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Dokumentenidentifikation DE69434759T2 16.05.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000733115
Titel ZELLULASE-ENZYMEN UND EXPRESSIONS-SYSTEME DAFUER
Anmelder Genencor International, Inc., Palo Alto, Calif., US
Erfinder FOWLER, Timothy, Belmont, CA 94002, US;
CLARKSON, Kathleen A., San Francisco, CA 94110, US;
WARD, Michael, San Francisco, CA 94114, US;
COLLIER, Katherine D., Redwood City, CA 94062, US;
LARENAS, Edmund, San Carlos, CA 94070, US
Vertreter WUESTHOFF & WUESTHOFF Patent- und Rechtsanwälte, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69434759
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 19.12.1994
EP-Aktenzeichen 959048570
WO-Anmeldetag 19.12.1994
PCT-Aktenzeichen PCT/US94/14163
WO-Veröffentlichungsnummer 1995016782
WO-Veröffentlichungsdatum 22.06.1995
EP-Offenlegungsdatum 25.09.1996
EP date of grant 07.06.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.05.2007
IPC-Hauptklasse C12N 15/80(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 9/42(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/52(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 1/15(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   
IPC additional class C12R 1/885  (2006.01)  A,  L,  N,  20051017,  B,  H,  EP

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hohen Spiegeln an neuen verkürzten bzw. trunkierten Cellulaseproteinen im filamentösen Pilz Trichoderma longibrachiatum; pilzliche Transformanten, die mittels gentechnologischer Techniken aus Trichoderma longibrachiatum hergestellt werden; und neue Cellulaseproteine, welche durch solche Transformanten produziert werden.

Hintergrund der Erfindung

Cellulasen sind Enzyme, welche Cellulose (&bgr;-1,4-D-Glucan-Verknüpfungen) hydrolysieren und als primäre Produkte Glucose, Cellobiose, Cellooligosaccharide und dergleichen produzieren. Cellulasen werden von einer Anzahl von Mikroorganismen hergestellt und umfassen mehrere unterschiedliche Enzymklassifikationen, einschließlich jene, die als Exo-Cellobiohydrolasen (CBH), Endoglucanasen (EG) und &bgr;-Glucosidasen (BG) identifiziert werden (Schulein, M., 1988 Methods in Enzymology 160: 235–242). Außerdem können die Enzyme innerhalb dieser Klassifikationen in einzelne Komponenten aufgetrennt werden. Zum Beispiel besteht die Cellulase, welche durch den filamentösen Pilz Trichoderma longibrachiatum, nachfolgend T.longibrachiatum, hergestellt werden, aus mindestens zwei CBH-Komponenten, d. h. CBHI und CBHII, und mindestens vier EG-Komponenten, d. h. Komponenten EGI, EGII, EGIII und EGV (Saloheimo, A. et al. 1993, in "Proceedings of the second TRICEL symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases", Espoo, Finnland, hrsg. von P. Suominen & T. Reinikainen. Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8: 139–146) und mindestens einer &bgr;-Glucosidase. Die Gene, welche diese Komponenten codieren, sind nämlich cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3 bzw. egl5.

Das komplette Cellulasesystem, welches CBH-, EG- und BG-Komponenten umfasst, wirkt synergistisch, um kristalline Cellulose zu Glucose umzuwandeln. Die zwei Exo-Cellobiohydrolasen und die vier derzeit bekannten Endoglucanasen wirken zusammen, um Cellulose zu kleinen Cello-Oligosacchariden zu hydrolysieren. Die Oligosaccharide (hauptsächlich Cellobiosen) werden anschließend zu Glucose durch eine Haupt-&bgr;-Glucosidase (unter möglicher zusätzlicher Hydrolyse durch Neben-&bgr;-Glucosidase-Komponenten) hydrolysiert.

Die Proteinanalyse der Cellobiohydrolasen (CBHI und CBHII) und hauptsächlichen Endoglucanasen (EGI und EGII) von T. longibrachiatum haben gezeigt, dass eine bifunktionelle Organisation in Form einer katalytischen Kerndomäne und einer kleineren Cellulosebindungsdomäne vorliegt, welche durch einen Linker oder einen flexiblen Gelenk-Abschnitt von Aminosäuren, die reich an Prolin- und Hydroxyaminosäuren sind, getrennt sind. Gene für die zwei Cellobiohydrolasen, CBHI und CBHII (Shoemaker, S., et al., 1983, Bio/Technology 1, 691–696, Teeri, T., et al. 1983, Bio/Technology 1, 696–699, und Teeri, T., et al., 1987, Gene 51, 43–52), und zwei Hauptendoglucanasen, EGI und EGII (Penttila, M., et al., 1986, Gene 45, 253–263, Van Arsdell, J. N., et al., 1987, Bio/Technology 5, 60–64, und Saloheimo, M., et al., 1988, Gene 63, 11–21) wurden aus T. longibrachiatum isoliert, und die Proteindomänenstruktur ist bestätigt worden.

Eine ähnliche bifunktionelle Organisation von Cellulaseenzymen wird in bakteriellen Cellulasen gefunden. Die Cellulose-Bindungsdomäne (CBD) und der katalytische Kern von Cellulomonas fimi-Endoglucanase A (C. fimi Cen A) wurde ausführlich untersucht (Ong, E., et al., 1989, Trends Biotechnol. 7: 239–243, Pilz et al. 1990, Biochem J. 271: 277–280, und Warren et al. 1987, Proteins 1: 335–341). Genfragmente, welche die CBD und die CBD mit dem Linker codieren, wurden kloniert, in E. coli exprimiert, und von ihnen wurde gezeigt, dass sie neue Aktivitäten bezüglich Cellulosefasern besitzen (Gilkes, N. R., et al. 1991, Microbiol Rev. 55: 305–315, und Din, N. et al. 1991, Bio/Technology 9: 1096–1099). Zum Beispiel zerstört isolierte CBD von C. fimi Cen A, welche genetisch in E. coli exprimiert wird, die Struktur von Cellulosefasern und setzt kleine Teilchen frei, besitzt jedoch keine nachweisbare hydrolytische Aktivität. CBD besitzt ferner eine breite Anwendung bei der Proteinreinigung und Enzymimmobilisierung. Andererseits zerstört die katalytische Domäne von C. fimi Cen A, welche aus Protease-gespalteter Cellulase isoliert ist, nicht die Fibrillenstruktur von Cellulose und glättet stattdessen die Oberfläche der Faser.

Diese neuen Aktivitäten weisen potenzielle Einsätze in der Textil-, Nahrungsmittel- und Tierfutter-, Waschmittel- und der Zellstoff- und Papierindustrie auf. Gleichwohl müssen bei der industriellen Anwendung hocheffiziente Expressionssysteme geschafft werden, welche höhere Ausbeuten an trunkierten Cellulaseproteinen produzieren, als wie sie derzeit verfügbar sind, um von kommerziellem Wert zu sein. Zum Beispiel wurden Trichoderma longibrachiatum-CBHI-Kerndomänen proteolytisch getrennt und gereinigt, jedoch werden nur Milligrammmengen durch diese biochemische Prozedur isoliert (Offord, D., et al., 1991, Applied Biochem. and Biotech. 28/29: 377–386). Ähnliche Untersuchungen wurden bezüglich einer Analyse der Kern- und Bindungsdomänen von CBHI, CBHII, EGI und EGII, isoliert aus T. longibrachiatum, nach biochemischer Proteolyse durchgeführt, gleichwohl wurde nur genügend Protein zur Struktur- und Funktional-Analyse gewonnen (Tomme, P., et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575–581, und Ajo, S., 1991, FEBS 291: 45–49).

Um Stämme zu erhalten, welche höhere Anteile an trunkierten Cellulaseproteinen exprimieren, als es bisher realisiert wurde, haben Anmelder T. longibrachiatum als Mikroorganismus gewählt, welcher zur Expression am meisten bevorzugt ist, da er gut bekannt ist für sein Vermögen, ganze Cellulasen in großen Mengen zu sezernieren. Somit fingen die Anmelder an, Stämme des oben erwähnten filamentösen Pilzes so gentechnisch zu behandeln, dass sie hohe Anteile an biotechnologisch bearbeiteten trunkierten Cellulasen exprimieren.

Vor der Erfindung der Anmelder war es unbekannt, ob die DNA, welche trunkierte Cellulase-Kerndomänenproteine codiert, in Trichoderma in einer solchen Weise transformiert werden könnte, dass neue trunkierte Cellulasegene zu funktionellen Proteinen, ohne Abbau in der Wirtszelle, überexprimiert werden könnten. Kürzlich haben Nakari und Penttila gezeigt, dass es möglich ist, einen Trichoderma-Wirt so gentechnologisch zu bearbeiten, dass eine trunkierte Form der Trichoderma-EGI-Cellulase, speziell die katalytische Kerndomäne, exprimiert wird, wobei der Grad der Expression der EGI-Kerndomäne niedrig war (Nakari, T., et al., Abstract P1/63 1st European Conference on Fungal Genetics, Nottingham, England, 20.–23. August 1992). Außerdem war es unbekannt, ob eine katalytische Kerndomäne einer Trichoderma-Cellobiohydrolase mittels rekombinanter genetischer Verfahren produziert werden konnte.

Demzufolge ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, DNA-Gen-Fragmente in Stämme des Pilzes Trichoderma longibrachiatum einzuführen, um Transformantenstämme zu erzeugen, welche hohe Anteile an neuen trunkierten proteintechnologisch manipulierten Cellulasen (Gramm/-Liter-Level) aus den Bindungs- und Kerndomänen von Trichoderma-Cellulasen exprimieren. Die trunkierten Proteine werden korrekt prozessiert und extrazellulär in einer aktiven Form sezerniert.

Zusammenfassung er Erfindung

Die Erfindung sieht ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Cellulaseproteins, welches Exoglucanaseaktivität zeigt, vor, umfassend die folgenden Schritte:

  • (a) Bereitstellen einer Trichoderma-Wirtszelle, welcher eine oder mehrere Cellulaseaktivitäten fehlt und welche mit einem Expressionsvektor, der eine ein Cellulaseprotein codierende DNA-Sequenz enthält, transformiert worden ist, wobei das Cellulaseprotein ein CBHI-katalytisches Kernprotein umfasst, welches Exoglucanaseaktivität zeigt und dem eine Cellulose-Bindungsdomäne fehlt, unter Bedingungen dergestalt, dass der Expressionsvektor in das Genom der Zelle integriert wird; und
  • (b) Wachsen lassen der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, so dass das rekombinante Cellulaseprotein exprimiert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das Cellulaseprotein eine Sequenz, welche aus der in der SEQ ID NR: 10 dargelegten Aminosäuresequenz besteht.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die DNA-Sequenz, die den CBHI-katalytischen Kern codiert, so wie in der SEQ ID NR: 9 dargelegt ist.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die Pilzwirtszelle Trichoderma longibrachiatum.

Das Verfahren kann ferner den Schritt des Isolierens des rekombinanten Cellulaseproteins umfassen.

Das Verfahren kann ebenfalls den Schritt des Transformierens der Wirtszelle mit dem Expressionsvektor unter Bedingungen umfassen, so dass der Expressionsvektor in das Genom der Wirtszelle integriert wird.

Beschreibung der Zeichnungen

Die 1 zeigt die genomische DNA- und Aminosäure-Sequenz von CBHI, welche aus Trichoderma longibrachiatum stammt. Die Signalsequenz beginnt an dem Basenpaar 210 und endet an dem Basenpaar 260 (SEQ ID NR. 25). Die katalytische Kerndomäne beginnt an dem Basenpaar 261 und geht bis zum Basenpaar 671 des ersten Exons, dem Basenpaar 739 bis zum Basenpaar 1434 des zweiten Exons, und Basenpaar 1498 bis zum Basenpaar 713 des dritten Exons (SEQ ID NR. 9). Die Linkersequenz beginnt an dem Basenpaar 714 und endet an dem Basenpaar 1785 (SEQ ID NR. 17). Die Cellulase-Bindungsdomäne beginnt an dem Basenpaar 1786 und endet an dem Basenpaar 1888 (SEQ ID NR. 1). Die SEQ ID NR. 26, 10, 18 und 2 repräsentieren die Aminosäuresequenz der CBHI-Signalsequenz, die katalytische Kerndomäne, die Linkerregion bzw. die Bindungsdomäne.

Die 2 zeigt die genomische DNA- und Aminosäuresequenz von CBHII, welche von Trichoderma longibrachiatum stammt. Die Signalsequenz beginnt an dem Basenpaar 614 und endet an dem Basenpaar 685 (SEQ ID NR. 27). Die Cellulose-Bindungsdomäne beginnt an dem Basenpaar 686 und geht bis zum Basenpaar 707 des Exons eins, und vom Basenpaar 755 bis zum Basenpaar 851 des Exons zwei (SEQ ID NR. 3). Die Linkersequenz beginnt am Basenpaar 852 und endet am Basenpaar 980 (SEQ ID NR. 19). Der katalytische Kern beginnt am Basenpaar 981 bis Basenpaar 1141 von Exon zwei, Basenpaar 1199 bis Basenpaar 1445 von Exons drei und Basenpaar 1536 bis Basenpaar 2221 des Exons vier (SEQ ID NR. 11). Die SEQ ID NR. 28, 4, 20 und 12 repräsentieren die Aminosäuresequenz der CBHII-Signalsequenz, der Bindungsdomäne, der Linkerregion bzw. der katalytischen Kerndomäne.

Die 3 zeigt die Konstruktion des Expressionsplasmids pTEX (SEQ ID NR. 39–41).

Die 4 ist eine Veranschaulichung der Konstruktion vom CBHI-Kerndomänen-Expressionsvektor (SEQ ID NR. 38).

Genaue Beschreibung

Wie oben angemerkt, betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen das Klonieren und das Exprimieren von neuen trunkierten Cellulaseproteinen bei hohen Spiegeln im filamentösen Pilz T. longibrachiatum. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden im weiteren Detail nach einer Definition der hierin angewandten Begriffe erörtert werden.

Der Begriff "Trichoderma" oder "Trichoderma sp." bezieht sich auf jeden Pilzstamm, welcher bereits früher als Trichoderma klassifiziert worden ist, oder welcher derzeit als Trichoderma klassifiziert wird. Vorzugsweise sind die Spezies Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei oder Trichoderma viride.

Die Ausdrücke "zellulolytische Enzyme" oder "Cellulase-Enzyme" beziehen sich auf pilzliche Exoglucanasen oder Exocellobiohydrolasen (CBH), Endoglucanasen (EG) und &bgr;-Glucosidasen (BG). Diese drei unterschiedlichen Typen an Cellulaseenzymen wirken synergistisch, um kristalline Cellulose zu Glucose umzuwandeln. Die Analyse der CBHI, CBHII und EGI und EGII codierenden Gene zeigt eine Domänenstruktur, welche eine katalytische Kernregion (CCD), eine Scharnier- oder Linkerregion (hierin austauschbar verwendet) und eine Cellulose-Bindungsregion (CBD) umfasst.

Der Ausdruck "trunkierte Cellulasen", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Kerndomänen der Cellobiohydrolasen, zum Beispiel CBHI und CBHII.

Ein "Derivat" der trunkierten Cellulasen umfasst die Kerndomänen der Cellobiohydrolasen, zum Beispiel CBHI oder CBHII, von Trichoderma sp., wobei eine Addition von einer oder mehreren Aminosäuren an entweder einem oder beiden der C- und N-terminalen Enden der trunkierten Cellulase, eine Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in der gesamten trunkierten Cellulase, eine Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren innerhalb oder an einem oder an beiden Enden des trunkierten Cellulaseproteins oder eine Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in dem trunkierten Cellulaseprotein vorliegen kann, so dass Exoglucanaseaktivitäten in den derivatisierten trunkierten CBH-Proteinen mit katalytischem Kern erhalten bleiben. Es ist ebenfalls beabsichtigt, mit dem Ausdruck "Derivat einer trunkierten Cellulase" Kerndomänen der Exoglucanaseenzyme einzuschließen, an denen eine oder mehrere Aminosäuren von der Linkerregion gebunden sind.

Ein trunkiertes Cellulaseproteinderivat betrifft ferner ein Protein, welches im Wesentlichen hinsichtlich der Struktur und der biologischen Aktivität zu einer Cellulase-Kerndomäne ähnlich ist, welches die in der Natur gefundenen zellulolytischen Enzyme umfasst, welches jedoch so technologisch bearbeitet ist, dass es eine modifizierte Aminosäuresequenz enthält. Mit der Maßgabe, dass die zwei Proteine eine ähnliche Aktivität besitzen, werden sie somit als "Derivate" angesehen, da der Ausdruck hierin selbst dann verwendet wird, wenn die Primärstruktur eines Proteins nicht die identische Aminosäuresequenz zu der in dem anderen gefundenen besitzt.

Der Ausdruck "katalytische Cellulase-Kerndomänen-Aktivität" bezieht sich hierin auf eine Aminosäuresequenz der trunkierten Cellulase, welche die Kerndomäne der Cellobiohydrolasen umfasst, zum Beispiel CBHI oder CBHII oder ein Derivat davon, welche in der Lage ist, Cellulose-Polymere wie Zellstoff oder Phosphorsäure-gequollene Cellulose enzymatisch zu spalten.

Die Aktivität der trunkierten katalytischen Kernproteine oder Derivate davon, wie hierin definiert, kann mittels im Fachbereich allgemein bekannter Verfahren bestimmt werden (siehe Wood, T. M., et al., in Methods in Enzymology, Bd. 160, Herausgeber: Wood, W. A., und Kellogg, S. T., Academic Press, S. 87–116, 1988). Zum Beispiel können solche Aktivitäten mittels der Hydrolyse von Phosphorsäure-gequollener Cellulose und/oder löslichen Oligosacchariden, gefolgt von einer Quantifizierung der freigesetzten reduzierenden Zucker, bestimmt werden. In diesem Fall können die löslichen Zuckerprodukte, die durch die Wirkung von katalytischen CBH-Domänen oder Derivaten davon freigesetzt werden, mittels HPLC-Analyse oder durch Anwendung von colorimetrischen Assays zur Messung von reduzierenden Zuckern nachgewiesen werden. Es wird erwartet, dass diese katalytischen Domänen oder Derivate davon mindestens 10% der Aktivität, welche von dem intakten Enzym aufgezeigt wird, beibehalten werden, wenn jedes unter ähnlichen Bedingungen getestet wird und auf der Basis von gleichen Mengen an katalytischem Domänen-Protein dosiert wird.

Der Ausdruck "Cellulose-Bindungsdomänen-Aktivität" bezieht sich hierin auf eine Aminosäuresequenz der Cellulase, welche die Bindungsdomäne von Cellobiohydrolasen und Endoglucanasen, zum Beispiel EGI, EGII, CBHI oder CHBII oder eines Derivates davon, umfasst, welche nicht-kovalent an ein Polysaccharid wie Cellulose bindet. Es wird angenommen, dass Cellulose-Bindungsdomänen (CBDs) unabhängig von dem katalytischen Kern des Cellulase-Enzyms funktionieren, um das Protein an Cellulose zu binden.

Andere Verfahren, die im Fachbereich allgemein bekannt sind, welche die katalytische Cellulaseaktivität mittels der physikalischen oder chemischen Eigenschaften von besonders behandelten Substraten messen, können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Zum Beispiel wird bei Verfahren, welche physikalische Eigenschaften eines behandelten Substrats messen, das Substrat bezüglich der Modifizierung der Form, Textur, Oberfläche oder struktureller Eigenschaften, der Modifikation des "Nass"-Verhaltens, z. B. der Fähigkeit von Substraten, Wasser zu absorbieren, oder der Modifizierung des Quellens analysiert. Andere Parameter, welche die Aktivität bestimmen können, schließen das Messen der Änderung in den chemischen Eigenschaften von behandelten festen Substraten ein. Zum Beispiel können die Diffusionseigenschaften von Farbstoffen oder Chemikalien nach der Behandlung von festem Substrat mit dem trunkierten Cellulasebindungsprotein oder Derivaten davon, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, untersucht werden. Geeignete Substrate zur Evaluierung der Aktivität schließen zum Beispiel Avicel, Rayon, Zellstofffasern, Baumwoll- oder Ramie-Fasern, Papier, Kraft- oder Holzmehlpulpe ein. (Siehe Wood, T. M., et al. in "Methods in Enzymology", Bd. 160, Herausgeber: Wood, W. A., und Kellogg, S. T., Academic Press, S. 87–116, 1988.) Der Ausdruck "Linker- oder Gelenkregion" bezieht sich auf die kurze Peptidregion, welche die zwei separaten funktionellen Domänen der pilzlichen Cellulasen verbindet, d. h. die Kerndomäne und die Bindungsdomäne. Diese Domänen in T. longibrachiatum-Cellulasen werden mittels eines Peptids verknüpft, welches reich an Ser, Thr und Pro ist.

Eine "Signalsequenz" bezieht sich auf eine beliebige Sequenz von Aminosäuren, welche an den N-terminalen Bereich eines Proteins gebunden ist, welche die Sekretion der reifen Form des Proteins aus der Zelle heraus erleichtert. Diese Definition einer Signalsequenz ist eine funktionelle. Der reifen Form des extrazellulären Proteins fehlt die Signalsequenz, welche während des Sekretionsprozesses abgespalten wird.

Der Ausdruck "Variante" bezieht sich auf ein DNA-Fragment, welches die CBH-Kerndomäne codiert, die ferner eine Addition von einem oder mehreren Nukleotiden intern oder an dem 5'- oder 3'-Ende des DNA-Fragmentes, eine Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden intern oder an dem 5'- oder 3'-Ende des DNA-Fragmentes oder eine Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden intern oder an dem 5'- oder 3'-Ende des DNA-Fragmentes enthalten kann, wobei die funktionelle Aktivität der Kerndomäne beibehalten bleibt.

Ein variantes DNA-Fragment, welches die Kerndomäne umfasst, ist weiterhin beabsichtigt, um anzugeben, dass eine Linker- oder Gelenk-DNA-Sequenz oder ein Abschnitt davon an die Kerndomänen-DNA-Sequenz entweder an dem 5'- oder 3'-Ende angebunden sein kann, wobei die funktionelle Aktivität des codierten trunkierten Kerndomänenproteins beibehalten bleibt.

Der Ausdruck "Wirtszelle" steht sowohl für die Zellen als auch für die Protoplasten, die aus den Zellen von Trichoderma sp. erzeugt werden.

Der Ausdruck "DNA-Konstrukt oder Vektor" (hierin austauschbar verwendet) bezieht sich auf einen Vektor, welcher ein oder mehrere DNA-Fragmente oder variante DNA-Fragmente, die eine beliebige der oben beschriebenen neuen trunkierten Cellulasen oder Derivate codieren, umfasst.

Der Ausdruck "funktionell gebunden an" bedeutet, dass eine regulatorische Region, wie ein Promotor, Terminator, Sekretionssignal oder Enhancer-Region, an ein strukturelles Gen gebunden ist und die Expression dieses Gens kontrolliert.

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von trunkierten Cellulasen, indem eine Wirtszelle, welche mit einem DNA-Konstrukt, umfassend mindestens ein Fragment von DNA, codierend eine Kernregion von CBHI, das funktionell an einen Promotor gebunden ist, transformiert ist, bereitgestellt wird, die Wirtszelle wachsen gelassen wird, um die trunkierte Cellulase zu exprimieren, und anschließend die trunkierte Cellulase bis zur wesentlichen Homogenität gereinigt wird.

Transformierte Mikroorganismenkulturen werden typischerweise bis zur stationären Phase wachsen gelassen, filtriert, um die Zellen zu entfernen, und der restliche Überstand wird mittels Ultrafiltration konzentriert, um eine trunkierte Cellulase oder ein Derivat davon zu erhalten.

Das Medium, welches verwendet wird, um die transformierten Wirtszellen zu kultivieren, kann jedes beliebige Medium sein, welches für die Cellulaseproduktion Trichoderma geeignet ist. Die trunkierten Cellulasen oder Derivate davon werden aus dem Medium mittels herkömmlicher Techniken gewonnen, einschließlich Abtrennungen der Zellen aus dem Medium mittels Zentrifugation oder Filtration, der Präzipitation der Proteine in dem Überstand oder Filtrat mit Salz, zum Beispiel Ammoniumsulfat, gefolgt von Chromatographieprozeduren, wie der Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und dergleichen.

Alternativ kann das letztendliche Proteinprodukt isoliert und gereinigt werden, indem es an ein Polysaccharidsubstrat oder eine Antikörpermatrix gebunden wird. Die Antikörper (polyklonal oder monoklonal) können gegen Cellulase-Kern- oder Bindungsdomänen-Peptide gezogen werden, oder synthetische Peptide können aus Teilen der Kerndomäne oder Bindungsdomäne hergestellt werden und verwendet werden, um polyklonale Antikörper heranzuzüchten.

Es fehlt der Trichoderma-Wirtszelle eine oder mehrere Cellulaseaktivitäten. Deshalb kann die Trichoderma-Wirtszelle bereits im Voraus durch gentechnologische Bearbeitung manipuliert worden sein, um jedwede Wirtsgene zu entfernen, welche intakte Cellulasen codieren.

Die trunkierte Cellulase kann rückgewonnen werden und von beliebigen intakten Cellulasen, die gleichzeitig in der Wirtszelle exprimiert werden, mittels herkömmlicher Prozeduren, die oben diskutiert sind, einschließend Größenchromatographie, getrennt werden. Eine Bestätigung der Expression von trunkierten Cellulasen oder Derivaten wird mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Immunoblot-Analyse bestimmt, um trunkierte von intakten Cellulaseproteinen zu unterscheiden.

Es wird in Betracht gezogen, dass das DNA-Fragment, welches die trunkierte Cellulasekerndomäne codiert, etwa durch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen innerhalb des Gens verändert werden kann, um eine DNA-Variante erzeugen, welche ein aktives trunkiertes Cellulasederivat codiert.

Es wird ferner in Betracht gezogen, dass das DNA-Fragment, welches die trunkierte Cellulase codiert, funktionell an eine pilzliche Promotorsequenz, zum Beispiel den Promotor vom cbh1- oder egl1-Gen, gebunden werden kann.

Die Trichoderma-Wirtszelle wird mittels Transformation manipuliert, so dass das DNA-Fragment, welches die trunkierte Cellulase codiert, innerhalb des Genoms inseriert wird. Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass mehr als eine Kopie des trunkierten Cellulase-DNA-Fragmentes in den Stamm rekombiniert werden kann.

Ein selektierbarer Marker muss zuerst gewählt werden, so dass eine Detektion des transformierten Pilzes ermöglicht wird. Jedes selektierbare Markergen, welches in Trichoderma sp. exprimiert wird, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, so dass seine Anwesenheit in den Transformanten die Eigenschaften davon materiell nicht beeinflussen wird. Der selektierbare Marker kann ein Gen sein, welches ein, einem Test zugängliches Produkt codiert. Der selektierbare Marker kann eine funktionelle Kopie eines Trichoderma sp.-Gens sein, welches, wenn es in dem Wirtsstamm fehlt, dazu führt, dass der Wirtsstamm einen auxotrophen Phänotyp zeigt.

Die verwendeten Wirtsstämme könnten Derivate von Trichoderma sp. sein, welche ein nicht-funktionelles Gen oder Gene, entsprechend dem gewählten selektierbaren Marker, ermangeln oder aufweisen. Wenn zum Beispiel der selektierbare Marker pyr4 gewählt wird, dann wird ein spezifischer pyr-Derivat-Stamm als Rezipient bei der Transformationsprozedur verwendet. Andere Beispiele von selektierbaren Markern, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen die Trichoderma sp.-Gene, welche äquivalent zu den Aspergillus nidulans-Genen argB, trpC, niaD sind, und dergleichen ein. Der entsprechende Rezipientenstamm muss deshalb ein Derivatstamm wie argB, trpC, niaD und dergleichen sein.

Der Stamm wird von einem Ausgangswirtsstamm abgeleitet, welcher ein beliebiger Trichoderma sp.-Stamm ist. Gleichwohl ist es bevorzugt, einen T. longibrachiatum-Cellulase überproduzierenden Stamm, wie RL-P37, der von Sheir-Neiss et al. in Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (1984), S. 46–53, beschrieben wurde, zu verwenden, da dieser Stamm erhöhte Mengen an Cellulaseenzymen sezerniert. Dieser Stamm wird dann verwendet, um die in dem Transformationsprozess verwendeten Derivatstämme herzustellen.

Der Derivatstamm von Trichoderma sp. kann mittels einer Vielzahl von im Fachbereich bekannten Techniken hergestellt werden. Ein Beispiel ist die Herstellung von pyr4-Derivatstämmen, indem die Stämme Fluororotsäure (FOA) unterzogen werden. Das pyr4-Gen codiert Orotidin-5'-monophosphat-decarboxylase, ein Enzym, welches für die Biosynthese von Uridin erforderlich ist. Stämme mit einem intakten pyr4-Gen wachsen in einem Medium, welchem es an Uridin mangelt, sind jedoch gegenüber Fluororotinsäure empfindlich. Es ist möglich, pyr4-Derivatstämme zu selektieren, welchen es an einem funktionellen Orotidinmonophosphat-Decarboxylaseenzym mangelt und welche Uridin zum Wachstum erfordern, indem hinsichtlich FOA-Resistenz selektiert wird. Unter Verwendung der FOA-Selektionstechnik ist es ebenfalls möglich, Uridin erfordernde Stämme zu erhalten, welchen es an einer funktionellen Orotat-Pyrophosphoribosyl-Transferase mangelt. Es ist möglich, diese Zellen mit einer funktionellen Kopie des Gens, das dieses Enzym codiert, zu transformieren (Berges und Barreau, 1991, Curr. Genet. 19, S. 359–365). Da es leicht ist, Derivatstämme unter Verwendung der FOA-Resistenz-Technik in der vorliegenden Erfindung zu selektieren, wird es bevorzugt, dass pyr4-Gen als einen selektierbaren Marker zu verwenden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden bei Trichoderma-Wirtszellstämmen ein oder mehrere Cellulasegen(e) vor der Einführung eines DNA-Konstrukts oder -Plasmids, enthaltend das DNA-Fragment, welches das trunkierte Cellulaseprotein von Interesse codiert, deletiert. Es ist bevorzugt, eine trunkierte Cellulase, ein Derivat davon oder kovalent verknüpfte trunkierte Cellulasedomänenderivate in einem Wirt zu exprimieren, welchem ein oder mehrere Cellulasegene fehlen, um die Identifizierung und anschließende Reinigungsprozeduren zu vereinfachen. Jedes beliebige Gen aus Trichoderma sp., welches kloniert worden ist, kann deletiert werden, wie cbh1, cbh2, egl1, egl3 und dergleichen. Das Plasmid zur Gendeletion wird so ausgewählt, dass einzigartige Restriktionsenzymstellen darin vorliegen, um zu ermöglichen, dass das Fragment von homologer Trichoderma sp.-DNA als ein einzelnes lineares Stück entfernt wird.

Das gewünschte Gen, welches aus der Transformante zu deletieren ist, wird in das Plasmid mittels Verfahren inseriert, die im Fachbereich bekannt sind. Das Plasmid, welches das zu deletierende oder zu zerstörende Gen enthält, wird dann an (einer) geeigneten Restriktionsenzymstelle(n), die intern zu der codierenden Region liegen, geschnitten, die Gen-codiernde Sequenz oder einen Teil davon kann daraus entfernt werden, und der selektierbare Marker wird inseriert. Flankierende DNA-Sequenzen von dem Locus des zu deletierenden oder zu zerstörenden Gens, vorzugsweise zwischen etwa 0,5 und 2,0 kB, verbleiben auf beiden Seiten des selektierbaren Markergens.

Ein einzelnes DNA-Fragment, welches das Deletionskonstrukt enthält, wird dann aus dem Plasmid isoliert und verwendet, um den geeigneten pyr-Trichoderma-Wirt zu transformieren. Transformanten werden basierend auf ihrem Vermögen selektiert, das pyr4-Genprodukt zu exprimieren und komplementieren somit die Uridin-Auxotrophie des Wirtsstammes. Eine Southern-Blot-Analyse wird dann an den resultierenden Transformanten ausgeführt, um ein Doppel-Cross-Over-Integrationsereignis zu identifizieren und zu bestätigen, welches einen Teil oder die Gesamtheit der codierenden Region des zu deletierenden Gens mit den selektierbaren pyr4-Markern ersetzt.

Obgleich oben spezifische Plasmidvektoren beschrieben sind, ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Herstellung dieser Vektoren beschränkt. Verschiedene Gene können in dem Trichoderma sp.-Stamm unter Verwendung der obigen Techniken deletiert und ersetzt werden. Jedwede verfügbaren selektierbaren Marker können verwendet werden, wie oben diskutiert. Potenziell kann jedes Trichoderma sp.-Gen, welches kloniert worden ist und somit identifiziert worden ist, aus dem Genom unter Verwendung der oben beschriebenen Strategie deletiert werden. Alle diese Varianten sind innerhalb der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.

Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung, welcher das inserierte DNA-Fragment oder variantes DNA-Fragment, codierend die trunkierte Cellulase oder ein Derivat davon der vorliegenden Erfindung, trägt, kann jeder beliebige Vektor, welcher in der Lage ist, autonom in einem gegebenen Wirtsorganismus zu replizieren, typischerweise ein Plasmid, sein. In bevorzugten Ausführungsformen werden zwei Typen von Expressionsvektoren zum Erhalt der Expression von Genen oder Trunkierungen davon in Betracht gezogen. Der erste enthält DNA-Sequenzen, in welchen der Promotor, die Gen-codierende Region und Terminatorsequenz alle von dem zu exprimierenden Gen stammen. Die Gen-Trunkierung wird erhalten, indem die unerwünschten DNA-Sequenzen (welche für nicht erwünschte Domänen codieren) deletiert werden, wodurch die Domäne, die unter der Kontrolle ihrer eigenen transkriptionellen und translationalen regulatorischen Sequenzen exprimiert werden soll, zurückbleibt. Ein selektierbarer Marker ist ebenfalls auf dem Vektor vorhanden, welcher die Selektion hinsichtlich Integration von mehreren Kopien der neuen Gensequenzen in den Wirt ermöglicht.

Der zweite Typ von Expressionsvektor ist vorgefertigt und enthält Sequenzen, die für ein hohes Transkriptionsniveau erforderlich sind, und einen selektierbaren Marker. Es wird in Betracht gezogen, dass die codierende Region für ein Gen oder ein Teil davon in diesen Allzweck-Expressionsvektor inseriert werden kann, so dass sie unter der transkriptionellen Kontrolle der Expressionskassettenpromotor- und Terminatorsequenzen steht.

Zum Beispiel ist pTEX ein solcher Allzweck-Expressionsvektor. Gene oder Teile davon können stromabwärts des starken CBHI-Promotors inseriert werden. Die hierin beschriebenen Beispiele sind eingeschlossen, bei denen gezeigt wird, dass Cellulase-katalytische Kern- und Bindungsdomänen unter Verwendung dieses Systems exprimiert werden.

In dem Vektor sollte die DNA-Sequenz, welche die trunkierte Cellulase oder andere neue Proteine der vorliegenden Erfindung codiert, in funktionsfähiger Weise an transkriptionale und translationale Sequenzen, d. h. an eine geeignete Promotorsequenz und Signalsequenz im Leseraster zu dem Strukturgen, gebunden werden. Der Promotor kann jede beliebige DNA-Sequenz sein, welche transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle zeigt und kann von Genen abstammen, welche Proteine codieren, die entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle sind. Das Signalpeptid ermöglicht die extrazelluläre Expression der trunkierten Cellulase oder von Derivaten davon. Die DNA-Signalsequenz ist vorzugsweise die Signalsequenz, welche in natürlicher Weise mit dem zu exprimierenden trunkierten Gen assoziiert ist, gleichwohl wird die Signalsequenz von beliebigen Cellobiohydrolasen oder Endoglucanase in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.

Die Prozeduren, welche verwendet werden, um die DNA-Sequenzen, welche die trunkierten Cellulasen, Derivate davon oder andere neue Cellulasen der vorliegenden Erfindung codieren, mit dem Promotor zu ligieren, und zur Inserierung in geeignete Vektoren, die die notwendigen Informationen zur Replikation in der Wirtszelle enthalten, sind im Fachbereich allgemein bekannt.

Der DNA-Vektor oder das Konstrukt, welche oben beschrieben sind, können in die Wirtszelle gemäß bekannten Techniken, wie der Transformation, Transfektion, Mikroinjektion, Mikroporation, biolistischer Bombardierung und dergleichen, eingeführt werden.

In der bevorzugten Transformationstechnik muss berücksichtigt werden, dass, da die Permeabilität der Zellwand in Trichoderma sp. sehr gering ist, die Aufnahme der gewünschten DNA-Sequenz, des Gens oder des Genfragmentes bestenfalls minimal ist. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, um die Permeabilität der Trichoderma sp.-Zellwand in dem Derivatstamm (d. h. dem ein funktionelles Gen fehlt, das dem verwendeten selektierbaren Marker entspricht) vor dem Transformationsprozess zu erhöhen.

Das bevorzugte Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Trichoderma sp. zur Transformation involviert die Herstellung von Protoplasten von pilzlichem Mycelium. Das Mycelium kann aus ausgekeimten vegetativen Sporen erhalten werden. Das Mycelium wird mit einem Enzym behandelt, welches die Zellwand verdaut, was zu Protoplasten führt. Die Protoplasten werden dann durch die Anwesenheit eines osmotischen Stabilisators in dem Suspendiermedium geschützt. Diese Stabilisatoren schließen Sorbitol, Mannitol, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat und dergleichen ein. Für gewöhnlich variiert die Konzentration dieser Stabilisatoren zwischen 0,8 M bis 1,2 M. Es ist bevorzugt, eine Lösung von etwa 1,2 M an Sorbitol in dem Suspensionsmedium zu verwenden.

Die Aufnahme der DNA in den Trichoderma sp.-Wirtsstamm hängt von der Calciumionenkonzentration ab. Im Allgemeinen werden zwischen etwa 10 mM CaCl2 und 50 mM CaCl2 bei einer Aufnahmelösung verwendet. Neben dem Anfordernis nach dem Calciumion bei der Aufnahmelösung sind andere Stoffe, die üblicherweise eingebracht werden, ein Puffersystem wie TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA) oder 10 mM MOPS-Puffer pH 6,0 (Morpholinpropansulfonsäure) und Polyethylenglykol (PEG). Man nimmt an, dass das Polyethylenglykol dahingehend wirkt, die Zellmembranen zu verschmelzen, wodurch ermöglicht wird, dass der Inhalt des Mediums in das Zytoplasma des Trichoderma sp.-Stamms zugeführt wird und die Plasmid-DNA zu dem Zellkern transferiert wird. Diese Fusion hinterlässt häufig mehrere Kopien der Plasmid-DNA, die tandemartig in dem Wirtschromosom integriert sind.

Für gewöhnlich wird eine Suspension, die Trichoderma sp.-Protoplasten oder Zellen enthält, welche einer Permeabilitätsbehandlung bei einer Dichte von 108 bis 109/ml, vorzugsweise 2 × 108/ml unterzogen worden sind, in der Transformation verwendet. Diese Protoplasten oder Zellen werden der Aufnahmelösung hinzugesetzt, zusammen mit dem gewünschten linearisierten selektierbaren Marker mit im Wesentlichen homologen flankierenden Regionen an beiden Seiten des Markers, um eine Transformationsmischung zu bilden. Im Allgemeinen wird eine hohe Konzentration von PEG der Aufnahmelösung hinzugesetzt. Von 0,1 bis 1 Volumen 25%iges PEG 4000 können der Protoplastensuspension hinzugesetzt werden. Gleichwohl ist es bevorzugt, etwa 0,25 Volumen zu der Protoplastensuspension hinzuzugeben. Additive wie Dimethylsulfoxid, Heparin, Spermidin, Kaliumchlorid und dergleichen können der Aufnahmelösung hinzugesetzt werden und bei der Transformation helfen.

Im Allgemeinen wird die Mischung dann bei etwa 0°C für einen Zeitraum von 10 bis 30 Minuten inkubiert. Zusätzliches PEG wird dann der Mischung hinzugesetzt, um die Aufnahme des gewünschten Gens oder der DNA-Sequenz weiter zu steigern. Das 25%ige PEG 4000 wird allgemein in Volumina vom 5- bis 15fachen des Volumens der Transformationsmischung hinzugesetzt; gleichwohl können größere oder geringere Volumina geeignet sein. Das 25%ige PEG 4000 entspricht vorzugsweise etwa dem 10fachen des Volumens der Transformationsmischung. Nachdem das PEG hinzugesetzt worden ist, wird die Transformationsmischung dann bei Raumtemperatur inkubiert, und zwar vor der Zugabe einer Sorbitol- und CaCl2-Lösung. Die Protoplastensuspension wird dann ferner zu geschmolzenen Aliquots eines Wachstumsmediums hinzugesetzt. Dieses Wachstumsmedium erlaubt nur das Wachstum von Transformanten. Jedes Wachstumsmedium kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, welches geeignet ist, die gewünschten Transformanten wachsen zu lassen. Wenn jedoch Pyr+-Transformanten selektiert werden, ist es bevorzugt, ein Wachstumsmedium zu verwenden, welches kein Uridin enthält. Die anschließenden Kolonien werden transferiert und auf einem Wachstumsmedium, welches kein Uridin enthält, gereinigt.

In diesem Stadium wurden stabile Transformanten von nichtstabilen Transformanten durch ihre schnelle Wachstumsrate und die Bildung von kreisförmigen Kolonien mit eher glatten als zerfurchten Umrissen auf einem festen Kulturmedium, dem es an Uridin fehlte, unterschieden. Zusätzlich wurde in einigen Fällen ein weiterer Test der Stabilität durchgeführt, indem die Transformanten auf einem festen nicht-selektiven Medium (d. h. Uridin enthaltend) wachsen gelassen wurden, Sporen von diesem Kulturmedium abgeerntet wurden und der Prozentanteil dieser Sporen bestimmt wurde, welche anschließend auskeimen und auf einem selektiven Medium, welchem Uridin fehlte, wachsen werden.

In einer besonderen Ausführungsform des obigen Verfahrens werden die trunkierten Cellulasen in aktiver Form aus der Wirtszelle [entweder] als ein Ergebnis der geeigneten posttranslationalen Prozessierung der trunkierten Cellulase gewonnen.

Die Verwendung von isolierten katalytischen Cellulase-Kerndomänen gegenüber der Verwendung des intakten Cellulaseenzyms kann in mehreren Anwendungen von Vorteil sein. Solche Anwendungen schließen das Stonewashing oder das Biopolishing ein, wobei es in Betracht gezogen wird, dass eine Farbstoff/Färbemittel/Pigment-Rückfärbung oder -Wiederablagerung reduziert oder eliminiert werden können, indem neue trunkierte Cellulaseenzyme zur Anwendung kommen, welche so modifiziert worden sind, dass ihnen eine Cellulose-Bindungsdomäne fehlt. Darüber hinaus wird es in Betracht gezogen, dass die Aktivität bezüglich bestimmter Substrate von Interesse beispielsweise in der Textil-, Waschmittel-, Zellstoff- und Papier-, Tierfutter-, Nahrungsmittel-, Biomassenindustrie in signifikanter Weise gesteigert oder verringert werden kann, wenn die Bindungsdomäne entfernt wird, so dass die Bindungsaffinität des Enzyms für Cellulose gesenkt wird.

Es wird ferner in Betracht gezogen, dass die Expression und Verwendung von einigen katalytischen Domänen von Cellulaseenzymen eine verbesserte Rückgewinnbarkeit vom Enzym, Selektivität, wenn eine geringere Aktivität bezüglich eines kristallineren Substrates erwünscht ist, oder Selektivität, wenn eine hohe Aktivität bei amorphem/löslichem Substrat erwünscht ist, bereitstellen.

Ferner können katalytische Domänen von Cellulaseenzymen brauchbar sein, um die Synergie mit anderen Cellulasekomponenten, Cellulase- oder Nicht-Cellulase-Domänen und/oder anderen Enzymen oder Portionen davon bei Cellulose enthaltenden celluloseartigen Materialien in Anwendungen wie der Biomasseumwandlung, Reinigung, Stonewashing, Biopolishing von Textilien, dem Weichmachen, der Zellstoff/Papier-Verarbeitung, der Tierfutternutzung, dem Pflanzenschutz und der Schädlingsbekämpfung, der Stärkeprozesszierung oder der Produktion von pharmazeutischen Intermediaten, Disacchariden oder Oligosacchariden zu steigern.

Außerdem könnten die Einsätze von katalytischen Cellulase-Kerndomänen oder Derivaten davon einige der schädlichen Eigenschaften, die mit dem intakten Enzym bei Cellulosestoffen wie Zellstoff, Baumwolle oder anderen Fasern oder Papier assoziiert sind, verringern. Eigenschaften von Interesse schließen Faser/Gewebe-Festigkeitsverlust, Faser/Gewebe-Gewichtsverlust, Fusselerzeugung und Fibrillierungs-Beschädigung ein.

Es wird ferner in Betracht gezogen, dass katalytische Cellulase-Kerndomänen eine geringere Faseraufrauung oder eine verringerte Färbemittel-Wiederabscheidung/rückfärbung aufzeigen könnten. Ferner können diese trunkierten katalytischen Kern-Cellulasen oder Derivate davon eine Option zur verbesserten Rückgewinnung/Recycling dieser neuen Cellulasen bieten.

Darüber hinaus wird in Betracht gezogen, dass katalytische Cellulase-Kerndomänen selektive Aktivitätsvorteile beinhalten könnten, wo die Hydrolyse der löslichen oder stärker amorphen cellulosischen Regionen des Substrates erwünscht ist, jedoch die Hydrolyse der stärker kristallinen Region nicht erwünscht ist. Dies kann bei Anwendungen wie der Bioumwandlung wichtig sein, wo eine selektive Modifizierung der Körnchen/Fasern/Pflanzen-Materialien von Interesse ist.

Eine noch weitere Anwendung für katalytische Cellulase-Kerndomänen oder Derivate ist die Erzeugung von mikrokristalliner Cellulose (MCC). Ferner wird in Betracht gezogen, dass das MCC weniger gebundenes Enzym enthält, oder dass das gebundene Enzym leichter entfernt werden kann.

Einige der folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Andere stellen einen brauchbaren Hintergrund zur Verfügung.

BEISPIELE Beispiel I Klonierung und Expression der CBHII-Kerndomäne unter Verwendung des CBHI-Promotors, Terminators und der Signalsequenz von CBHII. Teil 1. Konstruktion des T. longibrachiatum-Allzweck-Expressionsplasmids-PTEX.

Das Plasmid PTEX wurde konstruiert, indem die Methoden von Sambrook et al. (1989), oben, nachvollzogen wurden, und es ist in der 7 veranschaulicht. Dieses Plasmid wurde als ein Mehrzweck-Expressionsvektor zur Verwendung in dem filamentösen Pilz Trichoderma longibrachiatum entworfen. Die Expressionskassette weist mehrere einzigartige Merkmale auf, welche sie für diese Funktion brauchbar machen. Die Transkription wird unter Verwendung des starken CBHI-Gen-Promotors und Terminatorsequenzen für T. longibrachiatum reguliert. Zwischen dem CBHI-Promotor und Terminator gibt es einzigartige PmeI- und SstI-Restriktionsstellen, welche verwendet werden, um das zu exprimierende Gen zu inserieren. Das selektierbare T. longibrachiatum pyr4-Markergen wurde in den CBHI-Terminator inseriert, und die ganze Expressionskassette (CBHI-Promotor-Insertionsstellen-CBHI-Terminator-pyr4-Gen-CBHI-Terminator) kann unter Verwendung der einmaligen NotI-Restriktionsstelle oder der einmaligen NotI- und NheI-Restriktionsstellen herausgeschnitten werden.

Dieser Vektor basiert auf dem bakteriellen Vektor pSL1180 (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey), welcher ein Vektor vom PUC-Typ ist, und zwar mit einer verlängerten multiplen Klonierungsstelle. Ein im Fachbereich Erfahrener würde in der Lage sein, diesen Vektor basierend auf dem in der 3 veranschaulichten Flussdiagramm zu konstruieren. (Siehe ebenfalls die U.S.-Patentanmeldung 07/954 113 für die Konstruktion des PTEX-Expressionsplasmids.) Es wäre möglich, Plasmide zu konstruieren, welche zu PTEX-trunkierten Cellulasen oder Derivaten davon, beschrieben in der vorliegenden Erfindung, ähnlich sind, welche ein anderes Stück an DNA-Sequenz enthalten, die das trunkierte Cellulasegen ersetzt.

Teil 2. Klonierung.

Das komplette cbh2-Gen, welches bei der Konstruktion des CBHII-Kerndomänen-Expressionsplasmids, PTEX-CBHII-Kern, verwendet wurde, wurde aus dem Plasmid PUC219::CBHII erhalten (Korman, D., et al., 1990, Curr. Genet. 17: 203–212). Die Cellulose-Bindungsdomäne, positioniert an dem 5'-Ende des cbh2-Gens, ist zweckdienlicherweise zwischen einer XbaI- und Sna-BI-Restriktionsstelle lokalisiert. Um die XbaI-Stelle zu nutzen, wurde eine zusätzliche XbaI-Stelle in dem Polylinker zerstört. PUC219::CBHII wurde partiell mit XbaI verdaut, sodass der Hauptteil des Produktes linear war. Die XbaI-Überhänge wurden unter Verwendung von T4 DNA-Polymerase aufgefüllt und unter Bedingungen aneinander ligiert, welche die Selbstligation des Plasmids begünstigen. Dies hat den Effekt der Zerstörung der stumpf-gemachten Stelle, bei welcher es sich in 50% der Plasmide um die XbaI-Stelle in dem Polylinker handelte. Ein solches Plasmid wurde identifiziert und mit XbaI und SnaBI verdaut, um die Cellulose-Bindungsdomäne freizusetzen. Die Vektor-CBHII-Kerndomäne wurde isoliert und mit den folgenden synthetischen Oligonukleotiden ligiert, die entworfen waren, um die XbaI-Stelle mit der SnaBI-Stelle an der Signal-Peptidase-Spaltungsstelle und dem Papain-Spaltungspunkt in der Linkerdomäne zu verbinden.

Das resultierende Plasmid pUC&Dgr;CBD CBHII wurde mit NheI verdaut, und die Enden wurden durch die Inkubation mit T4 DNA-Polymerase und dNTPs stumpf gemacht. Danach wurde die lineare stumpf gemachte Plasmid-DNA mit BglII verdaut, und das Nhe(stumpf)-BglII-Fragment, welches die CBHII-Signalsequenz und Kerndomäne enthielt, wurde isoliert.

Das letztliche Expressionsplasmid wurde technologisch bearbeitet, und zwar durch den Verdau des Allzweck-Expressionsplasmids pTEX (beschrieben in 07/954 113) mit SstII und PmeI und Ligieren des CBHII NheI(stumpf)-BglII-Fragmentes stromabwärts von dem cbh1-Promotor unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids mit der Sequenz CGCTAG, um den BglII-Überhang mit dem SstII-Überhang aufzufüllen.

Das pTEX-CBHI-Kern-Expressionsplasmid wurde in einer ähnlichen Weise wie pTEX-CBHII-Kern, der in dem obigen Beispiel beschrieben ist, hergestellt. Seine Konstruktion ist in der 4 beispielhaft dargelegt.

Teil 3. Transformation und Expression.

Eine DNA-Präp. im großen Maßstab wurde aus dem pTEX-CBHII-Kern vorgenommen, und aus dieser wurde das NotI-Fragment, welches die CBHII-Kerndomäne unter der Kontrolle der transkriptionellen Elemente von cbh1 und das pyr4-Gen enthielt, durch präparative Gelelektrophorese isoliert. Das isolierte Fragment wurde in die Uridin-auxotrophe Version des Quaddeletierten Stammes 1A52 pyr13 transformiert, und stabile Transformanten wurden identifiziert.

Um zu selektieren, welche Transformanten die cbh2-Kerndomäne exprimierten, wurde genomische DNA aus Stämmen isoliert, gefolgt von einem Wachstum auf Vogels + 1% Glukose, und es wurden Southern-Blot-Experimente unter Verwendung eines isolierten DNA-Fragmentes, das nur die cbh2-Kerndomäne enthielt, durchgeführt. Transformanten wurden isoliert, die eine Kopie der cbh2-Kerndomänen-Expressionskassette integriert in das Genom von 1A52 aufwiesen. Gesamt-mRNA wurde aus den zwei Stämmen isoliert, im Anschluß an ein 1-tägiges Wachstum auf Vogels + 1% Laktose. Die mRNA wurde einer Northern-Analyse unter Verwendung der cbh2-Codierregion als einer Sonde unterzogen. Transformanten, welche mRNA der cbh2-Kerndomäne exprimierten, wurden identifiziert.

Zwei Transformanten wurden unter den gleichen Bedingungen, wie bereits vorher in Beispiel 1 beschrieben, in einem 141 großen Fermentor wachsen gelassen. Die resultierende Nährlösung wurde konzentriert, und die darin enthaltenden Proteine wurden mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese getrennt, und das CBHII-Kerndomänen-Protein wurde mittels Western-Analyse identifiziert. Eine Transformante, # 15, produzierte ein Protein der korrekten Größe und Reaktivität gegenüber polyklonalen CBHII-Antikörpern.

Es wurde anschließend abgeschätzt, dass die Proteinkonzentration des Fermentationsüberstandes nach der Reinigung 10 g/l betrug, wovon 30–50% die CBHII-Kerndomäne war (siehe Beispiel 2).

Beispiel 2 Reinigung von katalytischen CBHI-Kernen

Der CBHI-Kern wurde aus Nährmedium von T. longibrachiatum, welcher den pTEX-CBHI-Kern-Expressionsvektor enthielt, auf die folgende Weise gereinigt. Die ultrafiltrierte (UF) CBHI-Kern-Nährbrühe wurde unter Verwendung von Diatomeenerde filtriert und in 10 mM TES, pH 6,8, bis zu einer Leitfähigkeit von 1,5 mOhm verdünnt. Der verdünnte CBHI-Kern wurde dann auf eine Anionenaustauschsäule (Q-Sepharose-Fast Flow, Pharmacia Kat. # 17-0510-01), welche in 10 mM TES, pH 6,8, äquilibriert worden war, geladen. Der CBHI-Kern wurde von dem Hauptteil der anderen Proteine in der Brühe unter Verwendung einer Gradientenelution in 10 mM TES, pH 6,8, von 0 bis 1 M NaCl getrennt. Die Fraktionen, welche den CBHI-Kern enthielten, wurden dann auf einem Amicon-Rührzellen-Konzentrator mit einer PM 10-Membran (Diaflo-Ultrafiltrationsmembranen, Amicon Kat. # 13132MEM 5468A) konzentriert. Dieser Schritt konzentrierte den Kern und separierte ihn gleichfalls von Proteinen mit niedrigerem Molekulargewicht. Die resultierenden Fraktionen waren über 85% reiner CBHI-Kern. Die reinste Fraktion wurde bezüglich der Sequenz dahingehend verifiziert, dass es sich dabei um den CBHI-Kern handelte.


Anspruch[de]
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Cellulaseproteins, welches Exoglucanaseaktivität zeigt, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Bereitstellen einer Trichoderma-Wirtszelle, welcher eine oder mehrere Cellulaseaktivitäten fehlen und welche mit einem Expressionsvektor, der eine ein Cellulaseprotein codierende DNA-Sequenz enthält, transformiert worden ist, wobei das Cellulaseprotein ein katalytisches CBHI-Kernprotein umfasst, welches Exoglucanaseaktivität zeigt und dem eine Cellulose-Bindungsdomäne fehlt, unter Bedingungen dergestalt, dass der Expressionsvektor in das Genom der Zelle integriert wird; und

(b) Wachsen lassen der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, so dass das rekombinante Cellulaseprotein exprimiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Cellulaseprotein eine Sequenz besitzt, welche aus der in der SEQ ID NR: 10 dargelegten Aminosäuresequenz besteht. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die DNA-Sequenz, die den katalytischen CBHI-Kern codiert, in der SEQ ID NR: 9 dargelegt ist. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Pilzwirtszelle Trichoderma longibrachiatum ist. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, das ferner das Isolieren des rekombinanten Cellulaseproteins umfasst. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, das ferner den Schritt des Transformierens der Wirtszelle mit dem Expressionsvektor unter Bedingungen umfasst, so dass der Expressionsvektor in das Genom der Wirtszelle integriert wird.






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