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Dokumentenidentifikation DE102005018845B4 16.05.2007
Titel Miniaturisierte und multifunktionale optosensorische Meß- und Regelschleuse
Anmelder Gansert, Dirk, Dr., 40231 Düsseldorf, DE
Erfinder Gansert, Dirk, Dr., 40231 Düsseldorf, DE
DE-Anmeldedatum 22.04.2005
DE-Aktenzeichen 102005018845
Offenlegungstag 26.10.2006
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 16.05.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.05.2007
IPC-Hauptklasse G01N 33/483(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
IPC-Nebenklasse G01N 21/05(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   G01N 33/48(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   G01N 35/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   G01N 33/497(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   B01L 3/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   G01N 21/64(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft eine miniaturisierte und multifunktionale optosensorische Mess- und Regelschleuse zur minimalinvasiven Prozessanalyse mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in biologischen und abiotischen Systemen und zur experimentellen Manipulation physiko-chemischer und biologischer Parameter als ein innovatives Werkzeug, das gegenüber konventionellen Messvorrichtungen entscheidende Vorteile zum Zwecke der in situ Bio-Prozessanalyse bietet.

Der Fortschritt zur Quantifizierung von Lebensprozessen unter natürlichen Umweltbedingungen im Freiland als auch unter kontrollierten Bedingungen im Labor erfordert heute den Einsatz von Techniken und Sensoren, die sich durch Miniaturisierung, Präzision, Langlebigkeit und minimale Störung des zu untersuchenden Systems auszeichnen. Die berührungsfreie und daher auch kontaminationsfreie Messung ist das Ziel der minimalinvasiven Untersuchung, wozu optische Sensoren erstmals in der Lage sind. Miniaturisierung und minimalinvasiver Eingriff in das zu untersuchende System sind zwei wesentliche Voraussetzungen für den Fortschritt des Verständnisses über den koordinierten Ablauf von Lebensprozessen in räumlich und zeitlich hoher Auflösung. Faseroptische Sensoren mit wenigen Mikrometer Durchmesser (Optoden) repräsentieren den aktuellen Stand der Messtechnik im mikroskaligen Maßstab zur Quantifizierung biologisch relevanter physiko-chemischer Parameter, wie z.B. des Sauerstoffpartialdrucks (PreSens Precision Sensing GmbH, Regensburg): Desweiteren können auch die Temperatur, der CO2-Partialdruck, der pH-Wert oder der Chlorophyllgehalt grüner Pflanzen optisch quantifiziert werden.

Hybridoptoden repräsentieren die neueste Generation optischer Sensoren, deren Markteinführung in ein bis zwei Jahren zu erwarten ist (HYBOP Forschungsverbundprojekt des BMBF-Schwerpunktprogramms BIOPHOTONIK an der Universität Düsseldorf. Hybridoptoden können mittels analytspezifischer Mikropartikel jeweils zwei physiko-chemische Parameter gleichzeitig und im molekularen Maßstab ortsidentisch messen. Durch den Hybridcharakter wird die Zahl der für eine Prozessanalyse erforderlichen Sensoren halbiert, wodurch ein entscheidender methodischer Fortschritt erzielt wird. So kann z.B. mit nur einer CO2-O2-Hybridoptode der respiratorische Quotient von Zellkulturen, Geweben und Organen aus der simultanen Messung des metabolischen O2-Verbrauchs und der CO2-Produktion bestimmt werden.

Im Gegensatz zu konventionellen Sensoren zeichnet sich die neue optische Sensortechnologie neben der Miniaturisierung vor allem durch die Unabhängigkeit der Messung vom Aggregatszustand des Analyten aus. Mit optischen Sensoren sind Messungen in der wässrigen und gasförmigen Phase gleichermaßen möglich, wohingegen konventionelle Messverfahren durch den Aggregatszustand des Analyten definiert werden. Dies wird im folgenden für biologisch relevante Messgrößen erläutert.

In wässriger Phase werden CO2 und O2 elektrochemisch mittels Elektroden gemessen (z.B. Clark-Type O2-Elektrode oder CO2-Elektrode der Fa. Microelectrodes Inc., Bedford, USA). Der Nachteil elektrochemischer Messungen liegt im Verbrauch einer gewissen Analytmenge durch den Messvorgang selbst, so dass eine durch das Messinstrument unbeeinflusste Prozessanalyse nicht gewährleistet ist. Ebenso ist die Langzeitstabilität elektrochemischer Sensoren eingeschränkt.

Messungen in der Gasphase werden mit Gasanalysatoren (Absolut- oder Differenzmessungen) oder auch Gaschromatographen durchgeführt, die für die Spurengasanalytik geeignet sind. Konventionell werden für die CO2-Analyse Infrarotgasanalysatoren (IRGA) eingesetzt, deren Genauigkeit im Bereich von ± 1-2 ppm liegt. Für die Messgenauigkeit mittels Gasanalysatoren sind jedoch definierte Massenflussraten ausschlaggebend, die mit einer aufwendigen Mess-und Regeltechnik erzeugt werden. Daher sind solche Systeme sehr teuer und wartungsintensiv. Räumlich hochauflösende Messungen in Geweben und Organen können damit ebenfalls nicht durchgeführt werden. Da es sich um offene Messsysteme handelt, können sie auch nicht unter Sterilbedingungen eingesetzt werden. Die Gasanalyse mit Gaschromatographen ist technisch aufwendig, kosten- und zeitintensiv. Ferner ist ihr Einsatz für Feldmessungen nur mit hohem infrastrukturellen Aufwand (Labormesswagen, Stromversorgung, Explosionsschutz etc.) zu bewerkstelligen.

Puls-Amplituden-Modulations (PAM) Fluorometer (Fa. Walz, Effeltrich, Deutschland; LI-COR Inc., Lincoln, USA) zur physiologischen Charakterisierung der Photosynthese grüner Pflanzen entspricht dem Stand der Technik im Bereich der Bio-Prozessanalyse. In den Pflanzenwissenschaften hat sich die Chlorophyllfluoreszenzanalyse als leistungsfähige Methode etabliert. Einschränkend wird jedoch bei dieser Methode die tatsächliche photosynthetische O2-Produktion und die CO2-Fixierung nicht gemessen, sondern aus der Fluoreszenzintensität als Maß für die photochemische Ladungstrennrate der Antennenpigmente der Photosysteme berechnet. Eine Hybridoptode für die simultane Messung des Chrlorophyllgehalts und der O2-Produktion ist eine praktikable quantitative und zugleich deutlich kostengünstigere Alternative zum fluorometrischen Verfahren.

Elektronische Messungen der Temperatur werden meist mit Absoluttemperatursensoren (Pt 100, Pt 1000) oder referenzabhängigen Thermocouples durchgeführt. Mit letzteren wird eine Miniaturisierung bis ca. 0.2 mm Durchmesser erzielt (z.B. World Precision Instruments Inc., Sarasota, USA), wobei jedoch eine zusätzliche Referenzmessstelle der Absoluttemperatur erforderlich ist. Dagegen können mit temperatursensitiven Mikropartikeln räumlich hochauflösende Messungen der Temperatur durchgeführt werden, die lediglich von den Dimensionen des Trägers der temperatursensitiven Beschichtung abhängt.

Das den Sensoren zugrundeliegende Messprinzip definiert maßgeblich die technische Ausführung geschlossener Messzellen oder Durchflussmesszellen mit multipler Sensorbestückung. Als Beispiel sei die Ausführung einer multiplen Sensorvorrichtung genannt, US 2005/0016260 A1, die der physiko-chemischen Analyse von Flüssigkeiten dient, jedoch für die Analyse von Gasen ungeeignet ist. Diesem Beispiel entsprechend, gibt es eine Reihe von Veröffentlichungen, die unterschiedliche Lösungen multipler Sensormessung vorstellen. Davon beschreiben die DE 100 38 706 A1 und die DE 34 44 823 C2 Adaptersysteme für Lichtleiter, die EP 05 77 084 A2 und die DE 37 18 066 A1 beschreiben Systeme zur elektronischen Steuerung von Mikromanipulatoren. Die DE 196 17 964 A1 und DE 297 01 652 U1 beschreiben Kontaktmesszellen, bei denen eine poröse Membran das zu untersuchende Medium von der eigentlichen Messzelle trennt. Die zu messenden Stoffe, wie z.B. flüchtiges Ethanol, permeieren durch die Membran hindurch in die Messzelle und werden dort mit analytspezifischen Sensoren quantifiziert. Diese Kontaktmesszellen berühren nicht die der Mess- und Regelschleuse zugrundeliegende technische Problemstellung einer minimalinvasiven Applikation von Mikrosensoren und -werkzeugen in lebenden und abiotischen Systemen zur dreidimensionalen in vivo Prozessanalyse, zur Mikropräparation, zur experimentellen Manipulation und zur Probennahme, auch unter Wahrung der Sterilität.

Andere Druckschriften, z.B. EP 03 71 953 A2, DE 43 05 405 C1, DE 33 17 551 A1, US 46 40 820 und US 49 11 794 beschreiben Durchflussmesszellen, vergleichbar der im oben genannten US 2005/0016260 A1. Diesen Messzellen gemeinsam, liegt die technische Problemstellung der Messung einzelner oder mehrerer physikochemischer Parameter in Flüssigkeiten und/oder Gasen mit verschiedenartigen Sensoren zugrunde, die die Messzellen durchströmen.

Allerdings sind diese Vorrichtungen i.d.R. als monophasische Systeme ausgelegt, entweder für die gasförmige oder die wässrige Stoffanalyse. Ferner sind multiple Sensorsysteme zum Zwecke der Analytik nur als geschlossene Messzellen oder als Durchflussmesszellen konzipiert. Eine integrative technische Lösung, die über die Funktion einer Messzelle hinaus eine funktionale Synergie aus

  • 1) multipler Mikrosensorik,
  • 2) minimalinvasiver Präparation und Sensorapplikation zur online Messung unter in vivo Bedingungen und
  • 3) experimenteller Manipulation im Freiland und Labor schafft, wie sie in der vorliegenden Mess- und Regelschleuse realisiert ist, liegt bisher nicht vor.

Zusammenfassend ergeben sich aus den genannten spezifischen Mängel konventioneller Sensoren und zugehöriger multipler Messzellen zwei maßgebliche technische Defizite, die den Anforderungen moderner Bio-Prozessanalyse nicht genügen:

  • 1) die durch den Aggregatszustand des Analyten festgelegten Messprinzipien und den daraus resultierenden Unzulänglichkeiten der Messung sowie den stark eingeschränkten Einsatzmöglichkeiten;
  • 2) die unzureichende Miniaturisierung für den minimalinvasiven Einsatz.

Als Beispiel sei die Messung des CO2-Partialdruckes im Blattgewebe höherer Pflanzen genannt. Obwohl CO2 das Substrat der Photosynthese aller grünen Pflanzen ist, besteht bisher keine Möglichkeit der unmittelbaren Messung des CO2-Partialdruckes im Blattinneren. Er wird näherungsweise aus dem atmosphärischen CO2-Partialdruck und der stomatären Leitfähigkeit berechnet. Optische Sensoren, die mittels einer Schleuse in den Gasraum der Blätter eingeführt werden, bieten hier eine adäquate Problemlösung. In Anbetracht der Eigenschaft von CO2 als klimarelevantes Treibhausgas ist der Fortschritt zum Verständnis der räumlichen und zeitlichen Heterogenität photosynthetischer CO2-Fixierung als Bioprozess in grünen Pflanzen unter natürlichen Bedingungen von großer Bedeutung.

Mikrosensoren, insbesondere optische Mikrosensoren (Optoden) sind aufgrund ihrer extremen Miniaturisierung sehr empfindliche Messinstrumente, die keinen mechanischen Belastungen bei der Applikation und während des Messvorgangs ausgesetzt werden dürfen. Daraus ergeben sich für den Anwender zahlreiche Probleme bei der Durchführung minimalinvasiver Prozessanalysen hinsichtlich:

  • a) ihrer sicheren Applikation sowie der mikroskalig exakten und reproduzierbaren Positionierung in dem zu untersuchenden Objekt;
  • b) dem Schutz vor Beschädigung der Sensoren durch mechanische Beanspruchung während des Messvorgangs, eine entscheidende Voraussetzung für Langzeituntersuchungen (Wochen – Monate);
  • c) der Erfordernis zur Applikation mehrerer Sensoren unterschiedlicher Analytspezifität auf kleinstem Raum;
  • d) der Messung mehrerer Parameter in einem sehr kleinen Probenvolumen (nur wenige Mikroliter);
  • e) der mikromanipulativen Präparation unter sensorischer Kontrolle und Wahrung der Sterilität.

Will der Anwender über online Messungen hinaus, experimentelle Manipulationen vornehmen, einschließlich Probenentnahme und/oder Stoffapplikation, so muss stets eine spezielle Vorrichtung geschaffen werden, die den jeweiligen messtechnischen Erfordernissen Rechnung trägt. Dies gilt insbesondere für Untersuchungen im Freiland unter variablen Umweltbedingungen.

Die je spezifischen methodischen Probleme zu lösen ist technisch anspruchsvoll, zeit- und kostenintensiv und kann vielerorts mangels Infrastruktur (feinmechanische und elektrotechnische Werkstätten) und fachlicher Qualifikation nicht realisiert werden.

Die multifunktionale optosensorische Mess- und Regelschleuse mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1, bietet eine integrative technische Lösung, die die genannten Anforderungen erfüllt und dadurch dem Anwender ein breites methodisches Spektrum zu minimalinvasiver Prozessanalyse eröffnet. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Bei dieser Vorrichtung wird ein massiver zylindrischer Körper (Sensorgehäuse) mit horizontal umlaufender Nut in der unteren Hälfte und abgeschrägter Oberkante (Schrägfläche, 45° geneigt) drehbar und dichtend in eine zylindrische Wanne (Trägerteller) passgenau eingesetzt. In die untere plane Fläche des Sensorgehäuses ist mittig ein kleiner Hohlraum in Form einer Halbkugel (Messkammer) eingesenkt. In geringem konzentrischen Abstand zum Umkreis der Messkammer befindet sich ein Einstich mit Dichtungsring. Ein in die Bodenfläche des Sensorgehäuses vollständig eingesenktes ringförmiges Peltierelement, dessen innere Öffnung an den Dichtungsring angrenzt, erlaubt die elektronische Regulation der Temperatur in der Messkammer und in dem zu untersuchenden System im Bereich der Auflagefläche der Mess- und Regelschleuse. Das Peltierelement wird über einen PID-Regler (proportional, integral und differential) gesteuert, der drei Betriebsmodi der Temperaturregelung erlaubt: 1) eine mit der Umgebungstemperatur synchrone Nachlaufregulation, 2) eine von der Umgebungstemperatur um einen konstanten Betrag abweichende Nachlaufregulation und 3) eine von der Umgebungstemperatur unabhängige konstante Temperaturvorgabe. Diese Optionen zur thermischen Kontrolle sind vor allem für die Prozessanalyse im Freiland von großer Bedeutung.

Auf der kreisrunden Wand des Trägertellers sind drei um 120° versetzte sichelförmige Lamellen montiert, die unter einem Führungsring horizontal schwenkbar gelagert sind. Die Drehbarkeit des Sensorgehäuses im Trägerteller wird dadurch erreicht, in dem die Lamellen in die Nut des Sensorgehäuses eingeschwenkt werden. Hierzu muss das Sensorgehäuse mit leichtem Druck auf die Bodenplatte des Trägertellers angepresst werden, wodurch die Messkammer zur Bodenplatte hin abgedichtet wird. Der Führungsring dient hierbei als Widerlager.

Bleibt der Boden des Trägertellers geschlossen, so ist die Mess- und Regelschleuse als geschlossene Messzelle oder als Durchflussmesszelle zu betreiben (siehe unten). Steht die Messkammer über eine verschließbare Öffnung in der Bodenplatte mit einem biologischen oder abiotischen System in Verbindung, dann fungiert die Mess- und Regelschleuse als Regelschleuse. Über die zentrale Öffnung in der Bodenplatte werden Sensoren und Mikrowerkzeuge durch die Messkammer hindurch im Untersuchungsobjekt positioniert. Zur Gewährleistung einer dichtenden Verbindung zwischen Schleuse und Untersuchungsobjekt wird zuerst der Trägerteller mit Hilfe einer eigens dafür konstruierten Exzenterspannvorrichtung am Objekt fixiert. Danach wird das Sensorgehäuse in den Trägerteller eingesetzt.

Das Sensorgehäuse ist mit mehreren Bohrungen verschiedener Durchmesser versehen. Eine zentrale Bohrung in der Vertikalachse des Sensorgehäuses trifft die Messkammer am Scheitelpunkt der Kalotte. Weitere Bohrungen sind radiärsymmetrisch im Winkel von 45° zur Vertikalen angeordnet und führen in gleichen Abständen von der Schrägfläche des Sensorgehäuses auf die Kalotte der Messkammer. Mit einer Ausnahme haben die Achsen aller Bohrungen den geometrischen Mittelpunkt der Messkammer als gemeinsamen Schnittpunkt. Die Ausnahme ist eine Bohrung, deren Achse den 'Äquator' der Messkammer schneidet. Mit einem Ventil versehen, fungiert diese Bohrung als Auslassöffnung zum rückstandsfreien Befüllen der Messkammer mit Flüssigkeiten oder Gasen in vertikaler Position. Die Entnahme von Gas- oder Flüssigkeitsproben sowie die Applikation chemischer Substanzen erfolgt ebenfalls über diese Öffnung. Mehrere der radiärsymmetrisch angeordneten Bohrungen fungieren als Kanülen, durch die Sensoren oder/und Mikrowerkzeuge von aussen in die Messkammer und in das Untersuchungsobjekt eingeführt und gasdicht positioniert werden. Mittels eines Mikrometervorschubs können alle Sensoren und Mikrowerkzeuge individuell längs der Bohrachsen exakt und reproduzierbar vor- und zurück bewegt werden. Zwei weitere Bohrungen sind ebenfalls mit Ventilen versehen. Eine dient dem Befüllen der Messkammer mit Flüssigkeiten und Gasen, während die andere für die Druckregulation in der Messkammer zur Verfügung steht.

Durch die Wahl des Mittelpunktes der Messkammer als gemeinsamen Schnittpunkt der Kanülen bietet die Mess- und Regelschleuse drei verschiedene Verwendungsmöglichkeiten zur Prozessanalyse:

  • a) als geschlossene Messzelle zur simultanen Messung physiko-chemischer und biologischer Parameter in einem sich in der Messkammer befindlichen gasförmigen oder flüssigen Medium. In diesem Modus ist die Öffnung des Trägertellers verschlossen und der Stoffaustausch in der Messzelle erfolgt über die Ein- und Auslassventile. Die Sensoren werden auf der Kalotte der Messkammer positioniert. Da nur der Eigendurchmesser der Sensoren den minimalen Abstand zueinander auf der Kalotte definiert, kann durch den Einsatz von Hybridoptoden die Zahl der in derselben Probe gleichzeitig zu erfassenden Parameter auf engstem Raum verdoppelt werden. Diese Messanordnung eignet sich besonders zur Analyse sehr kleiner, nur wenige Mikroliter betragende Probenmengen eines gasförmigen oder flüssigen Stoffes oder Stoffgemisches, das in die Messkammer eingeleitet wird.
  • b) als Durchflussmesszelle mit geschlossenem Trägerteller und geöffneten Ein- und Auslassventilen oder im Bypass-Modus. Hierzu ist die Messkammer bei geschlossenen Ventilen aber geöffnetem Trägerteller mit dem Untersuchungsobjekt verbunden und der Stofftransport erfolgt als Bypass vom Untersuchungsobjekt durch die Messkammer und wieder zurück.
  • c) als Regelschleuse zur ortsidentischen, sukzedanen Messung physiko-chemischer und biologischer Parameter und Mikropräparation in biologischen oder abiotischen Systemen. In dieser Konfiguration ist die Mess- und Regelschleuse über die Öffnung im Trägerteller mit dem Untersuchungsobjekt verbunden. Mittels Mikrometervorschub werden die auf der Schrägfläche des Sensorgehäuses angeordneten Sensoren und Mikrowerkzeuge nacheinander in das Untersuchungsobjekt eingeführt. Die Drehbarkeit des Sensorgehäuses ist die konstruktive Voraussetzung zur freien Wahl der Messstelle im Untersuchungsobjekt auf einem Umkreis, dessen Länge sich aus dem Winkel der Kanülen zur Horizontalen und der Tiefe der Messstelle im Objekt ergibt. Dadurch kann mit zunehmender Tiefe ein dreidimensionales Raster von Messpunkten erstellt werden, das sich kegelförmig in das Untersuchungsobjekt hinein erstreckt. Über die vertikale Kanüle des Sensorgehäuses kann ein weiterer Sensor senkrecht zur Oberfläche in das Untersuchungsobjekt appliziert werden, wodurch Messungen entlang der Rotationsachse des kegelförmigen Messsektors möglich sind. Dies ist die einfachste Variante zur Erfassung einer Messgröße in einem Untersuchungsobjekt, entweder in konstanter Tiefe oder im vertikalen Gradienten. Darüber hinaus dient die vertikale Kanüle der exakten Positionierung von Mikroendoskopen und -werkzeugen für die Mikropräparation im Untersuchungsobjekt.

Die Vorrichtung bietet mehrere Vorteile. Die Konstruktion der optosensorischen Mess- und Regelschleuse basiert auf einer integrierenden technischen Problemlösung für die sehr unterschiedlichen Anforderungen an die Applikation von Mikrosensoren und Mikrowerkzeugen für die biologische und physiko-chemische Prozessanalyse und deren experimentellen Manipulation im Freiland und im Labor. Die Mess- und Regelschleuse bietet dem Anwender ein breites Spektrum von Einsatzmöglichkeiten, die neue Wege des minimalinvasiven Zugangs in biologische und abiotische Systeme eröffnet, wie sie bisher nicht möglich waren. Für die Forschung und für die anwendungsorientierte Praxis bietet die Mess- und Regelschleuse gegenüber konventionellen Systemen entscheidende Vorteile, die durch folgende Qualitätskriterien belegt sind:

  • 1) multifunktionale Verwendung durch:

    a) Miniaturisierung (Kammervolumen 35 &mgr;l),

    b) Funktion als geschlossene Messzelle, Durchflussmesszelle und regelbare Schleuse im Kontakt mit dem Untersuchungsobjekt,

    c) einfache und schnelle Montage am Untersuchungsobjekt (plug & play),

    d) Einsatz im Freiland und Labor, unter atmosphärischen und aquatischen Bedingungen;
  • 2) simultanes Messen mehrerer physiko-chemischer und biologischer Parameter in derselben Probe:

    a) Biotischen oder abiotischen Charakters,

    b) in direkter Kommunikation mit dem Untersuchungsobjekt (Bypass-Modus),

    c) im gasförmigen oder flüssigen Zustand,

    d) in strömender oder ruhender Phase;
  • 3) minimalinvasive Sensorapplikation und Mikropräparation unter sensorischer Kontrolle und Sterilbedingungen;
  • 4) individuelle Positionierung von Sensoren und Werkzeugen durch Mikrometervorschub ohne Kabelverdrillung;
  • 5) Gewährleistung langfristiger Messreihen durch sicheres Sensor-housing und maximalem Schutz der Sensoren vor mechanischer Belastung;
  • 6) experimentelle Manipulation am Untersuchungsobjekt durch Veränderung physikochemischer und biologischer Parameter unter online Messung;
  • 7) druckkompensierte Probenentnahme und Stoffzugabe.

Die Mess- und Regelschleuse wird nunmehr an Hand eines Ausführungsbeispiels mit Hilfe der Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:

1: Schemazeichnung der Mess- und Regelschleuse im Querschnittsprofil (oben) und in Aufsicht (unten), nicht maßstabsgetreu.

2: Darstellung des Sensorgehäuses der Mess- und Regelschleuse.

3: Darstellung des Trägertellers zur Aufnahme des Sensorgehäuses.

4: Darstellung der Exzenterspannvorrichtung zur Fixierung der Mess- und Regelschleuse an einem Untersuchungsobjekt.

5: Darstellung des Mikrometervorschubs zur Positionierung von Mikrosensoren und -werkzeugen durch die Messkammer der Mess- und Regelschleuse ins Untersuchungsobjekt.

Im folgenden wird eine spezifische technische Ausführung der optosensorischen Mess- und Regelschleuse bechrieben und in ihrer Funktionsweise am Beispiel der Applikation optischer Mikrosensoren (O2- und CO2-Optoden) im Splintholz von Bäumen zur Quantifizierung der Gaspartialdrücke unter Vermeidung von Embolien und dadurch der Aufrechterhaltung des Transpirationsstroms beschrieben.

Die Übersichtszeichnung (1) illustriert in vereinfachter Darstellung die wesentlichen Komponenten der Mess- und Regelschleuse. Im Querschnittsprofil (oberes Schema) ist das drehbare Sensorgehäuse 12 mit Messkammer 16 und Peltierelement 11 zu sehen, das in den Trägerteller 19 eingesetzt und mit dem 3-teiligen Lamellenverschluss 10 arretiert ist. Über eine kleine Öffnung in der Bodenplatte erfolgt ein gasförmiger oder flüssiger Stoffaustausch zwischen der Messkammer und einem lebenden oder abiotischen System 20 (Schleusenfunktion). Mikrosensoren 13, 15, 17 werden durch Bohrungen 16 im Sensorgehäuse 12 in die Messkammer 16 gasdicht eingeführt. Mit Hilfe eines umsteckbaren Mikrometervorschubs 14 können alle Mikrosensoren und -werkzeuge durch die Messkammer hindurch im Untersuchungsobjekt exakt positioniert werden. Die Anordnung der Sensoren 13, 15, 17 im Sensorgehäuse 12 erlaubt die Erstellung eines kegelförmigen Rasters von Messpunkten, das sich mit zunehmendem Durchmesser in die Tiefe des Untersuchungsobjekts erstreckt. Die Aufsicht (unteres Schema) zeigt das uhrenförmige Gehäuse des Trägertellers 19 mit den sichelförmigen Lamellen 10 sowie eine optionale Belegung der Messkammer mit Sensoren durch die Bohrungen 16. Die Ein- und Auslassventile zu Bohrungen 7, 9 und die Öffnung 8 zur Druckregulation in der Messkammer 16 sind ebenfalls abgebildet.

Das Sensorgehäuse 12 (d = 30 mm), hier aus PEEK-Kunststoff gefertigt, ist mit insgesamt neun Bohrungen 19 verschiedener Durchmesser (d = 1 – 2.4 mm ) versehen. Die zentrale Bohrung 6 (d = 2.4 mm) in der Vertikalachse des Sensorgehäuses trifft die Messkammer 16 (d = 5 mm; V = 35 &mgr;l) am Scheitelpunkt der Kalotte. Weitere acht Bohrungen sind radiärsymmetrisch im Winkel von 45° zur Vertikalen angeordnet und führen in gleichen Abständen von der Schrägfläche des Sensorgehäuses 12 auf die Kalotte der Messkammer 16 (2). Sieben dieser Bohrungen 15, 7, 8 haben den geometrischen Mittelpunkt der Messkammer als gemeinsamen Schnittpunkt. Eine weitere Bohrung 9 trifft den Äquator der Messkammer 16 (2A). Sie dient dem Auslass von Flüssigkeiten und Gasen und zugleich der Probenentnahme und Stoffapplikation. Für diese Doppelfunktion wird eine verschließbare Infusionskanüle mit seitlichem Septum verwendet. Fünf der radiärsymmetrisch angeordneten Bohrungen 15 fungieren als Kanülen, durch die Sensoren (Optoden und Hybridoptoden, Thermocouples und Elektroden) und Mikrowerkzeuge von aussen in die Messkammer und in das Untersuchungsobjekt eingeführt und gasdicht positioniert werden. Eine der Bohrungen 7 trägt ein Ventil und dient dem Befüllen der Messkammer mit Flüssigkeiten und Gasen, während Bohrung 8 mit einem einstellbaren Überdruckventil zur Druckregulation in der Messkammer versehen ist.

Der Trägerteller 19 (d = 40 mm) aus eloxiertem Aluminium hat die Form eines Uhrengehäuses. Bodenplatte (Dicke = 1 mm), Wand (Höhe = 5 mm, Dicke = 5 mm) und seitliche Halterungen für den Steg 22 zur Befestigung des Spannngurtes und einer Nut 23 zur Aufnahme eines Einhängebügels des Spanngurtes sind aus einem Stück gefertigt (3). Für die Benutzung der Mess- und Regelschleuse als Messzelle bleibt die Bodenplatte des Trägertellers geschlossen; für die Benutzung als Schleuse können je nach Verwendungszweck verschließbare Bohrungen 21 bis zu 5 mm Durchmesser gesetzt werden. Die drei schwenkbaren Lamellen 10 sind horizontal auf der Wand des Trägertellers drehbar montiert. Sie sind so dimensioniert, dass sie nahezu den gesamten Umfang der Nut des Sensorgehäuses umgreifen. Dies ist die Voraussetzung zur Drehbarkeit des Sensorgehäuses unter Gewährleistung der Abdichtung der Messkammer zur Bodenplatte. Ein Führungsring über den Lamellen dient als Widerlager zur Kraftaufnahme des Anpressdruckes des Sensorgehäuses im Trägerteller.

Die Montage des Trägertellers am Objekt – hier ein Baumstamm – erfolgt mittels eines Exzenterspanners als besondere Ausführungsart (4). In eine 6 mm dicke Aluminiumplatte 27 (Spannplatte: Höhe = 25 mm, Breite = 41 mm) sind zwei rechteckige Öffnungen im gleichen Abstand von der vertikalen Achse gefräst, in die je eine exzentrisch gelagerte Rändelwalze 24 eingesetzt ist. Die Rändelwalze ist auf einer Achse befestigt, die in der Spannplatte drehbar gelagert ist. Eine Spiralfeder dreht die Achse und bewirkt dadurch einen Andruck der Rändelwalze auf die innere Öffnungsfläche. Zur Durchführung eines Spanngurtes zwischen der Innenfläche einer Öffnung und der Rändelwalze wird diese mit einem Rändelgriff 25 gegen den Federandruck nach aussen geschwenkt. Durch den permanenten Andruck der exzentrischen Rändelwalze auf den Spanngurt kann dieser nur in einer Richtung gezogen werden, der Gegenzug bleibt jedoch stets blockiert. Die Spannplatte wird mittels zweier Stehbolzen geführt, die fest auf einem Widerlager 28 montiert sind. Eine zentrale Rändelschraube 26 bewegt die Spannplatte auf den Stehbolzen über eine Strecke von 8 mm vor- und zurück. Diese Vorrichtung ermöglicht eine schnelle Montage des Trägertellers am Untersuchungsobjekt, indem zwei Polyesterbänder zu beiden Seiten das Objekt umschließen und mittels der Exzenterwalzen vorgespannt werden. Durch die Verschiebung der Spannplatte auf den Stehbolzen wird auf kurzem Wege eine gleichmäßige Zugkraft auf beide Bänder ausgeübt, wodurch der Trägerteller verschiebungsfrei auf dem Untersuchungsobjekt arretiert wird. Darüber hinaus hat diese Ausführung der Spannvorrichtung den Vorteil, dass sie zur Montage der Mess- und Regelschleuse auf sehr unterschiedlich geformten Objekten mit beliebigem Umfang geeignet ist, sogar auch dann, wenn der Durchmesser deutlich kleiner ist als der des Trägertellers.

Da Mikrosensoren und besonders Optoden keinen mechanischen Kräften ausgesetzt werden dürfen, ist es nicht möglich solche Sensoren ungeschützt in tierischen oder pflanzlichen Geweben und Organen zu applizieren, was den Anwender vielfach daran hindert sie überhaupt einzusetzen. Eine Lösung dieses Problems bietet die Omni-Lock dergestalt, dass mit diesem Gerät feine Kanülen in Gewebe und Organe eingeführt werden können, in denen dann die Sensoren bis an die Kanülenspitze geschoben werden. Über die Kanülen steht die Messkammer der Mess- und Regelschleuse mit dem Untersuchungsobjekt in Verbindung.

In Pflanzen wird die Applikation optischer Mikrosensoren durch feste Abschluss-, Verfestigungs- und Stützgewebe, vor allem aber durch die Verholzung erschwert. Darüber hinaus ist für den minimalinvasiven Zugang in die saftführenden pflanzlichen Gewebe die Vermeidung von Embolien durch das Eindringen von Luft während der Sensorapplikation eine entscheidende methodische Voraussetzung, um die Gewebefunktion während der in situ Messung aufrechtzuerhalten. Gefäße, in denen beim Applizieren von Sensoren ohne Luftabschluss der unter Unterdruck stehende Wasserfaden durch Embolie reisst, stehen für weitere Untersuchungen nicht mehr zur Verfügung. Die Mess- und Regelschleuse löst dieses methodische Problem durch die Möglichkeit zur Applikation von Kanülen und Sensoren unter Luftabschluss in der flüssigen Phase. Zu diesem Zweck wird während des Einführens einer Kanüle in das zu untersuchende Gewebe die Messkammer mit einer entgasten Flüssigkeit, z.B.

eine sterile, wässrige isotonische Lösung, durchströmt. Hierzu wird ein kontinuierlicher Flüssigkeitskreislauf zwischen dem Ein- und Auslassventil der Messkammer hergestellt. Durch Anlegen eines regelbaren Überdrucks in der Messkammer wird das Eindringen von Luft in das Gewebe während der Sensorapplikation und der Messung verhindert. Diese Methode des Zugangs in verholzte pflanzliche Gewebe unter Luftabschluss zum Zwecke der Embolievermeidung wurde bereits erfolgreich erprobt [Gansert D, Burgdorf M, Lösch R (2001) A novel approach to the in situ measurement of oxygen concentrations in the sapwood of woody plants. Plant, Cell and Environment 24: 1055-1064]. Sie wurde zum Zwecke der Multifunktionalität in der technischen Realisierung der Mess- und Regelschleuse berücksichtigt.

Für den mikropräparativen Eingriff, z.B. zur Entnahme von Gewebeproben oder der Applikation von Sonden, werden Mikroendoskope und -werkzeuge eingesetzt. Diese werden, wie auch die Sensoren, mit Hilfe eines Mikrometervorschubs 14 im Objekt positioniert. Im vorliegenden Funktionsmuster wird dazu eine Einbaumessschraube (Verstellbereich: 0-25 mm, Genauigkeit: 0.002 mm) mit stehender Spindel 29 verwendet (5). Auf die Spindel ist eine Klemmplatte 33 zur Fixierung von Sensoren und Mikrowerkzeugen aufgesetzt. Die Klemmplatte wird auf zwei Stangen 30 (d = 3 mm, 1 = 41 mm) geführt, die mit der Aufnehmerplatte für die Messschraube und einer Grundplatte 34 fest verbunden sind. Die Grundplatte dient zugleich der Arretierung des Vorschubs auf einer Sensorbuchse mit Dichtungsring im Sensorgehäuse, durch die hindurch ein Sensor in die Messkammer und in das Untersuchungsobjekt eingeführt wird. Sensorbuchse, Grundplatte und Klemmplatte sind übereinander auf einer Achse zentriert. Nach erfolgter Positionierung wird der Sensor von der Klemmplatte gelöst und die Sensorbuchse durch Drehen des Vorschubs festgezogen. Dadurch wird der Sensor im Gehäuse gasdicht arretiert. Danach wird die Arretierung der Grundplatte an der Sensorbuchse gelöst und der Mikrometervorschub entfernt. Nacheinander werden so alle Sensoren positioniert und abgedichtet. Diese technische Ausführung des Mikrometervorschubs hat drei wesentliche Vorteile: 1) Gewichtseinsparung bei der Mess- und Regelschleuse, 2) die Sensorkabel werden beim Positionieren nicht verdrillt, da sie ohne Eigenrotation bewegt werden, 3) Kosteneinsparung durch Herstellung nur eines normierten Mikrometervorschubs, der für alle Anschlussbuchsen am Sensorgehäuse passend gefertigt ist.

Fig. 1
1 – 9
Bohrungen mit verschiedenen Durchmessern für:
1
Temperatursensor
2
pH-O2-Hybridoptode
3
pH-Mikroelektrode
4
T-O2-Hybridoptode
5
O2-Optode
6
CO2-O2-Hybridoptode und Mikrowerkzeuge
7
Flüssigkeits- und Gaseinlass
8
Druckregulation
9
Flüssigkeits- und Gasauslass, Probenentnahme und Stoffapplikation
10
Schwenkbare Lamelle des 3-teiligen Lamellenverschlusses im Trägerteller
11
Ringförmiges Peltierelement
12
Drehbares Sensorgehäuse
13
Mikrosensoren und -werkzeuge
14
Umsteckbarer Mikrometervorschub für Mikrosensoren und -werkzeuge
15
Mikrosensoren und -werkzeuge
16
Messkammer
17
Mikrosensoren und -werkzeuge
18
O-Ring zur Dichtung der Messkammer
19
Trägerteller mit dreiteiligem Lamellenwerschluss
20
Lebendes oder abiotisches System
29
Einbaumessschraube mit stehender (nicht drehender) Spindel
30
Führungsstangen für die Klemmplatte
32
Aufnehmerplatte der Einbaumessschraube
33
Klemmplatte zur Arretierung von Mikrosensoren und -werkzeugen
34
Grundplatte zur Arretierung des Mikrometervorschubs auf Buchsen
Fig. 2
A
Sensorgehäuse: Schnitt mit Bohrungen 3, 6, 9
16
Messkammer
B
Schnitt mit Bohrungen 2, 4, 6
C
Aufsicht mit Positionen der Bohrungen 1 – 9
Fig. 3
A
Trägerteller: Aufsicht
10
Schwenkbare Lamelle
22
Steg für Spanngurt
B
Seitenansicht
21
Verschließbare Öffnung in der Bodenplatte des Trägertellers
23
Nut für Einhängebügel
C
Einhängebügel für Spanngurt
Fig. 4
A
Exzenterspanner: Frontansicht
24
Exzentrisch gelagerte Rändelwalze
25
Rändelgriff
B
Aufsicht
26
Rändelschraube
27
Spannplatte
28
Widerlager mit kerbförmiger Auflagefläche
Fig. 5
A (14)
Mikrometervorschub: Seitenansicht
29
Einbaumessschraube mit stehender (nicht drehender) Spindel
30
Führungsstangen für die Klemmplatte
B (32)
Aufnehmerplatte der Einbaumessschraube
C (33)
Klemmplatte zur Arretierung von Mikrosensoren und -werkzeugen
31
Arretierschraube
D (34)
Grundplatte zur Fixierung des Mikrometervorschubs auf sechseckigem Sensorbuchsenkopf


Anspruch[de]
Miniaturisierte und multifunktionale optosensorische Mess- und Regelschleuse für die minimalinvasive Applikation von Mikrosensoren und Mikrowerkzeugen in lebenden und abiotischen Systemen zur quantitativen, räumlich und zeitlich hochauflösenden Prozessanalyse, Präparation und experimentellen Manipulation unter Freiland- und Laborbedingungen, dadurch gekennzeichnet, dass ein als Sensorgehäuse (12) ausgeführter drehbarer zylindrischer Körper, welcher mit Bohrungen verschiedener Durchmesser (19) versehen ist, deren Achsen einen gemeinsamen geometrischen Mittelpunkt haben, und in eine Messkammer (16) führen, wobei mehrere Bohrungen (16) zur beweglichen und gasdichten Aufnahme von Mikrosensoren und -werkzeugen (13, 15, 17) ausgebildet und mit Mikrosensoren und -werkzeugen versehen sind, wobei Bohrungen (7, 9) mit Ventilen zum Stoffeinlass und Stoffauslass versehen sind und wobei eine Bohrung (8) mit einem Ventil zur Druckregulation in der Messkammer ausgebildet ist, dass ein Trägerteller (19) mit Lamellen (10) und einer Bodenplatte mit einer verschließbaren Öffnung und mit regelbarem Peltierelement (11) vorhanden ist, wobei die Lamellen (10) mit einer Nut des Sensorgehäuses (12) zusammenwirken und wobei die Mess- uund Regelschleuse bei geschlossener Bodenplatte als geschlossene Messzelle oder als Durchflussmesszelle und bei geöffneter Bodenplatte als Regelschleuse betreibbar ist. Mess- und Regelschleuse nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Messkammer (16) halekugelig im Sensorgehäuse (12) ausgebildet ist. Mess- und Regelschleuse nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein O-Ring (18) zur Dichtung des drehbaren Sensorgehäuses (12) gegenüber dem Trägerteller (19) vorhanden ist. Mess- und Regelschleuse nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bohrungen (15) für die Mikrosensoren und -werkzeuge um 45° gegen die Horizontale geneigt sind und mit einem Mikrometervorschub (14) versehen sind. Mess- und Regelschleuse nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Spannvorrichtung zur Befestigung an einem Messobjekt vorhanden ist. Mess- und Regelschleuse nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine zentrale vertikale Bohrung (6) in die Messkammer (16) vorhanden ist.






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