierliche Fermentationsbedingungen: Kontinuierliche Fermentationen wurden durchgeführt im 8 l-Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor, angestellt mit 40% (V/V) kappa-Carrageenan-Kügelchen, enthaltend immobilisierte Lager-Hefezellen. Der Bioreaktor wurde mit einer Mischung von Kohlendioxid (438 ml/min bei STP) und Luft (34 ml/min bei STP) durchblasen. Fermentationstemperatur wurde auf 15°C während der ganzen Versuche geregelt, und die Bioreaktor-Verweilzeit, Rt, war 1,5 Tage. Gesamtdiacetylkonzentration wurde unter diesen Bedingungen überwacht, und eine durchschnittliche Diacetylkonzentration der pseudostationären Zustandskontrolle wurde erreicht. ALDC wurde der Würze dann in einer Konzentration von 72 &mgr;g/l (108 ADU/l) zugesetzt, und Gesamtdiacetylkonzentration im Bioreaktor wurde hinsichtlich einer Reaktion überwacht.

Experiment 1: Würze wurde im Sudhaus in einen 20 l-Edelstahlbehälter gesammelt und in einem Autoklaven für 45 Minuten auf 100°C erhitzt. Die Würze wurde während Einspeisung in den Bioreaktor bei 2°C in einem geregelten Wasserbad aufbewahrt. Sobald eine pseudostationäre Gesamtdiacetylkonzentration im Bioreaktor erreicht wurde, wurden 72 &mgr;g/l (108 ADU/l) ALDC zur Würze im 20 l-Behälter zugesetzt. Die anfängliche Biomassebeladung in den kappa-Carrageenan-Gelkügelchen war 3 × 107 Zellen/ml Gel.

Experiment 2: Um das Kontaminationsrisiko zu minimieren, wurde das System am Auslass im Kreislauf geschlossen, und andere Ausrüstungen wurden auch an dem in Kapitel 4 beschriebenen System durchgeführt. Wie bei Experiment 1 wurde Würze aus dem Sudhaus in einen 20 l-Edelstahlbehälter gesammelt und für 45 Minuten bei 100°C autoklaviert. Während Einspeisung in den Bioreaktor wurde die Würze bei 2°C in einem Temperatur-gesteuerten Wasserbad aufbewahrt. Die anfängliche Biomassebeladung in den kappa-Carrageenan-Gelkügelchen war 3 × 107 Zellen/ml Gel. Sobald eine pseudostationäre Gesamtdiacetylkonzentration im Bioreaktor erreicht wurde, wurden der Würze im 20 l-Behälter 72 &mgr;g/l (108 ADU/l) ALDC zugesetzt.

Experiment 3: Nicht-Sauerstoff-angereicherte Brauwürze mit 17,5°P (14 hl) wurden in einem großen Würzelagerbehälter (T-1) in der Pilotanlage gesammelt. Sie wurde dann Blitzpasteurisiert und mit Kohlendioxideinblasung gelagert, um eine konstant niedrige Konzentration gelösten Sauerstoffs von < 0,10 mg/l, wie in Kapitel 5 beschrieben, aufrecht zu erhalten. Die Würze wurde aus diesem Tank in den Bioreaktor eingespeist, bis eine pseudostationäre Gesamtdiacetylkonzentration erreicht war. Für den Rest des Versuchs wurde dann ALDC (72 &mgr;g/l) aseptisch zur Würze zugesetzt. Der Zusatz von ALDC wurde erreicht durch Messen der im Lagerbehälter verbleibenden Würzemenge und Berechnen der ALDC-Menge, die benötigt wird, um die Konzentration des Enzyms auf eine Zielkonzentration von 72 &mgr;g/l (108 ADU/l) zu bringen. Die entsprechende Menge des Enzyms wurde dann in 10 l steriler Würze aufgelöst. Diese Lösung wurde in einen 20 l-Edelstahldruckbehälter überführt, der über sterile Leitung mit dem Probenstutzen am Würzeaufbewahrungsbehälter (T-1) verbunden war. Die ALDC-Lösung wurde dann unter Verwendung sterilen Kohlendioxiddrucks in den Würzeaufbewahrungsbehälter gedrückt. Um sicherzustellen, dass die ALDC-Lösung adäquat mit der Würze im Aufbewahrungsbehälter gemischt war, wurde die Flussrate des in den Tank eingeblasenen Kohlendioxids auf 4720 ml/min bei STP für 1 Stunde gesteigert und dann auf seine normale Flussrate zurückgesetzt. Der Aufbewahrungstank enthielt dann genug ALDC-dosierte Würze, um den Versuch abzuschließen. Die anfängliche Biomassebeladung in den kappa-Carrageenan-Gelkügelchen war 108 Zellen/ml Gel.

7.2 Ergebnisse und Diskussion 7.2.1 Auswirkung relativer Mengen von Luft im Bioreaktor-Fluidisierungsgas auf Hefe-Metaboliten während primärer kontinuierlicher Fermentation

In Figuren 7.2–7.11 sind Hefelebensfähigkeit und Zellkonzentration in der Flüssigphase, freie Aminostickstoff- (FAN), gesamte fermentierbare Kohlenhydrate- (als Glucose), Ethanol-, Gesamtdiacetyl-, Acetaldehyd-, Ethylacetat-, 1-Propanol-, Isobutanol-, Isoamylacetat-, Isoamylalkohol-, Ethylhexanoat- und Ethyloctanoat-Konzentrationen gegen kontinuierliche Fermentationszeit aufgetragen. Alle Bioreaktor-Betriebsbedingungen wurden über das ganze Protokoll hinweg konstant gehalten, außer dem Prozentsatz der Luft im Bioreaktor-Einblasegas, was direkt an den Figuren vermerkt ist. In Tabelle 7.2 sind die Mittelwerte für jeden Analyten im pseudostationären Zustand (nach einem Minimum von drei Reaktorumsatzzeiten) zusammengefasst.

  • * Durchschnitt der letzten vier Tage jeder Betriebsbedingung

Figuren 7.2 und 7.3 zeigen, dass die Flüssigphasen-Hefepopulation während dieses Experiments nicht 0 erreichte. Die Aromaverbindungen, die in dieser Arbeit untersucht wurden, wurden durch eine Kombination von freien und immobilisierten Hefezellen gebildet, und die relativen Beiträge jeder Quelle wurden nicht bestimmt. Es gab in dieser Arbeit mehr als eine Quelle frei suspendierter Hefezellen: Biomassewachstum und Zellen, die aus den Gelkügelchen in das Hauptflüssigmedium freigesetzt wurden. Forschung hat mit zusammengesetzten Modellen aus Zellfreisetzung und -wachstum gezeigt, dass, wenn Zellen aus Biofilmen freigesetzt werden, immer eine Population von Zellen in der Ausstoßflüssigkeit sein wird, selbst wenn der Bioreaktor bei hohen Verdünnungsraten betrieben wird (Karamanev, 1991).

In Figur 7.4 wurde die Konzentration von freiem Aminostickstoff (FAN) in der Flüssigphase verfolgt. Es war interessant zu bemerken, dass die minimalen FAN-Konzentrationen bei 34 ml/min Luft bei STP auftraten. Dies stimmte nicht überein mit maximaler Ethanolkonzentration oder minimalen gesamten fermentierbaren Kohlenhydrate (als Glucose)-Konzentrationen. Die Ethanolkonzentration in der Bioreaktor-Flüssigphase nahm ab, während gesamte fermentierbare Kohlenhydrate (als Glucose) anstiegen, wenn die volumetrische Flussrate von Luft im Einblasegas von 94 auf 354 ml/min gesteigert wurde, wie in Figur 7.5 ersichtlich. Dies kann darauf hindeuten, dass aufgrund der Steigerung der Sauerstoffverfügbarkeit mehr Zellatmung, im Gegensatz zu Fermentation, auftrat. Wenn die volumetrische Flussrate wieder von 354 ml/min herab auf 34 ml/min bei STP reduziert wurde, stieg die Ethanolkonzentration wieder an, sie erreichte jedoch nicht die Konzentration, die bemerkt wurde, wenn die Flussrate 94 ml/min bei STP war. Es ist schwierig, die Ethanolkonzentrationen bei 34 ml/min mit denen bei 94 ml/min bei STP in präzisen Begriffen zu vergleichen, weil es andere das System beeinflussende Faktoren gab, resultierend aus Zellalterung, Wirkungen der kontinuierlichen Exposition gegenüber relativ hoher Sauerstoffmenge für die Zeit bei 354 ml/min bei STP und Änderung in der Population immobilisierter Zellen. White und Portno (1978) bemerkten in Figur 2.4 Änderungen der Konzentrationen von Aroma-Metaboliten der Hefe mit kontinuierlicher Fermentationszeit in ihrem Turmfermenter.

In Figur 7.6 ist die ausgeprägte Auswirkung von Sauerstoff auf die Produktion von Diacetyl sichtbar. Da Diacetyl üblicherweise als eine nicht-wünschenswerte Aromaverbindung in Bier angesehen wird, ist einer der Hauptgründe für das Optimieren der Sauerstoffmenge im Bioreaktor das Steuern der Konzentrationen dieser Aromaverbindung. Nach der Phase mit 354 ml/min Luft wurde die Flussrate auf 34 ml/min bei STP gesenkt, und Gesamtdiacetyl nahm ab. Es ist bekannt, dass erhöhter Sauerstoff während Chargenfermentation zu einer Steigerung der Bildung von alpha-Acetolactat, dem Vorläufer von Diacetyl, führt (Kunze, 1996).

In Figur 7.7 ergab sich eine klare Beziehung zwischen der Luftmenge im Einblasegas und Acetaldehydkonzentration. Als die Prozent Luft im Einblasegas sanken, sank die Acetaldehydmenge ebenfalls. Acetaldehyd verleiht Bier eine Note grüner Äpfel und ist in kommerziellem Bier normalerweise in Konzentrationen von weniger als 20 mg/l vorhanden.

In Tabelle 7.2 und Figuren 7.8–7.9 sind die Konzentrationen des pseudostationären Zustands von Ethylacetat, Isoamylacetat, Ethylhexanoat und Ethyloctanoat angegeben gegen kontinuierliche Fermentationszeit. Bei allen gemessenen Estern resultierte die Stufenänderung der Belüftungsrate von 94 auf 354 ml/min bei STP in einer Abnahme der Konzentration. Wenn die Belüftungsrate von 354 ml/min auf 34 ml/min bei STP gesenkt wurde, stiegen die Konzentrationen von Isoamylacetat, Ethylhexanoat und Ethyloctanoat. Sie stiegen jedoch nicht auf die Werte, die bei 94 ml/min Belüftungsrate festgestellt wurden. Das Reaktionsmuster dieser Verbindungen stimmte eng überein, wobei Ethylhexanoat und Ethyloctanoat mehr relative Schwankungen zeigen als Isoamylacetat. Die Konzentration von Ethylacetat nahm tatsächlich weiter ab, wenn die volumetrische Flussrate von Luft auf 34 ml/min bei STP reduziert wurde. Bei allen in dieser Untersuchung gemessenen Estern zeigte die Konzentration einen Anstieg, wenn die Luft aus dem Fluidisierungsgas vollständig eliminiert wurde. Die Konzentration jedes Esters stieg und nahm dann langsam ab, als die Zellkonzentration in der Flüssigphase im Bioreaktor rasch abnahm.

Die höheren Alkohole Isoamylalkohol, Isobutanol und 1-Propanol gegen kontinuierliche Fermentationszeit sind in Figuren 7.10 und 7.11 wiedergegeben. Bei den gemessenen Alkoholen stieg die Konzentration als Ergebnis des Stufenänderungsanstiegs der Belüftung von 94 auf 354 ml/min bei STP an. Isobutanol zeigte die größten relativen Schwankungen, wenn die Belüftungsrate geändert wurde. Die 1-Propanolkonzentrationen waren deutlich unterhalb der Geschmacksschwellenwerte von 600–800 mg/l, dennoch war über das kontinuierliche Fermentationsexperiment hinweg die Konzentration deutlich über der in typischen kommerziellen Chargen produzierten Bieren gefundenen, wo die Konzentrationen üblicherweise unter 16 mg/l sind. Dies war nicht der Fall bei Isoamylalkohol oder Isobutanol, die innerhalb der normalen Bereiche waren. Es wird angenommen, dass die Verbindung 1-Propanol aus der Reduktion der Säure Propionat entsteht (Gee und Ramirez, 1994). Andere (Hough et al., 1982; Yamauchi et al., 1995) haben die Bildung von 1-Propanol auch mit dem Metabolismus der Aminosäuren 4-Aminobuttersäure und Threonin in Verbindung gebracht, wobei die/der korrespondierende Oxosäure- und Aldehyd 4-Oxobuttersäure bzw. Propionaldehyd sind.

Weil Überschüsse von Diacetyl, Acetaldehyd und Fuselalkoholen in Bieren nicht wünschenswert sind, ist Sauerstoffkontrolle wichtig, um ihre Produktion zu begrenzen. Wie im Literatur-Review diskutiert, gibt es eine verstärkte anabolische Bildung von Aminosäurevorläufern, und daher einen Überfluss von höheren Alkoholen, Oxosäuren und Diacetyl, wenn die Zufuhr von Sauerstoff zu den Hefezellen gesteigert ist. Die Konzentration von Estern ist bekannt dafür, mit einem Anstieg der Sauerstoffverfügbarkeit abzunehmen, weil Esterbildung durch Acetyltransferase katalysiert wird. Acetyltransferase wird durch ungesättigte Fettsäuren und Ergosterol gehemmt, die wiederum in Anwesenheit von Sauerstoff ansteigen (Norton und D'Amore, 1994).

Bei den in diesem Experiment verwendeten Bioreaktor-Bedingungen waren die Konzentrationen des gelösten Sauerstoffs im pseudostationären Zustand (nach einem Minimum von drei Reaktorumsatzzeiten), gemessen in der Flüssigphase des Bioreaktors, nahe 0 (weniger als 0,03 mg/l).

Dieses Experiment erlaubte keinen direkten Vergleich der Daten von 94 ml/min und 34 ml/min Luft bei STP im Fluidisationsgas, weil sie durch die höchste Luftflussrate (354 ml/min) separiert waren. Dies liegt daran, dass der physiologische Zustand der Hefe, resultierend aus der Exposition gegenüber den vorherigen Bioreaktor-Bedingungen, die Immobilisierungsmatrix und kontinuierliche Fermentationszeit auch andere Änderungen der Aromabildung verursacht haben können.

Im Bioreaktor wurde an keinem Punkt des Experiments Kontamination detektiert.

Um das Bedürfnis der Hefe nach etwas Sauerstoff, um Hefelebensfähigkeit aufrecht zu erhalten, und der Notwendigkeit, Sauerstoff zu minimieren, um ein Bier mit wünschenswertem Aromaprofil zu erhalten, auszugleichen, könnten andere Strategien erforscht werden, wie z.B. der Zusatz von Nährstoffen, wie Zink, Magnesium oder Versorgung mit anderen exogenen Verbindungen, die erforderlich sind, um die Hefezellen lebensfähig zu halten. Solche Zusätze würden eine weitere Abnahme des Sauerstoffbedarfs der Hefe ermöglichen. Eine andere Möglichkeit wäre es, die meiste Zeit mit sehr niedrigen Sauerstoffkonzentrationen zu arbeiten, wobei der Hefe periodische Sauerstoffimpulse auf einer regelmäßigen Basis zugeführt werden, um Zelllebensfähigkeit aufrecht zu erhalten.

7.2.2 Chargenaufbewahrungsperiode nach der Fermentation: Auswirkungen der Sauerstoffexposition auf Hefe-Metabolite

Weil Gesamtdiacetyl am Ende der primären Fermentation nicht innerhalb der normalen Bereiche für ein kommerzielles Bier war, wurden mehrere Vorstöße unternommen, um die Konzentration dieser Verbindung auf akzeptable Konzentrationen zu reduzieren. Ein solcher Vorstoß war es, eine unmittelbar auf die kontinuierliche primäre Fermentation folgende Warmaufbewahrungsperiode zu verwenden. In Figuren 7.12–7.21 sind gesamte fermentierbare Kohlenhydrate- (als Glucose), Ethanol-, Gesamtdiacetyl-, Acetaldehyd-, Ethylacetat-, 1-Propanol-, Isobutanol-, Isoamylacetat-, Isoamylalkohol- und Ethylhexanoatkonzentrationen in der Flüssigphase gegen Aufbewahrungszeit nach der Fermentation aufgetragen. Vom kontinuierlichen primären Fermenter in pseudostationärem Zustand gesammelte Proben wurden unter anaeroben oder aeroben Bedingungen aufbewahrt, wie in der Legende jeder Figur angegeben.

In Figur 7.12 sank die Konzentration der gesamten fermentierbaren Kohlenhydrate (als Glucose) in den ersten zwei Stunden schnell ab und sank dann bei einer langsameren Rate während des Rests der Aufbewahrungsperiode sowohl in anaeroben als auch aeroben Proben. Mögliche Gründe für diese Beobachtung sind, dass während der ersten zwei Stunden mehr Hefe vor dem Dekantieren anwesend war und die Konzentration der Zucker am Beginn der Aufbewahrungsperiode höher war. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Aufnahme fermentierbarer Glucose zwischen aeroben und anaeroben Proben, obwohl anfänglich einige Unterschiede bemerkt wurden.

Die Konzentration von Ethanol in Figur 7.13 stieg am Beginn der Aufbewahrungsperiode rasch und dann stieg die Ethanolkonzentration der anaeroben und aeroben Proben über die Zeit in einer beinahe parallelen Weise. Der ursprüngliche Ethanolanstieg der anaeroben Probe fiel zusammen mit der Periode, in der die meiste Zuckeraufnahme auftrat. Am Ende der Aufbewahrungsperiode war die Ethanolkonzentration in den anaerob behandelten Proben höher.

In Figur 7.14 zeigten die aeroben Proben einen frühen Anstieg von Acetaldehyd nach Exposition gegenüber aeroben Bedingungen außerhalb des Bioreaktors. Die Kombination aerober Bedingungen mit Zuckerverbrauch und Ethanolproduktion könnte für dieses Ergebnis verantwortlich sein. Zum Ende der 48-stündigen Aufbewahrungsperiode hin war die Acetaldehydkonzentration von 17 mg/l auf 9 mg/l in der anaeroben Probe gefallen, was die Konzentration der Flüssigkeit auf Werte innerhalb der Spezifikationen für ein nordamerikanisches Qualitäts-Lager-Bier bringt (weniger als 10 mg/l).

Die Konzentration von Gesamtdiacetyl gegen die Aufbewahrungszeit ist in Figur 7.15 wiedergegeben. Die Resultate zeigen, dass die Elimination von Sauerstoff aus dem System während dieser Aufbewahrungsperiode vorteilhaftere Bedingungen für Diacetyl-Reduktion bietet. Die Form der Gesamtdiacetyl-Kurve kann mit Erschöpfung des freien Aminostickstoffs und der darauf folgenden intrazellulären Produktion von Valin, wovon Diacetyl ein Nebenprodukt ist (Nakatani et al., 1984a; Nakatani et al., 1984b), in Verbindung gebracht werden. Gesamtdiacetylkonzentration am Ende der primären kontinuierlichen Fermentation war 326 &mgr;g/l, und sie war bei einer Konzentration von 33 &mgr;g/l am Ende der anaeroben Aufbewahrungsperiode, was deutlich unterhalb der Geschmacksschwelle in kommerziellen Bieren ist.

In den Figuren 7.16–7.18 sind die Konzentrationen der Ester Ethylacetat, Isoamylacetat und Ethylhexanoat gegen Aufbewahrungszeit nach Fermentation aufgetragen. Das gleiche Muster wurde bei aeroben und anaeroben Proben für alle Ester beobachtet. Die Konzentration der Ester divergierte zwischen den anaeroben und aeroben Proben nicht bis später in der Aufbewahrungsperiode, wo die Konzentration der Ester in den aeroben Proben abnahm und die Konzentration in den anaeroben Proben anstieg. Es ist wünschenswert, Bedingungen auszuwählen, die Esterbildung begünstigen, weil die Konzentration der Ester in kontinuierlichen Fermentationen, verglichen mit in kommerziellem Bier gefundenen Esterkonzentrationen, etwas niedrig ist.

Figuren 7.19–7.21 zeigen Isoamylalkohol-, 1-Propanol- und Isobutanolkonzentration gegen Aufbewahrungszeit nach Fermentation. Am Ende der 48-stündigen Aufbewahrungsperiode wurden keine signifikanten Unterschiede bei diesen Alkoholen zwischen den aeroben und anaeroben Behandlungen beobachtet. Die 24-Stunden-Proben zeigten jedoch in allen Fällen eine höhere Konzentration bei den aeroben Behandlungen.

In Figur 7.22 ist ein Netzdiagramm wiedergegeben, um Vergleich einer Anzahl der Aromaverbindungen nach 48-stündiger aerober und anaerober Aufbewahrungsperiode mit einem Profil eines kommerziellen Bieres zu erlauben. Netzdiagramme werden in der Brauindustrie allgemein verwendet, um einem zu erlauben, eine Vielfalt unterschiedlicher Biereigenschaften zusammen in einem Graphen zu untersuchen und zu vergleichen (Sharpe, 1988). Aus dieser Figur ist ersichtlich, dass das anaerob aufbewahrte, kontinuierlich fermentierte Bier die engste Übereinstimmung mit einem typischen Marktbier ist. Aus Anhang 6 ist ersichtlich, dass die anaerobe Flüssigkeit innerhalb normaler Bereiche für ein Marktbier, außer im Fall von 1-Propanol, war, das signifikant höher als in Chargen-fermentierten Bieren war. Dieses überdurchschnittlich hohe 1-Propanol wurde in allen kontinuierlich fermentierten Produkten aus dieser Arbeit beobachtet.

Die Bildung von 1-Propanol geschah während der kontinuierlichen primären Fermentationsstufe und nahm während der Aufbewahrungsperiode nicht signifikant ab, gleich, ob die Bedingungen aerob oder anaerob waren. Kunze (1996) stellt fest, dass die folgenden Faktoren höhere Alkohole, wie 1-Propanol, während Chargenfermentation steigern werden: Mischung, intensive Belüftung der Würze und wiederholter Zusatz frischer Würze zu bestehender Hefe.

Schlussendlich wird das ideale Szenario darin bestehen, die sekundäre Aufbewahrungsperiode vollständig durch Optimieren der Bedingungen im primären kontinuierlichen Bioreaktor zu eliminieren. Dennoch können weitere Gewinne gemacht werden durch Verwenden der Aufbewahrungsperiode, durch Optimieren der Aufbewahrungstemperatur (Diacetyl-Entfernung durch Hefe ist sehr temperaturabhängig), der am Beginn der Aufbewahrungsperiode in der Flüssigkeit verbleibenden Menge fermentierbarer Zucker, Optimierung der vorhandenen Hefekonzentration, der hydrodynamischen Eigenschaften des Aufbewahrungsbehälters (Diacetyl-Entfernung könnte durch Verbessern des Kontakts zwischen der Hefe und dem Bier verbessert werden) und Unternehmen weiterer Maßnahmen, um Sauerstoff aus dieser Stufe zu eliminieren.

Volumetrische Bierproduktivitätsberechnungen sind in Anhang 3 angegeben. Das in diesem Abschnitt beschriebene Verfahren, mit einem mit einer 24-stündigen Verweilzeit arbeitenden kontinuierlichen Bioreaktor, gefolgt von einer 48-stündigen Chargenaufbewahrung, ist 1,8 Mal produktiver als ein gegenwärtiges industrielles Chargenverfahren. Ein relativ schnelles industrielles Chargenverfahren mit einer 7,5 Tage-Zykluszeit hat eine volumetrische Bierproduktivität von 0,093 m3 hergestelltes Bier/(m3 Behältervolumen × Tag), wohingegen das hier beschriebene kontinuierliche Verfahren eine Produktivität von 0,165 m3 hergestelltes Bier/(m3 Behältervolumen × Tag) hat. Wenn weitere Forschung erlauben würde, die Chargenaufbewahrungsperiode auf 24 Stunden zu kürzen, würde die Bierproduktivität 2,3 Mal produktiver als der industrielle Chargenstandard werden. Falls das ideale Szenario eines 24-stündigen kontinuierlichen Verfahrens ohne Chargenaufbewahrung erreicht würde, würde volumetrische Bierproduktivität 7,5× die des Chargenstandards werden. Zusätzlich zur gesteigerten volumetrischen Produktivität müssen die durch Abwandern von einem Chargen- zu einem kontinuierlichen Verfahren realisierten zusätzlichen Vorzüge, wie kürzere Zeit zum Vermarkten, Verringerung der Sudhausgröße und weniger häufige Hefepropagation, mit einer vorsichtigen Analyse der diesbezüglichen Betriebskosten ausgewogen sein.

Andere Forscher (Kronlöf und Virkajärvi, 1996; Nakanishi et al., 1993; Yamauchi et al., 1995) konzentrierten sich auf Entwicklung mehrstufiger kontinuierlicher Fermentationen, in denen die erste Stufe kontinuierlicher Fermentation (aerob) nur einen teilweisen Verbrauch der in der Würze vorhandenen fermentierbaren Zucker ergibt. Während diese Strategie einigen Erfolg im Hinblick auf Aromaproduktion gezeigt hat, sind diese Systeme komplex. Zudem schafft die erste aerobe Stufe solcher Systeme eine Umgebung, die empfänglicher für mikrobielle Kontamination ist (d.h., hohe Zuckerkonzentration, Temperatur und Sauerstoff mit niedrigen Ethanolkonzentrationen). In dem in dieser Arbeit vorgestellten Gasliftbioreaktor-System hat der Bioreaktor eine niedrige Konzentration fermentierbarer Zucker, niedrigen pH, hohe Ethanolkonzentration und niedrige Sauerstoffkonzentrationen, was die Umgebung für mögliche Kontaminanten ungastlich macht.

7.2.3 Auswirkung von Flüssigkeitsverweilzeit auf Hefe-Schlüssel-Metabolite während kontinuierlicher primärer Bierfermentation

Figuren 7.23–7.28 zeigen die aus der Bioreaktor-Flüssigphase erhaltenen analytischen Ergebnisse. In Tabelle 7.3 sind die durchschnittlichen Konzentrationen und Flussraten der bei pseudostationärem Zustand gemessenen Analyten (nach einem Minimum von drei Bioreaktor-Umsatzzeiten) bei den während dieses Experiments verwendeten zwei Flüssigkeitsverweilzeiten aufgelistet. Während sich Flüssigphasen-Hefelebensfähigkeit nicht signifikant änderte, wenn die Flussrate des Bioreaktors gesteigert wurde, änderte sich die Hefezellkonzentration, wie in Figur 7.23 ersichtlich.

In Figuren 7.23 und 7.25 stiegen die beiden Konzentrationen der Würzesubstrate freier Aminostickstoff (FAN) und gesamte fermentierbare Kohlenhydrate (als Glucose), wenn die Flüssigkeitsverweilzeit von 1,8 auf 0,9 Tage sank. Aufgrund der Massebilanzen in Tabelle 7.4 stieg die Verbrauchsrate von gesamten fermentierbaren Kohlenhydraten (als Glucose), während die Verbrauchsrate von freiem Aminostickstoff mit sinkender Bioreaktor-Verweilzeit sank. Mit der Reduktion der Flüssigkeitsverweilzeit stieg der Ausbeutefaktor, YP/S, des Fermentationsprodukts Ethanol aus fermentierbarem Glucosesubstrat von 0,3 auf 0,5. Weil das System mit Luft und Kohlendioxid durchblasen wurde, gab es vermutlich geringe Ethanolverluste in die Gasphase, die durch Beeinflussen der Ethanol-Bilanz eine Auswirkung auf den Ausbeutefaktor, YP/S, haben würden. In Zusammenarbeit mit Budac und Margaritis (1999) durchgeführte Forschung hat unter Verwendung einer gaschromatographisch-massenspektroskopischen Technik (GC-MS) qualitativ gezeigt, dass flüchtige Bieraromastoffe, einschließlich Ethanol, Acetaldehyd, Ethylacetat und Isoamylacetat, im Kopfraum des Gasliftbioreaktors während kontinuierlicher Fermentation detektiert werden.

  • * Einlasskonzentrationen aus Anhang 1

Die Flüssigphasenkonzentration des Fermentationsprodukts Ethanol sank mit der Stufenänderung der Flüssigkeitsverweilzeit. Jedoch produzierte das System als ein Ganzes bei der schnelleren Flüssigkeitsverweilzeit mehr Ethanol auf einer Massenflussraten-Basis. Maximierung der Ethanolproduktivität muss mit anderen Faktoren ausgeglichen werden, weil es das Ziel dieser Arbeit war, nicht nur Ethanol als einzelnes, sondern vielmehr ein Bier mit einem Gleichgewicht vieler Verbindungen herzustellen. Am Ende einer kommerziellen primären Bierfermentation muss die Mehrheit des fermentierbaren Glucosesubstrats verbraucht sein.

In Figur 7.26 ist die Reaktion von Acetaldehyd- und Gesamtdiacetylkonzentration auf die Stufenänderung der Würzeflussrate wiedergegeben. Beide Analyten stiegen in Konzentration und in ihrer Bildungsrate, wenn die Flüssigkeitsverweilzeit gesenkt wurde. Acetaldehyd wird während Chargen-Bierfermentationen von der Hefe während der ersten wenigen Tage der Fermentation ausgeschieden (Kunze, 1996).

Figuren 7.25 und 7.27 zeigen die Auswirkung sinkender Bioreaktor-Verweilzeit auf die Flüssigphasen-Konzentrationen der höheren Alkohole 1-Propanol, Isobutanol und Isoamylalkohol. Als die Bioreaktor-Verweilzeit gesenkt wurde, sanken die Konzentrationen aller drei höheren Alkohole.

Ethylacetat- und Isoamylacetat-Massenflussraten, angegeben in Tabelle 7.3 (b), stiegen beide als Reaktion auf die Senkung der Flüssigkeitsverweilzeit. In Figur 7.28 sank die Flüssigphasen-Konzentration von Ethylacetat, während Isoamylacetat anstieg. Die Bedingungen im Bioreaktor förderten Esterbildung, weil dieses Experiment eine Steigerung des Flüssigphasen-Zellwachstums ohne Steigern der Sauerstoffzufuhr zum System ermöglichte. Hough et al. (1982) stellen fest, dass gesteigerte Wachstums- und gesenkte Sauerstoffbedingungen Esterbildung fördern.

7.2.4 Verwendung einer kommerziellen Zubereitung von alpha-Acetolactat-Decarboxylase, um Gesamtdiacetyl während kontinuierlicher primärer Bierfermentation zu reduzieren

Experiment 1: Der Bioreaktor war mit aerob wachsenden grampositiven Kokken kontaminiert, bevor der Versuch abgeschlossen werden konnte. Es wurde festgestellt, dass der Bioreaktor selbst kontaminiert war, da mikrobiologisches Untersuchen des Würzevorrats keine Kontamination zeigte. Dies wies auf den Bedarf an Bioreaktor-Aufrüstungen mit verbesserten Sicherheitsvorkehrungen gegen Kontamination hin. Dennoch wurde, bevor das System herabgefahren war, eine Abnahme der Gesamtdiacetylkonzentration beobachtet, wenn ALDC zum Würzevorrat zugesetzt wurde. Unglücklicherweise war es aufgrund der verwirrenden Auswirkungen der Bioreaktor-Kontamination nicht möglich, irgendwelche Schlussfolgerungen aus diesen Daten zu ziehen.

Experiment 2: Als Ergebnis zahlreicher Bioreaktor-Aufrüstungen arbeitete das System während der Dauer von Experiment 2 ohne Kontamination. Die Daten für dieses Experiment sind in Figuren 7.29–7.31 wiedergegeben. In Tabelle 7.5 sind die durchschnittlichen pseudostationären Konzentrationen von Diacetyl vor und nach ALDC-Zugabe zu der Würze zusammengefasst. Gesamtdiacetylkonzentration fiel mit der Zugabe von ALDC zu der Würze um 47%, was die Verwendung dieses Enzyms für die Zukunft vielversprechend macht (Durchschnittswerte nach drei Bioreaktor-Umsatzzeiten genommen). Wie in Figuren 7.30 und 7.31 ersichtlich, veränderten sich während dieses Versuchs gesamte fermentierbare Kohlenhydrate (als Glucose)- und Zellkonzentration leicht, was durch leichte Unterschiede in der dem Bioreaktor vor und nach der Zugabe von ALDC zugeführten Würze verursacht worden sein kann.

Um die mögliche verwirrende Auswirkung von Würzevariabilität zu eliminieren, wurde während Experiment 3 eine große Menge Würze aus dem Sudhaus (14 hl) gesammelt, und ALDC wurde direkt zu der in diesem Aufbewahrungsbehälter verbleibenden Würze zugesetzt, sobald eine Basislinie des pseudostationären Zustands erreicht war. Dies eliminierte weiterhin jegliche mögliche Würze-Inkonsistenzen, die die Fermentationsleistung in Experiment 2 beeinträchtigt haben könnten. Dieser Würze-Lagerbehälter war ebenso mit Kohlendioxid-Einblasung ausgestattet, so dass gelöste Sauerstoffkonzentrationen im Würzevorrat auf einem beständig niedrigen Niveau gehalten wurden.

Experiment 3: Figuren 7.32–7.34 veranschaulichen die Auswirkung von ALDC-Zugabe zum Würzevorrat auf Gesamtdiacetyl, gesamte fermentierbare Kohlenhydrate- (als Glucose), Ethanolkonzentration und die Konzentration frei suspendierter Zellen während kontinuierlicher Bierfermentation. Tabelle 7.6 gibt auch die durchschnittliche Gesamtdiacetylkonzentration des pseudostationären Zustands vor und nach der Zugabe von ALDC zum Würzevorrat an (Durchschnittswerte nach drei Bioreaktor-Umsatzzeiten genommen). An keinem Punkt während dieses Experiments wurde Kontamination festgestellt. Die Konzentration von Gesamtdiacetyl wurde bei Zusatz von ALDC um 45% reduziert. Bei Ethanol-gesamte fermentierbare Kohlenhydrate (als Glucose)-Konzentration oder der Konzentration frei suspendierter Zellen wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet, was mit den Chargenergebnissen von Aschengreen und Jepsen (1992) übereinstimmt.

Die Ergebnisse der Experimente 2 und 3 zeigen, dass ALDC eine signifikante Auswirkung auf Gesamtdiacetylkonzentration während kontinuierlicher Fermentation in Gasliftbioreaktoren hatte, sie ergab eine durchschnittliche Reduktion der Gesamtdiacetylkonzentration von 46%. Dies hat das Potential sekundärer Bearbeitung zur Diacetyl-Reduktion in kontinuierlichen Gaslift-Systemen zu verringern oder zu eliminieren. Für diese anfänglichen Experimente wurde eine relativ hohe Dosierung von ALDC verwendet, und es wäre nötig, die Menge, Verfahren und Zeitabstimmung der ALDC-Dosierung in Würze zu optimieren, wenn dieses Enzym für das Verfahren eingesetzt werden sollte. Weitere Einsparungen könnten verwirklicht werden, falls ein Enzym mit höheren Aktivitätsgraden unter Brauerei-Fermentationsbedingungen verfügbar wird oder falls das Enzym selbst, daher seine Wiederverwendung ermöglichend, immobilisiert wäre (Dulieu et al., 1996). Öffentliche Akzeptanz von Enzymzusätzen, die unter Verwendung genetisch modifizierter Organismen hergestellt worden sind, wird ein anderer Gesichtspunkt sein.

Bei der vom Hersteller empfohlenen Dosierung von 2 kg/1000 hl und bei Kosten der kommerziellen Enzymzubereitung von $131,05/kg würden $0,26/hL zu den Materialkosten der Fermentation hinzugefügt werden. Die Enzymdosierung war, wie in den durchgeführten Experimenten verwendet, 72 &mgr;g/l (108 ADU/l) oder 7,2 kg/1000 hl ALDC, was hinzugefügte Materialkosten von $0,94/hl ergibt. Die Wirtschaftlichkeit des Verwendens von ALDC zur Diacetyl-Reduktion während kontinuierlicher Gaslift-Fermentationen wird von der unter Bioreaktor-Bedingungen optimalen Enzymdosierung und dem durch seine Verwendung eingesparten Zeitaufwand abhängen.

  • * Durchschnitte, basierend auf Werten im pseudostationären Zustand nach drei Reaktor-Umsatzzeiten

Das Vorangehende unterstützt den Vorschlag, dass kontinuierliche Fermentation unter Verwendung immobilisierter Hefe und der assoziierten freien Zellen in einem Gaslift-Leitrohr-Bioreaktor-System eine brauchbare Alternative zur Chargenfermentation für Bierproduktion ist, beruhend auf den folgenden Kriterien:

  • – Aromaübereinstimmung zustandegebracht
  • – höhere volumetrische Bioreaktor-Produktivität
  • – minimale Komplexität
  • – langzeitiger kontinuierlicher Betrieb gezeigt
  • – Steuerung von Luft (Sauerstoff) im Fluidisierungsgas zur Aromasteuerung
  • – Zusatz des Enzyms &agr;-Acetolactat-Decarboxylase als eine Option zur Diacetyl-Steuerung
  • – keine bakterielle Kontamination
  • – finanzielle Vorteile.

Es gibt noch viele Gebiete, die weiterer Untersuchung bedürfen, aber die Technologie ist bereit dazu, in einem größeren Maßstab getestet zu werden. Gasliftbioreaktoren werden bereits in einem industriellen Maßstab zur Abwasserbehandlung verwendet, was die Aussichten der Maßstabsvergrößerung des kontinuierlichen Bier-Fermentationssystems technisch ausführbar macht. Es wurde berichtet, dass die Grolsch-Brauerei in den Niederlanden einen 240 m3-Gasliftbioreaktor zur Behandlung ihres Abwassers verwendet (Driessen et al., 1997). Eine der größten Barrieren für kontinuierliche Fermentation in kommerziellem Maßstab in der Brauindustrie kann die Annahme eines neuen Verfahrens durch die Brauer in einer Industrie, die fest an Traditionen gebunden ist, sein.

Gesammelte Daten über sekundäre Hefe-Metabolite, die während kontinuierlicher Bierfermentationen, die in dieser Arbeit durchgeführt wurden, gebildet wurden, unterstrichen die Bedeutung des Steuerns von Sauerstoff im Fluidisierungsgas für die Bieraroma-Bildung. Die Befunde zeigten, dass unter den gegebenen Betriebsbedingungen gesteigerte Luft in dem Bioreaktor-Fluidisierungsgas einen Anstieg von Acetaldehyd, Diacetyl und höheren Alkoholen (Isoamylalkohol und Isobutanol) verursachte, während die Konzentrationen von Estern (Isoamylacetat, Ethylhexanoat, Ethyloctanoat) und Ethanol reduziert wurden. Diese Daten weisen darauf hin, dass es das Potential zum Steuern von Bieraroma durch die Zusammensetzung des Bioreaktor-Fluidisierungsgases gibt, was die Herstellung einzigartiger Produkte ermöglicht.

Eine Konzentration frei suspendierter Zellen von mehr als 108 Zellen/ml wurde in der Bioreaktor-Flüssigphase aufrechterhalten, außer wenn Luft aus dem Fluidisierungsas eliminiert wurde. Das System hat daher mehr als eine im Bioreaktor coexistierende Hefezellpopulation, die immobilisierte Hefe und die in der Flüssigphase suspendierte Hefe. Die Möglichkeit des Verwendens eines kontinuierlichen Bioreaktors als einen Hefepropagator besteht wegen der großen in der Flüssigphase des Bioreaktors wachsenden Mengen lebensfähiger Hefen.

Wenn eine sekundäre 48-stündige Chargenhalteperiode anschließend an kontinuierliche primäre Fermentation angefügt wurde, wurde ein Aromaprofil im Bereich von Marktbieren erhalten. Die Temperatur dieser Halteperiode war 21°C, und die Bedeutung des Minimierens der Exposition der Flüssigkeit gegenüber Sauerstoff während der Halteperiode für Aromabildung wurde experimentell gezeigt. Die Hinzufügung einer Halteperiode fügt zwei Tage zum Verfahren hinzu, sowie zusätzliche Komplexität, dennoch ist es noch signifikant schneller als kommerzielle Chargenfermentationen, die zwischen sieben und vierzehn Tagen benötigen.

Schlussendlich wäre es das ideale Szenario, die sekundäre Halteperiode durch Optimieren der Bedingungen im primären kontinuierlichen Bioreaktor vollständig zu eliminieren. Weitere Verringerungen der sekundären Haltezeit können jedoch in kurzer Zeit durch Optimieren der Haltetemperatur (Diacetyl-Entfernung durch Hefe ist sehr temperaturabhängig), der am Beginn der Halteperiode in der Flüssigkeit verbleibenden Menge fermentierbarer Zucker, der vorhandenen Hefekonzentration, der hydrodynamischen Eigenschaften des Haltebehälters (Diacetyl-Entfernung könnte durch Verbessern des Kontakts zwischen der Hefe und dem Bier verbessert werden) und durch Treffen weiterer Maßnahmen, um Sauerstoff aus dieser Stufe zu eliminieren, erreicht werden.

Andere Forscher (Kronlof und Virkajarvi, 1996; Nakanishi et al., 1993; Yamauchi et al., 1995) haben sich auf Entwicklung mehrstufiger kontinuierlicher Fermentationen konzentriert, die in der ersten Stufe kontinuierlicher Fermentation (aerob) nur einen teilweisen Verbrauch der in der Würze vorhandenen fermentierbaren Zucker ergeben. Während diese Strategie einigen Erfolg im Hinblick auf Aromabildung gezeigt hat, sind diese Systeme komplex. Die erste aerobe Stufe solcher Systeme schafft auch eine Umgebung, die für mikrobielle Kontamination empfänglicher ist (d.h., hohe Zuckerkonzentration, Temperatur und Sauerstoff mit niedrigen Ethanolkonzentrationen). In dem in dieser Arbeit vorgestellten Gasliftbioreaktor hat der Bioreaktor eine niedrige stationäre Konzentration fermentierbarer Zucker, niedrigen pH, hohe Ethanolkonzentration und niedrige Konzentrationen von Sauerstoff, was die Umgebung für potentielle Kontaminanten ungastlich macht. In einer weniger entwickelten Brauerei ist Minimieren von Komplexität und Entwicklung eines robusten Kontaminations-resistenten Verfahrens ein wichtiger Erfolgsfaktor.

Der Zusatz einer kommerziellen Zubereitung von alpha-Acetolactat-Decarboxylase (ALDC) zu der die kontinuierliche Fermentation versorgenden Würze zeigte eine durchschnittliche Diacetyl-Reduktion von 46%. Dennoch gibt es, weil ALDC ein Enzym ist, das durch eine genetisch modifizierten Organismus (GMO) produziert wird, Fragen in der öffentlichen Wahrnehmung, die vor Verwenden solch eines Enzyms in einem kommerziellen Produkt angesprochen werden müssten. Zusätzlich haben die für Diacetyl-Steuerung kommerziell verfügbaren Enzyme unter Fermentationsbedingungen keine optimale Aktivität.

Über sechs Monate kontinuierlicher Fermentation unter Verwendung von kappa-Carrageenan-Gel-Immobilisierung behielten in der Flüssigphase frei suspendierte Zellen mehr als 90% Lebensfähigkeit, während Lebensfähigkeit immobilisierter Zellen auf weniger als 60% sank. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen enthüllten, dass nahe der Peripherie des Gelkügelchens positionierte Zellen mehrfache Sprossnarben und eine regelmäßige Morphologie hatten, während die nahe des Kügelchenkerns eine unregelmäßige Form und weniger Sprossnarben hatten, was auf beeinträchtiges Wachstum hinweist. Die mikroskopischen Aufnahmen wiesen auch darauf hin, dass die nahe dem Kügelchenkern positionierte Hefe Zeichen von Alterung zeigte. kappa-Carrageenan-Gel hat, wie in Abschnitt 5 diskutiert, viele Eigenschaften, die es zu einer wünschenswerten Hefe-Immobilisierungsmatrix machen. Jedoch ist gegenwärtig kein industrielles Verfahren für Kügelchenherstellung verfügbar, und weil die Hefen als Teil des Kügelchenherstellungsverfahrens in der Matrix eingeschlossen werden, steigert Kügelchenhandhabung in einer kommerziellen Anlage Komplexität und Kosten. In Zukunft sollten andere Immobilisierungsverfahren, wie Selbst-Aggregation oder Flockung, erforscht werden. Dies würde die Komplexität der Kügelchenhandhabung in einer Anlagenumgebung eliminieren und, falls die Hefeflocken auf einer regelmäßigen Basis aufgebrochen würden, könnte man sicherstellen, dass gealterte Zellen regelmäßig aus dem Bioreaktor entfernt werden.


Anspruch[de]
Verfahren für die Herstellung von trinkbaren Alkoholen, bei dem ein Gasliftbioreaktor unter Anwendung von Innenzirkulation eingesetzt wird, um eine kontinuierliche Fermentationsstufe durchzuführen, in der zuerst Würze, die fermentierbare Zucker enthält, unter Verwendung von durch Selbstaggregation immobilisierten, flockenden Hefezellen bei eingeschränkter Sauerstoffzufuhr fermentiert wird, und die wenigstens partiell fermentierte Entnahme aus dem kontinuierlichen Verfahren zu einer Chargenbearbeitungsstufe zur Endbearbeitung geleitet wird. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der trinkbare Alkohol ein Bier ist. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Bier ein helles Bier (pale style beer) ist. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Bier ein Lager-Bier ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bier ein Bier des nordamerikanischen Typs (North American style beer) ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hefe eine hochflockende oder superflockende Hefe ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fermentation eine Primärfermentation ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hefe vor der Fermentation mit Kohlendioxid gespült wird. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Reaktor ein Kohlendioxidzerstäubungsgas verwendet, das etwa 3% Sauerstoff enthält. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine Vervollständigung der Primärfermentation in der Chargenhaltestufe durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 10, wobei eine Reduzierung der Diacetylkonzentration durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 10, wobei eine Reduzierung der Acetaldehydkonzentration durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Konzentration an höheren Fuselalkoholen durch die Chargenhaltebearbeitungsstufe im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Entnahme aus der kontinuierlichen Fermentationsstufe durch einen Verteiler in einige einer Vielzahl von Chargenhaltebehältern verteilt wird, in denen das Chargenhalteverfahren stattfindet. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das kontinuierliche Verfahren ein Verfahren zum Anstellen nachfolgender Chargenfermentationen in der Chargenhaltestufe ist.






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