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Dokumentenidentifikation DE112005001443T5 16.05.2007
Titel Mittel gegen Tuberkulose zur Behandlung und Prophylaxe
Anmelder Obschestvo S Ogranichennoi Otvetstvennostyu "Berezovy Mir", Moskau, RU
Erfinder Bocharova, Irina Vladimirovna, Moskau, RU;
Demikhova, Olga Vladimirovna, Moskau, RU;
Erokhin, Vladislav Vsevolodovoch, Moskau, RU;
Pospelov, Lev Evgenievich, Moskau, RU;
Balakshin, Vladimir Vladimirovich, Moskau, RU;
Chistiakov, Aleksey Nikolaevich, Moskau, RU;
Mishin, Vladimir Jurievich, Vidnoe, Moskovskaya oblast, RU
Vertreter Maiwald Patentanwalts GmbH, 80335 München
DE-Aktenzeichen 112005001443
Vertragsstaaten AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KM, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PG, PH, PL, PT, RO, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, SY, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, YU, ZA, ZM, ZW, EP, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, MC, NL, PL, PT, RO, SE, SI, SK, TR, OA, BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG, AP, BW, GH, GM, KE, LS, MW, MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW, EA, AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM
WO-Anmeldetag 27.05.2005
PCT-Aktenzeichen PCT/RU2005/000288
WO-Veröffentlichungsnummer 2006001733
WO-Veröffentlichungsdatum 05.01.2006
Date of publication of WO application in German translation 16.05.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.05.2007
IPC-Hauptklasse A61K 36/00(2006.01)A, F, I, 20050527, B, H, DE
IPC additional class A61K 129/00  (2006.01)  A,  L,  N,  20050527,  B,  H,  DE
A61P 31/06  (2006.01)  A,  L,  N,  20050527,  B,  H,  DE

Beschreibung[de]
Technikbereich

Die Erfindung gehört zum medizinischen sowie veterinären Bereich und konkret zur Behandlung und Prophylaxe von Tuberkulose.

Stand der Technik

Nach einer längeren Periode des Rückgangs der Erkrankung der Menschen an Tuberkulose, die in der Mitte des vergangenen Jahrhunderts lag und sich in Rußland bis zu Beginn des mit 1990 anlaufenden Jahrzehnts erstreckte, kam es zu einer einschneidenden Verschlechterung der epidemiologischen Situation. Von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) wurde schon im April 1993 die Tuberkulose als Problem einer „weltweiten Gefahr" angesprochen, da nach den Angaben dieser Organisation ein Drittel der Bevölkerung des Planeten mit Tuberkulose infiziert ist.

In Rußland werden jährlich 75 bis 85 Tsd. Tbc-Kranke erstmals festgestellt und registriert, wogegen es 1999 fast 100 Tsd. Menschen waren. Bei der Sterblichkeit durch Infektionskrankheiten insgesamt entfallen 75 % der Sterbefälle auf Tuberkulose.

Die Behandlung von Tuberkulose ist sogar in gewöhnlichen (Empfindlichkeit gegen Medikamente) Fällen ein langwieriger Prozeß, der unter gleichzeitiger Verwendung von mehreren (4 bis 5) Tuberkulosepräparaten abläuft. Der Standardablauf bei der Behandlung einer gewöhnlichen (bei Empfindlichkeit) Tuberkulose, der von der WHO empfohlen wird (DOTS-Schema), schließt eine sechsmonatliche, aus vier Standardmedikamenten (Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid, Etambutol, Streptomycinum) zusammengestellte, jeden Tag zu verabreichende Gabe ein.

Bei der Behandlung einer arzneimittelresistenten (bezüglich wenigstens eines der aufgezählten Medikamente) Tuberkulose werden vom DOTS-Schema abweichende Medikamente eingenommen, die auch als „Reservepräparate" oder „Präparate der zweiten Reihe" (Ofloxacin, Capryomycin, Äthionamid, Cycloserin, NPAS – Natrium-para-aminosalicylicum) bezeichnet werden, die ebenfalls komplex einzunehmen sind, wenigstens 4 zur gleichen Zeit im Laufe von 1,5 bis 2 Jahren. Viele Reservepräparate rufen schwere Nebeneffekte hervor, wobei die Wahrscheinlichkeit einer Heilung im Bereich von 50 % bis 80 % liegt. Als Nebenwirkungen (kennzeichnend für Präparate der „ersten Reihe") ergibt sich unter anderem: Dysbakteriose, Störung der Menstrualfunktion und Potenz, Diarrhoe, Stomatitis, Haarausfall, Veränderung des Bluts – Verringerung von Gesamteiweiß, Leukozyten, Erythrozyten und Thrombozyten.

Tuberkulose bei Tieren ist ebenfalls ein ernsthaftes Problem. 1995 wurden in Rußland 911 Krankheitsherde registriert, wo über 36 Tsd. Rinder an Tuberkulose erkrankt waren, hierbei ist Tuberkulose bei Tieren auch für die Menschen unumgänglich. Bei an Tuberkulose erkranktem Rindvieh liegen in jedem 8. Fall bei Menschen vorkommende Mikrobakterienarten vor. Gleichfalls können sich Hühner nicht nur durch Mikrobakterien anstecken, die bei Vögeln vorkommen, sondern auch durch solche, die beim Menschen vorkommen.

In diesem Zusammenhang liegt mit der Suche neuer Mittel, die zur Behandlung und Prophylaxe von Tuberkulose geeignet sind, ein aktuelles Problem vor, wobei Mittel ohne schwere Nebeneffekte und im einzelnen solche aus Naturprodukten gefragt sind.

Als ein solches Mittel wird im Patent der RF Nr. 2210379 der Extrakt von Espenrinde (Populus tremila) beschrieben.

Die Untersuchung vom gegen Tuberkulose wirkenden (tuberkuloziden) Extrakt von Espenrinde erfolgte lediglich unter der Bedingung in vitro.

Erfindungskern

Von den Urhebern der vorliegenden Erfindung wurde im Laufe der Forschungen in vitro und in vivo festgestellt, daß Betulin wie auch, bei einer nicht unter 70 % liegenden Konzentration, Birkenrindenextrakt (aus dem oberen weißen Teil der Birkenrinde) als ein gegen Tuberkulose wirkendes Mittel verwendet werden kann.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

In wurde ein Diagramm der Wirkung des Betulins auf Tuberkulosemykobakterien (bei wahlweisem Einschluß von 5,6-[3H]-Uracil in lebende Zellen) dargestellt.

In wurde ein Diagramm der Wirkung des Betulins auf Tuberkulosemykobakterien, die von Makrophagen phagozytiert wurden (bei wahlweisem Einschluß von 5,6-[3H]-Uracil in lebende Zellen) dargestellt.

In liegt ein Diagramm vor, das den prozentualen Anteil der spezifischen Lysis von nicht infizierten Makrophagen (bei Vorhandensein oder ohne Betulin in hohen Konzentrationen) und von Makrophagen zeigt, die Mykobakterien in unterschiedlichen Verhältnissen phagozytierten (bei Vorhandensein oder ohne Betulin in hohen Konzentrationen).

In ist ein Diagramm mit dem prozentualen Anteil der spezifischen Lysis von nicht infizierten Makrophagen (bei Vorhandensein oder ohne Betulin in kleinen Konzentrationen) und von Makrophagen gezeigt, die Mykobakterien in unterschiedlichen Verhältnissen phagozytierten (bei Vorhandensein oder ohne Betulin in kleinen Konzentrationen).

In ist ein Diagramm mit der spezifischen Lysis von nicht infizierten Makrophagen (bei Vorhandensein oder ohne Betulin-2 in kleinen Konzentrationen) und von Makrophagen gezeigt, die Mykobakterien in unterschiedlichen Verhältnissen phagozytierten (bei Vorhandensein oder ohne Betulin-2 in kleinen Konzentrationen). Der Austritt von LDG aus Makrophagen in das Medium wurde nach der fermentativen Farbreaktion ermittelt. Die Werte liegen als Mittelwerte der optischen Dichte (OD) nach drei Bestimmungen mit Standardabweichung vor.

In liegt ein Diagramm mit der spezifischen Lysis von nicht infizierten Makrophagen (bei Vorhandensein oder ohne Betulin in hohen Konzentrationen) und von Makrophagen vor, die Mykobakterien in unterschiedlichen Verhältnissen phagozytierten (bei Vorhandensein oder ohne Betulin in hohen Konzentrationen). Der Austritt von LDG aus Makrophagen in das Medium wurde nach der fermentativen Farbreaktion ermittelt. Die Werte liegen als Mittelwerte der optischen Dichte (OD) nach drei Bestimmungen mit Standardabweichung vor.

Offenbarung der Erfindung

Im Unterschied zum angegebenen Patent der RF 2210379 ist die Wirksamkeit der Mittel in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung nicht nur unter den Bedingungen in vitro sondern auch unter den Bedingungen in vivo bestätigt worden.

Außerdem wurde ebenfalls eine prophylaktische Wirkung von Betulin und des Birkenrindenextrakts hinsichtlich von Tuberkulose festgestellt, die bezüglich des Espenrindenextrakts nicht untersucht wurde.

Die Untersuchungen von Betulin wurden in vivo am Mausmodell für aktive exsudativnekrotische Tuberkulose und in vitro an einer mit MBT (Mykobakterien M. tuberculosis) infizierten Makrophagenkultur durchgeführt.

Hierbei wurden die folgenden Probleme gelöst:

  • 1. Bestimmung des Kennwerts für die Überlebenschancen der Tiere nach der Infizierung mit einer letalen MBT-Dosis in unterschiedlichen Versuchstiergruppen.
  • 2. Mit mikrobiologischen Methoden in vivo erfolgende Untersuchung einer möglichen bakteriziden und bakterienstatischen Aktivität der untersuchten Präparate.
  • 3. Mit morphologischen Methoden erfolgende Untersuchung der Reparationsprozesse parenchymatöser Organe im Prozeß der Behandlung von Testtuberkulose an Mäusen der untersuchten Gruppen.
  • 4. Einschätzung der Wirksamkeit von Betulin auf den Niveau der Lebensfähigkeit von MBT in vitro und des Einflusses auf die zytotoxische Wirkung von MBT auf peritoneale Makrophagen.

Die Untersuchung erfolgte an trockenem Birkenrindenextrakt mit einem Betulingehalt, der mit HELC zu 72 % bestimmt wurde, geliefert von der OOO Berjosowy mir, Moskau.

Die Bestimmung der spezifischen Aktivität des Präparats Betulin erfolgte an Männchen von Inzuchtmäusen der Linie C57BL/6, die aus dem Vivarium des Zentralen Forschungsinstituts für Tuberkulose der Russischen Akademie der medizinischen Wissenschaften stammen. Das Gewicht der Mäuse betrug 20 Gramm. Die Mäuse wurden mittels intravenöser Injektion einer Dosis von 5 × 106KBE M. tuberculosis des Stammes H37Rv in die retroorbitale Augenhöhle infiziert, stammend aus der Kollektion des Pasteur-Instituts (Frankreich). MBT wurden in präparativen Mengen im Labor für Immungenetik des benannten Instituts erhalten. Die aliquoten Mengen (1 ml) wurden bei -70 °C aufbewahrt. Zur Bestimmung der KBE von Mykobakterien in der dargestellten Suspension wurde die aliquote Menge entnommen, eine Serie aufeinanderfolgender Verdünnungen eingeleitet und 20 &mgr;l einer jeden Verdünnung wurden in einem Tropfen auf eine Petri-Schale mit Dubois-Agar versetzt. Die Schalen wurden bei einer Temperatur von 37 °C im Laufe von 14 Tagen zur Bestimmung der MB-Konzentration im infizierenden Material kultiviert. Zur Infizierung der Mäuse wurde die aliquote Menge entfrostet, in eine Pufferphosphatlösung übergeleitet, in der 0,025 % TWIN-80 enthalten war, und bis auf eine Konzentration von 5 × 106 KBE/ml gebracht.

Alle Versuchstiere wurden in die folgenden Gruppen eingeteilt:

  • 1. Gruppe – unberührte Tiere – 15 Stck.
  • 2. Gruppe – infizierte Tiere, für die keine Behandlung erfolgte – 15 Stck.
  • 3. Gruppe – infizierte Tiere, denen eine Kombination gegen Tuberkulose wirkender Präparate (Isoniazid + Rifampicin) – TWP – mit einer Dosis von 38 mg/kg verabreicht wurde – 15 Stck.
  • 4. Gruppe – infizierte Tiere, denen eine Standarddosis TWP und Betulin mit einer Dosis von 25 mg/kg verabreicht wurde – 15 Stck.
  • 5. Gruppe – infizierte Tiere, denen eine Standarddosis TWP und Betulin mit einer Dosis von 50 mg/kg verabreicht wurde – 15 Stck.
  • 6. Gruppe – infizierte Tiere, denen Betulin mit einer Dosis von 25 mg/kg verabreicht wurde – 15 Stck.
  • 7. Gruppe – infizierte Tiere, denen Betulin mit einer Dosis von 50 mg/kg verabreicht wurde – 15 Stck.
  • 8. Gruppe – nicht infizierte Tiere, denen TWIN-80 (ohne Betulin) verabreicht wurde – 10 Stck.

Die Präparate wurden intragastrisch eingeführt, täglich, im Laufe von 2 Monaten, nach zwei Wochen nach der Infizierung. Der Birkenrindenextrakt wurde in Wasser mit einem Gehalt von 1-prozentiger TWIN-80-Lösung aufgeschwemmt. Den Tieren der 8. Gruppe wurde intragastrisch TWIN-80-Lösung eingeführt, und zwar mit einer Dosis ähnlich der, die in anderen Versuchsgruppen verwendet wurde. Nach 2 Monaten wurde die Hälfte der lebenden Tiere aus dem Experiment nach der Methode der zervikalen Dislokation für mikrobiologische, immunologische und morphologische Untersuchungen herausgenommen, wogegen der verbleibende Teil für weitere 2 Monate belassen wurde, um den ausgeweiteten antimikrobiellen Effekt von Bitulin einzuschätzen.

Zur Einschätzung der Effektivität des zu untersuchenden Präparats wurden von jedem Tier Stücke von Lunge, Leber und Milz zur histologischen und das ganze Organ zur mikrobiologischen Untersuchung entnommen. Bei der mikrobiologischen Untersuchung wurde eine Bakterioskopie sowie eine qualitative und quantitative Analyse der makroskopisch festgestellten Veränderungen an Leber, Milz und Lunge unter Ermittlung der Befallsrate und Effektivitätsrate nach der Formel vorgenommen:

Zur Bakterioskopie sind die Stücke von Lunge, Leber und Milz speziell behandelt worden. Aus einem durch Homogenisierung erhaltenen Produkt von parenchymatösen Organen wurden Abstriche hergestellt, die mit lumineszenten Farbstoffen eingefärbt wurden.

Zur histologischen Untersuchung wurden die Stücke von Lunge, Leber und Milz in 10 % gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingeschlossen und histologische Schnitte angefertigt, die mit Hämatoxylin und Eosin eingefärbt wurden.

Die Anzahl von Mykobakterien in Milz und Lunge der infizierten Mäuse wurden nach 2 Monaten nach einsetzender Behandlung und nach 2 Monaten nach beendigter Behandlung bestimmt. Milz und Lunge wurden in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert, wonach eine Serie mit 10-facher Verdünnung der Ausgangssuspension in physiologischer Kochsalzlösung vorbereitet wurde und 50 &mgr;l einer jeden Verdünnung auf eine Petri-Schale gelangte, die im Dubois-Agar bedeckt war.

Die Petri-Schale mit den aufgetragenen Suspensionen der Zellen von Milz oder Lunge wurde im Laufe von 18 bis 20 Tagen einer Temperatur von 37 °C zur Inkubation ausgesetzt, wonach die Anzahl der Kolonien in der Schale und die KBE-Menge von Mykobakterien in Milz und Lunge nach den folgenden Formeln ermittelt wurde: Nmil = 2N1 × P/0.1 Nlun = 2N1 × P/0.1, wobei

Nmil
– Anzahl der Kolonien in der Milz,
Nlun
– Anzahl der Kolonien in der Lunge.

Die Ermittlung des Einflusses von Betulin auf Mykobakterien in der Makrophagenkultur erfolgte an peritonealen Makrophagen von Mäusen der Linie C57BL6. Das Präparat für die Untersuchung wurde auf folgende Art bereitet: zur ersten Verdünnung des Präparats wurde 120 &mgr;l Dimethylsulfoxid verwendet (es lagen jeweils 5 mg Birkenrindenextrakt bei jeder Verdünnung vor). Danach wurden die Präparate in einem vollständigen RPMI-1640-Medium gelöst. Die abschließende Konzentration der Präparate betrug 160 &mgr;g/ml, 80 &mgr;g/ml, 40 &mgr;g/ml, 2 &mgr;g/ml, 0,2 &mgr;g/ml und 0,02 &mgr;g/ml.

Die peritonealen Makrophagen (MP) schieden bei den Mäusen aus den Zellen nach 5 bis 6 Tagen nach einer intraperitonealen Injektion von 3 % Pepton ein peritoneales Exsudat aus. Eine Reinigung des peritonealen Exsudats von nicht makrophagalen Zellen erfolgte über die Adhäsion von Makrophagen in Petri-Plastschalen. Sich festsetzende Makrophagen wurden mittels Solutio Tetacini-calcii aus einer Monoschicht in eine Suspension überführt. Die Infektion von Makrophagen durch Mykobakterien (MBT) wurde in ebenbödigen 96-Loch-Planchetten in RPMI-Medium mit 2 % FCS vollzogen. Hierfür wurde die gereinigte Suspension der peritonealen Makrophagen (50 000 auf ein Loch) einer wiederholten Adhäsion in den Löchern der Planchette unterzogen, wonach zu den sich ausbildenden Monoschichten von Makrophagen in unterschiedlicher Konzentration M. tuberculosis zugegeben wurden (Verhältnis von Makrophage:Mykobakterie (MP:MBT) – 1:2,5; 1:5; 1:10). Die infizierten Makrophagen wurden in einem CO2-Inkubator im Laufe einer Nacht zur Phagozytose der Mykobakterien einer Inkubation ausgesetzt. Nach der Inkubation wurde in die Löcher das zu untersuchende Präparat in Konzentrationen von 160 &mgr;g/ml, 80 &mgr;g/ml, 40 &mgr;g/ml, 2 &mgr;g/ml, 0,2 &mgr;g/ml und 0,02 &mgr;g/ml zugegeben. Als Kontrolle wurden die Verdünnungen von Mykobakterien ohne Präparat zurückbehalten. Die Inkubation mit dem Präparat erfolgte innerhalb von 48 Stunden in einem CO2-Inkubator. 18 Stunden vor Ablauf der Inkubationsfrist wurde in die Löcher ein Merkzeichen (5,6-[3H]-Uracil in RPMI-1640-Medium mit 2 % FCS gelöst) zugefügt. Die Lebensfähigkeit der Mykobakterien in der gemischten Kultur mit den Makrophagen wurde hinsichtlich des selektiven Einschlusses von M. tuberculosis 5,6-[3H]-Uracil in die lebenden Zellen im Flüssigkeitsszintillator abgeschätzt. Vor dem Auszählen des eingeschlossenen Merkzeichens wurden die Makrophagen durch Einfrieren bei -80 °C zerstört. Alle Messungen erfolgten in Triplikaten.

Die Ermittlung des Einflusses vom zu untersuchenden Präparat auf die Mykobakterienkultur lief auf die folgende Weise ab: M. tuberculosis H37Rv wurde in einer Menge von 5 × 105, 2,5 × 105, 1,25 × 105 KBE/Loch in einem vollständigen RPMI-1640-Medium mit 2 % FCS in eine 96-Loch-Planchette eingegeben (jeweils 3 Löcher für jede Verdünnung). Nach zweistündiger Inkubation im CO2-Inkubator (Atmosphäre von 20 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid, 37 °C) wurde das Präparat in Konzentrationen von 2 &mgr;g/ml, 0,2 &mgr;g/ml und 0,02 &mgr;g/ml in die Löcher gegeben. Nach der Zugabe des Präparats wurden die 96-Loch-Planchetten einer Inkubation innerhalb von 48 Stunden in einem CO2-Inkubator unter den gleichen Bedingungen ausgesetzt. 18 Stunden vor Ablauf der Inkubationsfrist wurde in die Löcher ein Merkzeichen (5,6-[3H]-Uracil in RPMI-1640-Medium mit 2 % FCS gelöst) zugefügt. Nach Abschluß der Inkubationszeit wurde eine Messung der Menge der in die lebenden Mykobakterien eingeschlossenen Merkzeichen im Flüssigkeitsszintillator vorgenommen. Über die Aktivität der zu untersuchenden Präparate wurde nach der Menge des in die lebenden Mykobakterien eingeschlossenen 5,6-[3H]-Uracil im Vergleich mit der unberührten Kontrollgruppe ausgesagt. Alle Messungen erfolgten in Triplikaten.

Die zytotoxische Wirkung des Präparats auf Makrophagen wurde nach dem Austritt des Ferments Laktatdehydrogenase (LDG) aus den zerstörten Makrophagen in das Medium mittels eines Satzes Promega's CytoTox 96® (Promega) abgeschätzt. Für den Test wurden Konzentrationen des Präparats von 160 &mgr;g/ml, 80 &mgr;g/ml, 40 &mgr;g/ml, 2 &mgr;g/ml, 0,2 &mgr;g/ml und 0,02 &mgr;g/m herangezogen. Das Präparat wurde in einer jeden Konzentration zu einer reinen Kultur von peritonealen Makrophagen zugegeben, wie auch zu einer Kultur peritonealer Makrophagen, die mit M. tuberculosis H37Rv in Verhältnissen von Makrophage:Mykobakterie (MP:MBT) – 1:2,5; 1:5 und 1:10 infiziert wurde (Tabelle 1). Die Ergebnisse der Farbreaktion wurden mit einem lichtelektrischen Kolorimeter (Sigma) bei einer Wellenlänge von 490 nm aufgenommen. Alle Messungen erfolgten in Triplikaten.

Untersuchungsergebnisse Untersuchungsergebnisse für Betulin im System in vivo.

Die hauptsächlichen Parameter der Resistenz eines Lebewesens gegen Tuberkulose sind die Überlebensdauer nach dem Infizieren, die Möglichkeit der Kontrolle der Vermehrung der Mykobakterien in den Organen (d. h. der Menge von Mykobakterien, die in KBE gemessen wird) und die Stufe der pathologischen Veränderungen im Lungengewebe.

Bei den Mäusen der Kontrollgruppe, die keinerlei Präparate erhielten, war ein Überleben nach einer letalen Infektionsdosis über 31 ± 2.07 Tage gegeben.

Mäuse, die nur Betulin mit einer Dosis von 25 mg/kg innerhalb von 2 Monaten erhielten lebten nach der Infektion 25 ± 0.56 Tage, dagegen mit einer Dosis von 50 mg/kg – 37,86 ± 2.48 Tage. Mäuse, die TWP zusammen mit Betulin mit verschiedener Dosis erhielten, blieben über die Dauer des gesamten Experiments am Leben. (Die Angaben wurden in Tabelle 2 zusammengestellt.)

  • * Unterschiede bei den Überlebenschancen unter Kontrolltieren und denen, die 25mg/kg
  • Betulin erhielten sind signifikant (p<0.05), wogegen unter Kontrollgruppe und Gruppe, die Betulin mit einer Dosis von 50mg/kg erhielten, p>0.05 ist

Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung

Im Ergebnis der bakterioskopischen Untersuchung des Materials, das von den Mäusen der 3., 4. und 5. therapeutischen Gruppe nach 2 Monaten nach beginnender Behandlung erhalten wurde, ließen sich Mykobakterien bei der Durchsicht von 100 Instrumentengesichtsfeldern nicht feststellen.

Bei der Untersuchung des Impfmaterials von den Mäusen der 3., 4. und 5. Gruppe wurde innerhalb der gleichen Fristen in keiner Beobachtung ein Wachstum der MBT-Kolonien festgestellt (Die Angaben wurden in Tabelle 3 zusammengestellt).

Untersuchungsergebnisse für Betulin im System in vitro

Zu den Zielen der Untersuchung des antimykobakteriellen und zytotoxischen Effekts von Betulin im System von Makrophage-Mykobakterie gehörten:

  • 1. Klärung bezüglich Präparat, ob es eine zytotoxische Wirkung auf Eukaryonten im System in vitro hat.
  • 2. Auswahl der wirksamen Konzentrationen des Präparats, die keine zytotoxische Wirkung auf die Makrophagen haben.
  • 3. Klärung, ob ähnliche Konzentrationen von Betulin eine hemmende Wirkung auf Mykobakterien von Tuberkulose haben.
  • 4. Bestimmung, ob Betulin eine hemmende Wirkung auf Mykobakterien ausübt, die von Makrophagen phagozytiert wurden.
  • 5. Feststellung bezüglich Betulin, ob es die Zerstörung von Makrophagen bei deren Infektion durch Mykobakterien von Tuberkulose im System Makrophage-Mykobakterie verringert.

Die Untersuchungsergebnisse sind in den Tabellen 4, 5, 6 und 7 zusammengestellt.

Wie aus Tabelle 4 ersichtlich wird, führt Betulin in Konzentrationen von 160, 80 und 40 &mgr;g/ml zu einer zytotoxischen Wirkung auf unberührte Makrophagen. Der prozentuale Anteil der spezifischen Lysis von Makrophagen erhöhte sich bei der Zugabe von Präparaten wesentlich und erreichte 89,8 % bei der Einwirkung von Betulin mit einer Dosis von 160 &mgr;g/ml.

Bei weiterer Titrierung des Betulinpräparats wurden Konzentrationen des Präparats herausgefunden, die keine zytotoxische Wirkung auf Makrophagen hatten. Wie aus Tabelle 5 ersichtlich, ist der prozentuale Anteil der spezifischen Freisetzung von LDG aus Makrophagen, die einer Inkubation mit dem Präparat in Konzentrationen von 2, 0,2 und 0,02 &mgr;g/ml ausgesetzt waren, nicht signifikant vom prozentualen Anteil der spezifischen Lysis von Makrophagen zu unterscheiden gewesen, die nicht mit dem Präparat behandelt wurden.

Unter Berücksichtigung der erzielten Ergebnisse hinsichtlich des zytotoxischen Effekts von Betulin wurde sowohl die direkte Einwirkung von Betulin (in Konzentrationen von 2, 0,2 und 0,02 &mgr;g/ml) auf Mykobakterien als auch der Effekt der Betulinwirkung auf Mykobakterien getestet, die von Makrophagen phagozytiert wurden. Die Ergebnisse wurden in Diagrammen ( und ) abgebildet und in den Tabellen 6 und 7 angegeben.

Wie im Diagramm in zu erkennen ist, geht bei direkter Einwirkung auf Mykobakterien von Betulin eine hemmende Wirkung bei allen Konzentrationen aus. Die stärkste hemmende Wirkung (31,76 %) geht vom Präparat in einer Konzentration von 2 &mgr;g/ml aus (Tabelle 6).

Bei der Untersuchung der Wirkung von unterschiedlichen Betulinkonzentrationen auf Mykobakterien, die von Makrophagen phagozytiert wurden, wurde festgestellt, daß die Hemmung des Wachstums der Mykobakterien bei der Einwirkung von Betulin mit der höchsten Dosis (2 &mgr;g/ml) auf die Mykobakterien, die von Makrophagen in einem Verhältnis MP:MBT 1:5 (Diagramm in ) phagozytiert wurden, signifikant war. Hierbei war der Prozentsatz der Hemmung des Wachstums von Mykobakterien 42,06 % (siehe Tabelle 7).

Ausgehend von den erhaltenen Angaben über die Hemmung des Wachstums von Mykobakterien durch Betulin auf einem Nährboden wie auch die Hemmung des Wachstums von Mykobakterien, die von peritonealen Makrophagen phagozytiert wurden, war ein Vergleich der zytotoxischen Wirkung von Bedeutung, die die Mykobakterien auf Makrophagen ohne Präparat bei Vorliegen von Betulin ausüben. Beim Test wurden sowohl hohe Präparatkonzentrationen von Betulin (40, 80 und 160 &mgr;g/ml) wie auch Konzentrationen verwendet, die keinen zytotoxischen Effekt auf Makrophagen haben (20, 0,2 und 2 &mgr;g/ml). Die Ergebnisse sind in den Diagrammen 3 und 4 abgebildet.

Wie aus Diagramm 3 ersichtlich wird, fiel der prozentuale Anteil der spezifischen Lysis von Makrophagen, die durch Mykobakterien infiziert wurden (Kontrolle, ohne Betulinwirkung), bei allen Verhältnissen MP:MBT hoch aus und schwankte von 98,67 % (MP:MBT 1:1,25) bis 147,62 % (MP:MBT 1:10). Der Zusatz von Betulin in das System des MP:MBT als Präparat mit einer Dosis von 40, 80 und 160 &mgr;g/ml ergab eine Wirkung auf den Austritt von LDG aus den Makrophagen – bei allen Konzentrationen verringerte das Präparat die Zerstörung der Makrophagen praktisch in allen Verhältnissen MP:MBT. Eine Ausnahme ergab sich bei der Betulindosis von 80 &mgr;g/ml: der prozentuale Anteil der spezifischen Lysis bei einem Verhältnis MP:MBT von 2,5:1 betrug 82,62 %, wogegen bei einem Verhältnis MP:MBT von 5:1 71,30 % auftraten, was in Bezug auf die Kontrolle nicht signifikant war (ohne Präparat, 98,67 % beziehungsweise 132,69 %).

Die Ergebnisse für den Betulintest im System Makrophage-Mykobakterie in Konzentrationen, die keine Zerstörung der Makrophagen (0,02, 0,2 und 2 &mgr;g/ml) hervorrufen, zeigten, daß das Präparat in keiner Dosis eine Absenkung der Zerstörung der Makrophagen erbrachte, die durch Mykobakterien infiziert waren (Diag. 4)

Damit hat Betulin in hohen Konzentrationen (40, 80 und 160 &mgr;g/ml) den prozentualen Anteil der spezifischen Lysis von Makrophagen verringert, die bei Infektion mit Mykobakterien der Tuberkulose ablief. Beim Test niedriger Betulindosis (0,02, 0,2 und 2 &mgr;g/ml) wurde ein ähnlicher Effekt nicht beobachtet.

Bei der Untersuchung des direkten Einflusses von Betulin mit niedriger Dosis (0,02, 0,2 und 2 &mgr;g/ml) auf Mykobakterien und die Wirkung auf Mykobakterien, die von Makrophagen phagozytiert wurden, wurde ein das Wachstum der Mykobakterien hemmender Effekt des Betulins in Konzentrationen von 2 &mgr;g/ml herausgefunden. Dabei wurde bei der Einwirkung des Betulins unmittelbar auf die Mykobakterien eine Wachstumshemmung bei den Mykobakterien bei allen Verhältnissen MP:MBT 1:2,5, 1:5 und 1:10 beobachtet, wogegen bei der Einwirkung des Betulins auf die Mykobakterien, die von Makrophagen phagozytiert wurden, eine signifikante Wachstumshemmung bei den Mykobakterien nur bei einem Verhältnis MP:MBT von 1:5 festgestellt wurde.

Ergebnisse der histologischen Untersuchung

Bei gesunden Mäusen, denen längere Zeit TWIN (8. Gr.) eingegeben wurde, ist eine Polyämie der inneren Organe auffällig, die sich maximal in Lunge und Leber zeigt.

Die Lumen der Blutgefäße sind merklich erweitert und mit dichter Erythrozytarmasse angefüllt. Über deren Umfang sind Monozyten, Lymphozyten und eosinophile Leukozyten verteilt.

Von der hohen Durchlässigkeit der Gefäße des respiratorischen Bereichs zeugt der Austritt der Erythrozyten in das umliegende Gewebe und die Ausbildung einer Vielzahl kleiner Blutungen. In den Alveolenlumen verteilen sich Ansammlungen von ausgewachsenen Makrophagen vom phagozytierenden Typ, hauptsächlich Erythrophagen. Die Alveolenscheidewände sind ödematös, mäßig mit mononukleären Zellen infiltriert; in den Schlingen des Kapillarnetzes verteilen sich polynukleäre Eosinophile.

Bei den mit MBT infizierten Mäusen, denen 2 Monate gegen Tuberkulose wirkende Mittel verabreicht wurden (3. Gr.), lag in der Lunge vorwiegend Luftparenchym vor. Um Gefäße kleineren und mittleren Ausmaßes bildeten sich kleinere Zellinfiltrate (pneumonische Fokusse), die ausgewachsene Makrophagen- und Lymphoidelemente enthielten; neutrophile Leukozyten wurden recht selten bemerkt. In den Gefäßlumen konnten einzelne eosinophile Leukozyten beobachtet werden, was auf die Entwicklung einer allergischen Reaktion gegenüber gegen Tuberkulose wirkenden Präparaten bei den Mäusen hinweist.

In der Leber spiegelten die Änderungen an Hepatozyten Regenerationsprozesse (Hypertrophie des Zytoplasmas, Auftreten von zwei Kernen) wider. In der Periportalzone wurden kleinere lymphoide Makrophageninfiltrate beobachtet, mit denen zusammen einzelne neutrophile Leukozyten aufgefunden wurden.

Für die Milz der Mehrzahl der Tiere der 3. Gruppe war eine diffuse, seltener lokalisierte Infiltration weißer und roter Pulpa durch mononukleäre Zellen unterschiedlicher Reife kennzeichnend. In einzelnen Fällen wurden große mehrkernige Makrophagen mit dunklem Zytoplasma festgestellt.

Bei Mäusen der 4. und 5. Gruppe, für die eine komplexe Behandlung mit gegen Tuberkulose wirkenden Präparaten und Betulin existierte, waren die parenchymatösen Organe sehr nahe an der Norm im histologischen Aufbau, pneumonische Fokusse wurden nicht festgestellt. Es wurden kleinere perivaskuläre Ansammlungen mononukleärer Zellen ohne Vorhandensein von neutrophilen Leukozyten beobachtet. Ein Großteil des Lungenparenchyms blieb luftverbunden. Die Blutgefäße waren jedoch erweitert und in deren Lumen konnten Ansammlungen von Erythrozyten, Monozyten und eosinophilen Leukozyten erkannt werden. Dieselben Zellelemente wie auch ausgewachsene Makrophagen – Erythrophagen waren über die inneren Alveolenräume verteilt. Es stellten sich keine Besonderheiten in der histologischen Struktur der Organe in Abhängigkeit von der verwendeten Betulindosis (25 oder 50 mg/kg) heraus.

Ähnliche Lymphoid- und Makrophagenansammlungen und ein Austritt der Erythrozyten wurden in der Periportalzone der Leber beobachtet. Ein Teil der Hepatozyten hatten Anzeichen von albuminöser Degeneration, wenn auch weniger ausgeprägt als bei den Tieren der 2. Gruppe.

In der weißen Pulpa der Milz war eine Hypertrophie der Malpighischen Körperchen zu erkennen. Sie verfügten über gut ausgeprägte helle Zentren, in denen eine bedeutende Zahl Lymphozytenstammzellen und Lymphozyten vorkamen. Trabeculae lienis aufgrund der Aktivität der Bindegewebszellen und ausgeprägter Fibrillogenese merklich verdickt. Kleinere Ansammlungen von mononukleären Zellen enthielten selten mehrkernige Makrophagen.

Der bei erfahrenen Tieren zu beobachtende rückwirkende Zustand in der Mikrozirkulationsbahn und die Ausbildung von Blutergüssen kann durch die Wirkung von TWIN erklärt werden. Hiervon zeugt eine ähnliche Erscheinung bei der Veränderung der Blutgefäße von gesunden Kontrollmäusen, denen dieses Lösungsmittel ohne Betulin verabreicht wurde.

Der experimentelle Betulintest am Modell der exsudativ-nekrotischen Tuberkulose von Mäusen zeigte dessen positive Wirkung auf die Prozesse Consolidatio und biologische Wiederherstellung der strukturellen und funktionalen Besonderheiten der Lunge und anderer parenchymatöser Organe bei dessen längerer Anwendung vor dem Hintergrund einer spezifischen antibakteriellen Therapie. Zusammen mit gegen Tuberkulose wirkenden Präparaten ermöglicht Betulin die Erzielung einer ausgeprägteren Verringerung der mit dem Entzündungsprozeß behafteten Fläche im Vergleich zur traditionellen Behandlung. Außerdem wurde bei den Tieren, die dieses Präparat erhielten, eine umfassendere biologische Wiederherstellung der Struktur bei Lunge, Leber und Milz im Vergleich zur üblichen äthiotrophen Behandlung festgestellt.

Die folgenden Untersuchungen von Betulin bezogen sich auf die Einschätzung der Effektivität von Betulin bei einer entsprechenden prophylaktischen Applikation. Außerdem wurden zusätzliche Untersuchungen der antimykobakteriellen Aktivität bei einer hohen Betulinkonzentration im Birkenrindenextrakt (98 %) vorgenommen.

Die Bestimmung der prophylaktischen Aktivität des Betulins erfolgte unter Verwendung von Birkenrindenextrakt (BRE) mit einem Betulingehalt von 72 % (BRE-1) und 98 % (BRE-2) an Männchen von Inzuchtmäusen der Linie C57BL/6. Den Mäusen wurde im Laufe von zwei Wochen BRE intragastrisch mit verschiedener Dosis eingeführt, wonach diese mittels intravenöser Injektion einer Dosis von 5 × 106KBE M. tuberculosis des Stammes H37Rv in die retroorbitale Augenhöhle infiziert wurden, stammend aus der Kollektion des Pasteur-Instituts (Frankreich). Zur Bestimmung der KBE-Menge an Mykobakterien in der erzielten Suspension wurde die aliquote Menge entnommen, eine Serie aufeinanderfolgender Verdünnungen angesetzt und 20 &mgr;l einer jeden Verdünnung in einem Tropfen auf eine Petri-Schale mit Dubois-Agar versetzt. Die Schalen wurden bei einer Temperatur von 37 °C im Laufe von 14 Tagen zur Bestimmung der MB-Konzentration im infizierenden Material kultiviert. Zur Infizierung der Mäuse wurde die aliquote Menge entfrostet, in eine Pufferphosphatlösung übergeleitet, in der 0,025 % TWIN-80 enthalten war, und bis auf eine Konzentration von 5 × 106KBE/ml gebracht.

Untersuchungsmaterial und -methoden

Alle Versuchstiere wurden in die folgenden Gruppen eingeteilt:

  • 1. Gruppe – unberührte Tiere – 15 Stck.
  • 2. Gruppe – infizierte Tiere, für die keine Behandlung erfolgte – 15 Stck.
  • 3. Gruppe – infizierte Tiere, denen BRE-1 mit einem Betulingehalt von 72 % innerhalb von zwei Wochen vor der Infizierung mit einer Dosis von 25 mg/kg verabreicht wurde – 15 Stck.
  • 4. Gruppe – infizierte Tiere, denen BRE-1 innerhalb von zwei Wochen vor der Infizierung mit einer Dosis von 50 mg/kg verabreicht wurde – 15 Stck.
  • 5. Gruppe – infizierte Tiere, denen BRE-1 innerhalb von zwei Wochen vor der Infizierung mit einer Dosis von 100 mg/kg verabreicht wurde – 15 Stck.
  • 6. Gruppe – infizierte Tiere, denen BRE-2 mit einem Betulingehalt von 98 % mit einer Dosis von 25 mg/kg verabreicht wurde – 15 Stck.
  • 7. Gruppe – infizierte Tiere, denen BRE-2 mit einer Dosis von 50 mg/kg verabreicht wurde – 15 Stck.
  • 8. Gruppe – infizierte Tiere, denen BRE-2 mit einer Dosis von 100 mg/kg Betulinlösungsmittel – TWIN-80 verabreicht wurde – 10 Stck.
  • 9. Gruppe – nicht infizierte Tiere, denen BRE-Lösungsmittel – TWIN-80 verabreicht wurde – 10 Stck.

Die Präparate wurden intragastrisch eingeführt, täglich, im Laufe von 2 Wochen, bei deren vorausgehender Lösung in Wasser mit einem Gehalt von 1 % TWIN-80. Nach zwei Wochen nach der Eingabe wurde die Hälfte der Mäuse aus dem Experiment nach der Methode der zervikalen Dislokation für eine histologische Untersuchung parenchymatöser Organe herausgenommen. Den Tieren der 9. Gruppe wurde intragastrisch TWIN-80 mit einer ähnlich der in anderen Versuchsgruppen verwendeten Dosis eingegeben. Die verbleibenden Tiere wurden belassen, um die Überlebenschancen nach einer Infektion mit virulenter MBT-Kultur einzuschätzen.

Zur Einschätzung der Effektivität der zu untersuchenden Präparate wurden von jedem Tier Stücke von Lunge, Leber und Milz zur histologischen Untersuchung entnommen.

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die Mäuse, denen BRE-1 und BRE-2 innerhalb von zwei Wochen vor der Infizierung eingegeben wurde, wesentlich länger lebten als die Mäuse der Kontrollgruppe. Dabei lag der maximale Unterschied nach dem Parameter der Überlebenschance zwischen den Mäusen der Kontrollgruppe und Mäusen, die BRE-2 mit einer Dosis von 100 mg/kg erhielten (p<0,001).

Ergebnisse der histologischen Untersuchung

Bei gesunden Mäusen, denen das zu untersuchende Präparat 2 Wochen vor der Infizierung mit MBT eingegeben wurde, ist eine Polyämie parenchymatöser Organe aufgetreten, was sich besonders in der Lunge zeigte. Bei allen Tieren wurden unabhängig von der verwendeten Dosis der zu untersuchenden Präparate Veränderungen in der Mikrozirkulationsbahn festgestellt.

Die Lumen der Blutgefäße waren erweitert und mit einer Ansammlung von Erythrozyten angefüllt. In einzelnen Bereichen des Lungenparenchyms erfolgte ein Austritt von Formelementen des Bluts in das umliegende Gewebe und es kam zur Ausbildung kleiner, teilweise aber auch großer Zonen mit Blutungen.

Auffällig war vor diesem Hintergrund bei allen Versuchstieren das Auftreten einer erhöhten Anzahl von Monozyten und Lymphozyten in Gefäßen, den Schlingen des Kapillarnetzes und Alveolenscheidewänden. Die Stufe der Infiltrierung der Lunge mit mononukleären Zellen war bei Mäusen maximal, die BRE-2 (mit einem Betulingehalt von 98 %) erhielten. Auch bei diesen wurde eine im Vergleich zur Eingabe von BER-1 (mit einem Betulingehalt von 72 %) erhöhte Rate von Alveolarmakrophagen vorgefunden. In einer Reihe von Fällen bildeten diese kleine Ansammlungen, enthielten im Zytoplasma eine merkliche Anzahl von kleinen Einschlüssen, was von einer Aktivierung der phagozytierenden Funktion der Zellen spricht, die bei Tieren besonders ausgeprägt ist, die BRE-2 mit einer Dosis von 100 mg/kg erhielten.

Ausgehend von den erzielten histologischen Werten kann davon gesprochen werden, daß eine prophylaktische Eingabe von BRE sowohl mit einem Betulingehalt von 72 % wie auch mit einem Betulingehalt von 98 % eine gewisse Beeinflussung der makrophagalen Reaktion der Lunge ergibt, so daß eine Aktivierung der Alveolarmakrophagen hervorgerufen wird, die besonders bei Mäusen hervortritt, die BRE mit einem Betulingehalt von 98 % erhielten. Gerade bei den Mäusen dieser Versuchsgruppen wurde eine Abhängigkeit der phagozytierenden Funktion der Zellen von der gewählten BRE-Dosis beobachtet, die besonders bei der Eingabe von BRE bei Betulingehalt mit einer Dosis von 100 mg/kg hervortrat.

Eine an den Versuchsmäusen bemerkte Erhöhung der Permeabilität der Blutgefäße, der Austritt von Erythrozyten in das umliegende Gewebe ist offensichtlich mit einer gewissen Nebenwirkung des BRE-Lösungsmittels TWIN verbunden. Ähnliche Änderungen in Lunge und Leber wurden an Kontrolltieren festgestellt, denen dieses Lösungsmittel verabreicht wurde. Davon zeugt auch der Fakt, daß eine Erhöhung der BRE-Dosis beider Arten bis 100 mg/kg nicht auf die Ausbildungsrate und Verbreitung von Blutungsbereichen in der Lunge wirkte.

Damit ist bei der prophylaktischen Eingabe von Betulinpräparaten eine Aktivierung der für die Immunität zuständigen Zellen (Makrophagen, Monozyten und Lymphozyten) festgestellt worden, wobei das Aktivierungsniveau der für die Immunität zuständigen Zellen bei Eingabe einer BRE-2-Dosis von 100 mg/kg am höchsten war.

Es wurde eine wesentliche Erhöhung der Überlebensdauer der Versuchstiere im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet, wobei eine maximale Erhöhung der Überlebensdauer bei der Anwendung einer BRE-2-Dosis von 100 mg/kg festzustellen war.

Untersuchung der antimykobakteriellen Aktivität von BRE-2

Die Untersuchungen erfolgten an Inzuchtmäusen der Linie C57BL/6. Bei den Versuchen wurden 10 Mäuse unterschiedlichen Geschlechts mit einem Gewicht von 21 bis 24 Gramm und einem Alter von 2 bis 4 Monaten verwendet.

Bei der Arbeit wurde der virulente Stamm M. tuberculosis H37Rv (Pasteur) verwendet.

Die erste Verdünnung des Präparats (es wurden jeweils 5 mg eines jeden Präparats verwendet) erfolgte in 120 &mgr;l Dimethylsulfoxid. Danach wurden die Präparate in einem vollständigen RPMI-1640-Medium gelöst. Die abschließende Konzentration der Präparate betrug 160 &mgr;g/ml, 80 &mgr;g/ml, 40 &mgr;g/ml, 4 &mgr;g/ml, 0,4 &mgr;g/ml und 0,04 &mgr;g/ml.

  • 1. Die Bestimmung des Einflusses des zu untersuchenden Präparats auf Mykobakterien in einer Makrophagenkultur. Die peritonealen Makrophagen (MP) schieden bei den Mäusen aus den Zellen nach 5 bis 6 Tagen nach einer intraperitonealen Injektion von 3 % Pepton ein peritoneales Exsudat aus. Eine Reinigung des peritonealen Exsudats von nicht makrophagalen Zellen erfolgte über die Adhäsion von Makrophagen in Petri-Plastschalen. Sich festsetzende Makrophagen wurden mittels Solutio Tetacini-calcii aus einer Monoschicht in eine Suspension überführt. Die Infektion von Makrophagen durch Mykobakterien (MBT) wurde in ebenbödigen 96-Loch-Planchetten in RPMI-Medium mit 2 % FCS vollzogen. Hierfür wurde die gereinigte Suspension der peritonealen Makrophagen (50 000 auf ein Loch) einer wiederholten Adhäsion in den Löchern der Planchette unterzogen, wonach zu den sich ausbildenden Monoschichten von Makrophagen in unterschiedlicher Konzentration M. tuberculosis zugegeben wurden (Verhältnis von Makrophage:Mykobakterie (MP:MBT) – 1:2,5; 1:5; 1:10). Die infizierten Makrophagen wurden in einem CO2-Inkubator im Laufe einer Nacht zur Phagozytose der Mykobakterien einer Inkubation ausgesetzt. Nach der Inkubation wurde in die Löcher das zu untersuchende Präparat in Konzentrationen von 160 &mgr;g/ml, 80 &mgr;g/ml, 40 &mgr;g/ml, 4 &mgr;g/ml, 0,4 &mgr;g/ml und 0,04 &mgr;g/ml zugegeben. Als Kontrolle wurden die Verdünnungen von Mykobakterien ohne Präparat zurückbehalten. Die Inkubation mit dem Präparat erfolgte innerhalb von 48 Stunden in einem CO2-Inkubator. 18 Stunden vor Ablauf der Inkubationsfrist wurde in die Löcher ein Merkzeichen (5,6-[3H]-Uracil in RPMI-1640-Medium mit 2 % FCS gelöst) zugefügt. Die Lebensfähigkeit der Mykobakterien in der gemischten Kultur mit den Makrophagen wurde hinsichtlich des selektiven Einschlusses von M. tuberculosis 5,6-[3H]-Uracil in die lebenden Zellen im Flüssigkeitsszintillator abgeschätzt. Vor dem Auszählen des eingeschlossenen Merkzeichens wurden die Makrophagen durch Einfrieren bei -80 °C zerstört. Alle Messungen erfolgten in Triplikaten.
  • 2. Die Ermittlung des Einflusses vom zu untersuchenden Präparat auf die Mykobakterienkultur. M. tuberculosis H37Rv wurde in einer Menge von 5 × 105, 2,5 × 105 und 1,25 × 105 KBE/Loch in einem vollständigen RPMI-1640-Medium mit 2 % FCS in eine 96-Loch-Planchette eingegeben (jeweils 3 Löcher für jede Verdünnung). Nach zweistündiger Inkubation im CO2-Inkubator (Atmosphäre von 20 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid, 37 °C) wurde das Präparat in Konzentrationen von 160 &mgr;g/ml, 80 &mgr;g/ml, 40 &mgr;g/ml, 4 &mgr;g/ml, 0,4 &mgr;g/ml und 0,04 &mgr;g/ml in die Löcher gegeben. Nach der Zugabe des Präparats wurden die 96-Loch-Planchetten einer Inkubation innerhalb von 48 Stunden in einem CO2-Inkubator unter den gleichen Bedingungen ausgesetzt. 18 Stunden vor Ablauf der Inkubationsfrist wurde in die Löcher ein Merkzeichen (5,6-[3H]-Uracil in RPMI-1640-Medium mit 2 % FCS gelöst) zugefügt. Nach Abschluß der Inkubationszeit wurde eine Messung der Menge der in die lebenden Mykobakterien eingeschlossenen Merkzeichen im Flüssigkeitsszintillator vorgenommen. Über die Aktivität der zu untersuchenden Präparate wurde nach der Menge des in die lebenden Mykobakterien eingeschlossenen 5,6-[3H]-Uracil im Vergleich mit der unberührten Kontrollgruppe ausgesagt. Alle Messungen erfolgten in Triplikaten.
  • 3. Die Ermittlung der zytotoxische Wirkung des Präparats auf die Makrophagen Die zytotoxische Wirkung des Präparats auf Makrophagen wurde nach dem Austritt des Ferments Laktatdehydrogenase (LDG) aus den zerstörten Makrophagen in das Medium mittels eines Satzes Promega's CytoTox 96® (Promega) abgeschätzt. Für den Test wurden Konzentrationen des Präparats von 160 &mgr;g/ml, 80 &mgr;g/ml, 40 &mgr;g/ml, 4 &mgr;g/ml, 0,4 &mgr;g/ml und 0,04 &mgr;g/m herangezogen. Das Präparat wurde in einer jeden Konzentration zu einer reinen Kultur von peritonealen Makrophagen zugegeben, wie auch zu einer Kultur peritonealer Makrophagen, die mit M. tuberculosis H37Rv in Verhältnissen von Makrophage:Mykobakterie (MP:MBT) – 1:2,5; 1:5 und 1:10 infiziert wurde (Tabelle 1). Die Ergebnisse der Farbreaktion wurden mit einem lichtelektrischen Kolorimeter (Sigma) bei einer Wellenlänge von 490 nm aufgenommen. Alle Messungen erfolgten in Triplikaten.

Untersuchungsergebnisse

In der ersten Etappe der Untersuchung wurde das Präparat BRE-2 auf Zytotoxizität in Bezug auf die unberührten Tiere (nicht durch Mykobakterien infizierte Makrophagen) mit der ausgewählten Dosis untersucht.

Wie aus Tabelle 10 ersichtlich ist, hat das Präparat in einer Konzentration von 40 &mgr;g/ml die Lysis der Makrophagen nur unwesentlich (bis 5,63 %) erhöht. Dagegen wurde in Konzentrationen von 160 &mgr;g/ml und 80 &mgr;g/ml BRE-2 eine zytotoxische Wirkung auf unberührte Makrophagen ausgeübt und der Prozentsatz der spezifischen Lysis von Makrophagen erreichte 76,06 %.

Bei einem Test von Betulin-2 in kleinen Konzentrationen (0,04, 0,4 und 4 &mgr;g/ml) bezüglich unberührter Makrophagen wurde keine zytotoxische Wirkung auf die Zellen festgestellt. Außerdem hat das Präparat in kleinen Konzentrationen einer spontanen Zerstörung der Makrophagen entgegengewirkt.

Zur Erzielung eines antimykobakteriellen Effekts beim zu untersuchenden Präparat wurde sowohl eine direkte Einwirkung von BRE-2 (in Konzentrationen 160, 80, 40, 4, 0,4 und 0,04 &mgr;g/ml) auf die Mykobakterien getestet als auch der Effekt von BRE-2 mit der gleichen Dosis bei Mykobakterien, die von Makrophagen phagozytiert wurden. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 12 und 13 angegeben worden.

Die Ergebnisse zeigten, daß das zu untersuchende Präparat einen signifikanten antimykobakteriellen Effekt bei allen Konzentrationen bewirkte. Der Prozentsatz der Hemmung des Wachstums von Mykobakterien unterschied sich weder bei kleinen noch bei hohen Konzentrationen und bei Konzentrationen der MBT von 1,25 × 105 und 2,5 × 105 KBE/Loch schwankte dieser von 42,78 % bis 52,68 %. Eine Ausnahme bildete eine Konzentration der Mykobakterien von 5 × 105 KBE/Loch, bei der der Prozentsatz der Hemmung des Wachstums von MBT durch das Präparat signifikant geringer als bei allen anderen MBT-Konzentration war und dieser schwankte von 14,25 % bis 25,57 %.

Bei Untersuchungen der Wirkung von BRE-2 auf Mykobakterien, die von Makrophagen phagozytiert wurden, wurde keine hemmende Wirkung des Präparats gegenüber von Mykobakterien bei keiner BRE-Konzentration festgestellt.

Die Analyse der Daten zum Wachstum von Mykobakterien in den Makrophagen bei Einwirkung einer unterschiedlichen Dosis BRE-2 auf das System Mykobakterie-Makrophage zeigte ebenfalls das Fehlen eines Hemmeffekts des Präparats (Tabellen 14 und 15).

Die nächste Etappe der Untersuchung beinhaltete den Vergleich der zytotoxischen Wirkung, die Mykobakterien auf Makrophagen ohne Präparat und bei Vorliegen von Betulin ausüben. Im Experiment wurden sowohl hohe Konzentrationen des Präparats (80 und 160 &mgr;g/ml) als auch Konzentrationen verwendet, die keinen zytotoxischen Effekt auf Makrophagen zeigten (20, 0,4, 0,04 und 40 &mgr;g/ml).

Die Ergebnisse wurden in den Diagrammen in und vorgelegt.

Wie aus den Diagrammen 5 und 6 ersichtlich wird, war die spezifische Lysis von Makrophagen bei von diesen phagozytierten Mykobakterien hoch (sie unterschied sich signifikant von spontaner Lysis inaktiver und nicht infizierter Makrophagen) und der Mittelwert der optischen Dichte (OD) schwankte von 1,52 (bei einem Verhältnis von MBT:MP 2,5:1) bis 2,19 (bei einem Verhältnis MBT:MP 10:1). Bei Zugabe von Betulin-2 in kleiner Konzentration zum System Makrophage-Mykobakterie (Diagramm 5) war die Wirkung eines Protektionseffekts auf die Makrophagen festzustellen. Das Absterben von Makrophagen verringerte sich aufgrund einer Ermittlung des LDG-Austritts bei allen Verhältnissen MP:MBT und bei allen Konzentrationen. Eine Ausnahme trat bei einem Punkt auf – MP:MBT 10:1 bei einer Konzentration des Präparats von 4 &mgr;g/ml (OD=2,12), der Prozentsatz der spezifischen Lysis von Makrophagen war nicht signifikant niedriger als der Prozentsatz der spezifischen Lysis von Makrophagen in der Kontrollgruppe (ohne Präparat).

Die Ergebnisse, die beim Test von BRE-2 im System Makrophage-Mykobakterie in hohen Konzentrationen (40, 80, 160 &mgr;g/ml) erhalten wurden, zeigten, daß das Präparat in keiner Dosis zum Rückgang der Zerstörung von Makrophagen führte, die von Mykobakterien infiziert waren (Diagramm 6).

Damit zeigte das Präparat BRE-2 eine antimykobakterielle Aktivität bei direkter Einwirkung auf die Mykobakterien, wobei der Effekt nicht von der Dosis des Präparats abhing – eine Hemmung des Wachstums von Mykobakterien wurde sowohl bei kleiner (0,04, 0,4, 4 &mgr;g/ml) wie auch bei starker Dosis (40, 80, 160 &mgr;g/ml) von BRE-2 beobachtet. Der Prozentsatz der Hemmung des Wachstums von Mykobakterien bei Einwirkung von BRE-2 war höher (bis zu 52,68 %) als bei den früher untersuchten Präparat BRE-1 (bis zu 43,99 %). Bei der Einwirkung von BRE-2 auf das System Makrophage-Mykobakterie wurde jedoch keine hemmende Wirkung beobachtet.

Bei der Untersuchung des zytotoxischen Effekts von Betulin-2 auf nicht von Mykobakterien infizierte Makrophagen stellte sich heraus, daß der Dosisbereich, der keinen zytotoxischen Effekt auf makrophagale Zellen zeigt, etwas weiter ist als bei dem früher untersuchten Betulin. Betulin-2 rief kein Absterben von Makrophagen bei einer Dosis von 0,04, 0,4, 4 und 40 &mgr;g/ml hervor (bei einer Dosis von 40 &mgr;g/ml war der Prozentsatz der spezifischen Lysis von Makrophagen 5,63 %).

Die Untersuchung des Protektionseffekts von BRE-2 auf die Makrophagen, die von Mykobakterien infiziert waren, zeigte, daß BRE-2 die Zerstörung von Makrophagen durch Mykobakterien lediglich bei kleiner Dosis verringerte (0,04, 0,4 und 4 &mgr;g/ml). Eine starke Dosis BRE-2 zeigte keinen derartigen Effekt.

Zusammenfassung

Es wurde eine Möglichkeit für die Verwendung von Betulin und dieses enthaltenden Birkenrindenextrakt zur Behandlung und Prophylaxe von Tuberkulose aufgedeckt.


Anspruch[de]
Mittel zur Behandlung und Prophylaxe von Tuberkulose, das Betulin und eine pharmazeutisch oder veterinär annehmbare Trägersubstanz enthält. Mittel zur Behandlung und Prophylaxe von Tuberkulose, das Birkenrindenextrakt und eine pharmazeutisch oder veterinär annehmbare Trägersubstanz enthält. Mittel nach Pkt. 2, das durch die Verwendung von Birkenrindenextrakt mit einem Betulingehalt von über 70 % gekennzeichnet ist. Verwendung von Betulin zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung und Prophylaxe von Tuberkulose bei Mensch und Tieren. Verwendung von Birkenrindenextrakt zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung und Prophylaxe von Tuberkulose bei Mensch und Tieren. Methode für die Behandlung und Prophylaxe von Tuberkulose, die sich auf die Eingabe von Betulin in ein Behandlung und Prophylaxe von Tuberkulose benötigendes Subjekt stützt. Methode für die Behandlung und Prophylaxe von Tuberkulose, die sich auf die Eingabe von Birkenrindenextrakt in ein Behandlung und Prophylaxe von Tuberkulose benötigendes Subjekt stützt.






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