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Dokumentenidentifikation DE69334085T2 16.05.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000628164
Titel VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUR KONFOKALEN FLUORESZENZABTASTUNG EINER KAPILLARFILTERANORDNUNG
Anmelder The Regents of the University of California, Oakland, Calif., US
Erfinder MATHIES, Alfred, Richard, El Cerrito, CA 94530, US;
HUANG, Chen, Xiaohua, Mountain View, CA 94043, US;
QUESADA, Alejandro, Mark, San Francisco, CA 94116, US
Vertreter v. Füner Ebbinghaus Finck Hano, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69334085
Vertragsstaaten CH, DE, FR, GB, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 23.02.1993
EP-Aktenzeichen 939069977
WO-Anmeldetag 23.02.1993
PCT-Aktenzeichen PCT/US93/01607
WO-Veröffentlichungsnummer 1993017325
WO-Veröffentlichungsdatum 02.09.1993
EP-Offenlegungsdatum 14.12.1994
EP date of grant 22.11.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.05.2007
IPC-Hauptklasse G01N 21/64(2006.01)A, F, I, 20051224, B, H, EP
IPC-Nebenklasse G01N 27/447(2006.01)A, L, I, 20051224, B, H, EP   G02B 21/00(2006.01)A, L, I, 20051224, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Kurzbeschreibung der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich insgesamt auf einen Kapillaranordnungsabtaster sowie auf ein solches Verfahren und insbesondere auf einen konfokalen Kapillaranordnungs-Fluoreszenzabtaster sowie auf ein Verfahren zur Erfassung von elektrophoretischen, chromatographischen oder anderen Trennungen, die an Reihenanordnungen von Kapillaren ausgeführt werden.

Die Kapillar-Elektrophorese (CE) hat eine weit verbreitete Anwendung in der analytischen und biomedizinischen Forschung gefunden, wobei der Umfang und die Verfeinerung der CE noch schnell weiter fortschreitet1 bis 5. Für die schnelle Trennung und Analyse von synthetischen Polynukleotiden6, DNA-Sequenzerfragmenten7 bis 11 und DNA-Restriktionsfragmenten12, 13 hat man mit Gel gefüllte Kapillaren verwendet. Die Kapillar-Elektrophorese im offenen Rohr hat bei Aminosäureabtrennungen14 subattomole Erfassungspegel erreicht und ihre Nützlichkeit für die Trennung von Proteinen, Viren und Bakterien15 erwiesen. Eine Trennung der optischen Isomere von Dansylaminosäuren wurde ebenfalls erfolgreich demonstriert16. In Kapillarsäulen können eine micellare elektrokinetische Kapillarchromatographie sowie eine Derivation auf der Säule ausgeführt werden, was die Nützlichkeit von Kapillaren als analytisches und mikropreparatives Werkzeug4, 5 beweist.

Die Vorteile der CE bestehen eigentlich aus der Verwendung einer Kapillaren mit kleinem Innendurchmesser (20 bis 200 &mgr;m). An Silikatsglaskapillaren mit kleinem Durchmesser können ohne beträchtliche Zunahme der Temperatur des Trennmediums oder der Säule hohe elektrische Felder angelegt werden. Da die elektrophoretische Geschwindigkeit der geladenen Spezies proportional zum angelegten Feld ist, kann die CE eine schnelle hochauflösende Trennung erreichen. Die verringerte Joule-Erwärmung bei der CE ist ein Ergebnis eines sehr niedrigen Stroms, der durch die Kapillare hindurchgeht, des großen Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen des Kapillarkanals, der Verwendung von dünnen Kapillarwänden (50 bis 150 &mgr;m) und der hohen Wärmeleitfähigkeit des Wandmaterials1.

Obwohl die CE eine schnelle Analyse bereitstellt, ist insoweit der Gesamtdurchsatz nicht groß, da insgesamt nur eine Kapillare zur gleichen Zeit analysiert werden kann. Die Entwicklung eines Verfahrens zur Steigerung des Durchsatzes der CE ist eine herausfordernde und wichtige Aufgabe. Eine möglich Annäherung besteht in der Verwendung viel stärkerer elektrischer Felder, die schnellere Separationen bilden würden. Höhere elektrische Felder führen jedoch häufig zu einer Überhitzung der Säulen und einem Säulendefekt.

Ein Artikel in Biotechniques, Band 9, Nr. 1 (1990), Seiten 74 bis 79, "DNA Sequencing Separations in Capillary Gels on a Modified Commercial DNA Sequencing Instrument" (DNA-Sequenztrennungen in Kapillargelen an einem modifizierten kommerziellen DNA-Sequenzerinstrument) von R. Zagrusky und R. McCormick offenbart die Verwendung eines Argon-Laserstrahls mit 488 nm, der von einem Spiegel abgelenkt wird, der an der Welle eines digital gesteuerten Schrittmotors angebracht ist, um einen Punktfleck von 100 &mgr;m Durchmesser in jede gelgefüllte Kapillare einer Reihenanordnung von innen sequentiell zu fokussieren. Eine Fluoreszenz wird gleichzeitig von einem Paar von stationären Fotovervielfachern erfasst.

Ein anderer Weg zur Erhöhung des Durchsatzes besteht darin, eine große Anzahl von Kapillartrennungen parallel verlaufen zu lassen. Dieses Verfahren verwendet eine Reihenanordnung von Kapillaren und wird deshalb kapillare Reihenanordnungs-Elektrophorese (CAE) genannt. Die CAE ist potentiell vorteilhaft, weil die einzelnen Kapillaren unabhängig vom Einlass manipuliert werden können, wodurch ein schnelles paralleles Laden von Mehrfachproben erleichtert wird. Bei unserem Verfahren werden die Kapillaren zu einem Band am Auslass kombiniert, um eine parallele Erfassung an der Säule zu erleichtern. Auf diese Weise sollte eine Steigerung des CE-Durchsatzes um zwei Größenordnungen erreichbar sein, da Hunderte von Kapillaren für die Erfassung leicht gebündelt werden können.

Ein wesentliches Problem bei der Kapillaranordnungs-Elektrophorese ist die Erfassung. Da kleine Mengen einer Probe in eine Kapillare injiziert werden, ist ein hochempfindliches Erfassungssystem unerlässlich. Eine Fluoreszenz durch Lasererregung hat sich als ein empfindliches Erfassungsverfahren in der kapillaren Elektrophorese und in der DNA-Sequenzierung7 bis 11, 14, 17 bis 21 erwiesen. Bei den meisten Themata einer lasererregten Fluoreszenzerfassung sind der einfallende Laserstrahl und die emittierte Fluoreszenz senkrecht zueinander. Es ist schwierig, ein System zum Erfassen einer Reihenanordnung von Kapillaren zu gestalten, das diese Geometrie verwendet. Wie in der EP-A-440 342 offenbart ist, haben wir neuerdings einen lasererregten Konfokalfluoreszenzgelabtaster eingeführt, der eine verstärkte Erfassung von fluoreszenzmäßig etikettierter DNA in Slabgelen22 bis 26 bereitstellt. Dieses Erfassungssystem verwendet ein Epi-Illuminations-Format, bei welchem der Laser auf die Probe durch ein Mikroskopobjektiv fokussiert wird und die emittierte Fluoreszenz von dem gleichen Objektiv unter Verwendung einer 180°-Geometrie gesammelt wird, worauf eine konfokale Erfassung folgt. Diese Geometrie ist für eine An-der-Säule-Erfassung der Kapillaren ideal. Bei der Verwendung einer konfokalen Erregung und Erfassung ist die Tiefe eines Feldes des optischen Systems ausreichend klein, so dass nur das Innere der Kapillare sondiert wird. Hintergrundstreuung, Streufluoreszenz und Reflexionen aus der Kapillarwand werden durch räumliche und spektroskopische Filter absorbiert. Die hohe numerische Apertur des Mikroskopobjektivs sammelt die Fluoreszenz äußerst effizient und bietet dem räumlichen Lochblendenfilter ein Bild hoher Qualität. Die Nutzung der Fluoreszenzmikroskoperfassung für die CE wurde in früheren Studien bekannt, wobei statische optische Systeme zur Erfassung einzelner Kapillaren27, 28 verwendet wurden.

Wir zeigen hier, dass der ideale Weg, einen konfokalen Fluoreszenzdetektor zur Erfassung einer Reihenanordnung von Kapillaren zu verwenden, darin besteht, die kapillare Reihenanordnung am Detektor vorbei abzutasten. Dieses Format hat mehrere Vorteile, die das Verhältnis von Signal zu Rauschen verbessern: (1) der gesamte Querschnitt des Elektrophoresebandes wird getestet, wenn er an der Kapillare nach unten und durch den Erfassungsbereich hindurchgeht, (2) Probleme infolge der Fotobleichung des Bandes, die die Empfindlichkeit begrenzen, werden minimiert, da das gesamte Band getestet wird und das optische System sich konstant über das in Untersuchung befindliche Band bewegt, und (3) der Zylinderlinseneffekt der Kapillarwände ermöglicht eine ausgedehnte Erfassung des Trennungskanals, der das Verhältnis von Signal zu Rauschen verbessert. Diese Vorteile bedeuten, dass ein konfokales Abtasten ein einzigartiger starker Weg zur Ausführung von Hochempfindlichkeitserfassungen von Separationen an einer Reihenanordnung von kapillaren Säulen ist.

Ziele und Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Erhöhung des Durchsatzes bei Kapillarseparationen bereitzustellen.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Abtasten einer Reihenanordnung von Kapillaren bereitzustellen, um Separationen von Substanzen in den Kapillaren zu erfassen.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, ein hochempfindliches Fluoreszenzerfassungssystem zum Analysieren des Innenraums einer Anzahl von parallelen Kapillaren bereitzustellen.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Analysieren einer Anzahl von Separationen in einer Reihenanordnung von Kapillaren bereitzustellen, die unabhängig an ihrem Einlass manipuliert werden können, um eine parallele Beladung zu erleichtern und die in einer Bandanordnung zum Erfassen der Trennungen durch einen konfokalen Abtaster kombiniert werden.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, ein lasererregtes konfokales Fluoreszenzerfassungssystem sowie ein Verfahren zum Analysieren des Gels in dem Innenraum jeder Kapillare eines Kapillarbandes während der Elektrophorese bereitzustellen, das eine Vielzahl von Kapillaren aufweist, die in einer Beziehung Seite an Seite angeordnet sind.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, einen lasererregten Fluoreszenzkapillarabtaster zum Abtasten einer Reihenanordnung von Kapillaren während einer CE bereitzustellen.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, einen lasererregten Fluoreszenzabtaster bereitzustellen, der Trennungen über dem Kapillarkanal erfasst, um das gesamte Separationsband zu prüfen.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Analysieren einer DNA-Sequenzierung in einer Reihenanordnung von Kapillaren bereitzustellen, die unabhängig von ihrem Einlass manipuliert werden können, um ein paralleles Beladen zu erleichtern, und die in einer Bandanordnung zum Erfassen der Separationen durch einen konfokalen Abtaster kombiniert werden.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, ein lasererregtes konfokales Fluoreszenzerfassungssystem und ein Verfahren zum Analysieren von DNA-Fragmenten während einer Gelelektrophorese in jeder Kapillare eines Kapillarbandes bereitzustellen, das eine Vielzahl von mit Gel gefüllten Kapillaren aufweist, die in einer Beziehung Seite an Seite angeordnet sind.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, einen Kapillarabtaster bereitzustellen, der ein Fotobleichen der Probe in der Kapillaren unterbindet.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, einen Kapillarreihenanordnungsabtaster bereitzustellen, bei dem die Kapillaren für ein fortlaufendes Prüfen des Kapillarvolumens geformt sind.

Dementsprechend stellt die Erfindung einen Abtaster, wie er im Anspruch 1 angegeben ist, und ein Verfahren zum Erfassen von Fluoreszenz aus DNA-Sequenzerfragmenten, wie es im Anspruch 7 angegeben ist, bereit.

Die vorstehenden und weitere Ziele der Erfindung werden deutlicher aus der folgenden Beschreibung, gelesen in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen, verständlich, in denen

1 ein Schema eines Konfokalfluoreszenz-Kapillarreihenanordnungsabtasters nach einer Ausführungsform der Erfindung ist,

2 eine Ansicht eines Halters zum Halten eines Bereichs von Kapillaren in einer Beziehung nebeneinander ist,

3 eine vergrößerte Ansicht der Fokuszone ist,

4A und 4B veranschaulichen, wie der Erregungsstrahl auf ein Volumen im Inneren einer zylindrischen Kapillaren fokussiert wird,

5 ein durch Abtasten einer Vier-Kapillaren-Anordnung während einer DNA-Trennung erhaltenes Bild ist,

6 ein Elektropherogramm der DNA-Separation von 5 ist,

7 eine auseinandergezogene Ansicht der mit Markierungen versehenen Bereiche der Elektropherogramme von 6 ist,

8 ein durch Abtasten einer Vierundzwanzig-Kapillaren-Reihenanordnung erhaltenes Bild ist und

9 ein Schema eines Konfokalfluoreszenz-Kapillarabtasters für vier Farben ist.

Nach der Erfindung wird der Durchsatz bei der Kapillarelektrophorese durch Verwendung einer großen Anzahl von parallelen Kapillaren gesteigert. Das wichtigste Problem bei der Kapillarreihenanordnungs-Elektrophorese ist die Erfassung. In dem US-Patent 5 091 652 und in der EP 0 440 342 ist ein lasererregter Konfokalfluoreszenz-Gelabtaster beschrieben, der eine verstärkte Erfassung von fluoreszenzmäßig etikettierten DNA in Slabgelen ermöglicht. Dieses Erfassungssystem verwendet ein Epi-Illuminations-Format, bei welchem der Laser auf die Probe durch ein Mikroskopobjektiv fokussiert ist und die emittierte Fluoreszenz durch das gleiche Objektiv unter Verwendung einer retrooptischen Geometrie von 180° gesammelt wird, worauf die konfokale Erfassung erfolgt.

Eine sensitive Erfassung von fluoreszenzmäßig etikettierten Analyten, die in Kapillaren mit kleinem Durchmesser separiert sind, ist eine schwierige Aufgabe. Da die Kapillaren einen Innendurchmesser von 100 &mgr;m oder weniger haben, wird ein kleines Fokusvolumen benötigt. Das Erfassungssystem muss potentiell starke Rayleigh-Streuung, Fluoreszenz und Reflexionen von den Kapillarwänden unterdrücken. Bei Verwendung einer konfokalen Erregung und Erfassung ist die Tiefe des Felds des optischen Systems ausreichend klein, dass nur das Innere der Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 100 &mgr;m geprüft wird. Die seitliche Auflösung, die durch das Abtaststadium und den Laserstrahldurchmesser vorgegeben ist, kann nur wenige &mgr;m klein sein. Die Hintergrundstreuung und die Reflexionen von der Kapillarwand werden von den räumlichen und spektroskopischen Filtern vor dem Fotodetektor absorbiert.

Ein konfokales Fluoreszenzerfassungssystem zur Verwendung bei Kapillarreihenanordnungen ist in 1 gezeigt. Als Erregungsquelle wird ein nicht gezeigter Argonionenlaser (Modell 2020, Spectra-Physics, Mountain View, Kalifornien) verwendet. Der Laserstrahl wird auf einen Durchmesser von 5 mm aufgeweitet, kollimiert und dann durch ein 32X, N.A. 0,4-Objektiv 11 mit Unendlichzuordnung (LD Plan-Achromat 440850, Carl Zeiss, Westdeutschland) durch einen dichroitischen Langpass-Strahlteiler 12 (480DM, Omega Optical, Brattleboro, VT) gerichtet. Der dichroitische Strahlenteiler 12 reflektiert den Strahl des Erregungslasers in das Objektiv 11, überträgt jedoch von dem Objektiv gesammeltes fluoreszentes Licht, das eine Stoke-Verschiebung zu größeren Wellenlängen hin aufweist. Das Objektiv fokussiert den erregenden Laser auf die Probe und sammelt die Fluoreszenz mit einem sehr hohen Sammlungswirkungsgrad. Die Verwendung eines Objektivs mit Unendlichzuordnung ermöglicht eine vertikale Einstellung des Sondenvolumens durch Verschieben des Objektivs mit der Halterung 13, die an der Basis 14 befestigt ist, ohne merkliche Störung der optischen Ausrichtung. Der fokussierte 1 mW-Strahl mit einer Wellenlänge von 488 nm wird auf einen Strahldurchmesser von 10 &mgr;m und einen konfokalen Strahlparameter von 25 &mgr;m fokussiert. Die Fluoreszenzemission wird durch den dichroitischen Langpass-Strahlenteiler 12, der an der Basis 14 angebracht ist, zurückgeführt, um die Laserinterferenz zu reduzieren und um den Erregungs- und Erfassungsweg zu trennen. Dann wird die Fluoreszenz durch eine Linse 16 mit einer Brennweite von 75 mm, die an der Basis 14 angebracht ist, auf eine Lochblende von 400 &mgr;m fokussiert, die als der konfokale räumliche Filter dient. Das durch die Lochblende hindurchgehende Licht wird durch ein 488 nm-Absorptionsbandfilter (488 RB-Filter, Omega Optical, Brattleboro, VT), ein Langpass-Sperrfilter (Schott GG-495 Esco, Oakridge, NJ) und ein Bandpass-Fluoreszenzfilter (530 DF60, Omega Optical, Brattleboro, VT) gefiltert, die alle innerhalb des Gehäuses 17 angeordnet sind, worauf die Erfassung mit einem gekühlten Fotomultiplier 18 (RCA 31034A, Burle Industries, Lancaster, PA) erfolgt. Der räumliche Filter, die optischen Filter und der Fotovervielfacher sind auf der Basis 14 angebracht. Der Ausgang aus dem Fotovervielfacher wird durch einen Verstärker mit geringem Rauschen (SR560, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA) verstärkt und gefiltert, mit einer Analog-Digital-Platte von 12 bit (DASH-16F, Metra-Byte, Taunton, MA) digitalisiert und in einem Mikrorechner IBM PS/2 gespeichert. Der für den Fotovervielfacherausgang verwendete elektronische Filter war ein aktiver Tiefpassfilter erster Ordnung (DC bis 400 Hz) mit einer Dämpfung von 12 dB/Octave.

Die kapillare Reihenanordnung weist eine Vielzahl von Kapillaren 21 auf, deren Enden 22, 23 sich in Potentialtöpfe 24, 26 erstrecken, zwischen denen eine hohe Spannung für eine Elektrophorese angelegt ist. Die Enden 22 können für eine individuelle Handhabung und Beladung separiert sein. Ein Teil 27 der Kapillaren wird in einer parallelen koplanaren Beziehung Seite an Seite durch einen Halter 28, 2, gehalten. Der Halter 28 hat ein Fenster, durch welches der Strahl auf das Innenvolumen der Kapillaren fokussiert werden kann. 3 zeigt den Strahl 28 fokussiert in ein Innenvolumen einer Kapillare 21a.

Das Abtasten des Strahl- und Erfassungssystems über der Kapillare ist aus mehreren Gründen besser als nur in der Mitte der Kapillare zu sondieren. Wenn der Sondenlaser an der Mitte der Kapillare fixiert ist, wird zuerst der Probestrom durch den Laser schnell fotogebleicht. Ein seitliches Abtasten des Strahls über den Kapillarinnenraum ist viel besser als das Sitzen in einem Fleck, da das gesamte Band sondiert (seitlich) und die Fotobleichung reduziert wird. Ferner ist die Sondierung außerhalb der Achse vorteilhaft, da, wie in 4A und 4B gezeigt ist, der zylindrische Linseneffekt den Strahlverlust tatsächlich zurück in das Kapillargel bringt, so dass das Erfassungssystem das Gel über einen Zeitraum während der Abtastung sondiert, der länger ist als man ihn nominal aus dem Kapillardurchmesser und der Abtastrate vorhersagen würde.

Der Halter 28 ist an einer Verschiebebühne 30 (Modell 4000, Design Components, Franklin, MA) angebracht. Die Bühne ist so programmiert, dass sie die kapillare Reihenanordnung hin und her mit 20 mm/s fortlaufend in einer Richtung abtastet, die senkrecht zu der Elektrophorese-Richtung ist. Das auf diese Weise erfasste Bild hat zwei Dimensionen. Die eine ist eine räumliche Dimension, die das physikalische Bild der Kapillaren wiedergibt. Die andere ist eine zeitliche Dimension, die proportional zur abgelaufenen Zeit ist. Während eines speziellen Durchgangs werden Fluoreszenzdaten aus dem Fotodetektor bei 2000 Hz abgetastet, so dass die nominelle Bildauflösung 10 &mgr;m/Pixel beträgt. Somit stellen 10 Pixel die 100 &mgr;m Innenraumbreite irgendeiner gegebenen Kapillare dar. Die elektronische Tiefpassfilterunterbrechung wurde auf 300 Hz gesetzt, um eine Absorption des Hochfrequenzrauschens bereitzustellen, während die räumlichen Frequenzen noch hindurchgingen, die erforderlich sind, um einen Innendurchmesser von 100 &mgr;m der Kapillaren zu definieren. Ein Bild des wandernden Bandes wird als Funktion der Zeit dadurch aufgebaut, dass die periodischen Ein-Sekunden-Durchgänge des beleuchteten Bereichs der Kapillaren akkumuliert werden. Die Übergangszeit der wandernden DNA vorbei an dem Abtastbereich geht unter den hier verwendeten Bedingungen von etwa 10 s für Fragmente mit niedrigem Molekulargewicht (40 bis 50 mers) bis 14 s für Fragmente mit höherem Molekulargewicht (380 bis 390 mers). Mit Wiederholungszyklen von einer Sekunde ergibt dies 10 bis 14 Abtastwerte für jedes Band. Der Rechner verarbeitet die Daten und zeigt das erfasste Bild in Realzeit an. Die Bildverarbeitung kann mit dem NIH-Programm, Image 1.29 und einem herkömmlichen Bildverarbeitungspaket CanvaTM ausgeführt werden, um ein Bild – 5 – zu erhalten. Die Bilddaten können auf eine eindimensionale Linienaufzeichnung oder ein Elektropherogramm dadurch reduziert werden, dass die Pixel über der Breite einer jeden Bahn unter Verwendung von Image 1.29, 6, gemittelt werden, während Abschnitte, wie in 7 gezeigt ist, aufgeweitet werden können.

Bei einem Beispiel wurden mit einem Gel aus null-vernetztem Polyacrylamid gefüllte Kapillaren vorbereitet, wobei für den Vorgang ein modifiziertes Verfahren verwendet wird, wie es von Cohen et al.6, 7 beschrieben ist. In jeder der Quarzglaskapillaren (Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) mit einem Innendurchmesser von 100 &mgr;m und einem Außendurchmesser von 200 &mgr;m wurde ein 3 mm breites Erfassungsfenster dadurch hergestellt, dass die Polyimid-Beschichtung mit einem heißen Draht weggebrannt wurde. Das Fenster wurde 25 cm von der Einlassseite der 40 cm langen Kapillare gebrannt. Die Innenwand von jeder der Kapillaren wurde dann über Nacht mit einem bifunktionalen Reaktionsmittel, nämlich &ggr;-Methacryloxypropyltrimethoxy-Silan behandelt, um die Wände für eine Acrylamidhaftung6 zu präparieren. Es wurde eine frisch hergestellte Acrylamidgellösung (9% T, 0% C) in einem 1X TBE-Puffer (Tris-Borsäure-EDTA) mit 7M Harnstoff mittels eines 0,2 &mgr;m-Spritzenfilters gefiltert und unter Vakuum über etwa eine Stunde entgast. Der Gellösung wurde bei einer Endkonzentration von etwa 0,03% eine Lösung aus 10% TEMED (Tetraethylmethylendiamin) und aus 10% APS (Ammoniumpersulfat) zugegeben. Die Lösung wurde umgehend in die Kapillaren vakuumsiphoniert und dann über Nacht in einem kalten Raum polymerisieren gelassen. Vor der Verwendung wurden beide Enden der Säule um etwa 1 cm abgeschnitten und dann 30 bis 60 Minuten bei 7 kV einer Vorelektrophorese unterworfen.

Die kapillare Reihenanordnung wurde sandwichartig in dem Kapillarhalter 28 angeordnet, der auf der Verschiebebühne 30 angeordnet ist. Der Kapillarhalter 282 – dient einem doppelten Zweck, nämlich (1) jede Kapillare in der Anordnung auf einer identischen Höhe über der Oberseite der Verschiebebühne gleichförmig zwangsweise zu halten und (2) ein kleines Fenster freizulegen, durch welches die konfokale Zone den kapillaren Innenraum abtastet. Die Zwangshalterung der Kapillaren im Wesentlichen in der gleichen Ebene ist nötig, um eine gleichförmige Erfassungsempfindlichkeit von jeder Kapillare zu erhalten, da die Schärfentiefe des Mikroskopobjektivs nur ungefähr 25 bis 50 &mgr;m beträgt.

Die DNA-Proben, deren Daten in den 5 bis 7 gezeigt sind, wurden wie folgt präpariert: Unter Verwendung von Sequenase 2.0 Sequenzierbausatz (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) und fluorescin-markiertem Primer "FAM" (Applied Biosystems, Foster City, CA) wurden M 13mp 18 DNA-Fragmente mit Kettenabbruch hergestellt. Der detaillierte Vorgang ist anderweitig veröffentlicht25. Zusammengefasst wurden etwa ein pmol des Primers und eine Einzelstrang-M13mp18DNA auf 65°C über drei Minuten erhitzt und dann abkühlen gelassen (Hybridisierungsreaktion). Mittlerweile wurde die Sequenzierverlängerungsmischung in ein Zentrifugenröhrchen gegeben, worauf die Zugabe der Dideoxy-Abbruchmischung folgt. Wenn die Temperatur der Hybridisierungsreaktionsmischung unter 30°C abfällt, wurde eine Kombination aus der Markiermischung und einem verdünnten Enzym (Sequenase 2.0TM) zugegeben und dann die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Mischung wurde dann in das Röhrchen mit der Abbruchmischung überführt und weitere fünf Minuten bei 37°C inkubieren gelassen. Anstelle der Zugabe einer Anhaltelösung wurde eine Ethanolabscheidung unmittelbar benutzt, um die Reaktion zu beenden und um die DNA-Sequenzierprobe zu gewinnen. Die hohe Konzentration von leitenden Ionen, die in der DNA-Sequenzierprobe nach dem Abbruchschritt vorhanden sind, würde die DNA-Menge verringern, die in jede Kapillare durch elektrokinetische Einspritzung geladen werden kann. Um diesem Effekt entgegenzuwirken, wird eine Ethanolabscheidung auf allen DNA-Proben ausgeführt, worauf eine Resuspendierung in 6 &mgr;l von 80-prozentigem (v/v) Formamid folgt, um eine Konzentration zu erhalten, die etwa um das Zehnfache höher als diejenige ist, die in Slab-Gelen verwendet wird. Die Probe wird auf 90°C über drei Minuten gehalten, um eine Denaturierung zu gewährleisten, und dann bis zum Probeneinspritzen auf Eis platziert.

Die Flexibilität der Kapillarsäulen ermöglicht eine Verbindung der einzelnen Kapillaren der Reihenanordnung mit den einzelnen Proben-Potentialmulden. Da bei dem vorstehenden Beispiel nur eine DNA-Sequenzierprobe eingesetzt wurde, wurde sie in einem einzigen 500&mgr;l-Zentrifugenröhrchen für eine elektrokinetische Einspritzung in die Kapillaren angeordnet. Die gleiche elektrische Feldstärke (200 V/cm), die während der Separierung verwendet wurde, wird auch während der Probeneinspritzung angelegt. Die typische Einspritzzeit beträgt 10 Sekunden. Nach dem Einspritzen werden die Einlässe der Kapillaren von dem Zentrifugenröhrchen entfernt und in einem Pufferspeicher oder einer Mulde 24 angeordnet, die mit frischem laufendem Puffer gefüllt ist. Die 9%-T-Gele sind ausreichend stabil, dass an jeder Kapillare vier bis fünf Sequenziervorgänge durchgeführt werden können.

5 zeigt ein Bild, das bei einer konfokalen Online-Abtastung einer Reihenanordnung mit vier Kapillaren während der Elektrophorese einer Mischung aus DNA-Sequenzierfragmenten erhalten wird Die horizontale Richtung ist die physikalische Abmessung, die die geometrische Anordnung der Reihenanordnung wiedergibt, während die vertikale Richtung sich auf die Zeit bezieht und den Durchgang der fluoreszenten DNA-Fragmente durch das Erfassungsfenster darstellt. Für einen Vergleich von Bahn zu Bahn wurden identische Proben der "G"-Base-DNA-Fragmente gleichzeitig elektrokinetisch in jede Kapillare injiziert. Die abgelaufene gesamte Datenerfassungszeit beträgt ungefähr 80 min nach dem Durchgang des Primers. In 5 ist ein erweiterter Bereich des Bildes eingeschlossen. Die Bänder in allen vier Bahnen sind gut aufgelöst und die Auflösung erstreckt sich über den Sequenzierverlauf mit einem ausreichenden Verhältnis von Signal zu Rauschen, um Bänder von mehr als 500 Basen jenseits des Primers zu erfassen. Aus 5 kann man deutlich sehen, dass die zylindrischen Kapillaren das Bild nicht merklich verzerren.

6 und 7 sind Liniendiagramme des DNA-Signals, das über der Breite einer jeden Kapillaren integriert ist. Man beobachtet ein Verhältnis von Signal zu Rauschen von etwa 20 bis zur Base 385 (etwa 65 min), während Bänder bis zur Base 500 bei den vorliegenden Versuchsbedingungen erfasst werden. Die Anzahl der theoretischen Platten beträgt 1,9 × 106 (an der Base 385) über eine effektive Säulenlänge von 24 cm.

Zwischen dem Verhältnis von Signal zu Rauschen, das man bei dem Abtastmodus erhält, und für den Fall, bei welchem das System in der Mitte einer einzigen stationären Kapillare fokussiert ist, wird ein Vergleich ausgeführt. Der letztere Versuch ist analog zu der traditionellen Erfassung an der Säule aus einer einzigen Kapillare. Die für den Abtastmodus extrapolierten Empfindlichkeitsgrenzen ergaben sich zu etwa 2 × 10–12 M (S/N = 3) bei Strömenlassen von 1 × 1011 M Fluorescin durch eine offene Kapillare. Die Empfindlichkeitsgrenzen für den stationären Modus ergaben sich zu etwa 1 × 10–12 M. Diese Erfassungsgrenzen sind wenigstens so gut wie diejenigen, die sich aus Einzelkapillaren unter Verwendung der herkömmlichen 90°-Erfassungsgeometrie10 ergeben. Der Hintergrund aus den mit Gel gefüllten Kapillaren war ungefähr 2,6-mal (n = 4) höher als der aus einer nur mit TBE-Puffer gefüllten Kapillare. Somit erhöhte des Vorhandensein des Gels das Hintergrundrauschen um einen Faktor von ungefähr 1,6.

Diese Arbeit zeigt, dass die gesamte Durchsatzleistung von CAE sehr hoch sein kann. Bei der vorliegenden Untersuchung wird eine zufriedenstellende Sequenzierinformation bis zu 500 Basen für jede der vier Kapillaren erhalten. Der Gesamtdurchsatz des Systems hängt von der Gesamtzahl der Kapillaren N ab, die abgetastet werden können. Die Gleichung N ≈ vT/2D bestimmt, wie N von der Abtastgeschwindigkeit (v), der Abtastwiederholperiode (T) und dem kapillaren Außendurchmesser (D) abhängt. Für beispielsweise hundert Kapillaren mit einer Breite von 200 &mgr;m lässt sich leicht die Verwendung einer Abtastrate von vier cm/s und einer Abtastwiederholperiode von ein s ersehen. Eine Steigerung der Reihenanordnungsgröße würde (1) eine Steigerung der Abtastgeschwindigkeit, (2) die Verwendung von Kapillaren mit kleinerem Außendurchmesser und (3) eine Steigerung der Abtastwiederholperiode erfordern, die die zeitliche Auflösung der Elektrophoreseseparierung verringern würde. Da zuverlässige Systeme Geschwindigkeiten bis zu zehn cm/s haben und Kapillaren mit Außendurchmessern von 150 &mgr;m im Handel verfügbar sind, kann eine Grenze von etwa 330 Kapillaren/Reihenanordnung projiziert werden, wenn man eine Abtastwiederholperiode von einer Sekunde annimmt.

Um unsere Fähigkeit zu erläutern, dieses System auf große Zahlen von Kapillaren auszudehnen, zeigen wir in 8 eine Anordnung 24 von Kapillaren, die verwendet wurden, um eine andere DNA-Sequenzierprobe zu separieren.

Schließlich ist zu erwähnen, dass es einen beträchtlichen Unterschied in der Migrationszeit für ein gegebenes DNA-Band von Bahn zu Bahn gibt. Das kann durch Inhomogenitäten der Gelgrundmasse oder durch das Vorhandensein von lokalen ungleichförmigen Änderungen in der elektrischen Feldstärke verursacht werden. Früher hat man geschätzt, dass es eine 5%ige Änderung der Migrationszeit zwischen Proben an verschiedenen Gelsäulen4 gibt.

Die Geschwindigkeitsverschiebung der DNA-Bänder von Bahn zu Bahn kann das Sequenzieren von DNA mit CAE unter Verwendung einer einzigen fluoreszierten Gruppe und vier verschiedenen Kapillaren, jeweils eine für jede Base, ausschließen. Für eine DNA-Sequenzierung muss die vorliegende Vorrichtung auf ein Mehrfarbenerfassungssystem ausgedehnt werden, um alle vier Basen in einer einzigen Kapillare zu sequenzieren. Solche vierfarbigen Erfassungsschemata wurden für Einzelkapillaren8 und für Slabgele19 entwickelt. Die Grundidee besteht darin, dass man vier Sätze von DNA-Fragmenten trennt, die entweder mit G, A, T oder C enden. Jeder Satz wird mit einem anderen Fluoreszenzetikett durch irgendeines von mehreren Verfahren versehen, wonach die Fragmentsätze zusammengebracht und an der gleichen Kapillare separiert werden. Wenn die Fluoreszenzetiketten in einem ausreichend unterscheidbaren Wellenlängenbereich emittieren, können die vier Fragmentsätze durch Verwendung eines vierfarbigen Erfassungssystems einzeln erfasst werden.

Ein Schema für einen vierfarbigen konfokalen Fluoreszenz-Kapillarreihenanordnungs-Abtaster ist in 9 gezeigt. Der Abtaster hat eine Laserquelle, beispielsweise einen Argonlaser, der einen Strahl 30 in den dichroitischen Strahlteiler 31 projiziert und den Strahl zu dem Objektiv 32 richtet. Das Objektiv sammelt die Fluoreszenzenergie aus dem Fokusvolumen und leitet sie durch den Strahlteiler. Der Ausgang aus dem Strahlteiler wird zu einem ersten Strahlteiler 33 geführt, der Energie bei einer Wellenlänge, beispielsweise 540 &mgr;m, reflektiert und andere längere Wellenlängen durchlässt. Der nächste dichroitische Strahlteiler 34 reflektiert Energie mit einer zweiten Wellenlänge, beispielsweise 560 &mgr;m und lässt andere längere Wellenlängen durch. Ein dritter Strahlenteiler 36 reflektiert Energie bei einer anderen Wellenlänge, beispielsweise 580 &mgr;m, und lässt Energie bei 610 &mgr;m durch. Die Energie aus jedem der Strahlenteiler 33, 34 und 36 und die übertragene Energie wird zu konfokalen, räumlichen und spektralen Filtern 37, 38, 39 und zu Fotovervielfachern 41, 42, 43 und 44 gebracht, die Ausgangssignale für die Verarbeitung und Überführung zum Rechner 47 bereitstellen, der ein Bild für jede der Wellenlängen für jede der Kapillaren erzeugt. Jedes Farbbild zeichnet dann den Durchgang eines speziell etikettierten Satzes von DNA-Sequenzierfragmenten durch die Erfassungszone auf, nämlich eine Farbe für die A-Fragmente, eine zweite für die G-Fragmente, eine dritte für die T-Fragmente und eine vierte für die C-Fragmente.

In der ganzen vorhergehenden Beschreibung und in den Zeichnungen wurde Bezug auf Kapillarreihenanordnungen genommen. Auch wenn Kapillarreihenanordnungen mit einer Vielzahl von Kapillarröhrchen gezeigt und erörtert sind, ist es natürlich auch möglich, parallele Kapillardurchgänge in einem Materialblock durch Fotoätzung, Mikrobearbeitung, Gießen und andere Techniken, wie sie in der Halbleiterindustrie verwendet werden, auszubilden. Damit soll die Kapillarreihenanordnung, wie sie hier verwendet wird, alle Arten von kapillaren Durchgängen umfassen, die in einer Reihe angeordnet sind.

Zusammenfassend wurde gezeigt, dass es möglich ist, eine Fluoreszenzerfassung mit hoher Empfindlichkeit von Kapillarreihenanordnungen unter Verwendung eines konfokalen Fluoreszenzabtasters auszuführen. Dieses Format hat den Vorteil, dass (1) viele Analyten parallel laufen können, (2) das Laden von Mehrfachproben leicht erreichbar ist, (3) schnelle Separierungen erreicht werden und (4) die Erfassungsempfindlichkeit hervorragend ist. Die Verwendung von Kapillarreihenanordnungen löst die grundsätzlichen Durchsatzprobleme, die die Nützlichkeit von CE beispielsweise bei der DNA-Sequenzierung29 begrenzt. Zusätzlich bietet CAE eine Möglichkeit zur Optimierung analytischer Trennungen im großen Maßstab. Es kann eine große Anzahl von Kapillaren parallel verlaufen, wobei jede einen anderen Puffer-pH, eine andere Pufferzusammensetzung oder eine andere Ladung hat, um die besten Trennungsbedingungen zu bestimmen. Kommerziell hergestellte Kapillarreihenanordnungen können so gebaut werden, dass sie in Mehrfachtrogeinrichtungen für eine parallele Probeneinführung im großen Maßstab gesteckt werden. CAE sollte ein wertvolles neues Verfahren für eine schnelle parallele Trennung und Analyse sein. Die Vorrichtung wurde in Verbindung mit einer Kapillarreihenanordnung-Elektrophorese beschrieben. Natürlich kann sie auch in Verbindung mit anderen Arten von Kapillartrennungen verwendet werden, wie der Kapillarchromatographie, einer isoelektrischen Fokussierung und Säulenderivationen.

Die vorstehenden Beschreibungen von spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung wurden zum Zwecke der Veranschaulichung und Beschreibung angegeben. Sie sollen nicht erschöpfend sein oder die Erfindung auf die genau offenbarten Formen begrenzen, vielmehr sind viele Modifizierungen und Änderungen im Licht der obigen Lehre möglich. Die Ausführungsformen wurden ausgewählt und beschrieben, um die Erfindung und ihre praktische Anwendung am besten zu erläutern, damit andere Fachleute in der Lage sind, die Erfindung und verschiedene Ausgestaltungen mit unterschiedlichen Modifizierungen am besten zu verwenden, wie sie für den speziellen in Betracht gezogenen Einsatz geeignet sind. Der Umfang der Erfindung soll durch die anliegenden Ansprüche und ihre Äquivalente definiert werden.

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Anspruch[de]
Abtaster zum Erregen und Erfassen von Strahlung aus einer Vielzahl von benachbarten Kapillarkanälen, wobei der Abtaster

– eine Vielzahl von transparenten Kapillaren (21), die in einer koplanaren Beziehung Seite-an-Seite stehen und zylindrische Wände haben, die Kapillarkanäle bilden, welche sich in einer ersten Richtung erstrecken,

– eine Quelle für Strahlungsenergie mit einer ersten Wellenlänge,

– eine Objektivlinse (11) für die Aufnahme und das Fokussieren der Strahlungsenergie (29) bei einem Erregungsvolumen (21a) in den Kanälen,

– Einrichtungen (30), die zur Bildung einer kontinuierlichen Relativbewegung zwischen jedem der Kanäle und der Strahlungsenergie in einer Richtung senkrecht zu den Kapillaren angeordnet sind, so dass das Erregungsvolumen (21a) an einer spezifischen Position in jedem der Kapillarkanäle sequentiell ist und sich wiederholt, wodurch das Material in dem Erregungsvolumen (21a) erregt und das Material dazu veranlasst wird, Energie bei einer unterschiedlichen Wellenlänge abzustrahlen,

– wobei die Objektivlinse (11) dazu dient, die Strahlungsenergie zu sammeln und zu einem optischen System zu richten, das eine konfokale räumliche Filtereinrichtung (16) und eine spektrale Filtereinrichtung (17) zur Übertragung emittierter Strahlungsenergie bei der unterschiedlichen Wellenlänge und zur Zurückweisung von Strahlung bei anderen Wellenlängen aufweist,

– ein Erfassungssystem (18) zur Aufnahme der emittierten Strahlung und zur Erzeugung eines Signals sowie

– Rechnereinrichtungen aufweist, die so angeordnet sind, dass sie das Signal empfangen und verarbeiten und ein Ausgangssignal bilden, welches das Material bei dem Erregungsvolumen (21a) in jedem der Kapillarkanäle (21) darstellt.
Abtaster nach Anspruch 1, bei welchem die Einrichtungen (30), die zur Bildung einer kontinuierlichen Relativbewegung angeordnet sind, von den Rechnereinrichtungen gesteuert werden, wodurch das Ausgangssignal mit den Kapillarkanälen korreliert werden kann. Abtaster nach Anspruch 2, bei welchem jeder Kapillarkanal Teil einer langgestreckten zylindrischen Kapillaren ist. Abtaster nach Anspruch 3 mit Einrichtungen zum Halten eines Bereichs der Kapillaren (21) in einer koplanaren Beziehung Seite-an-Seite für ein Darbieten der fokussierten Strahlungsenergie. Abtaster nach Anspruch 2 oder 4, bei welchem die Enden (22, 23) der Kapillaren (21) für ein individuelles Handhaben und Beladen trennbar sind. Abtaster nach Anspruch 1, bei welchem die Erregungs-Strahlungsenergie Material erregt, das Strahlungsenergie bei einer Vielzahl von Wellenlängen emittiert, und das optische System eine Vielzahl von konfokalen räumlichen und spektralen Filtereinrichtungen (11, 12, 16, 17) zum selektiven Richten der mit unterschiedlichen Wellenlängen emittierten Strahlungsenergie zu unterschiedlichen Stellen sowie eine Vielzahl von Erfassungseinrichtungen aufweist, von denen jede emittierte Energie einer ausgewählten Wellenlänge empfängt und ein entsprechendes Ausgangssignal liefert. Verfahren zum Erfassen von Fluoreszenz aus DNA-Sequenzierfragmenten, die elektrophoretisch in Kapillarkanälen einer Vielzahl von zylindrischen Kapillaren (21) getrennt werden, wobei das Verfahren die Schritte aufweist

– Positionieren eines Bereichs der Vielzahl von Kapillaren (21) in einer koplanaren Beziehung Seite an Seite,

– Erregen eines Erregungsvolumens (21a) in den Kapillarkanälen mit Lichtenergie einer ersten Wellenlänge, die darin durch eine Objektivlinse (11) fokussiert wird, um Fragmente zum Fluoreszieren mit einer unterschiedlichen Wellenlänge zu veranlassen,

– Bereitstellen einer relativen kontinuierlichen Bewegung zwischen den zylindrischen Kapillaren (21) und dem fokussierten Licht in einer Richtung senkrecht zu den Kapillaren, wodurch das Erregungsvolumen an einer spezifischen Position in jedem der Kapillarkanäle sequentiell ist und sich wiederholt,

– Sammeln des fluoreszenzemittierten Lichts aus den vorgegebenen Volumina in jedem der Kapillarkanäle mit der Objektivlinse (11),

– spektrales und konfokales räumliches Filtern der fluoreszenzemittierten Lichtenergie, um Licht bei der ersten Wellenlänge zurückzuweisen und das emittierte Licht bei der unterschiedlichen Wellenlänge durchzulassen,

– Aufbringen des gefilterten emittierten Lichts auf einen Detektor (18) zur Erzeugung eines Ausgangssignals, das die Fluoreszenz aus den Fragmenten in jedem der Kapillarkanäle darstellt, und

– Empfangen und Verarbeiten des Signals zur Bereitstellung eines Ausgangssignals, welches das Material bei dem Erregungsvolumen (21a) in jedem der Kapillarkanäle (21) darstellt.






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