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Dokumentenidentifikation DE102005052275A1 03.05.2007
Titel Ethylaminspezifische Aptamere, deren Verwendung und ein Kit umfassend diese Aptamere
Anmelder UFZ-Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle GmbH, 04318 Leipzig, DE
Erfinder Strehlitz, Beate, Dr.-Ing., 04277 Leipzig, DE;
Mann, Dörthe, Dipl.-Nat., 04315 Leipzig, DE;
Reinemann, Christine, Dipl.-Ing., 04275 Leipzig, DE;
Stoltenburg, Regina, Dr., 04157 Leipzig, DE
Vertreter Anwaltskanzlei Gulde Hengelhaupt Ziebig & Schneider, 10179 Berlin
DE-Anmeldedatum 27.10.2005
DE-Aktenzeichen 102005052275
Offenlegungstag 03.05.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.05.2007
IPC-Hauptklasse C40B 10/00(2006.01)A, F, I, 20051027, B, H, DE
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft DNA-Aptamere, die für Verbindungen, die die Ethylamin-Gruppe enthalten, spezifisch sind, vorzugsweise für Verbindungen der Formel (I) oder Teilen davon, die das Ethylamin-Grundgerüst
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enthalten. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der Aptamere zur Diagnose, Prophylaxe oder Therapie von Ethanolaminose, Schizophrenie und/oder neurodegenerativen Erkrankungen. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Aptamere zur Aufreinigung und/oder zum Nachweis einer Ethylamin-haltigen Verbindung sowie Verfahren hierfür.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft DNA-Aptamere, die für Verbindungen, die die Ethylamin-Gruppe enthalten, spezifisch sind, vorzugsweise für Verbindungen der Formel (I) oder Teilen davon, die das Ethylamin-Grundgerüst enthalten. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der Aptamere zur Diagnose, Prophylaxe oder Therapie von Ethanolaminose, Schizophrenie und/oder neurodegenerativen Erkrankungen. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Aptamere zur Aufreinigung und/oder zum Nachweis einer Ethylaminhaltigen Verbindung sowie Verfahren hierfür.

Aptamere sind Oligonukleotide, welche spezifisch an Zielmoleküle einer definierten Zielmolekül-Spezies mit hoher Affinität binden. Die Selektivität beruht dabei auf der Fähigkeit bzw. Eigenschaft von Oligonukleotiden, bestimmte dreidimensionale Strukturen aufzubauen, die von der Nukleinsäuresequenz abhängen. Eine bestimmte Nukleinsäuresequenz kann folglich bei definierten Bedingungen eine dreidimensionale Struktur aufweisen, die spezifisch für ein definiertes Zielmolekül ist. Für die Suche nach Oligonukleotiden, die spezifisch für ein definiertes Zielmolekül sind, kann beispielsweise das SELEX-Verfahren (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) angewendet werden. Hierbei wird ein Pool verschiedener Oligonukleotide mit einem definierten Zielmolekül kontaktiert, bindende Oligonukleotide werden selektiert und amplifiziert und in aufeinanderfolgenden Runden schrittweise im Pool angereichert. Hierzu wird im Einzelnen auf die folgenden Literaturstellen verwiesen: Tuerk & Gold, Science 249 (1990) 505–510, sowie Ellington & Szostak, Nature 346 (1990) 818–822. Die so erhaltenen Oligonukleotide bzw. Aptamere eignen sich beispielsweise zur Detektion der zugehörigen Zielmoleküle in einem Bindungsassay. Aptamere zeigen eine hohe Affinität für eine große Vielfalt an Zielmolekülen, die Proteine, Peptide, aber auch kleinere Moleküle umfassen können, wie z.B. organische Farbstoffe, Nukleotide, Aminosäuren, Vitamine, Alkaloide etc. Die geringe Größe letztgenannter Zielmoleküle geht zwangsläufig mit einem geringen Erkennungsbereich einher und erschwert die Selektion. So konnten bisher keine Aptamere für Ethanolamin mit einem Molekulargewicht von nur 61,08 g/mol, ähnliche Strukturen oder Teilstrukturen generiert werden.

Die medizinische Relevanz von Ethanolamin und Derivaten davon ist bekannt. Bei der Ethanolaminose handelt es sich um eine angeborene Glycogenspeicherkrankheit Typ II, die auf einem genetischen Defekt beruht. Symptome der Krankheit sind eine Vergrößerung des Herzens, generelle Muskelschwäche, Funktionsstörungen des Gehirns und eine erhöhte Ethanolamin-Ausscheidung aus der Niere bei gleichzeitig herabgesetzter Ethanolaminkinase-Expression und Ethanolamin-Anreicherung in der Leber. Aufgrund des Ethanolaminkinase-Mangels sterben die betroffenen Kinder meist im ersten Lebensjahr, spätestens jedoch bis zum 5. Lebensjahr. Zum Nachweis der Ethanolaminose wird Ethanolamin in Urin und Serum bestimmt. Der analytische Nachweis von Ethanolamin ist nur aufwendig über Gaschromatographie, Massenspektrometrie oder Isotachophorese durchzuführen und somit an teure Geräte und hoch-qualifiziertes Personal gebunden.

Ethanolamin ist z.B. eine Vorstufe des Neurotransmitters Acetylcholin, dessen erhöhte Werte aus parasympathischer Stimulation mit Erkrankungen wie Schizophrenie und Alzheimer in Verbindung gebracht werden. Hier sind ebenfalls Konzentrationsbestimmungen notwendig, die nur mit den genannten nachteiligen Verfahren erfolgen können.

Die chemische Verbindung Ethanolamin ist auch von industrieller Bedeutung. Ethanolamin wird in der chemischen Industrie zur Herstellung von reinem Acetaldehyd, als Ausgangsprodukt für verschiedene organische Synthesen und als Vulkanisationsbeschleuniger verwendet. Ethanolamin, Di- und Triethanolamin werden auch als Fettsäure-Derivate für Detergentien, zur Gasreinigung (H2S, HCl, CO2) sowie zur Alkalisierung von Haarverformungsmitteln eingesetzt. Fettsäurealkanolamide (Fettsäureseifen) werden als Emulgatoren verwendet. Zur Prozessüberwachung sind die bisher nur möglichen aufwendigen Nachweise mittels Gaschromatographie, Massenspektrometrie oder Isotachophorese nachteilig.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, spezifische Substanzen zur Verfügung zu stellen, die einen schnellen, einfachen und zuverlässigen Nachweis von Verbindungen mit einer Ethylamin-Gruppe und insbesondere von Ethanolamin und dessen Derivaten gewährleisten.

Die Aufgabe der Erfindung wird gemäß den unabhängigen Ansprüchen gelöst. Die Unteransprüche beinhalten bevorzugte Ausführungsformen. Erfindungsgemäß werden DNA-Aptamere bereitgestellt, die für Verbindungen, die die Ethylamin-Gruppe enthalten, spezifisch sind. Vorzugsweise sind die DNA-Aptamere für Verbindungen der Formel (I): R1R2N-CR3R4-CH2-R5(I)oder Teilen davon spezifisch, wobei

R1, R2 ein Wasserstoffatom, -(CH2)nOH, eine Alkyl- oder Guanyl-Gruppe,

R3, R4 ein Wasserstoffatom, -(CH2)nOH oder eine Alkyl-Gruppe, und

R5 ein Wasserstoffatom, -(CH2)nOH, 3-Carboxy-3-amino-propyl, 2-Carboxy-2-amino-ethyl, eine Hydroxy-, Alkyl- oder Aryloxy-Gruppe sind,

wobei n = 1–6 ist, vorzugsweise 1–3, besonders bevorzugt 1 und 2.

Die Erfinder konnten überraschenderweise Oligonukleotide selektieren, die als Einzelstrang-DNA in der Lage sind, Verbindungen mit einem Ethylamin-Grundgerüst und insbesondere Verbindungen der Formel (I) mit hoher Affinität zu binden. Diese Oligonukleotide werden auch als Aptamere bezeichnet. Die Aptamere falten sich unter definierten Bedingungen in eine spezifische dreidimensionale Struktur. Entsprechend dem induced-fit Modell sind die Aptamere in der Lage, die Verbindungen der Formel (I) mit hoher Affinität und Spezifität zu binden. Dabei können die Aptamere die Zielmoleküle auch innerhalb einer komplexen Matrix erkennen. Die für die Aptamerbindung essentielle Teilstruktur ist die aliphatische Struktur die entsprechend der Formel (I) mit R1 bis R5 substituiert sein kann.

Die Selektion der erfindungsgemäßen Aptamere wurde nach dem bekannten SELEX-Prozess vorgenommen. Hierfür erfolgte zunächst die Synthese eines randomisierten DNA-Pools. Aptamere waren schematisch durch folgende Schritte generierbar: Teile der ssDNA des DNA-Pools wurden angereichert, indem der Pool mit einer Verbindung der Formel (I) zur Bindung gebracht wurde (i) und der Bindungskomplex von ungebundener ssDNA abgetrennt wurde (ii). Anschließend wurde die gebundene ssDNA eluiert (iii), amplifiziert (iv) und die erhaltene dsDNA in ssDNA überführt (v), bevor diese ssDNA einer erneuten Runde unterzogen wurde. Die Schritte (i) bis (v) wurden mehrfach (hier 11×) wiederholt. Nach erfolgter Klonierung des selektierten Aptamer-Pools wurden individuelle Aptamere hinsichtlich ihrer Sequenz (Sequenzierung und Sequenzanalysen) und ihrer Bindungseigenschaften (Bindungsstudien) charakterisiert. Für die Anwendung können die individuellen Aptamere auf der Basis ihrer bekannten Sequenz mittels chemischer Synthese hergestellt werden. Sämtliche Methoden sind dem Fachmann bekannt.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die DNA-Aptamere für die Ethylamin-Gruppe der Verbindungen der Formel (I) oder Teilen der Verbindungen spezifisch. Die Teile der Verbindungen der Formel (I) beschränken sich auf jene Abschnitte, die für die Expression einer bestimmten Funktion ausreichend sind. Substitutionen der Verbindungen der Formel (I) sind zwangsläufig durch das Erfordernis des Funktionserhalts, d.h. der Erkennung durch das Aptamer, eingeschränkt. Es versteht sich, dass die Ethylamin-Gruppe lediglich das strukturell-notwendige Grundgerüst für die Erkennung durch die DNA-Aptamere darstellt. Die Wasserstoffatome der Ethylamin-Gruppe können mit den Resten gemäß Formel (I) substituiert sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wurden DNA-Aptamere gefunden, die für Ethanolamin, 4-Amino-1-Butanol, 4-Amino-1-Hexanol, Diethanolamin, Triethanolamin, 2-Methylaminoethanol, 2-Phenoxyethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Lysin und Arginin spezifisch sind, vorzugsweise für Ethanolamin. Ethanolamin stellt das ursprüngliche Zielmolekül (Target) der Aptamerselektion dar. Darüber hinaus werden eine Vielzahl an strukturähnlichen Verbindungen bzw. Ethanolamin-Derivaten von den DNA-Aptameren erkannt, die in der Formel (I) zusammengefasst sind. Die Aptamerbindung an 4-Amino-1-Butanol und 4-Amino-1-Hexanol zeigt, dass Kettenverlängerungen über das C2-Grundgerüst hinaus die Interaktion zwischen Target und Aptamer nicht negativ beeinflussen.

In Formel (I) bedeutet Alkyl ein C1-C4-Alkyl, insbesondere Methyl, Ethyl oder Propyl. Aryloxy bedeutet Phenoxy oder Benzyloxy, wobei der Sechsring substituiert sein kann, z.B. mit Alkylgruppen, Halogen und/oder Hydroxy-Gruppen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnten DNA-Aptamere selektiert werden, die vier Gruppen zuzuordnen sind. Die Sequenzen innerhalb einer Gruppe unterscheiden sich nur in einzelnen Basenpositionen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das DNA-Aptamer eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 30 oder Varianten, Mutanten, Teile der DNA-Sequenz oder zu 80% homologe Sequenzen, die die gleichen Eigenschaften besitzen, vorzugsweise eine DNA-Sequenz aus der Gruppe der DNA-Sequenzen der SEQ ID NOs: 01 bis 11. Die Sequenz der SEQ ID NO: 30 ist die Gruppen-Konsensussequenz der Gruppe I, zu der die Sequenzen der SEQ ID NOs: 01 bis 11 gehören. Mutanten können beispielsweise durch Substitution, Deletion, Insertion, Translokation, Inversion und/oder Addition von zumindest einem Nukleotid erhalten werden. Varianten der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können durch Modifikationen, wie z.B. Alkylierung, Arylierung oder Acetylierung von zumindest einem Nukleotid, Einbau von Enantiomeren und/oder durch Fusion der Aptamere mit einem oder mehreren Nukleotiden oder einer Nukleinsäuresequenz entstehen. Teile der DNA-Sequenzen beschränken sich auf jene Abschnitte, die für eine bestimmten Funktion des Aptamers, insbesondere seine Bindungsfähigkeit, hinreichend sind. Sämtliche Veränderungen der Sequenz sind zwangsläufig durch das Erfordernis des Funktionserhalts beschränkt. Vorzugsweise weist eine DNA-Sequenz, die zu einer der DNA-Sequenzen der SEQ ID NOs: 1 bis 32 funktionsanalog ist, eine Homologie von mindestens 60% auf, besonders bevorzugt von mindestens 70%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 80%. Für die aufgezeigten Veränderungen derartiger DNA-Sequenzen sei auf die entsprechenden Standardwerke der Biochemie und der Molekularbiologie verwiesen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das DNA-Aptamer eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 31 oder Varianten, Mutanten, Teile der DNA-Sequenz oder zu 80% homologe Sequenzen, die die gleichen Eigenschaften besitzen, vorzugsweise eine DNA-Sequenz aus der Gruppe der DNA-Sequenzen der SEQ ID NOs: 12 bis 19. Die Sequenz der SEQ ID NO: 31 ist die Gruppen-Konsensussequenz der Gruppe II, zu der die Sequenzen der SEQ ID NOs: 12 bis 19 gehören. Das Nukleotid (G) in Position 29 der SEQ ID NO: 16 kann auch deletiert sein.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das DNA-Aptamer eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 20 oder Varianten, Mutanten, Teile der DNA-Sequenz oder zu 80% homologe Sequenzen, die die gleichen Eigenschaften besitzen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das DNA-Aptamer eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 32 oder Varianten, Mutanten, Teile der DNA-Sequenz oder zu 80% homologe Sequenzen, die die gleichen Eigenschaften besitzen, vorzugsweise eine DNA-Sequenz aus der Gruppe der DNA-Sequenzen der SEQ ID NOs: 21 bis 25. Die Sequenz der SEQ ID NO: 32 ist die Gruppen-Konsensussequenz der Gruppe IV, zu der die Sequenzen der SEQ ID NOs: 21 bis 25 gehören.

In den Aptamer-Sequenzen der Gruppen I bis IV wurde gruppenübergreifend eine gemeinsame G-reiche Kern-Konsensussequenz identifiziert, die nur in einzelnen Basenpositionen (ausgeschlossen G) innerhalb einer Gruppe bzw. zwischen verschiedenen Gruppen variiert. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das DNA-Aptamer eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 29 oder Varianten, Mutanten, Teile der DNA-Sequenz oder zu 80% homologe Sequenzen, die die gleichen Eigenschaften besitzen, vorzugsweise eine DNA-Sequenz aus der Gruppe der DNA-Sequenzen der SEQ ID NOs: 26 bis 28. Die Sequenz der SEQ ID NO: 26 ist die Kern-Konsensussequenz der Gruppen I und II; die Sequenz der SEQ ID NO: 27 ist die Kern-Konsensussequenz der Gruppe III; die Sequenz der SEQ ID NO: 28 ist die Kern-Konsensussequenz der Gruppen I bis III; die Sequenz der SEQ ID NO: 29 ist die Kern-Konsensussequenz der Gruppen I bis IV. In den Sequenzen der SEQ ID NOs: 28 und 29 können die Nukleotide in den Positionen 2 und/oder 11 auch komplett deletiert sein, so dass die Sequenzen nur eine Länge von 15 oder 16 Nukleotiden aufweisen. In der Sekundärstruktur bilden die G-reichen Kern-Konsensussequenzen jeweils einen einzelsträngigen Loop.

Die Bindungsfähigkeit der selektierten Aptamere wird durch die Affinität (Sensitivität) der Bindung (ausgedrückt durch die Dissoziationskonstante) beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die DNA-Aptamere eine Affinität an Ethanolamin von 0.1 bis 500 nM auf, vorzugsweise 1 bis 30 nM. Die besten Sensitivitäten (kleinste KD-Werte) haben beispielsweise die Aptamere der SEQ ID NOs: 23 (KD: 2.5 ± 0.8 nM), 2 (KD: 6 ± 3 nM), 4 (KD: 9 ± 5 nM), 14(KD: 10 ± 2 nM), 13 (KD: 15 ± 4 nM), 12 (KD: 17 ± 4 nM) und 15 (KD: 19 ± 7 nM).

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegen die DNA-Aptamere als Phosphorothioat-DNA, locked nucleic acid (LNA), peptide nucleic acid (PNA) oder Spiegelmer vor. Durch Modifikationen werden die Aptamere gegen Nukleinsäure-spaltende Enzyme stabilisiert. Bei der Stabilisierung der Aptamere kann grundsätzlich zwischen der nachträglichen Modifikation der Aptamere und der Selektion mit bereits modifizierter DNA unterschieden werden. Die Stabilisierung berührt die Affinität der modifizierten DNA-Aptamere nicht, verhindert jedoch die schnelle Zersetzung der Aptamere in einem Organismus oder biologischen Lösungen durch DNasen. Ein Aptamer wird im Rahmen der Erfindung als stabilisiert bezeichnet, wenn die Halbwertszeit in biologischen Seren größer als eine Minute, vorzugsweise größer als eine Stunde, besonders bevorzugt größer als ein Tag ist. Die Aptamere können auch mit Reportermolekülen modifiziert sein, die neben der Detektion der markierten Aptamere auch zur Erhöhung der Stabilität beitragen können.

Gegenstand der Erfindung sind auch die DNA-Sequenzen der SEQ ID NOs: 1 bis 25.

Die Erfindung betrifft auch ein pharmazeutisches Mittel, das mindestens eines der erfindungsgemäßen DNA-Aptamere umfasst, vorzugsweise zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen und/oder Trägern. Ein pharmazeutisches Mittel im Sinne der Erfindung ist jedes Mittel, welches in der Prophylaxe, Diagnose, Therapie, Verlaufskontrolle oder Nachbehandlung von Patienten eingesetzt werden kann, die zumindest zeitweise eine pathogene Modifikation des Gesamtzustandes bzw. des Zustandes einzelner Teile des Patientenorganismus zeigen, insbesondere infolge einer abnormen Ethanolamin-Konzentration. Das pharmazeutische Mittel kann das DNA-Aptamer beispielsweise als ein akzeptables Salz umfassen. Hierbei kann es sich beispielsweise um Salze anorganischer Säuren, wie z.B. der Phosphorsäure, oder um Salze organischer Säuren handeln. Die jeweilige Dosis bzw. der Dosisbereich für die Gabe des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittels ist groß genug, um den gewünschten prophylaktischen oder therapeutischen Effekt der Bindung an Verbindungen der Formel (I), wie z.B. Ethanolamin, zu erreichen. Im Allgemeinen wird die Dosis mit dem Alter, der Konstitution und dem Geschlecht des Patienten variieren sowie die Schwere der Erkrankung berücksichtigen. Es versteht sich, dass die spezifische Dosis, Häufigkeit und Dauer der Verabreichung darüber hinaus von einer Vielzahl an Faktoren abhängen, wie z.B. der Bindungsfähigkeit der Aptamere, Ernährungsgewohnheiten des zu behandelnden Individuums, Art der Verabreichung, Ausscheidungsrate und Kombination mit anderen Medikamenten. Die individuelle Dosis kann sowohl in Bezug auf die primäre Erkrankung als auch in Bezug auf das Eintreten eventueller Komplikationen eingestellt werden. Die exakte Dosis ist durch einen Fachmann mit bekannten Mitteln und Methoden feststellbar.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden die DNA-Aptamere in einer Dosis von 0.01 mg bis 1 g pro Kilogramm Körpergewicht und pro Tag verabreicht. Vorzugsweise werden jedoch Dosen von 20 bis 60 mg pro Kilogramm Körpergewicht und pro Tag verabreicht.

Zur Unterstützung der medizinischen Wirkung kann das pharmazeutische Mittel in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auch weitere Wirkstoffe umfassen, wie z.B. Antikörper.

Erfindungsgemäß ist das vorliegende pharmazeutische Mittel zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Ethanolaminose, Schizophrenie und/oder neurodegenerativen Erkrankungen, vorzugsweise Alzheimer, geeignet. Die vorherige Lehre der Erfindung und deren Ausführungsformen sind gültig und ohne Einschränkungen auf pharmazeutische Mittel anwendbar, sofern es sinnvoll erscheint.

Das pharmazeutische Mittel der vorliegenden Erfindung kann oral, transmucosal, rektal, pulmonal, enteral und/oder parenteral angewendet werden. Bevorzugt ist eine direkte Injektion in den Körper. Die gewählte Art der Verabreichung richtet sich nach der Indikation, der zu verabreichenden Dosis, Individuums-spezifischen Parametern etc. Insbesondere ermöglichen die verschiedenen Arten der Verabreichung eine ortspezifische Therapie, die Nebenwirkungen minimiert und die Wirkstoffdosis verringert. Bevorzugte Injektionen sind die intradermale, subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion. Die Applikation kann z.B. mit Hilfe sogenannter Impfpistolen, die die DNA mittels Goldkugeln in die Haut einbringen, oder mittels Spritzen, die die DNA unter die Haut oder in den Muskel einbringen, geschehen. Es ist auch möglich, das Aptamer als Aerosol bereitzustellen, welches von dem Organismus, bevorzugt einem humanen Patienten, inhaliert wird.

Um die protektive oder therapeutische Wirkung der erfindungsgemäßen DNA-Aptamere zu erhöhen, können den daraus hergestellten pharmazeutischen Mitteln pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, wie z.B. Adjuvantien, zugesetzt werden. Im Sinne der Erfindung ist jede Substanz, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Aptameren eine Wirkung ermöglicht, verstärkt oder modifiziert, ein Adjuvants. Bekannte Adjuvantien sind beispielsweise Aluminiumverbindungen, wie z.B. Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, Saponine, wie z.B. QS 21, Muramyldipeptid oder Muramyltripeptid, Proteine, wie z.B. Gammainterferon oder TNF, MF 59, Phosphatdibylcholin, Squalen oder Polyole. Des weiteren kann DNA, die eine immunstimulatorische Eigenschaft hat, oder die ein Protein mit Adjuvants-Effekt kodiert, wie z.B. ein Cytokin, parallel oder in einem Konstrukt appliziert werden.

Das pharmazeutische Mittel kann als Tablette, Kapsel, Pulver, Lösung, Dispersion oder Suspension vorliegen. Die Darreichungsformen des pharmazeutischen Mittels werden mit den üblichen festen oder flüssigen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und den üblicherweise eingesetzten Hilfsstoffen entsprechend der gewünschten Applikationsart in einer geeigneten Dosierung und in an sich bekannter Weise hergestellt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Aptamere zur Diagnose, Prophylaxe oder Therapie von Ethanolaminose, Schizophrenie und/oder neurodegenerativen Erkrankungen, vorzugsweise Alzheimer.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung dieser Aptamere zur Herstellung eines Medikaments zur Diagnose, Prophylaxe oder Therapie von Ethanolaminose, Schizophrenie und/oder neurodegenerativen Erkrankungen, vorzugsweise Alzheimer.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Aufreinigung von Verbindungen, die die Ethylamin-Gruppe enthalten, vorzugsweise von Verbindungen der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe, die eine Ethylamin-Gruppe enthaltende Verbindung umfasst, mit mindestens einem erfindungsgemäßen Aptamer inkubiert wird, der Komplex aus Aptamer und Verbindung von der restlichen Probe und die Verbindung von dem Komplex abgetrennt wird.

Eine Probe im Sinne der Erfindung ist ein bereitgestelltes oder durch Probenentnahme erhaltenes biologisches oder chemisches Material oder eines Teiles bzw. einer kleinen Menge eines solchen, von dem angenommen wird, dass es die Ethylamin-Gruppe enthaltende Verbindungen umfasst, oder dessen Beschaffenheit chemisch, biologisch, klinisch oder ähnlich geprüft werden soll auf das Vorhandensein von Verbindungen, die die Ethylamin-Gruppe enthalten, insbesondere Verbindungen der Formel (I). Eine Probe können insbesondere alle biologischen Materialien sein, die von Individuen isoliert worden sind, beispielsweise biologische Gewebe und Flüssigkeiten, zu denen u.a. Blut, Haut, Plasma, Serum, Lymphe, Urin, Gehirnflüssigkeit, Tränen, Abstriche, Gewebeproben, Organe und Tumore zählen. Vorliegend sind in Proben auch Bestandteile von Zellkulturen eingeschlossen. Die Probenentnahme erfolgt insbesondere so, dass die entnommene Teilmenge einem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Die durch Untersuchung der Probe ermittelten Merkmale dienen der Beurteilung der durch die Probe erfassten Menge, die wiederum Rückschlüsse auf die Gesamtmenge, beispielsweise das Blut bzw. die Lymphe in einem Organismus, zulässt. Für die Untersuchung können die Proben vorbehandelt, wie z.B. durch Mischen, Zugabe von Enzymen oder Markern, oder aufgereinigt werden.

Die Probe wird mit mindestens einem der erfindungsgemäßen Aptamere inkubiert. Unter einer Inkubation im Sinne der Erfindung versteht man eine Kontaktierung der Probe und der darin enthaltenen Verbindungen mit einem Aptamer, die ohne chemische Konvertierung einhergeht. Die Aptamere gelangen durch Diffusion zu den Verbindungen der Formel (I), wobei exponierte Verbindungen bevorzugt kontaktiert werden können. Es ist möglich, durch chemische Lösungen und/oder physikalische Methoden, wie z.B. Erhitzen, die Zugänglichkeit der Verbindungen zu verbessern.

Nach einer Inkubationszeit werden die spezifischen Inkubationsprodukte, d.h. die Komplexe aus Aptamer und Verbindung, von der restlichen Probenlösung abgetrennt. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt, wie z.B. Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration, Fällung, Chromatographie, magnetische Trennung oder einfach Waschschritte, sofern der Komplex immobilisiert vorliegt.

Durch Veränderungen der für die Aptamerbindung erforderlichen definierten Bedingungen wird im nächsten Schritt der Inkubationskomplex getrennt. Hierzu sind physiko-chemische Einwirkungen, wie z.B. eine Variation von Salzkonzentration oder pH oder eine hitzebedingte Denaturierung, denkbar. Abschließend ist eine weitere Reinigung der Verbindung möglich, wobei das Aptamer zuvor abgebaut werden kann, z.B. durch saure (thermische) Hydrolyse oder DNasen. Sofern das Aptamer immobilisiert ist, kann die aufgereinigte Verbindung eluiert werden, wie z.B. von einer Säule, die anschließend regeneriert und wiederverwendet wird.

Erfindungsgemäß können die DNA-Aptamere auch an einer festen Phase immobilisiert sein, vorzugsweise über ein Spacer-Molekül, das beispielsweise eine Linker-Nukleinsäure sein kann. Geeignete Methoden der Immobilisierung sind dem Fachmann bekannt, die sowohl mit einer kovalenten Kopplung als auch einer nicht-kovalenten Kopplung mittels geeigneter Affinitätspaare, wie z.B. Biotin/Streptavidin, einhergehen können. Die feste Phase können beispielsweise Platten, Streifen, Membranen, Filme, Gele oder Perlen sein. Geeignete Trägermaterialien sind anorganische und organische Polymere. Hierzu zählen Kunststoffe, vorzugsweise auf Basis von Polystyrol. Des weiteren sind Biopolymere, vorzugsweise Cellulose, Dextran, Agar, Agarose und Sephadex, die funktionalisiert sein können, insbesondere als Nitrocellulose oder Cyanbromid-Sephadex, Polymere im erfindungsgemäßen Verfahren. Aptamere können an Magnetic Beads gebunden werden, die z.B. Carboxy-terminierte oder Epoxy-aktivierte Seitenketten tragen. Des weiteren ist eine Kopplung von Magnetic Beads an die Desoxyribose der Aptamere, wie z.B. über eine Hydrazon-Bindung, möglich. Die Beispiele für Polymere sind nicht limitierend und andere Moleküle denkbar. Bevorzugte Kombinationen von geometrischer Form und Material sind Gele aus Biopolymeren, insbesondere Agarose, und Gelmatrices aus Dextran und Sephadex, die – beispielsweise in Säulen verpackt – Hohlräume definierter Porengröße ausbilden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis von Verbindungen, die die Ethylamin-Gruppe enthalten, vorzugsweise von Verbindungen der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchende Probe mit mindestens einem erfindungsgemäßen Aptamer inkubiert und ein Bindungsereignis zwischen dem Aptamer und der Verbindung nachgewiesen wird.

Die Probe und das Aptamer werden gemäß der vorherigen Lehre dieser Erfindung gewonnen, vorbereitet, wie z.B. immobilisiert, und inkubiert, im Ergebnis dessen das Aptamer und eine in der Probe vorhandene Verbindung, die die Ethylamin-Gruppe enthält, insbesondere eine Verbindung der Formel (I), einen Komplex bilden. Das Bindungsereignis kann elektrochemisch, optisch, mikrogravimetrisch, kalorimetrisch oder piezoelektrisch nachgewiesen werden. Beim markierungsfreien Nachweis wird das Aptamer beispielsweise auf einer Oberfläche fixiert und die Änderung der Schichtdicke nach Anlagerung der die Ethylamin-Gruppe enthaltenden Verbindungen mit einer der genannten Methoden bestimmt, wie z.B. optisch über eine Änderung des Evaneszenz-Feldes. Meist ist die Komplexierung nicht direkt detektierbar und wird vorzugsweise in einer Indikatorreaktion nach einer direkten oder indirekten Kopplung eines Komplexpartners mit einer gut nachweisbaren Markierungssubstanz sichtbar gemacht. Das bedeutet, entweder ist das verwendete Aptamer oder eine nachzuweisende Verbindung der Formel (I) mit einer Markierung versehen. Bevorzugt ist das Aptamer markiert.

In einer Ausgestaltung des Verfahrens der Erfindung wird die Markierung durch Lumineszenz, UV/VIS-Farbgebung, enzymatisch, elektrochemisch oder radioaktiv nachgewiesen. Lumineszenz betrifft die Emission von Licht. Im erfindungsgemäßen Verfahren finden vorzugsweise die Photolumineszenz, die Chemilumineszenz und die Biolumineszenz zum Nachweis der Markierung Anwendung. Bei der Photolumineszenz oder Fluoreszenz erfolgt die Anregung durch Absorption von Photonen. Bevorzugte Fluorophore sind Bisbenzimidalole, die kovalent an Aptamere oder Nachweisreagenzien auf DNA-Basis gekoppelt werden, Fluoreszein, Acridinorange, Cy5, Cy3 oder Propidiumiodid. Die Auswertung geschieht visuell oder mit entsprechenden Messgeräten, z.B. im Fluoreszenzmikroskop, oder durch Durchflusscytometrie, z.B. im Cytofluorimeter. Chemilumineszenz beschreibt die Emission sichtbaren Lichts als Folge einer chemischen Reaktion. Eine bevorzugte chemische Markierung zur Chemilumineszenz ist Luminol, das nach Oxidation, wie z.B. mit H2O2, eine intensive blaue Chemilumineszenz zeigt. Biolumineszenz beinhaltet die Emission sichtbaren Lichts als Folge einer durch das Enzym Luciferase katalysierten Redoxreaktion.

Darüber hinaus kann der Nachweis mit weiteren Enzymen als Markierungssubstanzen geführt werden, die Substrate zu farbigen Produkten umsetzen, vorzugsweise Peroxidase, CAT, GFP, GST, Luciferase, &bgr;-Galactosidase oder Alkalische Phosphatase. Beispielsweise wird das farblose Substrat X-Gal durch die Aktivität der &bgr;-Galactosidase zu einem blauen Produkt umgesetzt, dessen Farbgebung visuell erfasst wird. Die Alkalische Phosphatase (AP) setzt 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP oder X-Phosphat) und Nitroblau-Tetrazoliumsalz (NBT) farbig um. Die Farbstoffe fallen dabei in unmittelbarer Nähe der AP-Moleküle aus und färben die Umgebung der gebundenen Verbindungen dunkelviolett an. Die Peroxidase katalysiert z.B. die Oxidation von ABTS (2,2'-Azino-bis-[3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure]) in Gegenwart von H2O2. Aufgrund der Enzymstabilität und einer Vielzahl an möglichen Substraten ist die Meerettich-Peroxidase bevorzugt.

In Enzymelektroden wirken immobilisierte Enzyme als Rezeptor und ein elektrochemisches Messsystem fungiert als Transduktor. Im Sinne der vorliegenden Erfindung können die Enzyme sowohl auf Aptameren oder Nachweisreagenzien für die Inkubationskomplexe, oder auf einem externen Träger immobilisiert sein. Die Enzyme liefern durch Bildung oder Abbau elektrodenaktiver Substrate ein direktes chemisches Signal, das vom Transduktor in ein elektrisches Signal umgewandelt wird. Die Substrate befinden sich konträr zu den immobilisierten Enzymen an einem externen Träger, oder sind kovalent an Aptamere der vorliegenden Erfindung oder Nachweisreagenzien der Komplexe gekoppelt. Bevorzugte Systeme basieren auf spezifischen Oxidasen, wie z.B. der Glucoseoxidase, wobei Coenzyme über Redoxmediatoren die Verknüpfung mit elektrochemischen oder optischen Sensorelementen gewährleisten.

Alternativ kann der Nachweis auch radioaktiv mit radioaktiven Isotopen erfolgen, vorzugsweise 3H, 14C, 32P, 33P, 35S oder 125I, besonders bevorzugt 32P, 33P oder 125I. Bei der Sintillationszählung wird z.B. ein Molekülcocktail durch radioaktive &bgr;-Strahlung angeregt. Die beim Übergang in den Grundzustand als Licht freigesetzte Energie wird durch einen Photoelektronenvervielfacher verstärkt und gezählt.

Die Aptamere können auch mit Digoxigenin oder Biotin markiert sein, die beispielsweise durch Antikörper oder Streptavidin gebunden werden, die wiederum eine Markierung tragen können, wie z.B. ein Enzymkonjugat. Ist der Antikörper an ein Enzym gekoppelt, spricht man vom ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Die vorherige kovalente Verknüpfung (Konjugation) eines Antikörpers mit einem Enzym kann auf verschiedene bekannte Arten erfolgen. Der Nachweis der Antikörper-Bindung kann auch radioaktiv in einem RIA (radioactive immunoassay) mit radioaktiven Isotopen, vorzugsweise mit 125I, oder durch Fluoreszenz in einem FIA (Fluoroimmunoassay) mit Fluorophoren, vorzugsweise mit Fluorescein oder FITC, erfolgen.

Alle genannten Methoden schließen intensive Waschschritte ein, um ungebundene und/oder unspezifisch gebundene Aptamere und/oder Nachweisreagenzien abzutrennen. Die Durchführung sämtlicher Nachweisverfahren ist dem Fachmann bekannt. Der direkte Nachweis der Markierung ist im vorliegenden Verfahren der Erfindung bevorzugt, insbesondere der direkte Nachweis durch Fluoreszenz.

In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens wird der Nachweis in-situ durchgeführt. Diese Umsetzung erfordert einen geeigneten Inkubationsraum, auf dem der Nachweis einfach durchgeführt und sichtbar gemacht werden kann. Hierzu wird vorteilhaft ein fester Träger verwendet, der es ermöglicht, Probe, Aptamere und ggf. Nachweisreagenzien der Komplexe zu fixieren. Die Aptamere können sowohl vor oder nach der Probe auf den festen Träger aufgebracht werden. Methoden der Immobilisierung vorgenannter Aptamere sind dem Fachmann bekannt und werden vorzugsweise nicht in-situ, sondern während oder im Anschluss an die Produktion des festen Trägers durchgeführt. Für den Nachweis kommen beispielsweise ein visueller Farbnachweis oder ein elektrochemischer Nachweis in Frage. Im Farbnachweis können die Aptamere markiert sein, so dass direkt im Anschluss an die Inkubation ein Ablesen und Auswerten realisiert werden kann.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Aptamere zur Aufreinigung und/oder zum Nachweis von Verbindungen, die die Ethylamin-Gruppe enthalten, vorzugsweise von Verbindungen der Formel (I). Das Aptamer ist zur Affinitätsreinigung und/oder Affinitätschromatographie geeignet. Das Aptamer kann als Rezeptorelement für Biosensoren, in der klinischen Analytik, Umweltanalytik und/oder Prozessüberwachung der chemischen Industrie vorteilhaft eingesetzt werden.

Die Erfindung lehrt des weiteren einen Kit, der mindestens eines der erfindungsgemäßen DNA-Aptamere umfasst. In einer Ausgestaltung des Kits kann dieser auch signalgebende Substanzen oder Vorrichtungen enthalten, vorzugsweise Fluorophore, Chemilumineszenz-Cofaktoren, Enzymsubstrate, Feldeffekttransistoren oder markierte Antikörper. Die Signalgebung durch die Substanzen folgt den im Laufe der Spezifikation gemachten Ausführungen. Dagegen werden elektrostatische Veränderungen im Zuge einer Ligand/Rezeptor-Bindung durch die Vorrichtung eines Feldeffekttransistors als elektrisches Signal ausgegeben. Feldeffekttransistoren sind elektronische Bauelemente, bei denen der Stromfluss des Halbleitermaterials durch das elektrische Feld an einem bestimmten Teil seiner Oberfläche (Gate) reguliert wird. Das elektrische Feld kann durch Bindung (und ggf. Reaktion) von Molekülen an das Gate variiert werden. Bio-Feldeffekttransistoren registrieren die durch Liganden verursachte Dipolmomentänderung oder Ladungsanhäufung an immobilisierten Biomolekülen. Bevorzugte Feldeffekttransistoren sind ENZFET (für Enzyme), IMMUNFET (für Antikörper) und CHEMFET (für spezifische chemische Verbindungen), die als integraler Sensorbestandteil fungieren.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden also erstmalig spezifische Substanzen für Verbindungen, die die Ethylamin-Gruppe enthalten, bereitgestellt. Bei den spezifischen Substanzen handelt es sich um DNA-Aptamere, deren Sequenzen bisher nicht beschrieben sind. Die DNA-Aptamere zeichnen sich durch eine hohe Affinität im nanomolaren Bereich und eine ausgeprägte Spezifität für Verbindungen mit der Ethylamin-Gruppe aus. Diese Eigenschaften bilden die Grundlage für eine zuverlässige Erkennung, womit das Fehlen von Kreuzreaktivitäten eingeschlossen ist, und einen reproduzierbaren Nachweis von Verbindungen mit einer Ethylamin-Gruppe, insbesondere von Ethanolamin und dessen Derivaten. Die Affinität und Spezifität der erfindungsgemäßen Aptamere sind damit grundsätzlich mit denen von Antikörpern vergleichbar oder sogar besser. Die erfindungsgemäß zur Verfügung gestellten Aptamere können kostengünstig in-vitro hergestellt werden. Im Vergleich zur Antikörpertechnologie beispielsweise werden keine Versuchtiere für Immunisierungszwecke benötigt. Die Aptamere auf DNA-Basis besitzen auch eine hohe Stabilität und sind nicht zuletzt aufgrund ihrer geringen Größe gut zu handhaben.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von nicht limitierenden Beispielen für konkrete Ausführungsformen näher erläutert. In den Beispielexperimenten werden Standardreagenzien und Puffer verwendet, die frei von Kontaminationen sind.

1 zeigt Sequenzen von DNA-Aptameren, die für Verbindungen der Formel (I) spezifisch sind. Der unterstrichene Sequenzbereich ist die Kern-Konsensussequenz. Der eingerahmte Sequenzbereich (in Gruppe III) ist eine der Kern-Konsensussequenz der Gruppen I, II und IV sehr ähnliche Kern-Konsensussequenz. In den Sequenzen der SEQ ID NOs. 28 und 29 bedeutet X1: A oder T oder L, sowie X2: T oder L, wobei L für kein Nukleotid (d.h. eine Deletion) steht.

BEISPIEL 1: Präparation der Magnetic Beads.

Dynabeads® M-270 Epoxy oder M-280 Tosylactivated Magnetic Beads (Dynal Biotech, Norwegen) wurden nach Herstellerangaben verwendet. 1 × 109 Magnetic Beads wurden über Nacht bei 37°C und leichtem Schütteln mit 1 mL 1 M Ethanolamin inkubiert. Danach folgten Waschschritte: 4 × 1 mL PBS, pH 7.3; 1 × 1 mL PBS, pH 7.3 + 1% Tween 20; 1 × 1 mL PBS, pH 7.3. Die Abtrennung der Beads von den Waschlösungen erfolgte jeweils unter Verwendung eines Magnet-Separationsstandes (Promega, Deutschland). Die Ethanolaminmodifizierten Beads wurden dann in 500 &mgr;L PBS, pH 7.3, resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt.

BEISPIEL 2: In-vitro Selektion (FluMag-SELEX).

Die DNA-Aptamer-Selektion erfolgte unter Anwendung des FluMag-SELEX-Prozesses, in dem die Quantifizierung der DNA nach verschiedenen Schritten des Prozesses mittels Fluoreszenz-Messung über eingefügte Fluoreszenz-Marker erfolgt und für die Immobilisierung des Targets Magnetic Beads verwendet werden. Die Selektion der Ethanolaminbindenden Aptamere erfolgte mit Laminarin als Haupttarget, immobilisiert auf Magnetic Beads (Dynabeads M-270 Epoxy), wobei Ethanolamin für die Blockierung freier Bindungsstellen auf diesen Beads verwendet wurde. Somit waren sowohl Laminarin als auch Ethanolamin auf der Bead-Oberfläche vorhanden und standen für die Bindung der DNA als Target zur Verfügung. Ausgangspunkt des Selektionsprozesses war eine ssDNA-Bibliothek (genannt BANK), die mittels chemischer Synthese von Invitrogen (U.K.) hergestellt wurde (PAGE gereinigt): 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N60-AGATAGTAAGTGCAATCT-3'. Folgende modifizierte Primer, die sich an das 5'-Ende bzw. 3'-Ende der BANK anlagern, wurden verwendet: Primer AP60 mit der Sequenz: 5' fluorescein-ATACCAGCTTATTCAATT-3' und Primer TER-AP20 mit der Sequenz: 5' dA20HEGL-AGATTGCACTTACTATCT-3' (Invitrogen, U.K. und IBA GmbH, Deutschland). Es wurden aufeinanderfolgende Runden des SELEX-Prozesses durchgeführt, die sich aus den Schritten (i) Bindung der ssDNA Bibliothek bzw. der in der vorhergehenden Runde selektierten ssDNA an die Target-modifizierten Beads, (ii) Abtrennen der ungebundenen ssDNA, (iii) Elution der gebundenen ssDNA mittels Hitze, (iv) Vervielfältigung der eluierten ssDNA mittels PCR, (v) Trennung des Doppelstranges aus der PCR und Gewinnung des relevanten Einzelstranges, zusammensetzen. In jeder Runde wurden 108 Target-modifizierte Magnetic Beads eingesetzt. Nach der 9. Runde wurden die selektierten Oligonukleotide auf ihre Bindungsspezifität für Laminarin und Ethanolamin getestet. Dabei wurde eine eindeutige Anreicherung von Ethanolamin-bindender ssDNA gefunden.

BEISPIEL 3: Klonierung and Sequenzierung.

Der Aptamer-Pool aus der 9. SELEX-Runde wurde für eine nächste 10. SELEX-Runde verwendet, in der ausschließlich Ethanolamin-modifizierte Magnetic Beads als Target eingesetzt wurden. In der letzten 11. Runde wurde die selektierte ssDNA in der PCR mit unmodifizierten Primern amplifiziert, um sie danach in den Vektor pCR2.1-TOPO zu klonieren. E. coli TOP10 Zellen (TOPO TA Cloning Kit; Invitrogen, U.K.) wurden durch Aufnahme dieses Vektor-Konstruktes transformiert. Unter Verwendung des Plasmid DNA Purification Kit (Macherey-Nagel, Deutschland) und des QlAprep SPIN Miniprep Kit (Qiagen, Deutschland) wurde die Plasmid-DNA aus einigen der Klone präpariert und zur Sequenzierung gegeben (AGOWA Sequencing Service GmbH, Deutschland). Sequenz-Analysen und Alignments wurden unter Verwendung der Software Vector NTI Suite 8 (Invitrogen, U.K.) durchgeführt (1). Die Analyse der Sekundärstruktur einiger Aptamere erfolgte mittels des im Internet verfügbaren Faltungsprogramms mfold, das auf einem Energie-Minimierungs-Algorithmus beruht.

BEISPIEL 4: Bindungstests.

Alle sequenzierten Aptamer-Klone wurden auf ihre individuelle Bindungsfähigkeit an Ethanolamin, immobilisiert an Tosylactivated Magnetic Beads, getestet. Für jeden Bindungstest wurde ein frisches Aliquot der präparierten Ethanolamin-modifizierten Magnetic Beads (1 × 107 Beads für jede Bindungsreaktion) zunächst 5× in Bindungspufferlösung (BB: 100 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.6, 2 mmol/L MgCl2, 5 mmol/L KCl, 1 mmol/L CaCl2, 0.02 Tween 20) gewaschen. Die Aptamer-ssDNA wurde vorbereitet, indem jeweils ca. 15 pmol davon in 500 &mgr;L BB für 5 min bei 90°C inkubiert und danach 15 min auf Eis und 5 min bei Raumtemperatur equilibriert wurden. Das vorbereitete Aptamer wurde mit dem gewaschenen Aliquot Ethanolamin-modifizierter Magnetic Beads für 30 min bei 21°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach der Bindungsreaktion wurden die ungebundenen Aptamere entfernt und der Bindungskomplex wurde 5× in jeweils 500 &mgr;l BB gewaschen. Die gebundenen Aptamere wurden in zwei Schritten bei 80°C in jeweils 100 &mgr;l BB unter Schütteln Hitze-eluiert und die Elutionslösungen zusammengeführt. Die DNA-Mengen in den drei Fraktionen der eingesetzten, ungebundenen und eluierten ssDNA wurden mittels Fluorometrie (Wallac Victor2V Multilabel Counter; PerkinElmer life sciences, Deutschland) bei folgenden Bedingungen gemessen: Excitation 485 nm/Emission 535 nm; time 1 s; CW-lamp energy 15000. Das Messvolumen war 100 &mgr;L/well in 96 well black Mikrotiterplatten (NUNC, Deutschland). Die Berechnung der ssDNA-Konzentration jeder Fraktion erfolgte unter Verwendung einer Kalibrierkurve.

BEISPIEL 5: Bestimmung der Dissoziationskonstante KD einzelner Aptamere.

Zur Bestimmung der Affinität ausgewählter Aptamere zu ihrem Target Ethanolamin wurden Bindungstests wie in Beispiel 4 beschrieben mit einer konstanten Menge Ethanolaminmodifizierter Beads (1 × 107 Beads), aber mit ansteigender Menge des eingesetzten Aptamer-Klons (zwischen 2 nmol/L und 70 nmol/L Fluorescein-markierte ssDNA) durchgeführt. Die Menge gebundener Aptamere auf den Beads wurde nach ihrer Elution von den Beads mittels Fluoreszenz-Messung bestimmt (unter der Annahme, dass die gesamte gebundene ssDNA nach Elution in Lösung vorliegt). Die Ergebnisse wurden in Sättigungskurven überführt und aus diesen die Dissoziationskonstanten KD mittels nichtlinearer Regressionsanalyse bestimmt. Die Dissoziationskonstante betrug 6 ± 3 nM für das Aptamer der SEQ ID NO: 2, 9 ± 5 nM für das Aptamer der SEQ ID NO: 4, 17 ± 4 nM für das Aptamer der SEQ ID NO: 12, 15 ± 4 nM für das Aptamer der SEQ ID NO: 13, 10 ± 2 nM für das Aptamer der SEQ ID NO: 14, 19 ± 7 nM für das Aptamer der SEQ ID NO: 15 sowie 2.5 ± 0.8 nM für das Aptamer der SEQ ID NO: 23.

BEISPIEL 6: Bestimmung der Spezifität einzelner Aptamere mittels Affinitäts-Elutions-Assays.

Ausgewählte Aptamere wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, das freie, nicht-immobilisierte Target Ethanolamin sowie die Ethanolamin-Derivate Di- und Triethanolamin binden zu können. 4-Amino-1-Butanol und 4-Amino-1-Hexanol wurden verwendet, um zu überprüfen, ob das C2-Grundgerüst erforderlich ist oder eine Kettenverlängerung einen Einfluss auf die Aptamerbindung hat. Ethanol wurde getestet, um die Notwendigkeit der Aminogruppe für die Bindung zu testen. Diethylamin und Triethylamin sollten zeigen, ob die Hydroxylgruppe für die Bindung erforderlich ist. Als Verbindungen mit einer ähnlichen Struktur wurden 2-(Methylamino)-Ethanol und 2-Phenoxylethylamin getestet. Des weiteren wurden Glycin, &bgr;-Alanin, ʟ-Lysin und Arginin als Aminosäuren und Moleküle mit einer zu Ethanolamin ähnlichen Struktur getestet. Phosphocolamin und Cytidin-5'-diphosphoethanolamin sind phosphorylierte Ethanolamin-Verbindungen, wie sie physiologisch vorkommen, und für die geprüft werden sollte, ob sie von den Aptameren erkannt werden. Weiterhin wurden die physiologisch relevanten Targets Serin und Cholin, die wie Ethanolamin als Kopfgruppen bei der chemischen Synthese der Phosphoglyceride fungieren, getestet. Alle diese Substanzen wurden im Vergleich zu Ethanolamin in Bindungstests eingesetzt, um näher zu charakterisieren, an welcher Stelle im Molekül die Aptamerbindung erfolgt.

Die Tests wurden als Affinitäts-Elutions-Tests wie folgt durchgeführt: Zunächst wurden die Aptamere wie beschrieben an Ethanolamin-modifizierte magnetische Beads gebunden, gefolgt von Waschschritten. Danach wurde der Aptamer-Bead-Komplex mit 500 &mgr;l BB, in dem 5 &mgr;l des freien Targets gelöst waren (10 mmol/L) 15 min bei 21°C inkubiert. Der Überstand, der das eluierte Aptamer enthielt, wurde mittels magnetischem Separationsstand abgetrennt. Die Beads wurden dann 3× mit je 200 &mgr;l BB gewaschen und alle Waschlösungen zusammengenommen. Danach wurden die auf den Beads verbliebenen Aptamere mittels Hitzebehandlung abgelöst. Die Aptamermengen jeder Fraktion (Affinitätselution, Waschlösungen, Hitzeelution) wurden mittels Fluoreszenzmessung und unter Verwendung einer Kalibrierkurve bestimmt.

Die Aptamerbindung erfolgte an Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, 4-Amino-1-Butanol, 4-Amino-1-Hexanol, Diethylamin, Triethylamin, 2-(Methylamino)-Ethanol, 2-Phenoxylethylamin, ʟ-Lysin und Arginin, während keine Aptamerbindung festzustellen war an Ethanol, Phosphocolamin (Phosphoethanolamin), Cytidin-5'-diphosphoethanolamin (Natriumsalz), Cholin(-chlorid), Serin, Glycin und &bgr;-Alanin.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.


Anspruch[de]
DNA-Aptamer, dadurch charakterisiert, dass es für Verbindungen, die die Ethylamin-Gruppe enthalten, spezifisch ist. DNA-Aptamer nach Anspruch 1, dadurch charakterisiert, dass es für Verbindungen der Formel (I): R1R2N-CR3R4-CH2-R5(I)oder Teilen davon spezifisch ist, wobei

R1, R2 ein Wasserstoffatom, -(CH2)nOH, eine Alkyl- oder Guanyl-Gruppe,

R3, R4 ein Wasserstoffatom, -(CH2)nOH oder eine Alkyl-Gruppe, und

R5 ein Wasserstoffatom, -(CH2)OH, 3-Carboxy-3-amino-propyl, 2-Carboxy-2-aminoethyl, eine Hydroxy-, Alkyl- oder Aryloxy-Gruppe sind,

wobei n = 1–6 ist.
Aptamer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es für Ethanolamin, 4-Amino-1-Butanol, 4-Amino-1-Hexanol, Diethanolamin, Triethanolamin, 2-Methylaminoethanol, 2-Phenoxyethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Lysin und Arginin spezifisch ist. Aptamer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es für Ethanolamin spezifisch ist. Aptamer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Affinität von 0.1 bis 500 nM hat, vorzugsweise 1 bis 30 nM. Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 29 umfasst oder Varianten, Mutanten, Teile der DNA-Sequenz oder zu 80% homologe Sequenzen, die die gleichen Eigenschaften besitzen, vorzugsweise eine DNA-Sequenz aus der Gruppe der DNA-Sequenzen der SEQ ID NOs: 26 bis 28. Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 30 umfasst oder Varianten, Mutanten, Teile der DNA-Sequenz oder zu 80% homologe Sequenzen, die die gleichen Eigenschaften besitzen, vorzugsweise eine DNA-Sequenz aus der Gruppe der DNA-Sequenzen der SEQ ID NOs: 01 bis 11. Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 31 umfasst oder Varianten, Mutanten, Teile der DNA-Sequenz oder zu 80% homologe Sequenzen, die die gleichen Eigenschaften besitzen, vorzugsweise eine DNA-Sequenz aus der Gruppe der DNA-Sequenzen der SEQ ID NOs: 12 bis 19. Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 20 umfasst oder Varianten, Mutanten, Teile der DNA-Sequenz oder zu 80% homologe Sequenzen, die die gleichen Eigenschaften besitzen. Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 32 umfasst oder Varianten, Mutanten, Teile der DNA-Sequenz oder zu 80% homologe Sequenzen, die die gleichen Eigenschaften besitzen, vorzugsweise eine DNA-Sequenz aus der Gruppe der DNA-Sequenzen der SEQ ID NOs: 21 bis 25. Aptamer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Phosphorothioat-DNA, LNA, PNA oder ein Spiegelmer ist. Verwendung des Aptamers nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Diagnose, Prophylaxe oder Therapie von Ethanolaminose, Schizophrenie und/oder neurodegenerativen Erkrankungen, vorzugsweise Alzheimer. Verwendung des Aptamers nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Aufreinigung und/oder zum Nachweis von Verbindungen, die die Ethylamin-Gruppe enthalten, vorzugsweise von Verbindungen der Formel (I). Verfahren zur Aufreinigung von Verbindungen, die die Ethylamin-Gruppe enthalten, vorzugsweise von Verbindungen der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe, die eine Ethylamin-Gruppe enthaltende Verbindung umfasst, mit mindestens einem Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 11 inkubiert wird, der Komplex aus Aptamer und Verbindung von der restlichen Probe und die Verbindung von dem Komplex abgetrennt wird. Verfahren zum Nachweis von Verbindungen, die die Ethylamin-Gruppe enthalten, vorzugsweise von Verbindungen der Formel (I), dadurch gekennzeichnet, dass die zu untersuchende Probe mit mindestens einem Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 11 inkubiert und ein Bindungsereignis zwischen dem Aptamer und der Verbindung nachgewiesen wird. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer oder die Verbindung mit einer Markierung versehen werden, vorzugsweise das Aptamer. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung durch Lumineszenz, UV/VIS-Farbgebung, enzymatisch, elektrochemisch oder radioaktiv nachgewiesen wird. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer an einer festen Phase immobilisiert wird, vorzugsweise über ein Spacer-Molekül. Kit umfassend mindestens ein Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 11. Kit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass signalgebende Substanzen oder Vorrichtungen enthalten sind, vorzugsweise Fluorophore, Chemilumineszenz-Cofaktoren, Enzymsubstrate, Feldeffekttransistoren oder markierte Antikörper. DNA-Sequenzen mit den SEQ ID NOs: 1 bis 25.






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