PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69934246T2 03.05.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001135472
Titel UDP-N-ACETYLGLUCOSAMINE:GALACTOSE-ß1,3-N-ACETYLGALACTOSAMINE-a-R/N-ACETYLGLUCOSAMINE-ß1,3-N-ACETYLGALACTOSAMINE-a-R(G.cNActo GalNAc) ß1,6-N-ACETYLGLUCOSAMINYLTRANSFERASE, C2/4GnT
Anmelder Glycozym ApS, Holte, DK
Erfinder CLAUSEN, Henrik, DK-2840 Holte, DK;
SCHWIENTEK, Tilo, DK-2700 Br nsh j, DK
Vertreter Rechts- und Patentanwälte Lorenz Seidler Gossel, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69934246
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 03.12.1999
EP-Aktenzeichen 999572647
WO-Anmeldetag 03.12.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/DK99/00677
WO-Veröffentlichungsnummer 2000034449
WO-Veröffentlichungsdatum 15.06.2000
EP-Offenlegungsdatum 26.09.2001
EP date of grant 29.11.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.05.2007
IPC-Hauptklasse C12N 9/10(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]
TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Biosynthese von Glykanen, die als freie Oligosaccharide oder kovalent gebunden an Proteine und Glykolipide vorkommen. Diese Erfindung betrifft genauer gesagt eine Familie von Nukleinsäuren, die UDP-N-Acetylglucosamin: N-Acetylgalactosamin-&bgr;1,6-N-acetylglucosaminyltransferasen (Core-&bgr;1,6-N-acetylglucosaminyltransferasen) codieren, die N-Acetylglucosamin an die Hydroxygruppe am C6 von 2-Acetamido-2-desoxy-D-galactosamin (GalNAc) in O-Glykanen des Core 3- und des Core 1-Typs addieren. Diese Erfindung betrifft im Spezielleren ein Gen, das das dritte Mitglied der Familie der O-Glykan-&bgr;1,6-N-acetylglucosaminyltransferasen, bezeichnet als C2/4GnT, codiert, Sonden für die DNA, die C2/4GnT codiert, DNA-Konstrukte, umfassend DNA, die C2/4GnT codiert, rekombinante Plasmide und rekombinante Methoden für die Produktion von C2/4GnT, rekombinante Methoden für die stabile Transformierung oder Transfizierung von Zellen für die Expression von C2/4GnT, als auch Verfahren für die Identifizierung von DNA-Polymorphismen in Patienten.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die O-verknüpfte Proteinglykosylierung umfasst eine einleitende Stufe, bei der eine Familie von N-Acetylgalactosaminyltransferasen die Addition von N-Acetylgalactosamin an Serin- oder Threonin-Reste katalysiert (1). Der weitere Zusammenbau der O-Glykanketten umfasst mehrere sukzessive oder alternative biosynthetische Reaktionen: i) Bildung einfacher Core 1-Strukturen vom Mucin-Typ durch UDP-Gal: Gal-NAc&agr;-R&bgr;1,3Gal-Transferase-Aktivität; ii) Umwandlung des Core 1 zu Komplexartigen Core 2-Strukturen durch UDP-GlcNAc: Gal&bgr;1-3GalNAc&agr;-R&bgr;1,6GlcNAc-Transferase-Aktivitäten; iii) direkte Bildung des komplexen Core 3 vom Mucin-Typ durch UDP-GlcNAc: GalNAc&agr;-&bgr;1,3GlcNAc-Transferase-Aktivitäten: und iv) Umwandlung von Core 3 zu Core 4 durch UDP-GlcNAc: GlcNAc&bgr;1-3GalNAc&agr;-R&bgr;1,6GlcNAc-Transferase-Aktivität. Die Bildung von 1,6GlcNAc-Verzweigungen (Reaktionen ii und iv) kann als kontrollierendes Schlüsselereignis der O-verknüpften Proteinglykosylierung betrachtet werden, das zu Strukturen führt, die auf die Differenzierung und maligne Transformation hin produziert werden (2-6). Zum Beispiel wurde eine erhöhte Bildung von GlcNAc&bgr;1-6GlaNAc-Verzweigungen in O-Glykanen während der T-Zellaktivierung, während der Entwicklung von Leukämie und bei Immundefizienzen wie Wiskott-Aldrich-Syndrom und AIDS gezeigt (7; 8). Die Core 2-Verzweigung kann eine Rolle in der Tumorprogression und Metastasierung spielen (9). Im Gegensatz dazu zeigen viele Karzinome Veränderungen von komplexen O-Glykanen, wie sie in normalen Zelltypen gefunden werden, zu unreif prozessierten einfachen O-Glykanen vom Mucin-Typ, wie etwa T (Thomsen-Friedenreich-Antigen; Gal&bgr;1-3GalNAc&agr;1-R), Tn (GalNAc&agr;1-R) und Sialosyl-Tn (NeuAc&agr;2-6GalNAc&agr;-1R) (10). Die molekulare Grundlage hierfür ist bei Brustkrebs umfassend untersucht worden, wobei gezeigt wurde, dass eine spezifische Herabregulierung der Core 2-&bgr;6GlcNAc-Transferase für das beobachtete Fehlen der O-Glykane vom komplexen Typ an dem Mucin MUCI verantwortlich war (6). Der O-Glykan-Core-Zusammenbau kann daher durch inverse Veränderungen der Expressionshöhen von Core-&bgr;1,6-N-acetylglucosaminyltransferasen und der Sialyltransferasen, die Sialyl-T und Sialyl-Tn bilden, kontrolliert werden.

Interessanterweise ist das metastatische Potenzial von Tumoren mit einer erhöhten Expression der Core 2-&bgr;6GlcNAc-Transferase-Aktivität korreliert worden (5). Der Anstieg der Core 2-&bgr;6GlcNAc-Transferase-Aktivität war mit erhöhten Mengen der poly-N-Acetyllactosamin-Ketten, die Sialyl-Lex tragen, assoziiert, was zur Tumormetastasierung durch Veränderung der Selectin-vermittelten Adhäsion beitragen kann (4; 11). Fukada et al. in WO-A-9407917 beschreiben eine humane Core 2-&bgr;6GlcNAc-Transferase und stellen eine cDNA bereit, die diese Transferase codiert, als auch Methoden für ihre Expression. Die Kontrolle des O-Glykan-Core-Zusammenbaus ist durch die Expression der in 1 skizzierten Schlüsselenzym-Aktivitäten reguliert; allerdings können epigenetische Faktoren, einschließlich einer posttranslationalen Modifikation, der Topologie oder der Konkurrenz um Substrate, ebenfalls eine Rolle in diesem Prozess spielen (11).

Die in vitro-Biosynthese eines Subsets komplexer O-Glykopeptid-Strukturen ist derzeit durch die fehlende Verfügbarkeit der Enzyme behindert, die N-Acetylglucosamin in einer &bgr;1-3-Verknüpfung an GalNAc&agr;1-O-Ser/Thr zur Bildung von Core 3 addieren, als auch des Enzyms, das die sukzessive Addition von &bgr;1-6-N-Acetylglucosamin-Verzweigungen zur Bildung von Core 4 katalysiert. Diese Struktur ist für die Enzyme erforderlich, die für den weiteren Aufbau der Core 4-basierten O-Glykane vom komplexen Typ verantwortlich sind (1). Eine Mucin-&bgr;6N-acetylglucosaminyltransferase, die aus Rindertrachea isoliert ist, wie beschrieben durch Ropp et al., (1991) J Biol. Chem. 266(35): 23863-23871, weist eine vorausgesagte Molmasse von 69 kDa auf und kann drei verschiedene Akzeptoren vom Mucin-Typ nützen: Gal&bgr;1-3GalNAc&agr;R, GlcNA-c&bgr;1-3GalNAc&agr;R und GlcNAc&bgr;1-3Gal&bgr;R, wobei die Produkte einen GlcNAc-Rest enthielten, der &bgr;1-6 an das vorletzte GalNAc oder Gal geknüpft war, was mit Core 2, Core 4 und I-Antigen-Strukturen übereinstimmte. Die meisten anderen Enzyme, die für die Verlängerung der verzweigten O-Glykane erforderlich waren, sind verfügbar, und das hierin beschriebene Core 2/4-Enzym macht nun die Synthese von Core 4-basierten Strukturen möglich.

Der Zugang zu dem Gen, das C2/4GnT codiert, würde die Produktion einer Glykosyltransferase zur Verwendung in der Bildung von Core 2- oder Core 4-basierter O-Glykan-Modifikationen an Oligosacchariden, Glykoproteinen und Glykosphingolipiden erlauben. Dieses Enzym könnte zum Beispiel bei pharmazeutischen oder anderen kommerziellen Anwendungen eingesetzt werden, die die synthetische Addition von Core 2- oder Core 4-basierten O-Glykanen an diese oder andere Substrate erfordern, um geeignet glykosylierte Glykokonjugate mit speziellen enzymatischen, immunogenen oder anderen biologischen und/oder physikalischen Eigenschaften zu produzieren.

Folglich besteht ein Bedarf im Fachbereich nach UDP-N-Acetylglucosamin: Galactose-&bgr;1,3-N-acetylgalactosamin-&agr;-R/N-Acetylglucosamin-&bgr;1,3-N-acetylgalactosamin&agr;-R (GlcNAc bis GalNAc) &bgr;1,6-N-Acetylglucosaminyltransferase und der Primärstruktur des Gens, das dieses Enzym codiert. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und bietet außerdem weitere darauf bezogene Vorteile.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuren bereit, die die humane UDP-N-Acetylglucosamin: N-Acetylgalactosamin-&bgr;1,6-N-acetylglucosaminyltransferase (C2/4GnT) codieren, einschließlich der cDNA und genomischen DNA. C2/4GnT weist breitere Akzeptor-Substrat-Spezifitäten im Vergleich zu C2GnT auf, wie durch seine Aktivität mit Core 3-R-Saccharid-Derivaten beispielhaft veranschaulicht. Die vollständige Nukleotidsequenz von C2/4GnT ist in SEQ ID NR. 1 und 2 dargestellt.

In einem Aspekt umfasst die Erfindung isolierte Nukleinsäuren, umfassend die Nukleotidsequenz der Nukleotide 496–1812, wie in SEQ ID NR. 1 und 2 dargestellt. Ebenfalls bereitgestellt werden isolierte Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren mit der in SEQ ID NR. 1 und 2 dargestellten Sequenz oder Fragmenten davon hybridisierbar sind. Bei einer Ausführungsform codiert die DNA-Sequenz die in SEQ ID NR. 2 und 2 gezeigte Aminosäuresequenz von Methionin (Aminosäure Nr. 1) bis Leucin (Aminosäure Nr. 438). Bei einer anderen Ausführungsform codiert die DNA-Sequenz eine Aminosäuresequenz, umfassend eine Sequenz von Phenylalanin (Nr. 31) bis Leucin (Nr. 438) der in SEQ ID Nr. 2 und 2 dargestellten Aminosäuresequenz.

In einem verwandten Aspekt stellt die Erfindung Nukleinsäure-Vektoren bereit, umfassend C2/4GnT-DNA-Sequenzen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf solche Vektoren, in denen die C2/4GnT-DNA-Sequenz an ein transkriptionsregulatorisches Element, mit oder ohne einer Polyadenylierungssequenz, operativ geknüpft ist. Zellen, die diese Vektoren umfassen, werden ebenfalls bereitgestellt, einschließlich, doch nicht beschränkt auf, transient und stabil exprimierende Zellen. Viren, einschließlich Bakteriophagen, umfassend von C2/4GnT abgeleitete DNA-Sequenzen, werden ebenfalls bereitgestellt. Die Erfindung umfasst außerdem Methoden für die Produktion der C2/4GnT-Polypeptide. Die Zell-basierten Verfahren umfassen, ohne Einschränkung, solche, umfassend: Einführen in eine Wirtszelle eines isolierten DNA-Moleküls, das C2/4GnT codiert, oder eines DNA-Konstrukts, umfassend eine DNA-Sequenz, die C2/4GnT codiert; Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die für die C2/4GnT-Expression geeignet sind; und Isolieren von durch die Wirtszelle produzierter C2/4GnT. Ein Verfahren für die Generierung einer Wirtszelle mit einer stabilen de novo-Expression von C2/4GnT umfasst: Einführen in eine Wirtszelle eines isolierten DNA-Moleküls, das C2/4GnT codiert, oder eines enzymatisch aktiven Fragments davon (wie beispielsweise ein Polypeptid, umfassend Aminosäuren 31–438 der in SEQ ID NR. 2 und 2 dargestellten Aminosäuresequenz) oder ein DNA-Konstrukt, umfassend eine DNA-Sequenz, die C2/4GnT codiert, oder ein enzymatisch aktives Fragment davon; Selektieren und Züchten von Wirtszellen in einem geeigneten Medium; und Identifizieren stabil transfizierter Zellen, die C2/4GnT exprimieren. Die stabil transfizierten Zellen können für die Produktion von C2/4GnT-Enzym zur Verwendung als einem Katalysator und für die rekombinante Produktion von Peptiden oder Proteinen mit entsprechender Galactosylierung verwendet werden. Zum Beispiel können eukaryotische Zellen, und zwar normale oder erkrankte Zellen, mit einem durch stabile Transfektion wie oben modifiziertem Glykosylierungsmuster, oder Komponenten solcher Zellen, zur Darreichung spezifischer Glykoformen von Glykopeptiden und Glykoproteinen, wie zum Beispiel als Immunogene für die Impfung, verwendet werden.

In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung isolierte C2/4GnT-Polypeptide bereit, einschließlich, ohne Beschränkung, Polypeptide mit der in SEQ ID NR. 2 und 2 dargestellten Sequenz, Polypeptide mit der Sequenz der Aminosäuren 31–438, wie in SEQ ID NR. 2 und 2 dargestellt, und ein Fusionspolypeptid, bestehend zumindest aus Aminosäuren 31–438, wie in SEQ ID NR. 2 und 2 dargestellt, fusioniert in-frame an eine zweite Sequenz, die jegliche Sequenz sein kann, die mit der Beibehaltung der enzymatischen C2/4GnT-Aktivität in dem Fusionspolypeptid kompatibel ist. Zu geeigneten zweiten Sequenzen zählen, ohne Beschränkung, solche, die einen Affinitätsliganden oder eine reaktive Gruppe umfassen.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren für das Screening auf Mutationen in der Codierungsregion (Exon III) des C2/4GnT-Gens unter Verwendung von genomischer DNA, die z.B. aus Blutzellen von Patienten isoliert ist, beschrieben. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren: Isolieren der DNA von einem Patienten; PCR-Amplifizieren des codierenden Exons III; DNA-Sequenzieren der DNA-Fragmente des amplifizierten Exons und daraus Feststellen potenzieller struktureller Defekte des C2/4GnT-Gens, die mit der Krankheit assoziiert sind.

Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung und Zeichnungen erkennbar werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 zeigt die Biosynthesewege von O-Glykan-Core-Strukturen vom Mucin-Typ. Die verwendeten Abkürzungen sind GalNAc-T: Polypeptid-&agr;GalNAc-Transferase; ST6GalNAcl: Mucin-&agr;2,6-Sialyltransferase; C1&bgr;3Gal-T: Core 1-&bgr;1,3-galactosyltransferase; C2GnT: Core 2-&bgr;1,6-GlcNAc-Transferase; C2/4GnT: Core 2/Core 4-&bgr;1,6-GlcNAc-Transferase; C3GnT: Core 3-&bgr;1,3-GlcNAc-Transferase; ST3Gall: Mucin-&agr;2,3-Sialyltransferase; &bgr;4Gal-T: &bgr;1,4-Galactosyltransferase; &bgr;3Gal-T: &bgr;1,3-Galactosyltransferase; &bgr;3GnT: Elongations-&bgr;1,3-GlcNAc-Transferase.

2 zeigt die DNA-Sequenz des C2/4GnT-(Zugriffsnummer AF038650)-Gens und die vorausgesagte Aminosäuresequenz von C2/4GnT. Die Aminosäuresequenz ist im Einbuchstabencode gezeigt. Das hydrophobe Segment, das die mutmaßliche Transmembran-Domäne darstellt, ist doppelt unterstrichen. Zwei Konsensus-Motive für die N-Glykosylierung sind durch Sternchen angegeben. Die Lokalisation der für die Präparierung der Expressionskonstrukte verwendeten Primer sind durch einfache Unterstreichung gezeigt. Ein potenzielles Adenylierungssignal ist fettgedruckt und unterstrichen gezeigt.

3 zeigt eine Darstellung eines Sequenzvergleichs zwischen humaner C2GnT (Zugriffsnummer M97347), humaner C2/4GnT (Zugriffsnummer AF038650) und humaner I-GnT (Zugriffsnummer Z19550). Eingeführte Lücken sind als Bindestriche gezeigt, und angeordnete identische Reste sind als Boxen (schwarz für alle Sequenzen, und grau für zwei Sequenzen) gezeigt. Die mutmaßlichen Transmembran-Domänen sind mit einer einzelnen Linie unterstrichen. Die Positionen der konservierten Cysteine sind durch Sternchen angegeben. Eine konservierte N-Glykosylierungsstelle ist durch einen leeren Kreis angegeben.

4 zeigt eine Northern-Blot-Analyse von gesunden menschlichen Geweben und Magenkrebs-Zelllinien. Panel A: Northern-Blots aus mehreren menschlichen Geweben, MTN I und MTN II, von Clontech wurden mit einer 32P-markierten Sonde entsprechend dem löslichen Expressionsfragment von C2/4GnT (Basenpaare 91–1317) sondiert. Panel B: ein Northen-Blot der Gesamt-RNA von humanen Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien wurde wie für Panel A beschrieben sondiert.

5 zeigt Abschnitte eines 1-D 1H-NMR-Spektrums des C2/4GnT-Produkts. GlcNAc&bgr;1-3(GlcNAc&bgr;1-6)GlcNAc&agr;-1-1pNph, das alle nicht-austauschbaren Monosaccharid-Ring-Methin- und exocyclischen Methylen-Resonanzen zeigt. Den Reste-Bezeichnungen für GlcNAc&bgr;1→3 (&bgr;3), GlcNAc&bgr;1→6 (&bgr;6) und GalNAc&agr;1→1 (a) folgen Proton-Bezeichnungen (1-6). Alle Resonanzen in dieser Region, außer für &bgr;3-5 (3,453 ppm) sind markiert.

6 zeigt einen Abschnitt des 1H-detektierten 1H-13C Heteronuclear Multiple Bond Correlation-(HMBC)-Spektrums des Core 4-&bgr;6-GlcNAc-Transferase-Produkts, das interglykosidische H1-C1-O1-Cx- und C1-O1-Cx-Hx-Korrelationen zeigt (Crosspeaks markiert durch Ovale). Die unmarkierten Crosspeaks sind alle Intra-Reste-Korrelationen.

7 zeigt eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisation von C2/4GnT an Metaphasen-Chromosome. Die C2/4GnT-Sonde (P1 DNA von Klon DPMC-HFF#1-1091 [F1]) markierte Bande 15a21.3.

8 zeigt eine schematische Darstellung der Vorwärts-(TSHC78) und reversen (TSHC79) PCR-Primer, die zur Amplifizierung des codierenden Exons des C2/4GnT-Gens verwendet werden können. Die Sequenzen der Primer sind ebenfalls gezeigt. TSHC78 weist die SEQ ID NR. 9 auf, und TSHC79 weist die SEQ ID NR. 10 auf.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Definitionen:

  • 1. "Nukleinsäure" oder "Polynukleotid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Purin- und Pyrimidin-enthaltende Polymere einer beliebigen Länge, die entweder Polyribonukleotide oder Polydesoxyribonukleotide oder gemischte Polyribo-Polydesoxyribo-Nukleotide sind. Dies beinhaltet einzel- und doppelsträngige Moleküle, d.h. DNA-DNA, DNA-RNA und RNA-RNA-Hybride, als auch "Protein-Nukleinsäuren" (PNA) die durch Konjugieren von Basen an ein Aminosäure-Rückgrat gebildet sind. Dies umfasst auch Nukleinsäuren, die modifizierte Basen enthalten (siehe unten).
  • 2. "Komplementäre DNA oder cDNA", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein DNA-Molekül oder -Sequenz, das/die aus den Sequenzen enzymatisch synthetisiert worden ist, die in einer mRNA-Template vorhanden sind, oder einen Klon solch eines DNA-Moleküls. Ein "DNA-Konstrukt" ist ein DNA-Molekül oder ein Klon solch eines Moleküls in entweder einzel- oder doppelsträngiger Form, das so modifiziert worden ist, dass es Segmente von DNA enthält, die in einer Weise kombiniert und nebeneinander positioniert sind, die ansonsten in der Natur nicht vorkommen würde. Als ein nicht-beschränkendes Beispiel wird eine cDNA oder DNA, die keine Introns aufweist, angrenzend an oder innerhalb von exongenen DNA-Sequenzen inseriert.
  • 3. Ein Plasmid oder, allgemeiner gesagt, ein Vektor ist ein DNA-Konstrukt, das genetische Information enthält, die für seine Replikation sorgen kann, wenn es in eine Wirtszelle eingeführt ist. Ein Plasmid enthält allgemein mindestens eine Gensequenz, die in der Wirtszelle exprimiert werden soll, als auch Sequenzen, die solch eine Genexpression erleichtern, einschließlich Promotoren und Transkriptionsinitiationsstellen. Es kann ein lineares oder ringförmig geschlossenes Molekül sein.
  • 4. Nukleinsäuren sind aneinander "hybridisierbar", wenn mindestens ein Strang einer Nukleinsäure sich mit einer anderen Nukleinsäure unter definierten Stringenz-Bedingungen vereinigen kann. Die Stringenz der Hybridisation wird bestimmt z.B. durch a) die Temperatur, bei der die Hybridisation und/oder das Waschen vorgenommen wird, und b) die Ionenstärke und Polarität (z.B. Formamid) der Hybridisations- und Waschlösungen, als auch durch weitere Parameter. Die Hybridisation macht es erforderlich, dass die beiden Nukleinsäuren im Wesentlichen komplementäre Sequenzen, in Abhängigkeit von der Stringenz der Hybridisation, enthalten, doch können Fehlpaarungen toleriert werden. Typischerweise macht es die Hybridisation zweier Sequenzen bei hoher Stringenz (wie etwa beispielsweise in einer wässrigen Lösung von 0,5 × SSC bei 65°C) erforderlich, dass die Sequenzen einen gewissen hohen Grad an Komplementarität gegenüber ihrer Gesamtsequenz aufweisen. Bedingungen einer mittleren Stringenz (wie etwa beispielsweise eine wässrige Lösung von 2 × SSC bei 65°C) und geringer Stringenz (wie etwa beispielsweise eine wässrige Lösung von 2 × SSC bei 55°C) erfordern eine entsprechend geringere Gesamtkomplementarität zwischen den hybridisierenden Sequenzen. (1 × SSC ist 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-Citrat).
  • 5. Eine "isolierte" Nukleinsäure oder Polypeptid, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Komponente, die aus ihrer ursprünglichen Umgebung (z.B. ihrer natürlichen Umgebung, sofern sie natürlich vorkommend ist) entfernt worden ist. Eine isolierte Nukleinsäure oder Polypeptid enthält weniger als etwa 50 %, vorzugsweise weniger als etwa 75 %, und am bevorzugtesten weniger als etwa 90 %, der zellulären Komponenten, mit denen sie ursprünglich assoziiert war.
  • 6. Eine "Sonde" bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die eine Hybrid-Struktur mit einer Sequenz in einer Zielregion aufgrund von Komplementarität wenigstens einer Sequenz in der Sonde mit einer Sequenz in der Zielregion bildet.
  • 7. Eine Nukleinsäure, die "abgeleitet ist von" einer bezeichneten Sequenz, bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die einer Region der bezeichneten Sequenz entspricht. Dies umfasst Sequenzen, die homolog oder komplementär zu der Sequenz sind, als auch "Sequenz-konservative Varianten" und "Funktions-konservative Varianten". Sequenz-konservative Varianten sind solche, in denen ein Austausch eines oder mehrerer Nukleotide in einer gegebenen Codon-Position zu keiner Alteration bei der Aminosäure, die an jener Position codiert ist, führt. Funktions-konservative Varianten von C2/4GnT sind solche, in denen ein gegebener Aminosäure-Rest in dem Polypeptid ausgetauscht worden ist, ohne die Gesamt-Konformation und enzymatische Aktivität (einschließlich der Substrat-Spezifität) des nativen Polypeptids zu verändern; zu diesen Austäuschen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Ersetzung einer Aminosäure durch eine mit ähnlichen physiko-chemischen Eigenschaften (wie zum Beispiel sauer, basisch, hydrophob und ähnliches).
  • 8. Ein "Donor-Substrat" ist ein Molekül, das z.B. durch eine Core-&bgr;1,6-N-acetylglucosaminyltransferase erkannt wird und das eine N-Acetylglucosaminyl-Komponente für die Transferasereaktion beiträgt. Für C2/4GnT ist UDP-N-Acetylglucosamin ein Donor-Substrat. Ein "Akzeptor-Substrat" ist ein Molekül, vorzugsweise ein Saccharid oder Oligosaccharid, das z.B. durch eine N-Acetylglucosaminyltransferase erkannt wird und das das Ziel für die durch die Transferase katalysierte Modifikation ist, d.h. das die N-Acetylglucosaminyl-Komponente erhält. Für C2/4GnT zählen zur Akzeptor-Substraten, ohne Beschränkung, Oligosaccharide, Glykoproteine, O-verknüpfte Core 1- und Core 3-Glykopeptide und Glykosphingolipide, umfassend die Sequenzen Gal-1-3GalNAc, GlcNAc-1-3GalNAc oder Glc-1-3GalNAc.

Die vorliegende Erfindung stellt die isolierten DNA-Moleküle, einschließlich genomischer DNA und cDNA, bereit, die die UDP-N-Acetylglucosamin: N-Acetylgalactosamin-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase (C2/4GnT) codieren.

C2/4GnT wurde durch Analyse von EST-Datenbank-Sequenzinformation identifiziert und basierend auf EST und 5'RACE cDNA-Klonen kloniert. Die Klonierungsstrategie kann kurz wie folgt zusammengefasst werden: 1) Synthese von Oligonukleotiden, die aus EST-Sequenzinformation abgeleitet sind, bezeichnet als TSHC27 (SEQ ID NR. 3) und TSHC28 (SEQ ID NR. 4); 2) sukzessive „Rapid Amplification of 5'-cDNA Ends" (5'RACE) unter Verwendung einer kommerziell verfügbaren Marathon-Ready cDNA; 3) Klonierung und Sequenzierung von 5'RACE cDNA; 4) Identifizierung einer neuen cDNA-Sequenz entsprechend C2/4GnT; 5) Konstruktion von Expressions-Konstrukten durch Reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) unter Verwendung von humaner Colo205-Zelllinien-mRNA; 6) Expression der cDNA, die C2/4GnT codiert, in Sf9-(Spodoptera frugiperda)-Zellen. Spezifischer gesagt bezog die Isolierung eines repräsentativen DNA-Moleküls, das ein neues zweites Mitglied der Säuger-UDP-N-Acetylglucosamin: &bgr;-N-Acetylgalactosamin-&bgr;1,6-N-acetylglucosaminyltransferase-Familie codiert, die folgenden, unten beschriebenen Verfahrensweisen ein.

Identifizierung von zu C2GnT homologer DNA

Datenbank-Durchsuchungen wurden mit der Codierungssequenz der humanen C2GnT-Sequenz (12) unter Verwendung der BLASTn- und tBLASTn-Algorithmen gegen die dbEST-Datenbank bei The National Center for Biotechnology Information, USA, vorgenommen. Der BLASTn-Algorithmus wurde zum Identifizieren von ESTs verwendet, die das fragliche Gen darstellen (Identitäten von 95 %), wohingegen tBLASTn zum Identifizieren nicht-identischer, jedoch ähnlicher EST-Sequenzen verwendet wurde. ESTs mit 50–90 % Nukleotidsequenz-Identität wurden als von der fraglichen Sequenz verschieden betrachtet. Ein EST mit mehreren apparenten, kurzen Sequenzmotiven und Cystein-Resten, die in ähnlicher Beabstandung angeordnet waren, wurde für die weitere Sequenzanalyse ausgewählt.

Klonierung von humaner C2/4GnT

EST-Klon 178656 (5'-EST-GenBank-Zugriffsnummer AA307800), abgeleitet von einem mutmaßlichen Homologon zu C2GnT, wurde erhalten von der American Type Culture Collection, USA. Die Sequenzierung dieses Klons ergab einen teilweise offenen Leserahmen mit signifikanter Sequenz-Ähnlichkeit zu C2GnT. Die Codierungsregion von humaner C2GnT und einem bovinen Homologon wurde zuvor als in einem Exon ((13) und unveröffentlichte Beobachtungen) organisiert festgestellt. Da die von der C2/4GnT-EST verfügbare 5'- und 3'-Sequenz unvollständig, doch wahrscheinlich in einem einzigen Exon lokalisiert war, wurden die fehlenden 5'- und 3'-Abschnitte des offenen Leserahmens durch Sequenzieren genomischer P1-Klone erhalten. Die P1-Klone wurden von einer genomischen Human-Vorhaut-P1-Bibliothek (DuPont Merck Pharmaceutical Co. Human Foreskin Fibroblast P1 Library) durch Screening mit dem Primerpaar TSHC27 (5'-GGAAGTTCATACAGTTCCCAC-3') (SEQ ID NR. 3) und TSHC28 (5'-CCTCCCATTCAACATCTTGAG-3') (SEQ ID NR. 4) erhalten. Zwei genomische Klone für C2/4GnT, DPMC-HFF#1-1026(E2) und DPMC-HFF#1-1091(F1), wurden erhalten von Genome Systems Inc. Die DNA von P1-Phage wurde präpariert, wie empfohlen von Genome Systems Inc. Die gesamte Codierungssequenz des C2/4GnT-Gens war in beiden Klonen repräsentiert und wurde unter Anwendung einer automatischen Sequenzierung (AB1377, Perkin-Elmer) vollständig sequenziert. Eine bestätigende Sequenzierung wurde an einem cDNA-Klon vorgenommen, erhalten mittels PCR (30 Zyklen bei 95°C für 15 sek.; 55°C für 20 sek. und 68°C für 2 min. 30 sek.) an Gesamt-cDNA von der humanen COLO 205-Krebszelllinie mit dem Sense-Primer TSHC54 (5'-GCAGAATTCATGGTTCAATGGAAGAGACTC-3') (SEQ ID NR. 7) und dem Antisense-Primer TSHC45 (5'-AGCGAATTCAGCTCAAAGTTCAGTCCCATAG-3) (SEQ ID NR. 5). Die zusammengesetzte Sequenz enthielt einen offenen Leserahmen von 1314 Basenpaaren, der ein mutmaßliches Protein von 438 Aminosäuren mit einer Typ II-Domänenstruktur codierte, wie durch den TMpred-Algorithmus am Swiss Institute for Experimental Cancer Research (ISREC) (httpa/www.isrec-isb-isb.ch/software/TMPRED form.html) vorausgesagt. Die Sequenz des 5'-Endes der C2/4GnT mRNA, einschließlich der Translationsstartstelle und 5'-UTR, wurde durch „rapid amplification of 5'-cDNA ends" (35 Zyklen bei 94°C für 20 sek.; 52°C für 15 sek. und 72°C für 2 min.) unter Verwendung der Gesamt-cDNA von der humanen COLO 205-Krebszelllinie mit dem Antisense-Primer TSHC48 (5'-GTGGGAACTGTATGAACTTCC-3') (SEQ ID NR. 6) (2) erhalten.

Expression von C2/4GnT

Ein Expressionskonstrukt, das zur Codierung der Aminosäure-Reste 31–438 von C2/4GnT entworfen war, wurde mittels PCR unter Verwendung von P1 DNA und dem Primerpaar TSHC55 (5'-CGAGAATTCAGGTTGAAGTGTGACTC-3') (SEQ ID NR. 8) und TSHC45 (SEQ ID NR. 5) (2) präpariert. Das PCR-Produkt wurde in die EcoRI-Stelle von pAcGP67A (PharMingen) kloniert, und das Insert wurde vollständig sequenziert. pAcGP67-C2/4GnT-sol wurde mit Baculo-GoldTM DNA (Phar-Mingen) cotransfiziert, wie zuvor beschrieben (14). Rekombinantes Baculo-Virus wurde nach zwei sukzessiven Amplifikationen in Sf9-Zellen, gezüchtet in serumhaltigem Medium, erhalten, und die Virus-Titer wurden durch Titrierung in 24-Well-Platten unter Überwachung der Enzym-Aktivitäten bewertet. Die Transfektion von Sf9-Zellen mit pAcGP67-C2/4GnT-sol führte zu einer deutlichen Zunahme der GlcNAc-Transferase-Aktivität im Vergleich zu uninfizierten Zellen oder zu mit einem Kontroll-Konstrukt infizierten Zellen. C2/4GnT zeigte eine signifikante Aktivität mit Disaccharid-Derivaten von O-verknüpftem Core 1-(Gal&bgr;1-3GalNAc&agr;1-R) und Core 3-Strukturen (GlcNAc&bgr;1-3GalNAc&agr;1-R). Im Gegensatz dazu wurde keine Aktivität mit Lacto-N-neotetraose als auch GlcNAc&bgr;1-3Gal-Me als Akzeptor-Substraten gefunden, was darauf hinweist, dass C2/4GnT keine IGnT-Aktivität aufweist. Außerdem konnte keine Aktivität mit &agr;-D-GalNAc-1-para-Nitrophenyl nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass C2/4GnT kein Core 6 (GlcNAc&bgr;1-6GalNAc&agr;1-R) bildet (Tabelle I). Keine Substrat-Inhibition der Enzymaktivität wurde bei hohen Akzeptor-Konzentrationen von bis zu 20 mM Core 1-para-Nitrophenyl oder Core 3-para-Nitrophenyl festgestellt. C2/4GnT zeigt eine strikte Donor-Substrat-Spezifität für UDP-GlcNAc, es konnte keine Aktivität mit UDP-Gal oder UDP-GalNAc nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

  • a Die Enzym-Quellen waren teilgereinigte Medien von infizierten High FiveTM-Zellen (siehe "Experimentelle Verfahrensweisen"). Die Hintergrundwerte, die mit uninfizierten Zellen oder mit einem irrelevanten Konstrukt infizierten Zellen erhalten waren, wurden subtrahiert. b Me, Methyl; Nph, Nitrophenyl.

Die Kontrollen enthielten das pAcGP67-GalNAc-T3-sol (15). Die kinetischen Eigenschaften wurden mit teilgereinigten Enzymen, exprimiert in High FiveTM Zellen, bestimmt. Die teilweise Reinigung wurde durch aufeinanderfolgende Chromatographie an Amberlite IRA-95, DEAE-Sephacryl und CM-Sepharose vorgenommen, wie im Wesentlichen beschrieben (16).

Northern-Blot-Analyse von menschlichen Organen

Human Multiple Tissue Northern-Blots, die mRNA von gesunden Organen erwachsener Menschen (Clontech) enthielten, wurden mit einer C2/4GnT-Sonde sondiert. Die Northern-Analyse mit mRNA von sechzehn Organen ergab die Expression von C2/4GnT in Organen des Magendarmtrakts bei hohen Transkriptionsgraden, wie in Dickdarm und Niere beobachtet, und geringeren Graden in Dünndarm und Bauchspeicheldrüse (4A). Um Veränderungen in der Expression von C2/4GnT in Krebszellen zu untersuchen, die aus Geweben stammten, die normalerweise C2/4GnT exprimieren, wurden die mRNA-Mengen in einem Panel von humanen Adenokarzinom-Zelllinien bestimmt. Die Analysen der C2/4GnT-Transkriptionsmengen offenbarten eine unterschiedliche Expression in pankreatischen Zelllinien: Capan-1 und AsPC-1 exprimierten das Transkript, wohingegen PANC-1, Capan-2 und BxPC-3 dies nicht taten (4B). Von den Dickdarm-Zelllinien exprimierte lediglich HT-29 Transkripte von C2/4GnT. Die Größe des vorherrschenden Transkripts betrug etwa 2,4 Kilobasen, was mit der Transkriptionsgröße von 2,1 Kilobasen des kleinsten der drei Transkripte der humanen C2GnT korrelierte (12). Außerdem wurden Transkripte von etwa 3,4 Kilobasen und 6 Kilobasen in mRNA von gesunder Dickdarm-Schleimhaut erhalten (4A). Die beiden zusätzlichen Transkripte könnten den 3,3 Kilbobasen- und 5,4 Kilobasen-Transkripten der C2GnT ähneln, die bisher noch nicht charakterisiert worden sind. Multiple Transkripte von C2GnT sind als durch unterschiedlichen Gebrauch der Polyadenylierungssignale verursacht vorgeschlagen worden, was die Länge des 3'-UTR beeinflusst (12).

Genomische Organisation des C2/4GnT-Gens

Die vorliegende Erfindung stellt auch isolierte genomische DNA-Moleküle bereit, die C2/4GnT codieren. Die genomische Human-Vorhaut-P1-Bibliothek (DuPont Merck Pharmaceutical Co. Human Foreskin Fibroblast P1 Library) erbrachte durch Screening mit dem Primerpaar TSHC27 (5'-GGAAGTTCATACAGTTCCCAC-3') (SEQ ID NR. 3) und TSHC28 (5'-CCTCCCATTCAACATCTTGAG-3') (SEQ ID NR. 4), die im codierenden Exon lokalisiert sind, ein Produkt von 400 bp. Zwei genomische Klone für C2/4GnT, DPMC-HFF#1-1026(E2) und DPMC-HFF#1-1091(F1), wurden von Genome Systems Inc. erhalten. Der P1-Klon wurde teilweise sequenziert und Introns in der 5'-untranslatierten Region der C2/4GnT mRNA identifiziert, wie in 6 gezeigt. Alle identifizierten Exon/Intron-Grenzen entsprechen der GT-AG-Konsensus-Regel.

Chromosomale Lokalisation des C2/4GnT-Gens

Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die chromosomale Lokalisation des C2/4GnT-Gens. Die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung an Metaphasen-Chromosome unter Verwendung des isolierten P1-Phagen-Klons DPMC-HFF#1-1091(F1) ergab eine Fluoreszenzsignal bei 15q21.3 (7; 20 Metaphasen ausgewertet). Keine spezifische Hybridisierung wurde an irgendeiner anderen chromosomalen Stelle beobachtet.

Das C2/4GnT-Gen wird in Organen des Magendarmtrakts selektiv exprimiert. Das C2/4GnT-Enzym der vorliegenden Erfindung wurde als eine O-Glykosylierungs-Kapazität aufweisend gezeigt, was besagt, dass das C2/4GnT-Gen auch für eine korrekte/vollständige O-Glykosylierung in vivo wichtig ist. Ein struktureller Defekt im C2/4GnT-Gen, der zu einem defizienten Enzym oder völlig defekten Enzym führt, würde daher eine Zelle oder einen Organismus Protein/Peptid-Sequenzen aussetzen, die nicht durch die O-Glykosylierung abgedeckt waren, wie in Zellen oder Organismen mit einem intakten C2/4GnT-Gen erkennbar. In unten stehendem Beispiel 6 ist ein Verfahren für das Scanning des codierenden Exons auf potenzielle strukturelle Defekte beschrieben. Ähnliche Verfahren könnten für die Charakterisierung von Defekten in der nicht-codierenden Region des C2/4GnT-Gens, einschließlich der Promotor-Region, angewendet werden.

DNA, Vektoren und Wirtszellen

In der Ausführung der vorliegenden Erfindung werden viele herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA-Technologie und Immunologie angewendet. Diese Techniken sind wohlbekannt und umfassend erläutert zum Beispiel bei Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Bände I und II, 1985, (D.N. Glover Hrsg.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait Hrsg.); Nucleic Acid Hybridization, 1985 (Hames und Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames und Higgins Hrsg.); Animal Cell Culture, 1986 ((R.I. Freshney Hrsg.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller und M. P. Calos Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology Bd. 154 und Bd. 155 (Wu und Grossman, und Wu, jeweils Hrsg.); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, 1987 (Mayer und Waler, Hrsg.; Academic Press, London); Scopes, 1987, Protein Purification: Principles and Practice, Zweite Auflage (Springer-Verlag, N.Y.) und Handbook of Experimental Immunology, 1986, Bände I-IV (Weir und Blackwell Hrsg.).

Die Erfindung umfasst isolierte Nukleinsäure-Fragmente, die die gesamte oder einen Teil der hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenz umfassen, wie in SEQ ID NR. 1 und 2 dargestellt.

Die Nukleinsäuren können direkt aus Zellen isoliert werden. Alternativ kann die Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Methode zur Erzeugung der Nukleinsäuren der Erfindung unter Verwendung entweder chemisch synthetisierter Stränge oder eines genomischen Materials als Templaten angewendet werden. Für die PCR verwendete Primer können unter Verwendung der hierin bereitgestellten Sequenzinformation synthetisiert werden und können außerdem zur Einführung geeigneter neuer Restriktionsstellen, sofern erwünscht, designed werden, um den Einbau in einen gegebenen Vektor für die rekombinante Expression zu erleichtern.

Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können durch natürliche humane Regulatorsequenzen flankiert sein, oder können mit heterologen Sequenzen, einschließlich Promotoren, Enhancers, Response-Elementen, Signalsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Introns, 5'- und 3'-nicht-codierenden Regionen und ähnlichem assoziiert sein. Die Nukleinsäuren können auch durch viele, im Fachgebiet bekannte Methoden modifiziert sein. Nicht-beschränkende Beispiele solcher Modifikationen umfassen die Methylierung, "Caps", die Substitution eines oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon, Internukleotid-Modifikationen, wie zum Beispiel solche mit ungeladenen Verknüpfungen (z.B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate, etc.) und mit geladenen Verknüpfungen (z.B. Phosphorthioate, Phosphordithioate, etc.). Nukleinsäuren können ein oder mehrere zusätzliche kovalent verknüpfte Komponenten enthalten, wie beispielsweise Proteine (z.B. Nukleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin, etc.), Interkalatoren (z.B. Acridin, Psoralen, etc.), Chelatoren (z.B. Metalle, radioaktive Metalle, Eisen, oxidative Metalle etc.) und Alkylatoren. Die Nukleinsäure kann durch Bildung eines Methyl- oder Ethylphosphotriesters oder einer Alkylphosphoramidat-Verknüpfung derivatisiert sein. Weiterhin können die Nukleinsäure-Sequenzen der vorliegenden Erfindung auch mit einer Markierung modifiziert sein, die zur Bereitstellung eines nachweisbaren Signals entweder direkt oder indirekt in der Lage ist. Zu Beispielen für Markierungen zählen Radioisotope, Fluoreszenzmoleküle, Biotin und ähnliches.

Die Erfindung stellt auch Nukleinsäure-Vektoren bereit, umfassend die beschriebene Sequenz oder Derivate oder Fragmente davon. Eine große Anzahl von Vektoren, einschließlich Plasmid- und fungale Vektoren, ist für die Replikation und/oder Expression in einer Vielfalt von eukaryotischen und prokaryotischen Wirten beschrieben worden und kann für die Gentherapie, als auch für die einfache Klonierung oder Proteinexpression, verwendet werden.

Zu rekombinanten Klonierungsvektoren werden oftmals ein oder mehrere Replikationssysteme für die Klonierung oder Expression, ein oder mehrere Marker für die Selektion in dem Wirt, z.B. antibiotische Resistenz, und ein oder mehrere Expressionskassetten enthalten. Die inserierten Codierungssequenzen können mittels standardmäßiger Methoden synthetisiert, aus natürlichen Quellen isoliert oder als Hybride etc. präpariert werden. Die Ligation der Codierungssequenzen an tanskriptionsregulatorische Elemente und/oder an andere Aminosäure-codierende Sequenzen kann mittels bekannter Methoden erreicht werden. Geeignete Wirtszellen können transformiert/transfiziert/infiziert werden, je nach Eignung, mittels irgendeiner geeigneten Methode einschließlich der Elektroporation, CaCl2-vermittelten DNA-Aufnahme, fungaler Infektion, Mikroinjektion, Mikroprojektil und anderen etablierten Methoden.

Zu geeigneten Wirtszellen zählen Bakterien, Archebakterien, Pilze, insbesondere Hefe, und pflanzliche und tierische Zellen, insbesondere Säugerzellen. Von besonderem Interesse sind Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Neurospora, SF9-Zellen, C129-Zellen, 293-Zellen und CHO-Zellen, COS-Zellen, HeLa-Zellen und immortalisierte myeloide und lymphoide Säuger-Zelllinien. Zu bevorzugten Replikationssystemen zählen M13, ColE1, 2, ARS, SV40, Baculovirus, Lambda, Adenovirus und ähnliches. Eine große Zahl von Transkriptionsinitiations- und -terminations-regulatorischen Regionen ist isoliert und als effektiv in der Transkription und Translation heterologer Proteine in den verschiedenen Wirten gezeigt worden. Beispiele dieser Regionen, Methoden zur Isolierung, Methoden der Manipulation etc. sind im Fachgebiet bekannt. Unter geeigneten Expressionsbedingungen können Wirtszellen als einer Quelle von rekombinant produzierten C2/4GnT-abgeleiteten Peptiden und Polypeptiden verwendet werden.

Vektoren können vorteilhafterweise auch ein transkriptionsregulatorisches Element (d.h. einen Promotoren) umfassen, der an den C2/4GnT-codierenden Abschnitt operativ geknüpft ist. Der Promotor kann wahlweise Operator-Abschnitte und/oder ribosomale Bindungsstellen enthalten. Zu nicht-beschränkenden Beispielen der bakteriellen Promotoren, die mit E. coli kompatibel sind, zählen: &bgr;-Lactamase-(Penicillinase)-Promotor, Lactose-Promotor, Tryptophan-(trp)-Promotor, Arabinose-BAD-Operon-Promotor, Lambda-abgeleiteter P1-Promotor und N-Gen-ribosomale Bindungsstelle; und der Hybrid-tac-Promotor, abgeleitet von Sequenzen der trp- und lac-UV5-Promotoren. Zu nicht-beschränkenden Beispielen der Hefe-Promotoren zählen 3-Phosphoglyceratkinase-Promotor, Glyceraldehyd-3-Phophatdehydrogenase-(GAPDH)-Promotor, Galactokinase-(GAL1)-Promotor, Galactoepimerase-(GAL10)-Promotor, (CUP) Kupfer-cch- und Alkoholdehydrogenase-(ADH)-Promotor. Zu geeigneten Promotoren für Säugerzellen zählen, ohne Beschränkung, chirale Promotoren, wie z.B. der von Affenvirus 40 (SV40), Rous Sarkom-Virus (RSV), Adenovirus (ADV) und Rinderpapillom-Virus (BPV). Säugerzellen können ebenfalls Terminatorsequenzen und Poly A-Additionssequenzen erfordern, und Enhancer-Sequenzen, die die Expression erhöhen, können ebenfalls aufgenommen sein; Sequenzen, die die Amplifikation des Gens bewirken, können ebenfalls erwünscht sein. Weiterhin können Sequenzen, die die Sekretion des rekombinanten Produkts aus Zellen erleichtern, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Bakterien, Hefe und tierische Zellen, wie etwa sekretorische Signalsequenzen und/oder Prohormon-Proregionsequenzen, ebenfalls aufgenommen sein. Diese Sequenzen sind im Fachgebiet bekannt.

Nukleinsäuren, die Wildtyp- oder Varianten-Polypeptide codieren, können ebenfalls in Zellen mittels Rekombinationsereignissen eingeführt werden. Zum Beispiel kann solch eine Sequenz in eine Zelle eingeführt werden und dabei eine homologe Rekombination an der Stelle eines endogenen Gens oder einer Sequenz ohne wesentliche Identität zu dem Gen bewirken. Andere auf Rekombination basierende Methoden, wie nicht-homologe Rekombinationen oder die Deletion von endogenen Genen durch homologe Rekombination, können ebenfalls angewendet werden.

Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung finden Anwendung zum Beispiel als Sonden für den Nachweis von C2/4GnT in weiteren Spezies oder verwandten Organismen und als Templaten für die rekombinante Produktion von Peptiden oder Polypeptiden. Diese und weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind nachstehend ausführlicher beschrieben.

Polypeptide und Antikörper

Nukleinsäuren, die Protein-codierende Sequenzen umfassen, können zum Steuern der rekombinanten Expression von Polypeptiden in intakten Zellen oder in zellfreien Translationssystemen verwendet werden. Der bekannte genetische Code kann, sofern erwünscht, für eine effizientere Expression in einem gegebenen Wirtsorganismus maßgeschneidert, für die Synthetisierung von Oligonukleotiden, die die gewünschten Aminosäuresequenzen codieren, verwendet werden. Die Phosphoramidit-Festträger-Methode von Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185, die Methode von Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764:17078, oder andere wohlbekannte Methoden können für solch eine Synthese verwendet werden. Die resultierenden Oligonukleotide können in einen geeigneten Vektor eingeführt und in einem kompatiblen Wirtsorganismus exprimiert werden.

Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung, einschließlich der in SEQ ID NR. 2 beschriebenen Sequenz oder eines Fragments davon mit C2/4GnT-Aktivität, können aus nativen oder aus heterologen Organismen oder Zellen (einschließlich, doch nicht darauf beschränkt, Bakterien, Pilze, Insekten, Pflanzen und Säugerzellen) isoliert werden, in die eine Protein-kodierende Sequenz eingeführt und dort exprimiert worden ist. Weiterhin können die Polypeptide Teil eines rekombinanten Fusionsproteins sein.

Verfahren für die Polypeptid-Reinigung sind im Fachgebiet wohlbekannt, einschließlich, doch nicht darauf beschränkt, der präparativen diskontinuierlichen Gelelektrophorese, isoelektrischen Fokussierung, HPLC, Umkehrphasen-HPLC, Gelfiltration, Ionenaustausch- und Trennungschromatographie und der Gegenstromverteilung. Für einige Zwecke ist es bevorzugt, das Polypeptid in einem rekombinanten System zu produzieren, in welchem das Protein einen zusätzlichen Sequenz-Tag enthält, der die Reinigung erleichtert, wie etwa, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Polyhistidinsequenz. Das Polypeptid kann dann aus einem Rohlysat der Wirtszelle mittels Chromatographie an einer geeigneten Festphasen-Matrix gereinigt werden. Alternativ können Antikörper, die gegen ein Protein oder gegen davon abgeleitete Peptide produziert sind, als Reinigungs-Reagenzien verwendet werden. Weitere Reinigungsmethoden sind möglich.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Derivate der Polypeptide.

Die isolierten Polypeptide können zum Beispiel durch Phosphorylierung, Sulfierung, Acylierung oder andere Protein-Modifikationen modifiziert werden. Sie können auch mit einer Markierung modifiziert werden, die zur Lieferung eines nachweisbaren Signals, entweder direkt oder indirekt, in der Lage ist, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Radioisotope und Fluoreszenzverbindungen.

Core 2-O-Glykane sind an Zell-Zell-Adhäsionsereignissen durch Selektinbindung beteiligt, und die Core 2-beta6GlcNAc-Transferase-Aktivität ist für die Synthese der Selektin-Liganden erforderlich (11). Die Core 2-beta6GlcNAc-Transferase-Aktivität spielt daher eine Hauptrolle im Selektin-vermittelten Zell-Trafficking, einschließlich der Krebsmetastasierung. Da mindestens zwei unterschiedliche Core 2-Synthasen existieren, ist es erforderlich, zu definieren, welche von diesen an der Synthese von O-Glykanen in verschiedenen Zelltypen und an der Erkrankung beteiligt sind. Die Entwicklung von Inhibitoren individueller oder aller Core 2-Synthase-Aktivitäten kann in der Reduzierung oder Eliminierung von Core 2-O-Glykanen in Zellen und Geweben nützlich sein, und folglich die Hemmung der biologischen Ereignisse, an denen diese Liganden beteiligt sind. Die Hemmung von Transkription und/oder Translation der Core 2-beta6GlcNAc-Transferase-Gene kann dieselbe Wirkung haben. Verbindungen mit solchen Wirkungen können als Arzneimittel mit entzündungshemmender Aktivität und/oder zur Behandlung von Krebswachstum und -ausbreitung verwendet werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung ohne Beschränkung ihres Rahmens weiter veranschaulichen.

Beispiel 1 A. Identifizierung von zu C2/4GnT homologer cDNA durch Analyse der EST-Datenbank-Sequenzinformation

Datenbank-Durchsuchungen wurden mit der Codierungssequenz der humanen C2GnT-Sequenz (12) unter Verwendung der BLASTn- und tBLASTn-Algorithmen gegen die dbEST-Datenbank bei The National Center for Biotechnology Information, USA, vorgenommen. Der BLASTn-Algorithmus wurde zum Identifizieren von ESTs verwendet, die das fragliche Gen darstellen (Identitäten von 95 %), wohingegen tBLASTn zum Identifizieren nicht-identischer, jedoch ähnlicher EST-Sequenzen verwendet wurde. ESTs mit 50–90 % Nukleotidsequenz-Identität wurden als von der fraglichen Sequenz verschieden betrachtet. Komposite aus all der Sequenzinformation für jeden Satz von ESTs wurden zusammengestellt und auf die Sequenz-Ähnlichkeit zu humaner C2GnT analysiert.

B. Klonierung und Sequenzierung von C2/4GnT

EST-Klon 178656 (5'-EST-GenBank-Zugriffsnummer AA307800), abgeleitet von einem mutmaßlichen Homologon zu C2GnT, wurde erhalten von der American Type Culture Collection, USA. Die Sequenzierung dieses Klons ergab einen teilweise offenen Leserahmen mit signifikanter Sequenz-Ähnlichkeit zu C2GnT. Die Codierungsregion von humaner C2GnT und einem bovinen Homologon wurde zuvor als in einem Exon ((13) und unveröffentlichte Beobachtungen) organisiert festgestellt. Da die von der C2/4GnT-EST verfügbare 5'- und 3'-Sequenz unvollständig, doch wahrscheinlich in einem einzigen Exon lokalisiert war, wurden die fehlenden 5'- und 3'-Abschnitte des offenen Leserahmens durch Sequenzieren genomischer P1-Klone erhalten. Die P1-Klone wurden von einer genomischen Human-Vorhaut-P1-Bibliothek (DuPont Merck Pharmaceutical Co. Human Foreskin Fibroblast P1 Library) durch Screening mit dem Primerpaar TSHC27 (5'-GGAAGTTCATACAGTTCCCAC-3') (SEQ ID NR. 3) und TSHC28 (5'-CCTCCCATTCAACATCTTGAG-3') (SEQ ID NR. 4) erhalten. Zwei genomische Klone für C2/4GnT, DPMC-HFF#1-1026(E2) und DPMC-HFF#1-1091(F1), wurden erhalten von Genome Systems Inc. Die DNA von P1-Phage wurde präpariert, wie empfohlen von Genome Systems Inc. Die gesamte Codierungssequenz des C2/4GnT-Gens war in beiden Klonen repräsentiert und wurde unter Anwendung einer automatischen Sequenzierung (AB1377, Perkin-Elmer) vollständig sequenziert. Eine bestätigende Sequenzierung wurde an einem cDNA-Klon vorgenommen, erhalten mittels PCR (30 Zyklen bei 95°C für 15 sek.; 55°C für 20 sek. und 68°C für 2 min. 30 sek.) an Gesamt-cDNA von der humanen COLO 205-Krebszelllinie mit dem Sense-Primer TSHC54 (5'-GCAGAATTCATGGTTCAATGGAAGAGACTC-3') (SEQ ID NR. 7) und dem Antisense-Primer TSHC45 (5'-AGCGAATTCAGCTCAAAGTTCAGTCCCATAG-3) (SEQ ID NR. 5). Die zusammengesetzte Sequenz enthielt einen offenen Leserahmen von 1314 Basenpaaren, der ein mutmaßliches Protein von 438 Aminosäuren mit einer Typ 11-Domänenstruktur codierte, wie durch den TMpred-Algorithmus am Swiss Institute for Experimental Cancer Research (ISREC) (http://www.isrec-isb-isb.ch/software/TMPRED form.html) vorausgesagt. Die Sequenz des 5'-Endes der C2/4GnT mRNA, einschließlich der Translationsstartstelle und 5'-UTR, wurde durch „rapid amplification of 5'-cDNA ends" (35 Zyklen bei 94°C für 20 sek.; 52°C für 15 sek. und 72°C für 2 min.) unter Verwendung der Gesamt-cDNA von der humanen COLO 205-Krebszelllinie mit dem Antisense-Primer TSHC48 (5'-GTGGGAACTGTATGAACTTCC-3') (SEQ ID NR. 6) (2) erhalten.

Beispiel 2 A. Expression von C2/4GnT in Sf9-Zellen

Ein Expressionskonstrukt, das zur Codierung der Aminosäure-Reste 31–438 von C2/4GnT entworfen war, wurde mittels PCR unter Verwendung von P1 DNA und dem Primerpaar TSHC55 (5'-CGAGAATTCAGGTTGAAGTGTGACTC-3') (SEQ ID NR. 8) und TSHC45 (SEQ ID NR. 5) (2) präpariert. Das PCR-Produkt wurde in die EcoRI-Stelle von pAcGP67A (PharMingen) kloniert, und das Insert wurde vollständig sequenziert. Plasmide pAcGP67-C2/4GnT-sol und pAcGP67-C2GnT-sol wurden mit Baculo-GoldTM DNA (PharMingen) cotransfiziert, wie zuvor beschrieben (14). Rekombinantes Baculo-Virus wurde nach zwei sukzessiven Amplifikationen in Sf9-Zellen, gezüchtet in serumhaltigem Medium, erhalten, und die Virus-Titer wurden durch Titrierung in 24-Well-Platten unter Überwachung der Enzym-Aktivitäten bewertet. Die Kontrollen umfassten die pAcGP67-GalNAc-T3-sol (15).

B. Analyse der C2/4GnT-Aktivität

Standardmäßige Assays wurden unter Verwendung eines Kulturüberstands von infizierten Zellen in 50 &mgr;l Reaktionsgemischen, enthaltend 100 mM MES (pH 8,0), 10 mM EDTA, 10 mM 2-Acetamido-2-desoxy-D-glucono-1,5-lacton, 180 &mgr;M UDP-[14C]-GlcNAc (6.000 cpm/nmol) (Amersham Pharmacia Biotech) und den angegebenen Konzentrationen an Akzeptor-Substraten (Sigma and Toronto Research Laboratories Ltd., siehe Tabelle 1 für Strukturen), vorgenommen. Halbgereinigte C2/4GnT wurde in 50 &mgr;l-Reaktionsgemischen, enthaltend 100 mM MES (pH 7), 5 mM EDTA, 90 &mgr;M UDP-[14C]-GlcNAc (3.050 cpm/nmol) (Amersham Pharmacia Biotech) und die angegebenen Konzentrationen an Akzeptor-Substraten untersucht. Die Reaktionsprodukte wurden mittels Chromatographie auf Dowex AG1-X8 quantifiziert.

Beispiel 3 Organ-restringiertes Expressionsmuster von C2/4GnT

Gesamt-RNA wurde aus humanen Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsen-Adenokarzinom-Zelllinien AsPC-1, BxPC-3, Capan-1, Capan-2, COLO 357, HT-29 und PANC-1 wie im Wesentlichen beschrieben (17) isoliert. Fünfundzwanzig &mgr;g Gesamt-RNA wurden einer Elektrophorese auf einem denaturierenden 1 % Agarosegel unterzogen und auf Nitrocellulose übertragen, wie zuvor beschrieben (17). Das cDNA-Fragment der löslichen C2/4GnT wurde als einer Sonde für die Hybridisierung verwendet. Die Sonde wurde unter Verwendung von [&agr;32P]dCTP und einem Oligonukleotid-Markierungskit (Amersham Pharmacia Biotech) mit Zufallsprimer markiert. Die Membran wurde über Nacht bei 42°C sondiert, wie zuvor beschrieben (15), und zweimal für jeweils 30 min. bei 42°C mit 2 × SSC, 0,1 % SDS und zweimal für jeweils 30 min. bei 52°C mit 0,1 × SSC, 0,1 % SDS, gewaschen. Northern Blots aus mehreren humanen Geweben, MTN I und MTN II (CLONTECH), wurden wie oben beschrieben sondiert und zweimal für jeweils 10 min. bei Raumtemperatur mit 2 × SSC, 0,1 % SDS; zweimal für jeweils 10 min. bei 55°C mit 1 × SSC, 0,1 % SDS; und einmal für 10 min. mit 0,1 × SSC, 0,1 % SDS bei 55°C, gewaschen.

Beispiel 4 Genomische Struktur der Codierungsregion von C2/4GnT

Humane genomische Klone wurden von einer genomischen Human-Vorhaut-P1-Bibliothek (DuPont Merck Pharmaceutical Co. Human Foreskin Fibroblast P1 Library) durch Screening mit dem Primerpaar TSHC27 (5'-GGAAGTTCATACAGTTCCCAC-3') (SEQ ID NR. 3) und TSHC28 (5'-CCTCCCATTCAACATCTTGAG-3') (SEQ ID NR. 4) erhalten. Zwei genomische Klone für C2/4GnT, DPMC-HFF#1-1026(E2) und DPMC-HFF#1-1091(F1), wurden von Genome Systems Inc erhalten. Die DNA von P1-Phage wurde präpariert, wie von Genome Systems Inc empfohlen. Die gesamte Codierungssequenz des C2/4GnT-Gens war in beiden Klonen repräsentiert und wurde vollständig unter Anwendung einer automatischen Sequenzierung (AB1377, Perkin-Elmer) sequenziert. Die Intron/Exon-Grenzen wurden durch Vergleich mit den cDNA-Sequenzen bestimmt, wobei für die gt/ag-Regel optimiert wurde (Breathnach und Chambon, 1981).

Beispiel 5 Chromosomale Lokalisation von C2/4GnT: In situ-Hybridisierung an Metaphasen-Chromosome

P1 DNA wurde mit Biotin-14-dATP unter Verwendung des bio-NICK-Systems (Life Technologies) markiert. Die markierte DNA wurde mit Ethanol in Gegenwart von Heringsperma-DNA ausgefällt. Die ausgefällte DNA wurde gelöst und bei 80°C für 10 min. denaturiert, gefolgt von einer Inkubation für 30 min. bei 37°C, und wurde hitzedenaturierten Chromosomen-Spreads zugegeben, wo die Hybridisation über Nacht in einer Feuchtekammer bei 37°C durchgeführt wurde. Nach dem der Hybridisation folgenden Waschen (50 % Formamid, 2 × SSC bei 42°C) und Blockieren mit entrahmtem Trockenmilchpulver wurde die hybridisierte Sonde mit Avidin-FITC (Vector Laboratories) detektiert, gefolgt von zwei Amplifikationsschritten unter Verwendung von Kaninchen-Anti-FITC (Dako) und Maus-Anti-Kaninchen-FITC (Jackson Immunoresearch). Die Chromosomen-Spreads wurden in Ausbleichungs-verzögernder Lösung mit blauem Farbstoff DAPI aufgestellt.

Beispiel 6 Analyse des DNA-Polymorphismus des C2/4GnT-Gens

Primerpaare, wie in 8 beschrieben, sind für die PCR-Amplifikation individueller Sequenzen des codierenden Exons III verwendet worden. Jedes PCR-Produkt wurde subkloniert, und die Sequenz der 10 Klone, die das geeignete Insert enthielt, wurde bestimmt, wobei sichergestellt wurde, dass beide Allele jedes Individuums charakterisiert sind.

Literaturnachweise

  • 1. Clausen, H. and Bennett, E.P. A family of UDP-GalNAc: polypeptide N-acetylgalactosaminyl-transferases control the initiation of mucin-type O-linked glycosylation. Glycobiology, 6: 635-646, 1996.
  • 2. Piller, F., Piller, V., Fox, R.I, and Fukuda, M. Human T-lymphocyte activation is associated with changes in O-glycan biosynthesis J.Biol.Chem., 263: 15146-15150, 1988.
  • 3. Yang, J.M., Byrd, J.C., Siddiki, B.B., Chung, Y.S., Okuno, M., Sowa, M., Kim, Y.S., Matta, K.L., and Brockhausen, I. Alterations of O-glycan biosynthesis in human colon cancer tissues. Glycobiology, 4: 873-684, 1994.
  • 4. Yousefi, S., Higgins, E., Daoling, Z., Pollex-Kruger, A., Hindsgaul, O., and Dennis, J W. Increased UDP-GlcNAc:Gal beta 1-3GalNAc-R (GlcNAc to GalNAc) beta-1, 6-N-acetylglucosaminyltransferase activity in metastatic murine tumor cell lines Control of polylactosamine synthesis. J.Biol.Chem., 266: 1772-1782, 1991.
  • 5. Fukuda, M. Possible roles of tumor-associated carbohydrate antigens. Cancer Res., 56: 2237-2244, 1996.
  • 6. Brockhausen, I., Yang, J.M., Burchell, J., Whitehouse, C., and Taylor-Papadimitriou, J. Mechanisms underlying aberrant glycosylation of MUCI mucin in breast cancer cells. Eur.J.Biochem., 233: 607-617, 1995.
  • 7. Brockhausen, I., Kuhns, W., Schachter, H., Matta, K.L., Sutherland, D.R., and Baker, M.A. Biosynthesis of O-glycans in leukocytes from normal donors and from patients with leukemia: increase in O-glycan core 2 UDP-GlcNAc:Gal beta 3 GalNAc alpha-R (GlcNAc to GalNAc) beta(1-6)-N- acetylglucosaminyltransferase in leukemic cells. Cancer Res., 51: 1257-1263, 1991.
  • 8. Higgins, E.A., Siminovitch, K.A., Zhuang, D.L., Brockhausen, I., and Dennis, J.W. Aberrant O-linked oligosaccharide biosynthesis in lymphocytes and platelets from patients with the Wiskott-Aldrich syndrome. J.Biol.Chem., 266: 6280-6290, 1991.
  • 9. Saitoh, O., Piller, F., Fox, R.I, and Fukuda, M. T-lymphocytic leukemia expresses complex, branched O-linked oligosaccharides on a major sialoglycoprotein, leukosialin. Blood, 77: 1491-1499, 1991.
  • 10. Springer, G.F. T and Tn, general carcinoma autoantigens. Science, 224: 1198-1206, 1984.
  • 11. Kumar, R., Camphausen, R.T., Sullivan, F.X., and Cumming, D.A. Core2 beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase enzyme activity is critical for P-selectin elycoprotein ligand-1 binding to P-selectin. Blood, 88: 3872-3879, 1996.
  • 12. Bierhuizen, M.F. and Fukuda, M. Expression cloning of a cDNA encoding UDP-GlcNAc:Gal beta 1-3-GalNAc-R (GlcNAc to GalNAc) beta 1-6GlcNAc transferase by gene transfer into CHO cells expressing polyoma large tumor antigen Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 89: 9326-9330, 1992.
  • 13. Bierhuizen, M.F., Maemura. K., Kudo, S., and Fukuda, M: Genomic organization of core 2 and I branching beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferases. Implication for evolution of the beta- 1,6-N-acetylglucosaminyltransferase gene family. Glycobiology, 5: 417-425, 1995.
  • 14, Almeida, R., Amado, M., David, L., Levery, S.B., Holmes, E.H., Merkx, G., van Kessel, A.G., Rygaard, E., Hassan, H., Bennett, E., and Clausen, H. A family of human beta4-galactosyltransferases. Cloning and expression of two novel UDP-galactose:beta-n-acetylglucosamine betal, 4-galactosyltransferases, beta4Gal-T2 and beta4Gal-T3. J.Biol.Chem., 272: 31979-31991, 1997.
  • 15. Bennett, E.P., Hassan, H., and Clausen, H: cDNA cloning and expression of a novel human UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine. Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase, GalNAc-t3: J.Biol.Chem., 271: 17006-17012, 1996.
  • 16. Wandall, H.H., Hassan, H., Mirgorodskaya, E., Kristensen, A.K., Roepstorff, P., Bennett, E.P., Nielsen, P.A., Hollingsworth, M.A., Burchell, J., Taylor-Papadimitriou, J., and Clausen, H. Substrate specificities of three members of the human UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase family; GalNAc-T1, -T2, and -T3. J.Biol.Chem., 272:23503-23514, 1997.
  • 17. Sutherlin, M.E., Nishimori, I., Caffrey, T., Bennett, E.P., Hassan, H., Mandel, U., Mack, D., Iwamura, T., Clausen, H., and Hollingsworth, M.A. Expression of three UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide GalNAc N-acetylgalactosaminyltransferases in adenocarcinoma cell lines. Cancer Res., 57: 4744-4748, 1997.


Anspruch[de]
Isolierte Nukleinsäure, die eine UDP-N-Acetylglucosamin: Galactose-&bgr;1,3-N-acetylgalactosamin-&agr;-R/N-Acetylglucosamin-&bgr;1,3-N-acetylgalactosamin-&agr;-R &bgr;1,6-N-acetylglucosaminyltransferase (C2/4GnT) mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 oder ein Fragment davon mit C2/4GnT-Aktivität codiert. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure DNA ist. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei die DNA cDNA ist. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei die DNA genomische DNA ist. Isolierte Nukleinsäure, wie in einem der Ansprüche 1-4 definiert, wobei die Nukleinsäure die Sequenz der Nukleotide 1-2319 in SEQ ID NR. 1 umfasst. Isolierte Nukleinsäure, wie in einem der Ansprüche 1-5 definiert, wobei die Nukleinsäure die Sequenz der Nukleotide 496-1812 in SEQ ID NR. 1 umfasst. Isolierte Nukleinsäure, wie in einem der Ansprüche 1-6 definiert, wobei die Nukleinsäure die Sequenz der Nukleotide 586-1812 in SEQ ID NR. 1 umfasst. Isolierte Nukleinsäure, wie in einem der Ansprüche 1-7 definiert, die ein C2/4GnT-Polypeptid codiert, dem die Transmembrandomäne fehlt, mit der Aminosäuresequenz der Aminosäuren 31-438 in SEQ ID NR. 2. Nukleinsäure-Vektor, umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1-8. Vektor nach Anspruch 9, wobei die Nukleinsäure an ein transkriptionsregulatorisches Element operativ geknüpft ist. Zelle, umfassend einen Vektor nach Anspruch 9 oder 10. Zelle nach Anspruch 11, wobei die Zelle mit dem Vektor stabil transfiziert ist. Zelle nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Zelle enzymatisch aktive C2/4GnT produziert. Zelle, wie in einem der Ansprüche 11-13 definiert, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Vogel- und Säugerzellen. Zelle nach Anspruch 14, wobei die Zelle Sf9 ist. Zelle nach Anspruch 14, wobei die Zelle CHO ist. Zelle nach Anspruch 14, wobei die Zelle ein Bakterium ist. UDP-N-Acetylglucosamin: Galactose-&bgr;1,3-N-acetylgalactosamin-&agr;-R/N-Acetylglucosamin-&bgr;1,3-N-acetylgalactosamin-&agr;-R&bgr;1,6-N-acetylglucosaminyltransferase (C2/4GnT)-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 oder ein Fragment davon mit C2/4GnT-Aktivität. Polypeptid nach Anspruch 18, dem die Transmembrandomäne fehlt, mit der Sequenz der Aminosäuren 31-438 in SEQ ID NR. 2. Fusionspolypeptid, das die C2/4GnT-enzymatische Aktivität beibehält, bestehend zumindest aus der Sequenz der Aminosäuren 31-438 in SEQ ID NR. 2, fusioniert in-frame an eine zweite Sequenz. Fusionspolypeptid nach Anspruch 20, wobei die zweite Sequenz einen Affinitätsliganden oder eine reaktive Gruppe umfasst. Verfahren zum Herstellen eines C2/4GnT-Polypeptids nach einem der Ansprüche 18-21, welches umfasst:

(i) Einführen in eine Wirtszelle eines isolierten DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1-8, oder eines DNA-Konstrukts, umfassend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1-8;

(ii) Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die für die C2/4GnT-Expression geeignet sind; und

(iii) Isolieren von durch die Wirtszelle erzeugter C2/4GnT.
Verfahren zum Identifizieren von DNA-Sequenzvariationen in der Codierungsregion (Exon III) des C2/4GnT-Gens nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Isolieren von DNA aus Zellen, die einem Patienten entnommen worden sind;

(ii) Amplifizieren von C2/4GnT-genomischen Regionen der Nukleinsäure nach Anspruch 1 mittels PCR; und

(iii) Nachweisen des Vorhandenseins der DNA-Sequenzvariation mittels DNA-Sequenzierung, Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP) oder Fehlpaarungs-Mutation.
Verfahren zum Modifizieren eines Substrats, umfassend einen O-verknüpften Core 1-(Gal&bgr;1-3GalNAc&agr;1-R)- und/oder Core 3-(GlcNAc&bgr;1-3GalNAc&agr;1-R)-Akzeptor, umfassend das Kontaktieren des Substrats mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 18-21 unter Bedingungen, die die Addition von Core 2- und/oder Core 4 GlcNAc-Verknüpfungen an den Akzeptor erlauben.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com