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Dokumentenidentifikation DE102005047271A1 22.02.2007
Titel Verfahren zum Messen der Lichtintensität einer Lichtquelle in der Bioanalytik
Anmelder Berthold Detection Systems GmbH, 75173 Pforzheim, DE
Erfinder Nofer, Lothar, 75334 Straubenhardt, DE
Vertreter Twelmeier, U., Dipl.-Phys., Pat.-Anw., 75172 Pforzheim
DE-Anmeldedatum 01.10.2005
DE-Aktenzeichen 102005047271
Offenlegungstag 22.02.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.02.2007
IPC-Hauptklasse G01J 1/44(2006.01)A, F, I, 20051001, B, H, DE
IPC-Nebenklasse G01J 1/46(2006.01)A, L, I, 20051001, B, H, DE   G01J 1/58(2006.01)A, L, I, 20051001, B, H, DE   G01N 21/64(2006.01)A, L, I, 20051001, B, H, DE   G01N 21/76(2006.01)A, L, I, 20051001, B, H, DE   H01J 43/04(2006.01)A, L, I, 20051001, B, H, DE   H01J 43/30(2006.01)A, L, I, 20051001, B, H, DE   
Zusammenfassung Beschrieben wird ein Verfahren zum Messen der Lichtintensität einer Lichtquelle in der Bioanalytik, insbesondere aus Proben, in denen Lumineszenz- oder Fluoreszenzreaktionen ablaufen, durch Auffangen von Photonen der Lichtquelle mit einem Photoelektronenvervielfacher, welcher für jedes aufgefangene Photon an einem Ausgang des Photoelektronenvervielfachers eine bestimmte elektrische Ladungsmenge zur Verfügung stellt,
wobei in einem Bereich einer niedrigen Intensität der Lichtquelle, in welchem die aufgefangenen Photonen zu einzelnen, unterscheidbaren elektrischen Impulsen an dem Ausgang des Photoelektronenvervielfachers führen, die Photonen durch Zählen der von ihnen am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers hervorgerufenen elektrischen Impulse über eine Zeitspanne gezählt werden.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass beim Beobachten der Lichtquelle mit der niedrigeren Intensität zusätzlich die elektrische Ladung bestimmt wird, welche von einem Photon am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers im Mittel zur Verfügung gestellt wird,
und dass beim Beobachten von Lichtquellen mit höherer Intensität die am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers zur Verfügung gestellte elektrische Ladung in einem Speicher gesammelt, nach einer Zeitspanne gemessen, mit der mittleren Ladung je Photon verglichen und daraus die Anzahl der in der Zeitspanne empfangenen Photonen bestimmt wird.

Beschreibung[de]

Die Erfindung geht aus von einem Verfahren mit den im Oberbegriff des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Ein solches Verfahren ist aus der DE 196 18 601 A1 bekannt.

Bei den Lichtquellen handelt es sich in der Bioanalytik um Proben, in welchen in Folge von chemischen oder biologischen Reaktionen Licht erzeugt und ausgesandt, durch eingestrahltes Licht angeregt oder in welchen eingestrahltes Licht mehr oder weniger stark absorbiert wird. Die von den Proben kommenden Lichtsignale sind meistens schwach, weshalb man sie mit einen Photoelektronenvervielfacher, nachfolgend abgekürzt PMT genannt, auffängt und verstärkt. Sind die Lichtsignale so schwach, dass das PMT die auf seiner Photokathode auftreffenden Photonen einzeln nachweisen kann, dann kann man die Lichtintensität der die Photonen aussendenden Lichtquelle einfach dadurch bestimmen, dass man die vom PMT während eines bestimmten Zeitintervalls aufgefangenen Photonen zählt.

Die DE 196 18 601 A1 offenbart zu diesem Zweck folgende Vorgehensweise: Die vom PMT gelieferten elektrischen Impulse werden zunächst verstärkt. Dem Ausgang des Verstärkers ist ist Impulshöhendiskriminator nachgeschaltet, weicher nur solche Impulse durchläßt, die eine bestimmte, einstellbare Schwellenhöhe überschreiten. Das Ausgangssignal des Impulshöhendiskriminators wird einem Zähler eingespeist, welcher mit einem Mikroprozessor verbunden ist, der das Zeitintervall vorgibt, in welchem die Impulse gezählt werden, der das Zählergebnis auswertet und den Zähler zurückstellt und startet.

Die zu bestimmende Lichtintensität ist proportional der Anzahl der gezählten Photonenimpulse pro Zeiteinheit.

Dieses Einzelphotonenzählverfahren hat eine Reihe von Vorteilen:

  • • Die Photonimpulse werden in Echtzeit registriert. Das erlaubt ein Zählen der eingetroffenen Photonimpulse in sehr kurzen Zeitintervallen, so dass auch schnellen Änderungen der Lichtintensität gefolgt werden kann. Das ist für die Messung von schnell ablaufenden Reaktionen sowie zur Beobachtung der Reaktionskinetik in der Probe von Bedeutung.
  • • Das Einzelphotonenzählverfahren ist verhältnismäßig unempfindlich gegen Schwankungen der Verstärkung des PMT, des nachgeschalteten Verstärkers und der am PMT anliegenden Hochspannung.
  • • Das Einzelphotonenzählverfahren ist verhältnismäßig unempfindlich gegen Störsignale, da diese in einem hohen Maße durch den Impulshöhendiskriminator unterdrückt werden.

Der wesentliche Nachteil des Einzelphotonenzählverfahrens ergibt sich aus der Tatsache, dass die Impulse, die der PMT als Antwort auf ein Auftreffen eines Photons liefert, eine endliche Dauer haben. Eine Impulsdauer von 5 ns bis 10 ns ist typisch. Die Impulse treten nicht in gleichen Zeitabständen, sondern statistisch verteilt auf. Mit zunehmender Impulsrate steigt die Anzahl der Impulse, die einander mehr oder weniger überlagert sind, bis die Impulsraten schließlich so hoch sind, dass die einzelnen Impulse nicht mehr voneinander trennbar sind. Das hat zur Folge, dass im Einzelphotonenzählverfahren bei höherer Lichtintensität die Zählrate wieder abnimmt und im Extremfall keine Impulse mehr gezählt werden.

Um diesem Nachteil zu begegnen lehrt die DE 19618 601 A1, dem PMT für den Fall hoher Lichtintensitäten einen weiteren Auswertekanal nachzuschalten, mit welchem vom PMT ein durch die Photonen ausgelöstes Stromsignal abgeleitet wird. Für höhere Lichtintensitäten, bei welchen das Einzelphotonenzählverfahren keine zuverlässige Aussage mehr über die Intensität der Lichtquelle liefert, wird dieses Stromsignal als Maß für die Lichtintensität ausgewertet. Die Stromstärke ist proportional der Lichtintensität. Der durch das PMT fließende Strom unterliegt jedoch statistischen Schwankungen, die vom statistisch variierenden Eintreffen der Photonen herrühren. Um dennoch einen aussagekräftigen, stabilen Mittelwert der Stromstärke zu erreichen, wird der durch das PMT fließende Strom geglättet, indem mittels eines Integriergliedes ein Stromintegral gebildet wird. Mittels eines Analogverstärkers wird das Stromsignal verstärkt und in einem Analog-Digital-Wandler digitalisiert, z. B. in eine Frequenz gewandelt, deren Impulse während eines vorgegebenen Zeitintervalls in einem Zähler als Stromintegralwert addiert werden.

Die Bestimmung der Lichtintensität mittels einer Strommessung, wie es in der DE 196 18 601 A1 offenbart ist, hat Nachteile:

  • • Das Verfahren ist, wie die DE 196 18 601 A1 bestätigt, anfällig gegen Veränderungen der Verstärkung des PMT und der nachgeschalteten Verstärker sowie gegen Veränderungen der am PMT anliegenden Hochspannung, z. B. aufgrund von Temperaturschwankungen.
  • • Da der Strom durch das PMT entsprechend dem statistischen Einfall der Photonen eine statistisch schwankende, sich impulsförmig verändernde Stromstärke hat, ist vor allem im unteren Bereich des Strommeßverfahrens eine Glättung des Stromsignales mit großer Zeitkonstante erforderlich. Das hat zur Folge, dass das Stromsignal einer Veränderung der Lichtintensität erst mit entsprechender zeitlicher Verzögerung folgt und rasche Änderungen im Intensitätsverlauf, z. B. kurzzeitige auftretende Maximas, nicht oder nur eingeschränkt beobachtet werden können, so dass es schwer ist, mittels einer Strommessung Aussagen über die Reaktionskinetik in der Probe zu gewinnen oder schnell ablaufende Reaktionen (flash Lumineszenz) überhaupt zu messen.
  • • Ein eindeutiger zeitlicher Bezug zwischen dem Lichtsignal und dem Stromsignal ist nicht gegeben.
  • • Das Stromsignal steht bei der in der DE 196 18 601 A1 gewählten Art der Auskopplung des Signals nicht in einem linearen Zusammenhang mit dem Photonenstrom.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Messen der Lichtintensität einer Lichtquelle in der Bioanalytik anzugeben welches bei niedriger intensität der Lichtquelle Einzelphotonen zählt und bei höherer Intensität der Lichtquelle mehr und/oder genauere Informationen über den Intensitätsverlauf der Lichtquelle zu gewinnen erlaubt.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den im Anspruch 1 angegebenen Merkmalen. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.

Erfindungsgemäß wird beim Beobachten von Lichtquellen mit höherer Intensität die am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers zur Verfügung gestellte elektrische Ladung in einem Speicher gesammelt, nach einer bestimmten Zeitspanne gemessen und daraus die Anzahl der in dieser Zeitspanne empfangenen Photonen bestimmt. Um das zu ermöglichen, wird die im Speicher gesammelte Ladung mit der Ladung verglichen, die jedes empfangene Photon zu der im Speicher gesammelten Ladung im Mittel beiträgt. Die mittlere Ladung je Photon wird erfindungsgemäß gewonnen, indem beim Beobachten der Lichtquelle mit so niedriger Intensität, dass die aufgefangenen Photonen zu einzelnen, unterscheidbaren elektrischen Impulsen am Ausgang des Photoelektronenvervielfacher führen, die Photonen nicht nur gezählt werden, sondern zusätzlich auch die elektrische Ladung gesammelt und bestimmt wird, welche von den gezählten Photonen am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers zur Verfügung gestellt wird. Teilt man die bei niedriger Intensität gesammelte Ladung durch die Anzahl der während des Sammelns der Ladung gezählten Photonen, dann ergibt sich daraus die mittlere elektrische Ladungsmenge pro Photon. Diese mittlere Ladungsmenge pro Photon ist ein Eichfaktor, der bei der Apparatur, mit welcher man die mittlere Ladung pro Photon nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt hat, benutzt wird, um beim Beobachten von Lichtquellen mit höherer Intensität aus der gesammelten Ladung auf die Anzahl der Photonen zurückzuschließen, welche die angesammelte Ladungsmenge bewirkt haben. Die während eines Zeitintervalls gesammelte Ladung ist proportional zu der Anzahl der in diesem Zeitintervall im Photoelektronenvervielfacher eingetroffenen Photonen. Das gilt auch beim Beobachten von Lichtquellen mit höherer Intensität, bei weicher sich die von den Photonen im Photoelektronenvervielfacher erzeugten elektrischen Impulse sämtlich oder teilweise nicht mehr voneinander trennen lassen.

Bei niedriger Intensität der Lichtquelle, bei welcher die aufgefangenen Photonen zu einzelnen, unterscheidbaren elektrischen Impulsen am Ausgang des PMT führen, hat das erfindungsgemäße Verfahren alle Vorteile des Einzelphotonenzählverfahrens, welche einleitend dargestellt worden sind.

Beim Beobachten von Lichtquellen mit höherer Intensität, bei welcher die von den empfangenen Photonen im PMT erzeugten elektrischen Signale nicht mehr oder nur noch zum Teil einzeln unterscheidbar sind, hat die Erfindung den Vorteil, dass – wie beim bekannten Strommeßverfahren – das zeitliche Auflösungsvermögen des PMT, welches die Anwendbarkeit des Einzelphotonenzählverfahrens beschränkt, keine Rolle spielt. Weiterhin ist das Verfahren unempfindlich gegenüber Veränderungen der Verstärkung des PMT, der ihm nachgeschalteten Verstärker sowie der an das PMT angelegten Hochspannung, z. B. aufgrund von Temperaturschwankungen, aber auch aufgrund von Alterung, denn der Eichfaktor "Ladung je Photon" ist einer fortlaufenden Aktualisierung zugänglich. Zugleich werden eine Reihe von weiteren Vorteilen erreicht, die das bekannte Strommeßverfahren nicht hat:

  • • Die Zeitintervalle, in welchen die am Ausgang des PMT auftretende Ladung gesammelt wird, können ebenso kurz oder – wegen der höheren Lichtintensität -kürzer sein als beim Einzelelektronenzählverfahren. Deshalb kann der zeitliche Intensitätsverlauf sehr viel besser beobachtet werden als beim bekannten Strommeßverfahren, unter Umständen sogar noch besser als beim Einzelphotonenzählverfahren.
  • • Die Zunahme der Ladung im Speicher bzw. die daraus ableitbare Zählrate hat einen engen, eindeutigen, zeitlichen Bezug zur Intensität des Lichtsignals. Der für das bekannte Strommeßverfahren charakteristische Nachlauf des Stromsignals gegenüber dem Lichtsignal wird vermieden.
  • • Die Zunahme der Ladung im Speicher bzw. die daraus ableitbare Zählrate steht in einem linearen Zusammenhang mit dem vom PMT aufgefangenen Photonenstrom.
  • • Es können Spitzen im Intensitätsverlauf der Lichtquelle beobachtet und gemessen werden. Das ist z. B. vorteilhaft bei der Beobachtung des Reaktionsverlaufs bei von schnell verlaufenden Reaktionen (Flash Lumineszenz).
  • • Hat die Intensität der Lichtquelle einen solchen Verlauf, dass sowohl niedrigere Intensitäten auftreten, welche das Anwenden des Einzelphotonenzählverfahrens erlauben, als auch höhere Intensitäten, bei denen die einzelnen Photonen im Ausgangssignal des PMT nicht mehr unterscheidbar sind, dann lassen sich die gewonnenen Messergebnisse aus dem Einzelphotonenzählverfahren und aus dem erfindungsgemäßen, mit der Ladungssammlung arbeitenden Verfahren einander zeitlich eindeutig zuordnen und die jeweiligen Meßsignale der beiden Verfahrensvarianten lassen sich einfach ineinander überführen. Auf diese Weise läßt sich ein Intensitätsverlauf, der sich von einem Bereich hoher Intensität bis in einen Bereich mit niedriger Intensität erstreckt, in welcher eine Zählung einzelner Photonen möglich ist, optimal beobachten.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann so durchgeführt werden, dass die Zeitspanne, über welche die einzelnen Photonen am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers gezählt werden, vorgewählt wird. Die Vorwahl kann so vor sich gehen, dass unter einer Anzahl vorgegebener Zeitspannen eine unter den gegebenen Versuchsbedingungen besonders geeignete Zeitspanne ausgewählt wird. Es besteht aber auch die Möglichkeit, den Zähler, der dem Ausgang des PMT nachgeschaltet ist, auf eine vorgewählte Anzahl von Photonen voreinzustellen und die Zeitspanne zu messen, die benötigt wird, um die vorgewählte Anzahl von Photonen zu erreichen.

In entsprechender Weise kann beim Beobachten einer Lichtquelle mit höherer Intensität die Zeitspanne vorgewählt werden, während der die am Ausgang des PMT auftretende Ladung gesammelt wird. Alternativ ist es möglich, die beim Beobachten von Lichtquellen mit höherer Intensität am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers zur Verfügung gestellte elektrische Ladung zu sammeln, bis eine vorgewählte Ladungsmenge erreicht ist und die dafür benötigte Zeitspanne zu messen.

Die Person, die das erfindungsgemäße Verfahren durchführt, hat die Möglichkeit, unter den genannten Möglichkeiten jene auszuwählen, die den Versuchsbedingungen, der Lichtquelle und der durch die Untersuchung zu beantwortenden Frage am besten gerecht wird. So kann man, wenn es darum geht, den zeitlichen Verlauf der Lichtintensität mit möglichst großer zeitlicher Auflösung zu verfolgen, mit entsprechend kurz gewählten Zeitintervallen arbeiten. Kommt es eher darauf an, den Eichfaktor (Ladung pro Photon) möglichst genau zu bestimmen, wird es sich empfehlen, am Photonenzähler eine entsprechend hohe Photonenzahl vorzugeben, die beim Zählvorgang erreicht werden soll. Soll in erster Linie das gesamte Ausmaß einer Reaktion in einer Probe ermittelt werden, ist es angemessen, eine Zeitspanne vorzuwählen, die so lang ist, dass sie die mutmaßliche Dauer der Reaktion umfaßt. Wird eine besonders genaue Messung der Lichtintensität angestrebt, ist es angemessen, am Zähler eine entsprechend hohe Anzahl von gezählten Photonen vorzugeben bzw. am Ladungssammler das Erreichen einer entsprechend hohen Ladungsmenge vorzugeben. Die unterschiedlichen Vorgaben können bei der Untersuchung einer Serie gleichartiger Proben auch alternativ zur Anwendung kommen, um ein möglichst vollständiges Bild über Umfang, Dauer und Ablauf der in gleichartigen Proben ablaufenden Reaktion zu erhalten.

Die beigefügte einzige Zeichnung ist ein Blockschaltbild einer Apparatur, die zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann. Die Apparatur hat einen Photoelektronenvervielfacher (PMT) 1 mit einer Kaskade von Dynoden, die über einen Spannungsteiler mit einer Hochspannungsquelle 2 verbunden sind, die durch einen Schalter 3 vom PMT 1 getrennt werden kann.

Der Ausgang des PMT 1 ist zum einen über einen Kondensator 4 in Reihe mit einem breitbandigen Impulsverstärker 5, mit einem Impulshöhendiskriminator 6 und einem Zähler 7 verbunden, der mit einem Mikroprozessor 8 verbunden ist. Im Einzelphotonenzählverfahren werden die am Ausgang des PMT 1 auftretenden Spannungsimpulse über dem Kondensator 4 abgegriffen und durch den Verstärker 5 verstärkt. Störsignale, die unterhalb einer einstellbaren Schwelle liegen, sowie in dem Ausgangssignal des Verstärkers 5 enthaltenes Rauschen werden durch den Impulshöhendiskriminator 6 unterdrückt. Impulse, die der Impulshöhendiskriminator durchläßt, werden vorzugsweise so umgeformt, dass sie gleiche Höhe und Breite haben. So werden sie zum Zähler 7 weitergeleitet und gezählt. Das Zählergebnis wird im Mikroprozessor 8 ausgewertet. Über den Mikroprozessor 8 können entweder das Zeitintervall, in welchem der Zähler 7 zählt, oder eine vom Zähler 7 zu erreichende Anzahl von Zählimpulsen vorgegeben werden. Im zuletzt genannten Fall ermittelt der Mikroprozessor 8 die Zeit, die benötigt wird, um die vorgegebene Anzahl von Zählimpulsen zu erreichen.

Zusätzlich ist der Ausgang des PMT 1 mit einem Speicher 9 verbunden, welcher die am Ausgang des PMT 1 auftretende elektrische Ladung speichert, im einfachsten Fall in ein Kondensator oder eine Schaltungsabordnung mit einem Kondensator als Speicher. Ein mit dem Mikroprozessor 8 verbundenes Steuermodul 10 bestimmt den Startzeitpunkt für den Speicher 9 und setzt diesen wieder zurück, wenn entweder eine vom Mikroprozessor 8 vorgegebene Zeitspanne erreicht ist oder wenn die gesammelte Ladung einen Schwellenwert erreicht hat, der durch einen Schwellenwertdetektor 11 überwacht wird. Die Höhe des Schwellenwertes kann durch den Mikroprozessor 8 vorgegeben werden und wird in jedem Fall so gewählt, dass sie unterhalb der Kapazität des Speichers 9 liegt. Der Ausgang des Schwellenwertschalters 11 ist mit dem Steuermodul 10 verbunden und meldet das Erreichen des vorgegebenen Schwellenwertes an das Steuermodul 10, woraufhin dieses den Speicher 9 zurückstellt.

Der Ausgang des Speichers 9 ist nicht nur mit dem Schwellwertdetektor 11 verbunden, sondern über einen steuerbaren Schalter 12 auch mit einem Analog-Digital-Wandler 13, welcher die über den geschlossenen steuerbaren Schalter 12 abfließende Ladung in ein digitales Signal, z. B. in eine der Ladungsmenge proportionale Frequenz wandelt, welche der Mikroprozessor 8 misst und als Maß für die gespeicherte Ladungsmenge nimmt.

Aus der bei niedriger Lichtintensität im Einzelphotonenzählverfahren gewonnenen und vom Zähler 7 registrierten Photonenzahl und der gleichzeitig im parallelen Zweig ermittelten Ladungsmenge im Speicher 9 berechnet der Mikroprozessor 8 laufend die Ladung pro Photon als Eichfaktor. Bei höheren Lichtintensitäten, die dazu führen, dass nicht mehr alle vom PMT 1 aufgefangenen Photonen als einzelne Ereignisse gezählt werden können, errechnet der Mikroprozessor aus der in einer bestimmten Zeitspanne gesammelten Ladung mit Hilfe des Eichfaktors die der gespeicherte Ladungsmenge entsprechende Anzahl der Photonen, die der Lichtintensität im gewählten Zeitintervall proportional ist.

Ist die Lichtintensität so groß, dass der Schwellwertdetektor 11 anspricht, bevor die vorgegebene Zeitspanne abgelaufen ist, wird der Zeitpunkt des Ansprechens des Schwellwertdetektors 11 an den Mikroprozessor 8 gemeldet, welcher aus der bis zum Ansprechen des Schwellwertdetektors 11 benötigten Zeitspanne und aus der am Schwellwertdetektor 11 voreingestellten Ladungsmenge die Ladungsmenge pro Zeiteinheit errechnet und daraus mit Hilfe des Eichfaktors die Photonenzahl pro Zeiteinheit errechnet. Gleichzeitig mit dem Ansprechen des Schwellwertdetektors 11 stellt das Steuermodul 10 den Speicher 9 zurück und startet einen neuen Meßzyklus.

Alternativ ist es möglich, dem Steuermodul 10 keine bestimmte Zeitspanne vorzugeben, die vom Beginn des Meßvorgangs bis zum Öffnen des steuerbaren Schalters 10 abläuft, sondern lediglich eine Schwelle am Schwellenwertdetektor 11 vorzugeben und die Zeit bis zum Erreichen des Schwellenwertes mit Hilfe des Mikroprozessors 8 zu messen.

Um den Eichfaktor auch in Meßpausen aktualisieren zu können, kann das PMT 1 im Meßpausen von einer Standard-Liehtquelle, z. B. von einer Leuchtdiode, beaufschlagt werden.

Der Schwellenwertdetektor 11 kann weiterhin dazu herangezogen werden, eine Überlastung des PMT 1 im Falle zu hoher Lichtintensitäten zu verhindern, indem die Hochspannungsquelle 2 beim Erreichen eines vorgegebenen Schwellenwertes vom PMT 1 getrennt wird.


Anspruch[de]
Verfahren zum Messen der Lichtintensität einer Lichtquelle in der Bioanalytik, insbesondere aus Proben, in denen Lumineszenz- oder Fluoreszenzreaktionen ablaufen, durch Auffangen von Photonen der Lichtquelle mit einem Photoelektronenvervielfacher, welcher für jedes aufgefangene Photon an einem Ausgang des Photoelektronenvervielfachers eine bestimmte elektrische Ladungsmenge zur Verfügung stellt,

wobei in einem Bereich einer niedrigen Intensität der Lichtquelle, in welchem die aufgefangenen Photonen zu einzelnen, unterscheidbaren elektrischen Impulsen an dem Ausgang des Photoelektronenvervielfachers führen, die Photonen durch Zählen der von ihnen am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers hervorgerufenen elektrischen Impulse über eine Zeitspanne gezählt werden, dadurch gekennzeichnet, dass beim Beobachten der Lichtquelle mit der niedrigeren Intensität zusätzlich die elektrische Ladung bestimmt wird, welche von einem Photon am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers im Mittel zur Verfügung gestellt wird,

und dass beim Beobachten von Lichtquellen mit höherer Intensität die am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers zur Verfügung gestellte elektrische Ladung in einem Speicher gesammelt, nach einer Zeitspanne gemessen, mit der mittleren Ladung je Photon verglichen und daraus die Anzahl der in der Zeitspanne empfangenen Photonen bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitspanne, über welche die einzelnen Photonen am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers gezählt werden, vorgewählt wird. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Photonen am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers bis zum Erreichen einer vorgewählten Anzahl gezählt und die dafür benötigte Zeitspanne gemessen wird. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitspanne, über welche die beim Beobachten einer Lichtquelle mit höherer Intensität am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers auftretende Ladung in dem Speicher gesammelt wird, vorgewählt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die beim Beobachten von Lichtquellen mit höherer Intensität am Ausgang des Photoelektronenvervielfachers zur Verfügung gestellte elektrische Ladung in dem Speicher gesammelt wird, bis eine vorgewählte Ladungsmenge erreicht ist, und dass die dafür benötigte Zeitspanne gemessen wird.






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