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Dokumentenidentifikation DE69834633T2 03.05.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000975235
Titel OLIGOSACCHARIDE ENTHALTENDE ERNÄHRUNGSZUSAMMENSETZUNGEN
Anmelder Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill., US
Erfinder PRIETO, A., Pedro, West Worthington, OH 43235, US;
KIRCHNER, J., Stephen, Westerville, OH 43081, US;
ERNEY, M., Renee, Columbus, OH 43214, US
Vertreter Schieber · Farago, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69834633
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 30.03.1998
EP-Aktenzeichen 989121181
WO-Anmeldetag 30.03.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/US98/06216
WO-Veröffentlichungsnummer 1998043494
WO-Veröffentlichungsdatum 08.10.1998
EP-Offenlegungsdatum 02.02.2000
EP date of grant 24.05.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.05.2007
IPC-Hauptklasse A23L 1/09(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A23L 1/304(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A23L 1/302(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A23C 9/20(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen die Zusammensetzung aus synthetischen Ernährungsprodukten, die Oligosaccharide von menschlicher Milch enthalten. Genauer enthält das synthetische Ernährungsprodukt mindestens eines der folgenden Oligosaccharide: 3-Fucosyllactose, Lacto-N-fucopentaose III, Lacto-N-fucopentaose II, Difucosyllactose, 2'-Fucosyllactose, Lacto-N-fucopentaose I, Lacto-N-neotetraose oder Lacto-N-fucopentaoase V.

Hintergrund der Erfindung

Es ist wohl bekannt, daß menschliche Milch mehr als 100 unterschiedliche Oligosaccharide enthält, von denen einige genetisch bestimmt sind. Leider haben es die strukturellen Ähnlichkeiten von vielen dieser Kohlenhydrate schwierig gemacht, viele dieser Oligosaccharide zu isolieren, zu identifizieren und zu quantifizieren. Die meisten der veröffentlichten Arbeiten über diese Oligosaccharide haben diese Verbindungen als Klassen untersucht anstatt als einzelne Oligosaccharide.

Vorausgegangene Arbeiten haben gezeigt, daß bestimmte Oligosaccharide biologisch nützlich sein können. Zum Beispiel wurde gezeigt, daß Oligosaccharide, die N-Acetylglucosamin (GlcNAc) enthalten, das Wachstum von Lactobacillus bifidus Var pennsylvanicus stimulieren, welches Kleinkinder vor gastrointestinalen Infektionen schützt (Coppa, G., et al., Pediatrics 91:3 (1993) 637–641. Andere Berichte zeigen an, daß menschliche Milch-Oligosaccharide das Wachstum des nützlichen Bakteriums Bifidobacterium bifidum fördern, von dem angenommen wird, daß es in die gesunde Entwicklung von Kleinkindern involviert ist (Thurl, S., et al., Journal of Chromatography 568 (1991) 291–300). In einer Studie verhinderte menschliche Milch die Anheftung von Streptococcus pneumoniae und Haemophilus influenzae (Andersson, B., et al., J. Infect. Dis. 153 (1986) 232–237). Diese Studie bewies weiter, daß diese Verminderung der Anheftung "hauptsächlich aufgrund von anderen Komponenten als den spezifischen Antikörpern" war, die in der Milch vorhanden sind, und durch die "Rezeptor-aktiven Oligosacchariddeterminanten auf Glycoproteinen" bewirkt sein kann. Die Pneumokokkenanheftung wurde sowohl durch hochmolekulargewichtige als auch niedermolekulargewichtige Fraktionen gehemmet, insbesondere Lactose-N-tetraose (LNT, Gal&bgr;1-4GlcNAc&bgr;1-4Galß1-4Glc) und Laktose-N-Neotetraose (LNnT, Gal&bgr;1- 4GlcNAc&bgr;1-3Gal&bgr;1-4Glc) (Anderson, B., et al., J. Infect. Dis. 153 (1986) 232–237). Im allgemeinen können Oligosaccharide die Bindung von Bakterien an Epithelialzellen hemmen, wobei sie durch Kompetitieren mit Zellrezeptoren als Köder wirken. Zusätzlich schützen Oligosaccharide Kleinkinder vor viralen und bakteriellen Infektionen des Respirations-, Gastrointestinal- und Urogenitaltrakts.

Die Genetik spielt eine große Rolle bei der Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten Oligosacchariden in der Milch von verschiedenen Donoren, ein Attribut, welches mit dem Lewis Blutgruppenstatus der einzelnen Person zusammenhängt. Die "Sekretor-" und "Lewis-" Gene kodieren spezifische Glycosyltransferasen. Diese Enzyme wiederum erzeugen eine Vielzahl von sekundären Genprodukten, insbesondere Oligosaccharide und andere Glycokonjugate. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von Glycosyltransferasen in der Milch absondernden Brustdrüse hat eine direkte Auswirkung auf die Existenz und die Menge von bestimmten Kohlenhydratstrukturen, die in menschlicher Milch von einem gegebenen Donor gefunden werden.

Viele nützliche Funktionen wurden den menschlichen Milch-Oligosacchariden zugeschrieben. Aus diesem Grund ist die Ergänzung von Kleinkinderformulierungen und anderen pädiatrischen Ernährungsprodukten mit menschlichen Milch-Oligosacchariden wünschenswert. Eine Kleinkinderformulierung, die mit Oligosacchariden nahe dem natürlich vorkommenden Spiegeln von solchen Oligosacchariden in menschlicher Brustmilch ergänzt ist, wäre am nützlichsten. Die natürlichen Spiegel von spezifischen menschlichen Milch-Oligosacchariden wurden aus gepoolten Milchproben erhalten (Kobata, A., Methods in Enzymology 28 (1972) 262–271; Kunz, C., et al., Acta Paediatr. 82 (1993) 903–912) oder durch die Verwendung von Verfahren, die das Erhitzen der Proben erforderten, wodurch labile Oligosaccharide zerstört wurden (Thurl, S. et al., Analytical Biochemistry 235 (1996) 202–206). Es wurden auch Durchschnittswerte für einige Oligosaccharidkonzentrationen veröffentlicht (Siehe Thurl, S., et al., Ana. Biochem. 235 (1996) 202–206; Thurl, S., et al., J. Chromat. 565 (1991) 291–300), aber die Variabilität dieser Oligosaccharide wurde aufgrund der großen Menge an menschlichen Milchproben, die notwendig ist, um eine statistische Signifikanz zu erreichen, nicht festgestellt.

EP-A-0 313 533 offenbart Nahrungsmittel, insbesondere basierend auf Milch von Wiederkäuern, wozu Lacto-N-tetraose in einer gastrointestinal wirksamen Menge hinzugefügt wurde; und ein Verfahren für seine Herstellung.

WO-95/24495 offenbart die transgene Produktion von Oligosacchariden und Glycokonjugaten. Die Oligosaccharide sind, inter alia, gewählt aus Laktose, 2'-Fucosyllactose, Lacto-N-tetraose, Lacto-N-neotetraose, Lacto-N-fucopentaose I, Lacto-N-fucopentaose II, Lacto-N-fucopentaose III. Nahrungsprodukte können aus der transgenen Milch oder aus daraus isolierten Oligosacchariden hergestellt werden.

Aufgrund von diesen Schwierigkeiten ist zum jetzigen Zeitpunkt keine Kleinkinderformulierung erhältlich, die Oligosaccharide nahe den natürlich vorkommenden Spiegeln, die in menschlicher Brustmilch gefunden werden, enthält.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine synthetische Nahrungszusammensetzung bereit, die eines oder mehrere menschliche Milch-Oligosaccharide umfaßt, worin die menschlichen Milch-Oligosaccharide in der Zusammensetzung gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:

von 1456 bis 1750 mg/Liter von 3-Fucosyllactose;

von 507 bis 1100 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose III;

von 361 bis 750 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose II;

von 393 bis 1450 mg/Liter von Difucosyllactose;

von 2240 bis 2400 mg/Liter von 2'-Fucosyllactose;

von 845 bis 1650 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose I;

von 258 bis 450 mg/Liter von Lacto-N-neotetraose; oder

von 120 bis 1600 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose V;

und diese Zusammensetzung umfaßt weiter eßbare Makro-Nährstoffe, worin diese Zusammensetzung für die Verwendung mit normalen, gesunden Kleinkindern, Kindern, Erwachsenen oder Personen mit speziellen Bedürfnissen, wie zum Beispiel denjenigen, die bestimmte pathologische Zustände begleiten, gedacht ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die menschlichen Milch-Oligosaccharide in der Zusammensetzung in den folgenden Mengen vorhanden:

von 1456 bis 1472 mg/Liter von 3-Fucosyllactose;

von 507 bis 578 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose III;

von 361 bis 429 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose II;

von 393 bis 494 mg/Liter von Difucosyllactose;

von 2240 bis 2260 mg/Liter von 2'-Fucosyllactose;

von 845 bis 912 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose I;

von 258 bis 279 mg/Liter von Lacto-N-neotetraose; oder

von 120 bis 154 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose V.

Gemäß einer Ausführungsform sind die Makro-Nährstoffe zur Fütterung an ein Kleinkind formuliert. Die Makro-Nährstoffe können eines oder mehrere von Kokosnussöl, Sojaöl, Mono- und Diglyceriden, Glucose, Laktose in Nahrungsmittelqualität, elektrodialysierte Molke, elektrodialysierte Magermilch, Milchmolke und Sojaprotein umfassen. Die Zusammensetzung kann weiterhin eines oder mehrere der Vitamine A, C, D, E und B-Komplex umfassen. Zusätzlich kann die Zusammensetzung eines oder mehrere der Mineralien Kalzium, Magnesium, Mangan, Natrium, Kalium, Phosphor, Kupfer, Zink, Chlorid, Jod, Selen und Eisen umfassen.

Beschreibung der Zeichnungen

1 zeigt ein Chromatogramm von neun Oligosacchariden, die aus menschlicher Milch quantifiziert wurden.

2 zeigt zwei Chromatogramme, die die Oligosaccharidprofile von menschlicher Milch von Sekretor- und Nichtsekretor-Donoren vergleichen. 2A zeigt das Oligosaccharidprofil von menschlicher Milch von einem Sekretor.

2B zeigt das Oligosaccharidprofil von menschlicher Milch von einem Nichtsekretor.

3 zeigt zwei Chromatogramme, die die Oligosaccharidprofile von menschlicher Milch von Lewis-positiven und Lewis-negativen Donoren vergleichen. 3A zeigt das Oligosaccharidprofil von menschlicher Milch von einem Lewispositiven Donor. 3B zeigt das Oligosaccharidprofil von einem Lewis-negativen Donor.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine synthetische Nahrungsformulierung bereit, die mindestens eines der folgenden Oligosaccharide in den oben angegebenen Mengen enthält:

Alle diese Oligosaccharide sind natürlich vorkommende Oligosaccharide, die in menschlicher Brustmilch gefunden werden. Wie es im Fachgebiet wohl bekannt ist, bezeichnet Gal Galaktose, GlcNAc bezeichnet N-Acetyl-glucosamin, Glc bezeichnet Glucose und Fuc bezeichnet Fucose.

Die synthetische Ernährungsformulierung der vorliegenden Erfindung enthält eßbare Makro-Nährstoffe, Vitamine und Mineralien in Mengen, die für eine spezielle Verwendung gewünscht sind. Die Mengen solcher Inhaltsstoffe werden variieren abhängig davon, ob die Formulierung für die Verwendung mit normalen, gesunden Kleinkindern, Kindern, Erwachsenen oder Personen mit speziellen Bedürfnissen, wie zum Beispiel denjenigen, die bestimmte pathologische Zustände begleiten (z.B. metabolische Krankheiten) gedacht ist. Es wird von Personen, die im Fachgebiet bewandert sind, verstanden werden, dass die Komponenten, die in einer Ernährungsformulierung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, von halbgereinigtem oder gereinigtem Ursprung sind. Mit halbgereinigt oder gereinigt ist ein Material gemeint, welches durch Reinigung eines natürlichen Materials oder durch Synthese hergestellt wurde.

Diese Techniken sind im Fachgebiet wohl bekannt (siehe z.B. Code of Federal Regulations for Food Ingredients and Food Processing; Recommended Dietary Allowances, 10th Ausgabe, National Academy Press, Washington D.C., 1989).

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die synthetische Ernährungsformulierung der vorliegenden Erfindung ein enterales Kleinkinderernährungsprodukt. Dementsprechend wird in einem weiteren Aspekt der Erfindung eine Ernährungsformulierung bereitgestellt, die geeignet ist für die Fütterung an Kleinkinder. Die Formulierung umfaßt, zusätzlich zu den oben beschriebenen Oligosacchariden, Vitamine und Mineralien in Mengen, die so gestaltet sind, um die täglichen Ernährungsbedürfnisse von Kleinkindern bereitzustellen. Es ist wichtig anzumerken, daß antimikrobielle Faktoren in menschlicher Milch oder in Kleinkinderformulierungen einen Respirationstrakt eines Kleinkindes direkt erreichen können als ein Ergebnis von Wiederaufstoßen und Inhalieren dieser Faktoren während und nach der Fütterung. Die Mukosa des Respirationstrakts kann deshalb direkten Schutz auf diese Weise erlangen.

Die Makro-Nährstoffkomponenten schließen zum Beispiel eßbare Fette, Kohlenhydrate und Proteine ein. Beispielhafte eßbare Fette sind Kokosnussöl, Sojaöl, und Mono- und Diglyceride. Beispielhafte Kohlenhydrate sind Glucose, (eßbare) Laktose in Nahrungsmittelqualität und hydrolysierte Maisstärke. Eine typische Proteinquelle wäre zum Beispiel Sojaprotein, elektrodialysierte Molke oder elektrodialysierte Magermilch oder Milchmolke, oder die Hydrolysate dieser Proteine, obwohl andere Proteinquellen auch erhältlich sind und verwendet werden können. Diese Makro-Nährstoffe würden in der Form von allgemein verträglichen Nahrungsverbindungen hinzugefügt werden in einer Menge, die äquivalent ist zu derjenigen, die in menschlicher Milch vorhanden ist, auf einer Energiebasis, d.h. auf einer pro Kalorien-Basis.

Die Kleinkinderformulierung würde vorzugsweise die folgenden Vitamine und Mineralien einschließen: Kalzium, Phosphor, Kalium, Natrium, Chlorid, Magnesium, Mangan, Eisen, Kupfer, Zink, Selen, Jod und Vitamine A, E, D, C und den B-Komplex.

Die Kleinkinderformulierung kann sterilisiert werden und danach auf einer verabreichungsfertigen (ready-to-feed, RTF) Basis verwendet werden oder in einer konzentrierten Flüssigkeit oder einem Pulver gelagert werden. Das Pulver kann hergestellt werden zum Beispiel durch Sprühtrocknung der Kleinkinderformulierung, die wie oben angegeben hergestellt wurde, und die Formulierung kann rekonstituiert werden zum Beispiel durch Wiederbefeuchten des Konzentrats. Kleinkinderernährungsformulierungen sind im Fachgebiet wohl bekannt und kommerziell erhältlich (z.B. Similac® und Alimentum® von Ross Products Division, Abbott Laboratories).

Tatsächliche Dosierspiegel der Oligosaccharide in den Formulierungen der vorliegenden Erfindung können variiert werden, um eine Menge an aktivem Inhaltsstoff zu erhalten, die wirksam ist, um eine gewünschte Reaktion für eine spezielle Zusammensetzung und ein Verabreichungsverfahren zu erhalten. Der ausgewählte Dosierspiegel hängt deshalb von dem gewünschten therapeutischen Effekt, von dem Verabreichungsweg, von der gewünschten Dauer der Verabreichung und von anderen Faktoren ab.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Oligosaccharide in der Formulierung nahe den natürlich vorkommenden Spiegeln solcher Oligosaccharide, die in menschlicher Brustmilch gefunden werden, vorhanden.

Die Oligosaccharide, die in der Ernährungsformulierung dieser Erfindung verwendet werden, können in jeglicher Art und Weise hergestellt werden, vorzugsweise durch chemische Synthese. Zum Beispiel können Oligosaccharide für die Verwendung in dieser Erfindung chemisch synthetisiert werden durch enzymatischen Transfer von Saccharideinheiten von Donoranteilen an Akzeptoranteile unter Verwendung von Glycosyltransferasen, wie beschrieben in U.S. Patent 5,288,637 und WO 96/10086. Das bevorzugte Verfahren zur Synthetisierung der Oligosaccharide schließt den enzymatischen Transfer von Saccharideinheiten von Saccharidnukleotiden zu Saccharidakzeptoren unter Verwendung von Glycosyltransferasen ein, worin die Saccharidnukleotide und die Glycosyltransferasen, die verwendet werden, in einer ungereinigten Form vorliegen.

Zusätzlich sollten die Oligosaccharide, die in der Ernährungsformulierung verwendet werden, in gereinigter Form und frei von bakteriellen Toxinen, Viren und anderen schädlichen Kontaminanten sein.

Beispiel 1: Oligosaccharidextraktion aus menschlichen Milchproben Sammlung/Lagerung von menschlichen Milchproben:

Milchproben wurden gesammelt durch 5 unterschiedliche Mittel:

  • 1. Dem Zentrum für pädiatrische Forschung, Eastern Virginia Medical School, Norfolk, VA.
  • 2. Der Universität von Chile, Division of Medical Science Orient, Santiago, Chile.
  • 3. Abteilung für infektiöse Krankheiten, National Institute of Nutrition, Mexico.
  • 4. Klinische Studie Nr. W93–180, Abbott International Division, North Chicago, IL.
  • 5. Kinderkrankenhaus, Columbus, Ohio.
  • 6. Dr. Milo Hilty, Ross Laboratories, Columbus Ohio.

Alle Proben wurden durch eine externe Pumpe gesammelt und gefroren gelagert bis sie zu Abbott Laboratories, Ross Products Division, Columbus, Ohio geschickt wurden, wo sie bei –70°C gehalten wurden bis sie analysiert wurden.

Extraktion von Oligosacchariden aus Milchproben:

Zu testende Milchproben wurden langsam bei Raumtemperatur aufgetaut. Nachdem sie gut geschüttelt wurden, wurden 0,75 ml in Centricon 10,000 Molekulargewicht cut-off-Filter (Amicon, Inc., Beverly, MA) pipettiert. Die Milchproben wurden für 2 Stunden bei 2,000 RCF bei 15–18°C zentrifugiert. Ungefähr 100 bis 400 &mgr;l klares farbloses Filtrat wurde für jede Probe erhalten. Die Filtrate wurden gefroren bei –70°C bis zur Verwendung gelagert.

Entfernung von überschüssiger Laktose:

Für die Oligosaccharidanalyse mußte überschüssige Laktose entfernt werden, um die niedrigeren Mengen an vorhanden Oligosacchariden zu quantifizieren. Um dies zu vervollständigen wurden 186 &mgr;l aufgetautes gemischtes Filtrat mit 14 &mgr;l Isopropylalkohol verdünnt. 100 &mgr;l von dieser Verdünnung wurden auf eine BioGel P2 Größenausschlußchromatographiesäule (BioRad Inc., Hercules, CA), die mit einem Brechungsindexdetektor und einem Fraktionssammler ausgestattet war, injiziert. Die Proben wurden eluiert unter Verwendung eines 1,0 ml/Min. Flusses von filtriertem entgastem 7% IPA, das durch eine HPLC Pumpe zugeführt wurde. 4,0 ml Fraktionen wurden gesammelt. Mit Ausnahme des Totvolumens (Fraktion Nr. 1, die sehr großmolekulargewichtige Verbindungen enthielt), wurden alle Fraktionen vor dem Hauptteil der Laktose getrocknet. Überschüssige Laktose enthaltende Fraktionen, und diejenigen, die später aus der Säule eluiert wurden, wurden verworfen. Die gewünschten Fraktionen wurden über Nacht in einem Savant Speed-Vac, der mit einer Kühlfalle und einer Vakuumpumpe ausgestattet war, getrocknet. Sie wurden in 800 &mgr;l 7% IPA gepoolt/resuspendiert und analysiert.

Beispiel 2: Identifizierung und Quantifizierung von Oligosacchariden aus menschlichen Milchproben Oligosaccharidanalyse durch Hochdruck-Anionenaustauscherchromatographie:

Proben aus Beispiel 1 wurden analysiert unter Verwendung eines Dionex Bio-LC Systems, ausgestattet mit einem gepulsten elektrochemischen Detektor. Zwei CarboPac PA-1 analytische Säulen wurden in Serie miteinander verbunden durch ein sehr kurzes Rohr und es wurde eine Führungssäule aus demselben Material vorangestellt. Die Bedingungen waren wie folgt:

  • • Empfindlichkeit: 0,300 C
  • • Durchgangszeit: 75 Minuten
  • • Peak Breite: 8,0 Sekunden
  • • Peak Schwelle: 25,00
  • • Peak Gebiet Ausschuss: 1000
  • • Probenvolumen: 20 &mgr;l

Das Gradientenprogramm war:

  • • 0–60 Minuten: 5 mM NaOH bis 500 mM NaOH
  • • 60,1–75 Minuten: 5 mM NaOH

Das PED Programm war: Zeit (Sekunden): Potential (V) 0,00 0,05 0,40 0,05 0,41 0,75 0,60 0,75 0,61 –0,15 1,00 –,015
Beginn (Sekunden): Ende (Sekunden): 0,20 0,40

Eine Serie von 8 Oligosaccharidstandards von 50 bis 200 ppm wurde mit jedem Instrumentendurchlauf analysiert. Alle Standards wurden erworben von V-Labs, Inc. (Covington, LA). Die Berechnungen des Oligosaccharidgehalts in jeder Probe wurden aus diesen Standardkurven bestimmt. Eine 7% IPA-Blindanalyse wurde mit jedem Instrumentendurchlauf analysiert, und sein Chromatogramm wurde von jedem Proben- und Standardchromatogramm subtrahiert, um die Basislinien von allen zu verbessern. Es wurde herausgefunden, daß dies keine Auswirkung auf die tatsächliche Integration der einzelnen Peaks hatte.

Bestimmung von Laktose in Filtraten:

Die Oligosaccharidextrakte wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und gevortext, um gut zu mischen. Jeder wurde 1:1000 mit 7% IPA unter Mischen verdünnt. Die Proben, und eine Serie von Laktosestandards, wurden durch die Verwendung des folgenden Verfahrens analysiert:

Laktoseanalyse durch Hochdruck-Anion-Austauscherchromatoaraphie:

Proben für Laktose wurden analysiert unter Verwendung des Dionex Systems, das früher beschrieben wurde, wobei dieses Mal eine einzelne analytische CarboPac PA-1 Säule mit Führung verwendet wurde. Bedingungen waren wie folgt:

  • • Empfindlichkeit: 0,200 &mgr;C
  • • Durchgangszeit: 45 Minuten
  • • Peakbreite: 8,0 Sekunden
  • • Peakschwelle: 25,00
  • • Peak Gebiet Ausschuss: 1000
  • • Probenvolumen: 20 &mgr;l

Das Gradientenprogramm war:

  • • 0–12 Minuten: 100 mM NaOH
  • • 12,1–20 Minuten: 42 mM NaOAc in 100 mM NaOH
  • • 20,1–27 Minuten: 60 mM NaOAc in 100 mM NaOH
  • • 27,1–32 Minuten: 300 mM NaOAc in 100 mM NaOH
  • • 32,1–45 Minuten: 100 mM NaOH

Das PED Programm war: Zeit (Sekunden): Potential (V): 0,00 0,05 0,40 0,05 0,41 0,75 0,60 0,75 0,61 –0,15 1,00 –0,15
Beginn (Sekunden): Ende (Sekunden): 0,20 0,40

Eine Serie von Laktosestandards von 2,5–25 g/l wurde hergestellt, 1:100 verdünnt und analysiert. Laktosekonzentrationen wurden aus diesen Standardkurven berechnet.

Ergebnisse

1 zeigt ein Standardchromatogramm von neun Oligosacchariden, die in menschlicher Milch gefunden werden. Die Elution/Retention von jedem Oligosaccharid wurde bestimmt unter Verwendung von einzelnen Kohlenhydratstandards. Sieben von den neun untersuchten Kohlenhydraten waren gut aufgelöst von ihren Nachbarpeaks: 3-Fucosyllactose (3-FL, Gal&bgr;-4(Fuc&agr;1-3)Glc) co-eluiert mit der geringfügigen Komponente Lacto-difucohexaose I (LDFH-I, Fuc&agr;1-2Gal&bgr;1-3(Fuc&agr;l-4)GlcNAc&bgr;1-3Gal&bgr;1-4Glc) in denjenigen Proben von Donoren, welche das Lewis Gen sezernierten; und LNT, co-eluiert mit der geringfügigen Komponente Lacto-N-neohexaose (LNnH, Gal&bgr;1-4GlcNAc&bgr;1-3(Gal&bgr;1-4GlcNAc&bgr;1-6)Gal&bgr;1-4Glc). 2 zeigt zwei Chromatogramme, die die Oligosaccharidprofile von menschlicher Milch von Sekretor(2A) und Nichtsekretor-Donoren (2B) vergleichen. Die klare Anwesenheit oder Abwesenheit von 2'-Fl, DFL und LNF-I, wie vorhergesagt durch die Anwesenheit oder Abwesenheit der Fucosyltransferase, die notwendig ist, um Fucose auf einer terminalen Galaktose in eine alpha 1–2 Position zu bringen, kann in den Chromatogrammen festgestellt werden. Sekretoren waren 199 der 232 untersuchten Personen, oder 86% der Population. 3 zeigt zwei Chromatogramme, die menschliche Milch von Lewis positiven (3A) und Lewis negativen (3B) Personen vergleichen. Lewis positive Personen besitzen die Fucosyltransferase, die benötigt wird, um Fucose in die alpha 1–4 Position von N-Acetylglucosamin zu platzieren. Es gab 224 (oder 97%) Lewis positive Donoren in dieser Gruppe.

Eine Zusammenfassung der gesammelten Daten wird unten in Tabelle 1 bereitgestellt. Milch von insgesamt 232 Donoren wurde verwendet, wobei einige Donoren eine Serie von Milchproben lieferten. Diese Proben wurden verwendet, um die Änderung in der Konzentration von jedem Oligosaccharid durch den Laktationszeitraum hindurch zu bestimmen. Um einen normalen Konzentrationsdurchschnitt der Zucker zu entwickeln wurden ihre Werte im Durchschnitt genommen.

  • "n:*" zeigt die Anzahl von getesteten Proben, welche das in Frage stehende Oligosaccharid enthielten.
  • "%:**" ist der Prozentsatz von Proben, die das Oligosaccharid enthielten. Durchschnitte wurden nur für diejenigen Proben berechnet, welche den Zucker enthielten; wenn eine Probe ihn nicht enthielt, war ein "null" Wert nicht eingeschlossen.

Die Werte, die oben in Tabelle 1 gefunden werden, weichen deutlich von denjenigen ab, die in der Literatur anerkannt sind. In den jüngsten Publikationen über diese Sache veröffentlichte Thurl et al. (Analytical Biochemistry 235 (1996) 202–206), ein Verfahren, das die einzelnen menschlichen Milch-Oligosaccharide trennt und quantifiziert, einschließlich neutraler und saurer Oligosaccharide, und Laktose. In dieser Publikation beschreiben Thurl et al. das verwendete Verfahren und fünf Ergebnisse für einen Donor. Tabelle II unten vergleicht die Ergebnisse aus der Thurl et al. Studie mit den Ergebnissen in Tabelle I, ebenso wie den Ergebnissen aus zwei anderen Studien, die tatsächlich die einzelnen Zucker quantifizierte. Die zwei anderen Studien sind beschrieben in Kobata, A., Methods in Enzymology 28 (1972) 262–271 und Kunz, C. et al., Acta Paediatr. 82 (1993) 903–912. Die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung, die in Tabelle I gezeigt sind, nahmen die Durchschnittswerte der Konzentrationen für eine große Anzahl von zufälligen Personen. Die anderen Studien, die oben diskutiert sind, bestimmten die Werte von höchstens 4 Proben von unterschiedlichen Personen.

Das von Kobata et al. verwendete Verfahren verwendete eine Entlipidisierung durch Zentrifugation, eine Proteinentfernung durch Ethanolextraktion, und eine komplizierte Serie von Papier- und Dünnschichtchromatographieschritten, um zu den aufgelisteten Konzentrationen zu gelangen. Dieses Verfahren braucht fast einen Monat zur Vervollständigung, und läßt viel Raum für Fehler und Verluste oder Abbau von einigen der komplexeren Verbindungen. Thurl et al. verwendete eine Hitzebehandlung, um jegliche biologisch gefährliche Materialien in der Milch, die vorhanden sein können, zu deaktivieren, ein Schritt, welcher auch die Hitze-empfindlichen fucosylierten Zucker abbauen kann. Es wurde gezeigt, daß Hitze und ein saurer pH sogar die basischeren der Oligosaccharide abbauen kann, einschließlich LNnT und die Fucosyllaktosen. Jedes der Oligosaccharide, die in der vorliegenden Erfindung quantitativ bestimmt wurden, wurde (unter Verwendung von autenthischen Standards) durch das gesamte Verfahren geführt und analysiert, ohne bemerkenswerte Verluste in irgendeinem Schritt. Desweiteren wurden menschliche Milchproben mit einigen der Standards in erhöhten Spiegeln versehen, mit exzellenten Wiedergewinnungsraten durch das Verfahren hindurch.

Veranschaulichendes Beispiel einer verabreichungsfertigen (ready-to-feed) Kleinkinderformulierunq, die Oligosaccharide enthält, welches nicht Teil der Erfindung ist.

Eine verabreichungsfertige (ready-to-feed) Kleinkinderformulierung, die die Oligosaccharide 3-Fucosyllactose, Lacto-N-fucopentaose III, Lacto-N-fucopentaose II, Difucosyllactose, 2'-Fucosyllactose enthält, hat die folgende Zusammensetzung (147,9 ml (5 Flüssigkeitsunzen) = 100 Kal): Nährstoffe: Pro 100 Kal: Protein 2,14 g Fett 5,40 g Kohlenhydrate 10,7 g 3-Fucosyllactose 206,0 mg Lacto-N-Fucopentaose III 72,0 mg Lacto-N-Fucopentaose II 51,3 mg Difucosyllactose 55,8 mg 2'-Fucosyllactose 318,1 mg Wasser 133,0 g Linolsäure 1300,0 mg
Vitamine: Pro 100 Kal: Vitamin A 300 IE Vitamin D 60 IE Vitamin E 3,0 IE Vitamin K 8 &mgr;g Thiamin (Vitamin B1) 100 &mgr;g Riboflavin (Vitamin B2) 150 &mgr;g Vitamin B6 60 &mgr;g Vitamin B12 0,25 &mgr;g Niacin 1050 &mgr;g Folsäure (Folacin) 15 &mgr;g Pantothensäure 450 &mgr;g Biotin 4,4 &mgr;g Vitamin C (Ascorbinsäure) 9 mg Cholin 16 mg Inositol 4,7 mg Mineralien: Pro 100 Kal: Kalzium 73 mg Phosphor 56 mg Magnesium 7,5 mg Eisen 1,8 mg Zink 0,75 mg Mangan 30 &mgr;g Kupfer 75 &mgr;g Jod 15 &mgr;g Natrium 44 mg Kalium 108 mg Chlorid 62 mg

Die oben beschriebene Kleinkinderformulierung kann verwendet werden, wenn eine Kleinkinderformulierung benötigt wird, wie zum Beispiel wenn entschieden wird, die Brustfütterung vor dem Alter von einem Jahr zu unterbrechen, wenn eine Ergänzung zur Brustfütterung benötigt wird oder als eine Routinefütterung, wenn die Brustfütterung nicht angenommen wird.


Anspruch[de]
Eine synthetische Nahrungs-Zusammensetzung, die eines oder mehrere menschliche Milch-Oligosaccharide umfasst, worin die menschlichen Milch-Oligosaccharide in der Zusammensetzung gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:

von 1456 bis 1750 mg/Liter von 3-Fucosyllactose;

von 507 bis 1100 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose III;

von 361 bis 750 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose II;

von 393 bis 1450 mg/Liter von Difucosyllactose;

von 2240 bis 2400 mg/Liter von 2'-Fucosyllactose;

von 845 bis 1650 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose I;

von 258 bis 450 mg/Liter von Lacto-N-neotetraose; oder

von 120 bis 1600 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose V;

und die Zusammensetzung weiter essbare Makro-Nährstoffe umfasst, worin die Zusammensetzung für die Verwendung mit normalen, gesunden Säuglingen, Kindern, Erwachsenen oder Subjekten beabsichtigt ist, die spezielle Bedürfnisse haben, wie: zum Beispiel die, die bestimmte pathologische Zustände begleiten.
Die Zusammensetzung von Anspruch 1, worin die essbaren Makro-Nährstoffe zur Fütterung an einen Säugling formuliert, sind. Die Zusammensetzung von Anspruch 1 oder 2, worin die Makro-Nährstoffe mindestens einen von Kokosnussöl, Sojaöl, Mono- und Diglyceride, Glucose, Laktose in Lebensmittelqualität, elektrodialysierte Molke und elektrodialysierte entrahmte Milch, Milchmolke und Sojaprotein umfassen. Die Zusammensetzung von Anspruch 1 oder 2, die weiter mindestens eines der Vitamine A, C, D, E und B-Komplex umfasst. Die Zusammensetzung von Anspruch 1 oder 2, die weiterhin mindestens eines von Kalzium, Magnesium, Mangan, Natrium, Kalium, Phosphor, Kupfer, Zink, Chlorid, Jod, Selen und Eisen umfasst. Die Zusammensetzung von Anspruch 1, worin die menschlichen Milch-Oligosaccharide in den folgenden Mengen vorhanden sind:

von 1456 bis 1472 mg/Liter von 3-Fucosyllactose;

von 507 bis 578 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose III;

von 361 bis 429 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose II;

von 393 bis 494 mg/Liter von Difucosyllactose;

von 2240 bis 2260 mg/Liter von 2'-Fucosyllactose;

von 845 bis 912 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose I;

von 258 bis 279 mg/Liter von Lacto-N-neotetraose; oder

von 120 bis 154 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose V.
Ein Verfahren zur Herstellung einer synthetischen Nahrungs-Zusammensetzung, die eines oder mehrere menschliche Milch-Oligosaccharide umfasst, worin die menschlichen Milch-Oligosaccharide in der Zusammensetzung gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:

von 1456 bis 1750 mg/Liter von 3-Fucosyllactose;

von 507 bis 1100 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose III;

von 361 bis 750 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose II;

von 393 bis 1450 mg/Liter von Difucosyllactose;

von 2240 bis 2400 mg/Liter von 2'-Fucosyllactose;

von 845 bis 1650 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose I;

von 258 bis 450 mg/Liter von Lacto-N-neotetraose; oder

von 120 bis 1600 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose V;

und die Zusammensetzung weiter essbare Makro-Nährstoffe umfasst, worin die Zusammensetzung für die Verwendung mit normalen, gesunden Säuglingen, Kindern, Erwachsenen oder Subjekten beabsichtigt ist, die spezielle Bedürfnisse haben, wie zum Beispiel die, die bestimmte pathologische Zustände begleiten, wobei das Verfahren den Schritt Herstellen der Oligosaccharide durch chemische Synthese umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 7, worin die essbaren Makro-Nährstoffe zur Fütterung an einem Säugling formuliert sind. Das Verfahren von Anspruch 7 oder 8, worin die Makro-Nährstoffe mindestens einen von Kokosnussöl, Sojaöl, Mono- und Diglyceride, Glucose, Laktose in Lebensmittelqualität, elektrodialysierte Molke und elektrodialysierte entrahmte Milch, Milchmolke und Sojaprotein umfassen. Das Verfahren von Anspruch 7 oder 8, worin die Zusammensetzung weiter mindestens eines der Vitamine A, C, D, E und B-Komplex umfasst. Das Verfahren von Anspruch 7 oder 8, worin die Zusammensetzung weiter mindestens eines von Kalzium, Magnesium, Mangan, Natrium, Kalium, Phosphor, Kupfer, Zink, Chlorid, Jod, Selen und Eisen umfasst. Das Verfahren von Anspruch 7, worin die menschlichen Milch-Oligosaccharide in der Zusammensetzung in den folgenden Mengen vorhanden sind:

von 1456 bis 1472 mg/Liter von 3-Fucosyllactose;

von 507 bis 578 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose III;

von 361 bis 429 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose II;

von 393 bis 494 mg/Liter von Difucosyllactose;

von 2240 bis 2260 mg/Liter von 2'-Fucosyllactose;

von 845 bis 912 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose I;

von 258 bis 279 mg/Liter von Lacto-N-neotetraose; oder

von 120 bis 154 mg/Liter von Lacto-N-fucopentaose V.






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