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Dokumentenidentifikation DE60306190T2 03.05.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001565479
Titel 2'-O-TRISUBSTITUIERTER-SILYLOXYMETHYL-RIBONUKLEOSID-DERIVAT UND VERFAHREN ZU SEINER HERSTELLUNG
Anmelder Novartis AG, Basel, CH
Erfinder NATT, Jean-Charles, Francois, CH-4147 Aesch, CH;
HUNZIKER, Jürg, CH-5000 Aarau, CH;
HALL, Jonathan, CH-4143 Dornach, CH;
MARTIN, Pierre, CH-4310 Rheinfelden, CH
Vertreter Spott, Weinmiller & Böhm, 80336 München
DE-Aktenzeichen 60306190
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, RO, SE, SI, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 21.11.2003
EP-Aktenzeichen 037800240
WO-Anmeldetag 21.11.2003
PCT-Aktenzeichen PCT/EP03/13113
WO-Veröffentlichungsnummer 2004049274
WO-Veröffentlichungsdatum 10.06.2004
EP-Offenlegungsdatum 24.08.2005
EP date of grant 14.06.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.05.2007
IPC-Hauptklasse C07H 19/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C07H 21/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07F 7/18(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Nukleinsäurechemie und betrifft Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Ribonukleosid-Derivaten mit neuen Schutzgruppen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind besonders angepasst für die automatisierte Herstellung von Oligoribonukleotiden.

Hintergrund der Erfindung

Die Anwendungen für synthetische Nukleinsäuren sind zahlreich und der Schlüssel für das Verständnis von biologischen Prozessen. Unter diesen Anwendungen ist die Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden für die spezielle Regulation von Proteinen nach unten (Down-Regulation) durch spezielle Hybridisation oder Hybridisierung in der Zelle des synthetischen Oligonukleotids zu einer mRNA als ein Antisense-Mechanismus bekannt und wurde ausführlich beschrieben (1). Erst vor kurzem wurde die RNS- oder RNA-Interferenz, eine Technik unter Verwendung von dsRNA bekannt als siRNA, erfolgreich verwendet, um die Translation von Säuger-mRNA in ihr Protein zu inhibieren oder hemmen (2). Die große Verheißung der RNA-Technologie erzeugte einen Bedarf an der Entwicklung von wirksamer und kostengünstiger Herstellung von synthetischen Oligoribonukleotiden.

Die Oligoribonukleotid-Synthese ist anspruchsvoller oder schwieriger als die Oligodeoxynukleotid-Synthese, hauptsächlich wegen der 2'-OH-Gruppe, die in Ribonukleinsäuren aber nicht in Deoxyribonukleinsäuren vorliegt. Die chemische Synthese von Oligoribonukleotiden basiert normalerweise auf einem geschützten Ribonukleosid-Derivat, das auf einer festen Phase immobilisiert ist, an das weitere geschützte Ribonukleotid-Derivate gekoppelt werden in aufeinanderfolgenden Stufen eines Synthesezyklus bis jeweils die gewünschte Länge der Kette erreicht ist. Um eine wirksame oder effiziente Synthese zu gewährleisten und um RNA-Abbau während des Herstellungsverfahrens zu vermeiden, sollte die Schutzgruppenstrategie für die 2'-OH-Gruppe perfekt orthogonal sein zu der anderer Schutzgruppen, und die Schutzgruppe sollte so spät wie möglich in dem Verfahren entfernt werden. Bisher wurden hauptsächlich die folgenden Typen an Schutzgruppen verwendet, um die 2'-OH-Gruppe zu schützen: Die 2'-O-TBDMS-Chemie ist die üblicherweise verwendete Schutzgruppe für die RNA-Synthese (3). Sie ist orthogonal zu anderen Schutzgruppen. Es wurde jedoch eine 2'-3'-Phosphorylwanderung während der Oligoribonukleotid-Synthese berichtet (4). Außerdem verringert eine sterische Hinderung der tert.-Butyldimethylsilylgruppe nahe am reaktiven Phosphoramidit beträchtlich die Kupplungswirksamkeit. Die letztere Beschränkung kann verringert werden, aber der Preis dafür sind längere Kupplungszeiten, die Verwendung eines höheren molaren Überschusses an Reagenzien und spezielle Phosphoramidit-Aktivatoren, wie 5-(Benzylmercapto)-1H-tetrazol zum Beispiel (5).

Die 2'-O-ACE wurde von Caruthers et al. (6) als Alternative zur TBDMS-Chemie beschrieben. Dort wird 2'-OH durch einen säurelabilen Orthoester geschützt. Im Vergleich zu TBDMS erlaubt die geringere Hinderung von dieser Schutzgruppe höhere Kupplungsraten. Die Säurelabilität des 2'-Orthoesters erfordert einen vorübergehenden nicht säurelabilen Schutz von 5'-OH. Dies wurde mit trisubstituierten Silylgruppen erreicht, die am Ende von jedem Kupplungszyklus durch eine Fluorid enthaltende Lösung entfernt werden. Demzufolge müssen Reagenzien für die Herstellung von 2'-O-ACE-Baueinheiten oder Building-Blocks speziell an einen größeren Maßstab angepasst werden. Eine solche Entfernung der Schutzgruppe an 5' kann in einigen Fällen problematisch sein: Es erfordert einen fest geschalteten oder zweckbestimmten Synthesizer, der gegenüber Fluoridionen beständig ist, und die Verwendung der üblicherweise verwendeten auf Kieselgel basierenden Trägern (wie Controlled Pore Glass) ist nicht möglich. Die 2'-O-TOM-Chemie wurde von Pitsch et al. (6) berichtet. Wie für die 2'-OTBDMS Schutzgruppenstrategie, wird die 2'-O-TOM-Schutzgruppe entfernt nach Behandlung mit Fluoridionen. Ursprünglich wurde sie entwickelt, um die Synthese von langer RNA zu ermöglichen, ohne die bei 2'-O-TBDMS beobachtete 2'-3'-Phosphorylwanderung. In diesem Fall kann aufgrund der Acetalnatur der Bindung zwischen Nukleosid und Schutzgruppe keine Wanderung der Schutzgruppe an eine andere Position in dem Ribonukleosiderivat, insbesondere zu der benachbarten 3'-Position, stattfinden. Eine solche Isomerisierung ist ein weithin bekanntes Problem bei der Synthese der herkömmlichen 2'-O-Silyl-substituierten RNA-Einheiten.

Eine weiterer wichtiger Vorteil dieser Schutzgruppe ist die geringere Hinderung der Schutzgruppe aufgrund des Acetalspacers zwischen 2'-Sauerstoff und der sperrigen Triisopropylsilylgruppe.

Sowohl 2'-O-TOM als auch 2'-O-ACE bieten Kupplungsausbeuten, die solche erreichen, die bei der Oligodeoxynukleotidsynthese beobachtet werden. Zufriedenstellende Kupplungsausbeuten sind auch erhältlich mit der 2'-O-TBDMS-Chemie aber zum Preis der Verwendung von unüblichen oder ungewöhnlichen Aktivatoren oder höheren molaren Überschüssen der Baueinheiten oder Building-Blocks. In allen Fällen tragen die genannten Baueinheiten zu einem großen Ausmaß zu den Herstellungskosten von Oligoribonukleotiden bei. Zweitens ist die nachsynthetische Verarbeitung von Oligoribonukleotiden anspruchsvoller im Vergleich zur Verarbeitung von Oligoribonukleotiden. Der letztere Gesichtspunkt kann von besonderer Wichtigkeit sein, wenn eine hohe Durchsatzanforderung erfüllt werden muss.

Es gibt einen Bedarf an verbesserten RNA-Baueinheiten, die leicht erschwinglich oder finanziell tragbar sind und eine leichtere nachsynthetische Verarbeitung erlauben.

Substituierte Siloxymethylgruppen wurden als Schutzgruppen von Hydroxylgruppen in der Vergangenheit verwendet (7,8). Die sterische Hinderung von Substituenen am Si-Atom moduliert die Stabilität und die Entfernungsbedingungen der Schutzgruppe. Zum Beispiel wurden Siloxymethyl enthaltende tertiäre Kohlenstoffe benachbart oder vicinal zu dem Si-Atom berichtet (7), in diesen Fällen waren die Ausbeuten zur Entfernung von Schutzgruppen suboptimal oder verbesserungsfähig im Vergleich zu solchen, die in der Regel bei einem TBDMS-Schutz beobachtet werden, und offensichtlich nicht geeignet für die Festphasenoligoribonukletid-Synthese.

Die vorliegende Erfindung stellt nun neue und verbesserte Gruppen zum Schutz an der 2'-OH-Position von Ribonukleosid-Derivaten bereit, die besonders geeignet sind für die automatisierte Oligoribonukleotid-Festphasen-Synthese. Ein neues Verfahren zur Herstellung dieser Baueinheiten oder Building-Blocks wird bereitgestellt. Schließlich wird die Verwendung dieser Baueinheiten oder Building-Blocks bei der RNA-Festphasensynthese offenbart.

Zusammenfassung der Erfindung

Unter einem Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung Ribonukleosid-Derivate der folgenden Formel: bereit, wobei

R1 für eine Base der Purin- oder Pyrimidin-Familie oder ein Derivat einer solchen Base oder einen beliebigen anderen Rest steht, der als Nukleobasensurrogat dient,

R2 für ein Proton oder ein substituiertes Derivat der Phosphonsäure steht,

R3 für ein Proton oder eine Schutzgruppe für das Sauerstoffatom in der 5'-Position steht,

R4, R5 und R6 unabhängig für Alkyl oder Aryl oder eine Kombination von Alkyl und Aryl oder ein Heteroatom stehen, R4, R5 und R6 auch cyclisch miteinander verbunden sein können; und wobei mindestens einer der R4-, R5- oder R6-Substituenten ein tertiäres C-Atom oder ein Heteroatom benachbart zu dem Si-Atom umfasst.

Unter einem bevorzugten Gesichtspunkt umfasst der Substituent, der das tertiäre C-Atom benachbart zu dem Si-Atom umfasst, 4 bis 24 C-Atome, besonders bevorzugt 5 bis 24 C-Atome, und ganz besonders bevorzugt 6 bis 24 C-Atome. Unter einem weiteren bevorzugten Gesichtpunkt steht der Substituent, der das tertiäre C-Atom benachbart zu dem Si-Atom umfasst, für einen Alkylsubstituenten, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus tert.-Butyl, tert.-Pentyl, tert.-Hexyl, tert.-Heptyl, tert.-Octyl, tert.-Nonyl, tert.-Decyl, tert.-Undecyl, tert.-Dodecyl. Unter einem noch weiteren bevorzugten Gesichtspunkt ist der Substituent, der das tertiäre C-Atom benachbart zu dem Si-Atom umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend 1,1-Dimethylethyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1,1-Dimethylpentyl, 1,1-Dimethylhexyl, Thexyl(1,1,2-Trimethylpropyl), 1,1,2-Trimethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpentyl, 1,1,2-Trimethylhexyl, 1,1,2,2-Tetramethylpropyl, 1,1,2,2-Tetramethylbutyl. Unter einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Substituenten der obigen Gruppen mindestens 5 C-Atome, besonders bevorzugt mindestens 6 C-Atome.

Unter einem verwandten Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung Ribonukleosid-Derivate bereit, wobei der Substituent benachbart zu dem Si-Atom ein substituiertes Heteroatom umfasst. Unter einem bevorzugten Gesichtspunkt umfasst der Substituent benachbart zu dem Si-Atom ein substituiertes zweiwertiges oder zweibindiges Heteroatom, unter einem noch weiter bevorzugten Gesichtspunkt steht dieser Substituent für Sauerstoff.

Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zur Herstellung eines Ribonukleosid-Derivats, wobei das Verfahren umfasst ein Umsetzen eine Nukleosids mit der folgenden Formel wobei R1 und R3 wie oben definiert sind, mit einem Silyloxymethylderivat der folgenden Formel wobei Y für eine geeignete Abgangsgruppe steht und wobei R4, R5 und R6 unabhängig für Alkyl oder Aryl oder eine Kombination von Alkyl und Aryl oder ein Heteroatom stehen, R4, R5 oder R6 auch cyclisch miteinander verbunden sein können. In einer bevorzugten Ausführungsform steht Y für Halogen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen R4, R5 und R6 zusammen zwischen 6 und 30 Kohlenstoffatome. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen R4, R5 und R6 mindestens ein substituiertes Heteroatom benachbart zu dem Si-Atom, das vorzugsweise für ein zweiwertiges oder zweibindiges Atom steht, besonders bevorzugt Sauerstoff. Das Ribonukleosid-Derivat kann zusätzlich substituiert sein an dem Sauerstoff in 3'-Position durch eine Gruppe, die ein Derivat der Phosphonsäure umfasst.

Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zur Herstellung eines Ribonukleosid-Derivats, wobei das Verfahren umfasst ein Umsetzen eines Ribonukleosid-Derivats mit der folgenden Formel nach einer elektrophilen Aktivierung mit einer Verbindung der Formel: wobei R1 wie oben definiert ist und R7 für eine Alkyl- oder Arylgruppe oder eine Alkylarylgruppe steht,

wobei R2 für eine Schutzgruppe steht,

wobei R3 für eine Schutzgruppe steht,

wobei R4, R5 und R6 wie oben definiert sind.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ribonukleosid-Derivat ferner an dem Sauerstoff in 3'-Position durch eine Gruppe substituiert, die ein Derivat der Phosphonsäure umfasst.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Abkürzungen:

  • TBDMS
    tert.-Butyldimethylsilyl
    ACE
    Bis[2-(acetyloxy)ethoxy]methyl
    TOM
    (Triisopropylsilyl)oxymethyl
    THEX
    [((1,1,2-Trimethylpropyl)dimethylsilyl)]oxymethyl
    DCA
    Dichloressigsäure
    dsRNA
    doppelsträngige RNA
    siRNA
    small interfering RNA

Die vorliegende Erfindung betrifft 2'-O-Silyloxymethylribonukleotid-Derivate zur Anwendung bei der chemischen Synthese von Ribonukleinsäuren, die eine D- oder L-Riboseeinheit umfassen, welche die folgende allgemeine Strukturformel aufweisen: wobei

R1 für eine Base der Purin- oder Pyrimidin-Familie oder ein Derivat einer solchen Base oder einen beliebigen anderen Rest steht, der als Nukleobasensurrogat dient, R2 für ein Proton oder ein substituiertes Derivat der Phosphonsäure steht, R3 für ein Proton oder eine Schutzgruppe für das Sauerstoffatom in der 5'-Position steht, und R4, R5 und R6 unabhängig für Alkyl- oder Arylgruppen oder eine Alkyl-Aryl-Gruppe stehen. R4, R5 und R6 können auch cyclisch miteinander verbunden sein.

Die Schutzgruppe R3 in der 5'-O-Position ist zum Beispiel eine Monomethoxytrityl- oder Dimethoxytritylgruppe oder eine andere geeignete Gruppe, die entfernt wird aus der wachsenden Sequenz während der Kettenbildung um so eine Bindungsposition freizugeben zur Kupplung der nächsten Einheit, die an die Kette addiert oder gebunden wird.

Die Basenkomponente R1 des Ribonukleosid-Derivats ist vorzugsweise eine Base der Purin- oder Pyrimidin-Familie, z.B. eine der fünf Nukleobasen Adenin, Cytosin, Thymin, Uracil, Guanin oder ein Derivat davon oder ein anderer Rest, der als Nukleobasensurrogat dient. Sie kann geschützt sein durch einen Acylsubstituenten, der entfernt werden kann nach der Bildung der Kette.

In der 3'-O-Position steht R2 für ein Derivat der Phosphonsäure, wie eine N,N- und O-substituierte Phosphoramiditgruppe, wobei die N-Substituenten für Alkyl- oder Arylgruppen stehen, die zusätzlich substituiert sein können und/oder cyclisch miteinander verbunden sein können. Durch Aktivierung des Stickstoffs der disubstituierten Aminogruppe wird das Phosphorzentrum aktiviert zur Kupplung der Einheit an eine wachsende Kette.

Diese Erfindung stellt nun neue und vorteilhafte 2'-O-Silyloxymethylschutzgruppen bereit, wobei R4, R5 oder R6 unabhängig für einen Alkyl- oder Aryl-Substituenten oder einen Alkyl-Aryl- oder Aryl-Alkyl- oder einen subsituierten Heteroatom-Subsituenten steht, und wobei mindestens einer der R4, R5 oder R6-Subsituenten ein Heteroatom oder ein tertiäres C-Atom umfasst, wie dies dargestellt werden kann durch die folgende Formel wobei R', R'' und R''' für Alkyl- oder Aryl- oder einen Alkyl-Aryl-Subsituenten oder Aryl-Alkyl oder ein substituiertes Heteroatom stehen, und wobei R', R'' und R''' nicht für H stehen. R', R'' und R''' können gleich oder verschieden sein, bevorzugt sind Substituenten, die 1 bis 12 C-Atome umfassen, vorzugsweise 1 bis 6 C-Atome und besonders bevorzugt sind 1 bis 4 C-Atome. R', R'' und R''' können auch cyclisch miteinander verbunden sein, z.B. kann R' cyclisch mit R'' oder R''' verbunden sein, oder R'' kann cyclisch an R''' gebunden sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind zwei der Substituenten identisch und umfassen 1 bis 6 C-Atome, vorzugsweise 1 bis 4 C-Atome. Der dritte Substituent umfasst vorzugsweise mindestens 3 C-Atome, bevorzugt sind 3 bis 12 C-Atome, besonders bevorzugt sind 3 bis 6 C-Atome.

Daher steht in einer Ausführungsform mindestens einer der Substituenten R4, R5 und/oder R6 für (C4 bis C24)-Tertiäralkyl und/oder Aryl, vorzugsweise (C5 bis C18)-Tertiäralkyl und/oder Aryl, besonders bevorzugt (C6 bis C12)-Tertiäralkyl und/oder Aryl, wobei das tertiäre C-Atom benachbart oder vicinal zu dem Si-Atom ist. Ohne die Absicht an diese Gruppen beschränkt zu sein, können Beispiele solcher Substituenten z.B. tert.-Butyl, tert.-Pentyl, tert.-Hexyl, tert.-Heptyl, tert.-Octyl, tert.-Nonyl, tert.-Decyl, tert.-Undecyl, tert.-Dodecyl, Thexyl (1,1,2-Trimethylpropyl), 1,1,2-Trimethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpentyl, 1,1,2-Trimethylhexyl, 1,1,2,2-Tetramethylpropyl, 1,1,2,2-Tetramethylbutyl umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform steht der Substituent für tert.-Pentyl oder höher, bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform steht der Substituent für tert.-Hexyl oder höher. Besonders bevorzugte Beispiele umfassen z.B. 1,1-Dimethylethyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1,1-Dimethylpentyl, 1,1-Dimethylhexyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,1,2-Trimethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpentyl, 1,1,2-Trimethylhexyl, 1,1,2,2-Tetramethylpropyl, 1,1,2,2-Tetramethylbutyl. Bei einer weiteren Ausführungsform umfassen R4, R5 und/oder R6 ein Heteroatom.

Der/die Substituent(en), der/die kein tertiäres C-Atom umfassen, können identische oder verschiedene Substituenten sein. Diese Substituenten sind vorzugsweise Alkyl- oder Aryl-Substituenten oder Alkyl-Aryl-Substituenten. Bevorzugt sind Substituenten, die 1 bis 12 C-Atome umfassen, vorzugsweise 1 bis 8 C-Atome, besonders bevorzugt 1 bis 4 C-Atome. Ohne die Absicht, auf diese Gruppen beschränkt zu sein, können Beispiele solcher Substituenten z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, i-Propyl, sek.-Butyl, Isobutyl, sek.-Pentyl umfassen.

Bei einer weiteren Ausführungsform umfassen R4, R5 und/oder R6 ein substituiertes Heteroatom wie z.B. Silicium, Germanium, Zinn, Blei, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, wie z.B. dargestellt werden kann durch ein „vierwertiges" oder „vierbindiges" Heteroatom gemäß der folgenden Formel: wobei X für Si oder Ge, Sn oder Pb steht und wobei R', R'' und R''' definiert sind wie für die Formel 2, und R4 und R6 wie oben definiert sind. Beliebige der Substituenten R4, R5 oder R6 können das Heteroatom benachbart zu dem Si-Atom umfassen, bevorzugt nur eins wie veranschaulicht in der Formel 3. Für „zweiwertige" Heteroatome, wie Sauerstoff, oder für dreiwertige Heteroatome, wie Stickstoff, kann die Formel 3 entsprechend angepasst werden, wie ein Fachmann leicht erkennen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform steht X für Sauerstoff.

Die Verbindung kann durch Verfahren hergestellt werden, die in der Technik bekannt sind, wie die metallorganische Route. Diese Route oder dieser Weg wird z.B. in der WO 99/09044 (6) beschrieben. Die Umsetzung oder Reaktion 4 → 5a/5b → 6 zeigt ein Beispiel der Herstellung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung über die metallorganische Route. Kurz zusammengefasst wird ein Ribonukleosid, das an dem 5'-O geschützt wird, umgesetzt mit z.B. Chlormethyl[dimethyl-(1,1,2-trimethylpropyl)silyl]ether (oder THEX-Cl) in Gegenwart eines geeigneten metallorganischen Salzes, wie z.B. Dibutylzinndichlorid oder Dibutylzinnoxid. THEX-Cl selbst wird in einer Art und Weise hergestellt, die ähnlich ist zu TOM-Cl gemäß einem veröffentlichten Verfahren (7). Im Gegensatz zu TOM-Cl benötigt die Herstellung von THEX-Cl jedoch keine Enddestillationsstufe des Reagenzes vor der Umsetzung mit dem Ribonukleosid, was eine signifikante Vereinfachung darstellt. Bei der Umsetzung von THEX-Cl mit einem 5'-O geschützten Ribonukleosid wird ein Gemisch von 2'- und 3'-geschützten Ribonukleosiden erhalten, wovon das 2'-substituierte Ribonukleosid z.B. durch chromatographische Maßnahmen gereinigt wird. In einer nachfolgenden Stufe wird die 3'-OH-Gruppe der gereinigten Verbindung 5a in das Phosphoramidit 6 gemäß den in der Technik bekannten Verfahren überführt (N.D. Sinha et al., Tetrahedron Lett. 1983, 24, 5843; N.D. Sinha et al., Nucleic Acid Res. 1984, 12, 4539).

Dieses Verfahren erfordert die Verwendung von substituierten Silyloxymethylethern, wobei Substituenten Alkyl, Aryl oder Arylalkylgruppen enthalten und die cyclisch miteinander verbunden sein können. Bei einer weiteren Ausführungsform ist dieses Verfahren anwendbar auf Silyloxymethylether, wobei mindestens einer der Substituenten mindestens ein substituiertes Heteroatom enthält, wie z.B. Silicium, Germanium, Zinn, Blei, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel.

Die Umsetzung kann in Lösung oder auf einer festen Phase oder durch Verwendung Polymerunterstützer oder Polymer-getragener Reagenzien ausgeführt werden. Das Lösemittel kann ein Kohlenwasserstofflösemittel, etherisches Lösemittel, Nitrillösemittel, chloriertes Lösemittel, heterocyclisches Lösemittel, Sulfoxidlösemittel, etc. sein. Spezielle Beispiele von geeigneten Lösemitteln schließen Pyridin, N,N-Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Dichlorethan und Methylenchlorid ein. Vorzugsweise wird Dichlorethan verwendet.

Obwohl die Reaktion bei Raumtemperatur ausgeführt werden kann, kann sie auch bei einer Temperatur im Bereich vom 0 bis 150°C, vorzugsweise bei 10 bis 100°C, ausgeführt werden.

Unter einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung werden die Verbindungen der Erfindung durch ein neues und überlegenes Verfahren hergestellt, wie es durch die Reaktion 7 → 8 → 9 → 10 → 6 veranschaulicht wird.

Dieses Verfahren erlaubt die selektive Einführung von 2'-OH-Schutzgruppen über zuerst das Einführen einer 2'-OH-Alkylthiomethyl-, Arylthiomethyl-, Alkylarylthiomethyl- oder Arylalkylthiomethylgruppe. Es vermeidet die unselektive Stufe, die bei der metallorganischen Route beschrieben ist. Dieses neue Verfahren ist im Allgemeinen anwendbar für die Einführung von Oxymethylderivaten selektiv an die 2'-OH-Gruppe von Ribonukleosiden und ist nicht beschränkt auf die Einführung von Schutzgruppen wie oben beschrieben. Die Verfahren zur Herstellung von geschützten Ribonukleotiden, die zur Zeit in der Technik bekannt sind, wie die metallorganische Route, sind nicht 2'-3'-selektiv wie die Einführung der Schutzgruppe. Dieses Verfahren erlaubt die selektive Einführung der Methylthiomethylgruppe an der 2'-Position und vermeidet daher eine unselektive Stufe spät in dem Syntheseschema.

Bei dieser neuen Route oder diesem neuen Reaktionsweg wird ein 2'-O-Alkylthiomethyl-Ribonukleosid, wie durch die folgende Formel dargestellt werden kann wobei R7 für Alkyl oder Aryl oder eine Kombination von Alkyl und Aryl steht, mit einem Silanol der allgemeinen Formel HOSiR4R5R6 umgesetzt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform steht R7 für ein (C1 bis C20)-, besonders bevorzugt für ein (C1 bis C10)-Alkyl und/oder Aryl. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform steht R7 z.B. für Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Isopropyl, sek.-Butyl, Isobutyl, sek.-Pentyl. Die Substituenten R4, R5 und R6 des Silanols sind identische oder verschiedene Alkyl- oder Aryl- oder eine Kombination von Alkyl- und Aryl-Substituenten oder substituierte Heteroatome und die auch cyclisch miteinander verbunden sein können. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die drei Substituenten zusammen zwischen jeweils 3 und 30 Kohlenstoffatome.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Verbindung 11 mit einem Silanol der allgemeinen Formel HOSiR4R5R6 mit den Substituenten R4, R5, R6, wie oben definiert, unter geeigneten Bedingungen, die in der Technik bekannt sind, umgesetzt. Diese umfassen ein elektrophil aktivierendes Reagenz oder eine Reagenzkombination, wie, ohne darauf beschränkt zu sein, z.B. N-Halogensuccinimide und eine katalytische Menge einer Säure. Die Umsetzung oder Reaktion kann in Lösung oder auf einer feste Phase oder unter Verwendung von Polymer-gestützten Reagenzien ausgeführt werden. Das Lösemittel kann ein Kohlenwasserstofflösemittel, etherisches Lösemittel, Nitrillösemittel, chloriertes Lösemittel, heterocyclisches Lösemittel, Sulfoxidlösemittel etc. sein. Spezielle Beispiele von geeigneten Lösemitteln schließen Pyridin, N,N-Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril, Dichlorethan und Methylenchlorid ein. Vorzugsweise wird Dichlormethan verwendet. Obwohl die Reaktion bei Raumtemperatur ausgeführt werden kann, kann sie auch bei einer Temperatur von –78°C bis 100°C, vorzugsweise bei 0 bis 50°C, ausgeführt werden.

Der Alkylthiomethyl-Substituent an der 2'-OH-Gruppe umfasst vorzugsweise eine (C1 bis C12)-Alkyl- und/oder Aryl-Gruppe, vorzugsweise eine (C1 bis C6)-Alkyl- und/oder Aryl-Gruppe. Beispiele von bevorzugten Substituenten umfassen Methylthiomethyl, Ethylthiomethyl, Propylthiomethyl, Isopropylthiomethyl oder Butylthiomethyl.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne den Schutzbereich davon in irgendeiner Weise zu beschränken.

Beispiele 1. Herstellung von THEX-Baueinheiten über eine metallorganische Route

Das Schema 1 zeigt das Syntheseschema zur Einführung der THEX-Schutzgruppe an 5'-O-DMTr-Uridin und die folgende Phosphitylierung.

Herstellung von (1,1,2-Trimethylpropyl)dimethylsilyloxymethylchlorid (THEX-Cl)

Eine Suspension von 11,1 ml (0,15 mol) Ethanthiol und 4,5 g (0,15 mol) Paraformaldehyd wurde mit zwei Tropfen NaOMe/MeOH (30 %) behandelt und 1 h lang bei 40°C gerührt. Nach einem Kühlen wurden 150 ml CH2Cl2 und 22,66 g (0,333 mol) Imidazol zugegeben. Nach 10 min wurden tropfenweise 32,66 g (0,167 mol) (1,1,2-Trimethylpropyl)dimethylsilylchlorid zugegeben. Die erhaltene Suspension wurde bei Raumtemperatur 24 h lang gerührt und mit 300 ml n-Hexan verdünnt. Nach Zugabe von 200 ml 2M NaH2PO4-Lösung, Rühren (15 min) und Phasentrennung, wurde die organische Phase über Na2SO4 getrocknet und verdampft. Der Rückstand wurde in 100 ml CH2Cl2 gelöst, tropfenweise mit 12,3 ml (20,4 g, 0,152 mol) Sulfurylchlorid in 50 ml CH2Cl2 behandelt. Nach 1 h wurde das Gemisch verdampft. Das Produkt wurde als Wachs erhalten (31,5 g).

1H NMR (400 MHz, CDCl3): 0,5 (s, 6H, SiMe2); 0,65 (12H, CH3); 1,40 (sept, 1H, CH); 5,43 (s, 2H, CH2).

Herstellung von 1-[5'-O-(4,4-Dimethoxytrityl)-2'-O-[((1,1,2-trimethylpropyl)dimethylsilyl)]oxymethyl-beta-D-ribofuranosyl]uracil (5a)

Eine Lösung von 9,5 g (17,4 mmol) 5'-O-dimethoxytrityliertes Uridin (1) in 200 ml 1,2-Dichlorethan wurde mit 11,23 g (87 mmol) Hünig-Base und dann mit 5,81 g (19,2 mmol) Dibutylzinndichlorid behandelt. Nach 30 min wurde das Gemisch auf 80°C erwärmt, mit 4,2 g (22,6 mmol) (1,1,2-Trimethylpropyl)dimethylsilyloxymethylchlorid (THEX-Cl) in 50 ml Dichlorethan behandelt und 2 h bei 80°C gerührt. Nach einem Kühlen wurde das Gemisch mit 400 ml CH2Cl2 verdünnt, und 350 ml wässrige gesättigte NaHCO3-Lösung wurden zugegeben. Nach 30 min Rühren wurden die Phasen getrennt, und die organische Phase wurde verdampft. Der Rückstand wurde an Kieselgel chromatographiert unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (3:1) enthaltend 0,1 % N-Methylmorpholin. Das Produkt wurde als fester Schaum (4,52 g) erhalten.

1H NMR (400 MHz, CDCl3): 0,1 (s, 6H, CH3); 0,6-0,8 (s und d, 12H, CH3); 1,45 (m, 1H, CH); 3,15 (d, 2H, CH2); 3,64 (s, 6H, OCH3); 3,85 (q, 2H, CH2); 4,05 (m, 1H, CH); 4,15 (m, 1H, CH); 4,80 (q, 2H, CH2); 5,12 (d, 1H, OH); 5,30 (q, 1H, CH); 5,78 (d, 1H; CH); 6,8-5,3 (m, 13H); 7,6 (d, 1H).

Herstellung von 1-[5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-2'-O-[((1,1,2-trimethylpropyl)-dimethylsilyl)]-oxymethyl-beta-D-ribofuranosyl]-uracil-3'-(2-cyanoethyldiisopropyl)phosphoramidit (6)

Eine Lösung von 4,0 g (5,56 mmol) geschütztem Uridin (2), 1,14 g (6,68 mmol) Diisopropylaminotetrazolid und 2,01 g (6,68 mmol) Bis(N,N-diisopropylamino)-2-cyanoethoxyphosphin in 150 ml CH2Cl2 wurden 24 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit 100 ml CH2Cl2 verdünnt und mit zweimal mit 50 ml wässriger gesättigter NaHCO3 Lösung gewaschen. Die getrocknete (Na2SO4) organische Phase wurde verdampft, und der Rückstand wurde einer Säulenchromatographie (Ethylacetat/Hexan 3:2 mit zusätzlich 0,1 % N-Methylmorpholin) unterworfen. Das Produkt wurde als fester Schaum (4,12 g) erhalten.

31P-NMR (400 MHz, CDCl3): 151,183 (s) und 151,537 (s).

2. Herstellung von THEX Baueinheiten über 2'-O-Methylthiomethyl-Route 3',5'-O-Diacetyl-2'-O-methylthiomethyluridin (8)

Eine Lösung von 4,53 g (14,8 mmol) 2'-O-Methylthiomethyluridin 7 (8) in 50 ml Pyridin wurde mit 3,04 g (29,7 mmol) Ac2O behandelt. Nach 24 h Rühren wurde die Lösung verdampft. Der Rückstand wurde in 40 ml EtOAc gelöst, mit Wasser gewaschen und mit Na2SO4 getrocknet. Nach Verdampfung wurde die reine Verbindung gemäß der Überschrift erhalten (5,05 g).

3',5'-O-Diacetyl-2'-O-[((1,1,2-trimethylpropyl)-dimethylsilyl)-oxymethyl]-uridin (9)

0,33 g (1,47 mmol) N-Iodsuccinimid in 3 ml THF wurden zugegeben zu einer Lösung von 0,5 g (1,287 mmol) 8, 0,978 g (6,1 mmol) (1,1,2-Trimethylpropyl)dimethylsilanol, 10 ml CH2Cl2 und 1 Tropfen MeOSO3H. Nach 2 h Rühren wurden 2 ml NaHSO3 (37 %) zugegeben, dann 100 ml CH2Cl2. Die organische Phase wurde getrennt und mit Na2SO4 getrocknet. Nach Filtration wird die Lösung verdampft: 552 mg reine Verbindung gemäß der Überschrift.

2'-O-[((1,1,2-Trimethylpropyl)dimethylsilyl)oxymethyl]uridin (10)

Eine Lösung von 187 mg (0,37 mmol) 9, 20 ml MeOH und 0,135 ml (0,74 mmol) NaOMe/MeOH (30 %) wurde 30 min bei 0°C gerührt. Nach Verdampfung wurde der Rückstand durch eine kleine Kieselgelsäule (EtOAc/MeOH 4:1) filtriert: 140 mg 10 als Pulver.

3. Verfahren zur Einführung von 6 in Oligodeoxynukleotid durch Phosphoramidit-Chemie und schnelle Entfernung der Schutzgruppe davon

Die Oligonukleotid-Synthese wurde typischerweise durchgeführt auf einem ABI394 autmatisierten DNA-Synthesizer (Applied Biosystems). DNA-Phosphoramidite, THEX-geschütztes Uridinphosphoramidit (6) oder TOM-geschütztes Uridinphosphoramidit (Xeragon, Inc.) wurden in trockenem Acetonitril mit einer 5 % Gewicht/Volumen (w/v) Konzentration gelöst; eine Kupplung wurde durchgeführt durch Aktivierung von Phosphoramiditen unter Verwendung einer 0,2 M Lösung von Benzimidazoliumtriflat (9) in Acetonitril. Die Kupplungszeiten betrugen zwischen 1 bis 5 min. Eine erste Knüpfung einer Kappe oder Schutzgruppe an das Kopfende (capping) wurde durchgeführt unter Verwendung von Standard-Schutzgruppen- oder -Capping-Reagenzien. Eine Oxidation wurde durchgeführt unter Verwendung von 0,1 M Iodlösung in THF/Wasser/Pyridin (1:1:1). Eine zweite Knüpfung einer Kappe oder Kopfschutzgruppe (Capping) wurde nach der Oxidation durchgeführt. Eine Detritylierung vor der nächsten Kupplung wurde mit 2 % Dichloressigsäure in Dichlorethan bewirkt.

Nach Vervollständigung der Oligonukleotidkettenverlängerung wurde der feste Träger in ein Eppendorf-Rohr übertragen.

Wenn Oligonukleotide mit THEX-geschütztem Uridinphosphoramidit (6) hergestellt wurden, wurden die Oligonukleotide von dem Träger gespalten und wie folgt die Schutzgruppen entfernt:

  • 1. 32 % wässriger Ammoniak/EtOH 3:1 (250 &mgr;l für 0,2 &mgr;mol-Maßstab), Raumtemperatur, 2 h Lyophilisation bis zur Trockne.
  • 2. 1M Tetrabutylammoniumfluorid in THF (250 &mgr;l für 0,2 &mgr;mol-Maßstab), 30 min bei Raumtemperatur.
  • 3. 1M Tris·HCl, pH = 7,4 (250 &mgr;l für 0,2 &mgr;mol-Maßstab).

Wenn Oligonukleotide mit TOM-geschütztem Uridinphosphoramidit hergestellt wurden, wurden die Oligonukleotide von dem Träger gespalten und die Schutzgruppen wie folgt entfernt:

  • 1. 32 % wässriger Ammoniak/EtOH 3:1 (250 &mgr;l für 0,2 &mgr;mol-Maßstab), Raumtemperatur, 2 h Lyophilisation bis zur Trockne.
  • 2. 1M Tetrabutylammoniumfluorid in THF (250 &mgr;l für 0,2 &mgr;mol-Maßstab), 6 min bei Raumtemperatur.
  • 3. 1M Tris·HCl, pH = 7,4 (250 &mgr;l für 0,2 &mgr;mol-Maßstab).

Die erhaltenen rohen Lösungen wurden durch Kapillargelelektrophorese analysiert.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengefasst.

Wie in der Tabelle 1 und den 1 bis 4 gezeigt ist, sind die Qualitäten des rohen Materials, das durch THEX-geschütztes Uridinphosphoramidit 6 und TOM-geschütztes Uridinphosphoramidit erhalten wurde, sehr ähnlich. Die Verwendung der 2'-O-THEX-Schutzgruppenstrategie erlaubt die Verringerung der 2'-Entfernung der Schutzgruppe von 6 h bei 35 °C (wie berichtet in der Literatur Nr. 6) auf 30 min bei Raumtemperatur.

Literatur:

  • 1. A. De Mesmaeker, R. Haener, P. Martin, H.E. Moser, Acc. Chem, Res. 28 (1995) 366 und Frank C. Bennett, Lex M. Cowsert, Curr. Opin. Mol. Ther. 1, (1999), 359.
  • 2. Sayda M. Elbashir, Jens Harborth, Winfried Lendeckel, Abdullah Yalcin, Klaus Weber, Thomas Tuschl, Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature (London, Vereinigtes Königreich) (2001), 411 (6836), 494-498.
  • 3. N. Usman, K.K. Ogilvie; M.Y. Jiang, R.J. Cedergren, The automated chemical synthesis of long oligoribonucleotides using 2'-O-silylated ribonucleoside 3'-O-phosphoramidites on a controlledpore glass support: synthesis of a 43-nucleotide sequence similar to the 3'-half molecule of an Escherichia coli formylmethionine tRNA J. Am. Chem. Soc. (1987), 109(25), 7845-54.
  • 4. Michael A. Morgan, Sergei A. Kazakov, Sidney M. Hecht, Phosphoryl migration during the chemical synthesis of RNA. Nucleic Acids Research (1995), 23(19), 3949-53.
  • 5. Rüdiger Welz, Sabine Müller, 5-(Benzylmercapto)-1H-tetrazole as activator for 2'-O-TBDMS phosphoramidite building blocks in RNA synthesis. Tetrahedron Letters (2002), 43(5), 795-797.
  • 6. Stefan Pitsch, Patrick A. Weiss, Luzi Jenny, Alfred Stultz, Xiaolin Wu, Reliable chemical synthesis of oligoribonucleotides (RNA) with 2'-O-[(triisopropylsilyl)oxy]methyl(2'-O-tom)-protected phosphoramidites. Helvetica Chimica Acta (2001), 84(12), 3773-3795.
  • 7. Lise Lotte Gundersen, Tore Benneche, Kjell Undheim, Chloromethoxysilanes as protecting reagents for sterically hindered alcohols. Acta Chem. Scand. (1989), 43(7), 706-9.
  • 8. Russian J. Bioorg. Chem. 2000, 26, 327-333.
  • 9. Yoshihiro Hayakawa, Masanori Kataoka, Ryoji Noyori, Benzimidazolium Triflate as an Efficient Promoter for Nucleotide Synthesis via the Phosphoramidite Method. Journal of Organic Chemistry (1996), 61(23), 7996-7997.


Anspruch[de]
Ribonukleosid-Derivat der folgenden Formel: wobei

R1 für eine Base der Purin- oder Pyrimidin-Familie oder ein Derivat einer solchen Base oder einen beliebigen anderen Rest steht, der als Nukleobasensurrogat dient,

R2 für ein Proton oder ein substituiertes Derivat der Phosphonsäure steht,

R3 für ein Proton oder eine Schutzgruppe für das Sauerstoffatom in der 5'-Position steht,

R4, R5 und R6 unabhängig für Alkyl oder Aryl oder eine Kombination von Alkyl und Aryl oder ein Heteroatom stehen, R4, R5 und R6 auch cyclisch miteinander verbunden sein können; und

wobei mindestens einer der R4-, R5- oder R6-Substituenten ein tertiäres C-Atom oder ein Heteroatom benachbart zu dem Si-Atom umfasst.
Ribonukleosid-Derivat nach Anspruch 1, wobei der Substituent, der das tertiäre C-Atom benachbart zu dem Si-Atom umfasst, 4 bis 24 C-Atome umfasst. Ribonukleosid-Derivat nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Substituent, der das tertiäre C-Atom benachbart zu dem Si-Atom umfasst, für einen Alkylsubstituenten steht, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus tert.-Butyl, tert.-Pentyl, tert.-Hexyl, tert.-Heptyl, tert.-Octyl, tert.-Nonyl, tert.-Decyl, tert.-Undecyl, tert.-Dodecyl. Ribonukleosid-Derivat nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei der Substituent, der das tertiäre C-Atom benachbart zu dem Si-Atom umfasst, ausgewählt ist aus der Gruppe von 1,1-Dimethylethyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1,1-Dimethylpentyl, 1,1-Dimethylhexyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,1,2-Trimethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpentyl, 1,1,2-Trimethylhexyl, 1,1,2,2-Tetramethylpropyl, 1,1,2,2-Tetramethylbutyl. Ribonukleosid-Derivat nach Anspruch 1, wobei der Substituent benachbart zu dem Si-Atom ein substituiertes Heteroatom umfasst. Ribonukleosid-Derivat nach Anspruch 5, wobei der Substituent benachbart zu dem Si-Atom ein substituiertes zweiwertiges Heteroatom umfasst. Ribonukleosid-Derivat nach Anspruch 6, wobei das Heteroatom für Sauerstoff steht. Verfahren zur Herstellung eines Ribonukleosid-Derivats nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfasst ein Umsetzen eine Nukleosids mit der folgenden Formel wobei R1 und R3 wie in Anspruch 1 definiert sind, mit einem Silyloxymethylderivat der folgenden Formel wobei Y für eine geeignete Abgangsgruppe steht und wobei R4, R5 und R6 unabhängig für Alkyl oder Aryl oder eine Kombination von Alkyl und Aryl oder ein Heteroatom stehen, R4, R5 oder R6 auch cyclisch miteinander verbunden sein können. Verfahren nach Anspruch 8, wobei Y für ein Halogen steht. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei R4, R5 und R6 zusammen zwischen 3 und 30 Kohlenstoffatome umfassen. Verfahren nach den Ansprüchen 8 oder 9, wobei R4, R5 oder R6 mindestens ein substituiertes Heteroatom benachbart zu dem Si-Atom umfassen. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Heteroatom für ein zweiwertiges Atom steht. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Heteroatom für Sauerstoff steht. Verfahren nach Anspruch 11, 12 oder 13, wobei das Ribonukleosid-Derivat zusätzlich substituiert ist an dem Sauerstoff in 3'-Position durch eine Gruppe, die ein Derivat der Phosphonsäure umfasst. Verfahren zur Herstellung eines Ribonukleosid-Derivats, wobei das Verfahren umfasst ein Umsetzen eines Ribonukleosid-Derivats mit der folgenden Formel nach einer elektrophilen Aktivierung mit einer Verbindung der Formel: wobei R1 wie in Anspruch 1 definiert ist und R1 für eine Alkyl- oder Arylgruppe oder eine Alkylarylgruppe steht,

wobei R2 für eine Schutzgruppe steht,

wobei R3 für eine Schutzgruppe steht,

wobei R4, R5 und R6 für identische oder verschiedene Alkyl- oder Aryl- oder eine Kombination von Alkyl- und Aryl-Substituenten stehen, die zusätzlich substituiert sein können durch Heteroatome und die auch cyclisch miteinander verbunden sein können.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei R4, R5 und R6 wie in den Ansprüchen 1 bis 7 definiert sind. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Ribonukleosid-Derivat zuzsätzlich an den Sauerstoff in 3'-Position substituiert ist durch eine Gruppe, die ein Derivat der Phosphonsäure umfasst.






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