PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69815396T3 16.05.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001047725
Titel ZUM BINDEN VON ZELLULOSE BEFÄHIGTES POLYSACCHARID-KONJUGAT
Anmelder Unilever N.V., Rotterdam, NL
Erfinder BERRY, John, Mark, Sharnbrook, GB;
DAVIS, James, Paul, Sharnbrook, Bedford MK44 1LQ, GB;
GIDLEY, John, Michael, Sharnbrook, Bedford MK44 1LQ, GB
Vertreter Lederer & Keller, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69815396
Vertragsstaaten DE, ES, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 23.12.1998
EP-Aktenzeichen 989668678
WO-Anmeldetag 23.12.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/EP98/08551
WO-Veröffentlichungsnummer 1999036469
WO-Veröffentlichungsdatum 22.07.1999
EP-Offenlegungsdatum 02.11.2000
EP date of grant 04.06.2003
EPO date of publication of amended patent 10.01.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 16.05.2007
IPC-Hauptklasse C08L 5/14(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C08B 37/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C08B 37/14(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C11D 7/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Binden von Polysacchariden und betrifft ein an Cellulose bindendes Polysaccharidkonjugat, Produkte, die das Polysaccharidkonjugat einschließen und Zielverfahren, unter Verwendung des Polysaccharidkonjugats. Im Zusammenhang der Erfindung ist der Begriff „Polysaccharid" vorgesehen, Polysaccharide und Oligosaccharide abzudecken und Hinweise auf „Polysaccharid" und „Polysaccharidkonjugat" sollten entsprechend aufgefasst werden. Der verwendete Begriff „Konjugat" betrifft Einheiten, gebunden oder befestigt aneinander (physikalisch und/oder chemisch) mit einem „Polysaccharidkonjugat", umfassend eine Polysaccharid-gebundene oder aneinander befestigte Einheit.

Hintergrund der Erfindung

Es ist bekannt, dass verschiedene natürlich vorkommende Polysaccharide, wie Erbsenxyloglucan, Tamarindensamenxyloglucan, usw., durch Polysaccharid:Polysaccharid-Wechselwirkung an Cellulose binden; tatsächlich ist diese Bindungsfähigkeit für die Funktion von Pflanzenzellwänden wichtig.

US-A-3297604 betrifft Polymerzusammensetzungen, die Galactose, oxidiert unter Bildung einer Carbonylgruppe an der C6-Position, enthalten. Die aktive Carbonylgruppe kann in bekannter Weise, z.B. unter Bildung von Cyanhydrinen, Bisulfitadditionsverbindungen, Oximen, Hydrazonen, usw., reagieren. Die Zusammensetzungen können auch wirken, um Polymere, einschließlich Cellulose, zu vernetzen. Das Polymer kann beispielsweise Guar-, Johannisbrotbaumgummi, usw., sein. Es gibt keine Offenbarung eines Polysaccharidkonjugats mit gebundener Einheit von einem Molekulargewicht von mindestens 5 000. Obwohl die Polymerzusammensetzung selbst an Cellulose binden kann, ist dies nicht unerwartet, und es gibt keine Offenbarung eines Polysaccharidkonjugats, das an Cellulose binden kann.

US-A-2949397 betrifft die Verwendung von Mineralfüllstoff, beschichtet mindestens teilweise mit in Wasser dispergiertem, organischem Kolloid, um die Retention von Füllstoff an Cellulosefasern bei der Papierherstellung zu fördern. Das Kolloid kann z.B. ein Galactomannan oder substituiertes Mannan, wie Johannisbrotbaumgummi und Guargummi, sein. Der beschichtete Füllstoff wird durch elektrostatische Wirkung an Cellulosefasern angezogen. Der Füllstoff und Kolloid werden miteinander vermischt, trennen sich jedoch beim Stehen, und folglich liegen sie in Form eines einfachen Gemisches, nicht eines Polysaccharidkonjugats, vor.

Der Artikel von Hayashi et al. mit dem Titel „Pea Xyloglucan and Cellulose" in Plant. Physiol. (1987) 83, 384–389, beschreibt Untersuchungen zum Binden von Erbsenxyloglucan an Cellulose, unter Verwendung von Fluorescein-markiertem Xyloglucan, hergestellt durch Behandeln von Xyloglucan mit CNBr und Inkubieren mit Fluoresceinamin, und auch unter Verwendung von radiojodiertem Xyloglucan, das durch Reaktion von 125I mit der Fluoresceineinheit an Xyloglucan hergestellt wurde. Diese Markierungen wurden verwendet, um das Binden des Polysaccharids zu verfolgen und sind unter den kleinsten Molekülmarkierungseinheiten bekannt.

Die vorliegende Erfindung basiert auf dem überraschenden Befund, dass Polysaccharide mit viel größeren gebundenen Einheiten als jene, verwendet von Hayashi et al., dennoch schnell mit hoher Wirksamkeit an Cellulose durch Polysaccharid:Polysaccharid-Wechselwirkung binden können. Dies ist überraschend, weil das Binden an vielen Stellen entlang der Polysaccharidgerüste stattfindet, anstatt an einer einzelnen Bindungsstelle, wie mit Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, und es wäre vorauszusehen, dass das Binden durch das Anbringen von großen Einheiten an Cellulosebindungs-Polysaccharide unterbrochen würde. Die Erfindung eröffnet somit die Möglichkeit der Anwendung von Polysacchariden zur zielgerichteten Befestigung von Einheiten an Cellulose, z.B. in Textil, Papier, usw..

Kurzdarstellung der Erfindung

In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Polysaccharidkonjugat bereitgestellt, umfassend ein Polysaccharid mit einer gebundenen Einheit mit einem Molekulargewicht von mindestens 5000, wobei das Polysaccharidkonjugat in der Lage ist, an Cellulose zu binden und die gebundene Einheit ein Enzym, ein Antikörper oder Antikörperfragment darstellt, wobei das Polysaccharid eine 1-4-gebundene &bgr;-Glycan-Gerüststruktur hat und wobei das Polysaccharid ausgewählt ist aus Xyloglucanen und Galactomannanen.

Das Polysaccharidkonjugat ist vorzugsweise zum Binden an Cellulose durch Polysaccharid:Polysaccharid-Wechselwirkung in der Lage.

Das Polysaccharid kann jenes sein, das natürlich an Cellulose bindet oder derivatisiert wurde oder anderweitig modifiziert wurde, um an Cellulose zu binden. Das Polysaccharid kann in natürlicher Weise vorkommen oder synthetisch sein.

Das Polysaccharid hat eine 1-4-gebundene &bgr;-Glycan-(im Allgemeinen Zucker)-Gerüststruktur, die stereochemisch mit Cellulose kompatibel ist, wie ein Glucangerüst (bestehend aus &bgr;-1-4-gebundenen Glucoseresten), ein Mannangerüst (bestehend aus &bgr;-1-4-gebundenen Mannoseresten) oder ein Xylangerüst (bestehend aus &bgr;-1-4-gebundenen Xyloseresten). Geeignete Polysaccharide sind Xyloglucane, Galactomannane. Siehe „Physiology and Biochemistry of Plant Cell Walls" (1990) von C. Brett und K. Waldron für eine Erörterung dieser Materialien.

Die für Celluloseoligomere zum Binden an Cellulose erforderliche minimale Kettenlänge ist 4 Glucoseeinheiten. Für Xyloglucane machen die Seitenketten das Binden weniger wirksam und 12 Gerüstglucoseeinheiten (d.h. etwa 25 Gesamtzuckereinheiten) sind zum Binden an Cellulose erforderlich. Strukturbetrachtungen, die Galactomannane vorschlagen, liegen bei der Bindungswirksamkeit dazwischen, und etwa 6 bis 8 Gerüstreste werden zum Binden an Cellulose als erforderlich erwartet. Das Polysaccharid sollte somit mindestens 4 und vorzugsweise mindestens 10 Gerüstreste aufweisen, die vorzugsweise &bgr;-1-9-gebunden sind.

Natürliche vorkommende Polysaccharide, die schnell und stark an Cellulose durch Polysaccharid:Polysaccharid-Wechselwirkung binden, umfassen Xyloglucane, wie Erbsenxyloglucan und Tamarindensamenxyloglucan (TXG) (das ein &bgr;-1-9-gebundenes Glucangerüst mit Seitenketten von &agr;-D-Xylopyranose und -D-Galactopyranosyl-(1-2)-&agr;-D-xylopyranose aufweist, beide 1-6-gebunden an das Gerüst: siehe Gidley et al. Carbohydrate Research, 214 (1991) 200–314, für eine Erörterung der Struktur von Tamarindensamenpolysaccharid); und Galactomannane, insbesondere Galactomannane mit niedrigem Galactosegehalt, wie Johannisbrotbaumgummi (LBG) (welches ein Mannangerüst von &bgr;-1-4-gebundenen Mannoseresten mit Einzeleinheit-Galactoseseitenketten, 1-6-gebunden an das Gerüst, aufweist), Enzym-modifiziertes Guar (EMG) (Guargummi hat die gleichen Struktureinheiten wie LBG, hat jedoch einen viel höheren Anteil an Galactosesubstitution, in einem solchen Ausmaß, dass es dort hindurch kein ausreichend zugängliches Mannangerüst gibt, um Cellulose zu binden. EMG wird durch enzymatische Entfernung eines steuerbaren Prozentsatzes der Galactosereste aus Guargummi zur Erzeugung einer Vielzahl an Materialien, die an Cellulose binden können, jedoch kostengünstiger und konsistenter erhältlich sind als LBG, hergestellt. (Siehe Bulpin et al. in Carbohydrate Polymers 12 (1990) 155–168 für eine Erörterung von EMG), Taragalactomannan und Cassiagalactomannan. Diese Materialien sind kommerziell erhältlich und liefern somit potenziell nutzbare Quellen von geeigneten Polysacchariden. Diese Materialien haben die Vorteile, relativ billig zu sein und werden bereits für die Verwendung in Lebensmitteln akzeptiert.

Das Polysaccharid hat wünschenswerterweise Seitenkettengalactosereste, die gegen Oxidation durch Galactoseoxidase anfällig sind, zur Herstellung einer Aldehydgruppe zum Kuppeln einer Proteineinheit, wie nachstehend erläutert wird. TXG, LBG und EMG haben solche Galactosereste.

Die gebundene Einheit kann ausgewählt sein aus einem breiten Bereich von Einheiten, die im Allgemeinen eine verwendbare Wirkung, in Annäherung an Cellulose, ausführen; beispielsweise in Textil, Papier, usw., und ist ein Enzym, Antikörper oder Antikörperfragment.

Das Enzym ist geeigneterweise eine Oxidase, Peroxidase, Katalase oder Urease. Diese Enzyme wirken, indem ihr Substrat durch sie hindurch diffundiert und erzeugen einen Fluss von aktivem Produkt von Molekülen, die hinweg diffundieren. Redoxenzyme, beispielsweise Oxidasen, wie Glucoseoxidase, erzeugen Wasserstoffperoxid, das als ein Bleichmittel wirken kann. Peroxidase katalysiert die Oxidation von einer Vielzahl von Substraten durch Wasserstoffperoxid. Urease katalysiert die Hydrolyse von Harnstoff, unter Freisetzen eines Flusses von Ammoniumionen, die den örtlichen pH-Wert erhöhen. Katalase ist eine Oxidoreduktase, die die Umwandlung von Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff katalysiert.

Antikörper oder Antikörperfragmente können beispielsweise bei Trenn- oder Reinigungstechniken, wie nachstehend beschrieben, oder in Immunoassays verwendet werden.

Die Einheit kann an das Polysaccharid durch eine Vielzahl von physikalischen oder chemischen Mitteln gebunden werden. Beispielsweise werden Proteine zweckmäßigerweise chemisch an Polysaccharide mit Galactoseseitenketten durch enzymatisches Oxidieren der Galactose, beispielsweise unter Verwendung von Galactoseoxidase, gebunden, unter Erzeugung einer Aldehydgruppe, an die eine Aminogruppe eines Proteins chemisch gebunden sein kann. Wie vorstehend angemerkt, haben TXG, LBG und EMG geeignete Galactoseseitenketten. Für Polysaccharide ohne geeignete Galactoseseitenketten können verschiedene Verfahren des chemischen Bindens von Proteinen verwendet werden. Alternative Techniken schließen begrenzte Perjodatoxidation, die erfordert, dass das Polysaccharid zwei benachbarte Hydroxylgruppen in cis-Orientierung aufweist, ein und zur Erzeugung von Aldehydgruppen führt, die reduktiv aminiert werden können. Eine weitere Möglichkeit ist die Reaktion von Bromcyan (CNBr), was in Zuckerringe bei vicinalen Diolen eingeschoben wird; sowohl in das Gerüst als auch in die Seitenketten, unter Bereitstellung einer Isoharnstoffbindung an die Aminogruppen von Proteinen. Es ist bevorzugt, chemische Techniken zu verwenden, die nicht die Polysaccharidgerüstlänge beeinflussen, was die Cellulosebindungsfähigkeit des Polysaccharids vermindern würde.

Weil das Polysaccharidkonjugat an Cellulose bindet, welche in Baumwolle und anderen Textilien, Papier, usw., vorliegt, bringt das Binden des Konjugats an Cellulose die gebundene Einheit in enge Nachbarschaft zu einer Oberfläche aus oder enthaltend Cellulose. Die Erfindung ermöglicht somit Zielen von gebundenen Einheiten auf solche Oberflächen. Diese Zielfunktion ist in einer Vielzahl verschiedener potenzieller Anwendungen von Nutzen, einschließlich der nachstehenden:

  • 1. Zielen von Enzymen zum Binden an Textil, beispielsweise löslich oxidierende Enzyme, wie Glucoseoxidase. Solche Enzyme wirken unter Freisetzen von Wasserstoffperoxid, welches als ein Bleichmittel wirken kann und somit einen Textil reinigenden Effekt aufweist oder zum Blockieren von Farbstoffübertragung während des Waschens zum Verhindern von Abfärben oder Vergrauung. Polysaccharidoxidasekonjugate finden somit Verwendung bei der Behandlung von neuer Bekleidung, insbesondere Baumwolle enthaltender Kleidung, und als ein Bestandteil von Wäschereiprodukten, wie Textil-Waschen, und Konditionierungsprodukten.
  • 2. Zielen von Enzymen, Antikörpern, usw., um an Papier zu binden, beispielsweise unter Erzeugung von Bleichen oder Färben des Papiers.
  • 3. Immobilisieren von Antikörpern, Enzymen oder Antikörperfragmenten an eine Cellulose-enthaltende Oberflächen, z.B. Celluloseteilchen oder Papier, beispielsweise zur Verwendung in diagnostischen Tests oder Immunoabsorbentsystemen.
  • 4. Bei Trennungs- oder Reinigungstechniken, die den Durchgang von Polysaccharidkonjugat durch ein Cellulosebett beinhalten, unter Entfernung des Konjugats. Beispielsweise durch Verwendung eines geeigneten Antikörper-Polysaccharid-Konjugats kann Antigen an das Konjugat gebunden werden und dann entfernt werden, beispielsweise aus der Lösung, durch Binden des Konjugats (und an gebundenes Antigen) an Cellulose, beispielsweise in einem Cellulosebett.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung erwächst aus der Tatsache, dass im Gegensatz zu den meisten anderen Zielmolekülen Cellulose-bindende Polysaccharide besonders robust sind. Proteine, wie eine Cellulose-bindende Domäne, können durch Wärme oder aggressive Tenside inaktiviert werden (denaturiert), während Polysaccharide, wie LBG, TXG, usw., durch solche Behandlungen vollständig unbeeinflusst bleiben. Die erfindungsgemäßen Polysaccharidkonjugate eröffnen somit den großen Vorteil von zusätzlicher Stabilität und Produktkompatibilität, verglichen mit anderen Zielmolekülen.

In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Produkt unter Einbezug eines Polysaccharidkonjugats gemäß der Erfindung bereit. Das Produkt ist zweckmäßigerweise ein Wäschereiprodukt, wie ein Textilwaschprodukt, beispielsweise ein Waschmittelprodukt oder ein Textil konditionierendes Produkt. In diesem Fall kann die gebundene Einheit ein Enzym sein.

Die Erfindung findet auch Anwendung bei Körperpflegeprodukten. Andere Anwendungen schließen zum Beispiel diagnostische Testsysteme, Papierprodukte, usw., ein.

Das Produkt kann ansonsten von im Allgemeinen üblicher Formulierung sein, wie sie dem Fachmann gut bekannt sein wird. Für eine Erörterung von bekannten Waschmittelzusammensetzungen siehe beispielsweise WO-A-95/34628, insbesondere Seiten 11 bis 15.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum gezielten Binden an eine Einheit von Cellulose durch die Verwendung eines Polysaccharidkonjugats gemäß der Erfindung bereit.

Die Erfindung wird weiterhin zur Erläuterung in den nachstehenden Beispielen beschrieben.

BEISPIEL 1: Konjugation von Johannisbrotbaumgummi mit Glucoseoxidase. MATERIALIEN UND VERFAHREN Reinigung von Johannisbrotbaumgummi

Johannisbrotbaumgummi (LBG) (bezogen von Meyhall) wurde gemäß dem nachstehenden Verfahren gereinigt. Eine 1%ige (Gewicht/Volumen) wässrige LBG-Lösung wurde durch Auflösen von 15 g LBG in 1500 ml Wasser bei 80–90°C für 30 Minuten, unter mechanischem Rühren in einem Silverson-Homogenisator, hergestellt. Die erhaltene Lösung wurde bei 27 000 G (Sorval RCSC, 6 × 250 ml Lösungen, GSA Rotor) 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die verbleibenden Pellets wurden in 500 ml desionisiertem Wasser gelöst, wiederum bei 80–90°C für 30 Minuten, mit Hilfe des Silverson-Rührers. Diese Lösung wurde wie vorstehend weiter zentrifugiert. Die erhaltenen vereinigten Überstände wurden dann in Isopropanol (1:2, Überstand:Isopropanol) bei Umgebungstemperatur ausgefällt. Der zähflüssige Niederschlag wurde in Isopropanol weiter gewaschen, in Aceton für eine Stunde stehen lassen und dann zweimal mit frischem Aceton gewaschen. Dieses gereinigte LBG wurde an der Luft und dann in einem Vakuumofen bei 45°C getrocknet.

Oxidation von Johannisbrotbaumgummi mit Hilfe von Galactoseoxidase

Gereinigtes LBG wurde mit 0,1% (Gewicht/Volumen) in 0,1M Natriumphosphat (pH 7,0) durch Erhitzen auf 80–90°C und periodischem Rühren mit einem Ultra-Turrax-Homogenisator gelöst. Galactoseoxidase (Sigma, G7907) wurde in Natriumphosphat, pH 7,0, zu einer Konzentration von 50 &mgr;g/ml gelöst. Eine aliquote Menge dieser Lösung von 400 &mgr;l wurde zu 1,2 ml LBG-Lösung (0,1% Gewicht/Volumen) gegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei 37°C 5–16 Stunden, in Abhängigkeit von dem einzelnen Versuch, inkubiert.

Konjugation von Glucoseoxidase (GOX) zu oxidiertem LBG

Glucoseoxidase (Sigma-Produkt Nr. 7141, 12,5 mg) wurde in ein Röhrchen eingewogen und 0,5 ml oxidierte LBG/Galactoseoxidaselösung wurden zugegeben. Das Gemisch wurde leicht angeklopft zum Auflösen von Glucoseoxidase, dann für 2 Stunden bei Umgebungstemperatur gelagert. Natriumcyanoborhydrid (NaBH3CN, 10 &mgr;l bei 19 mg/ml) wurde zugegeben und das Röhrchen wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur belassen. Glucoseoxidase hat ein ungefähres Molekulargewicht von 160 000.

Assay für aktives Konjugat (Cellulosebinden) Allgemeines Verfahren

Alle Assays nutzten die Fähigkeit von Galactomannanen, an Cellulose durch Polysaccharid:Polysaccharid-Wechselwirkung zu binden. Sigmacell Typ 20 Celluloseteilchen mit einer mittleren Teilchengröße von 20 m (von Sigma) wurden zum Bereitstellen einer Oberfläche, auf der Cellulosebindungsmoleküle eingefangen wurden, verwendet. Eine Aufschlämmung von Sigmacell von 50 mg/ml wurde in PBS + Tween 20 (0,05) (PBST) hergestellt. Die Assays wurden an Filterplatten (Millipore, Produkt Nr. MAHVN4550) mit 0,45 m Porengrößenfiltern durchgeführt. Die Platten wurden immer durch Vollsaugen über Nacht in PBST mit Rinderserumalbumin (BSA, 2% Gewicht/Volumen) zum Verhindern von unspezifischem Binden von Enzym oder Konjugat vorbehandelt. Die Lösungen wurden durch die Filterplatte unter Verwendung einer individuell verfügbaren Vakuumleitung (Anachem) abgezogen. Die über Nacht behandelte Lösung (PBST/BSA) wurde vor dem Versuch entfernt. 100 &mgr;l Sigmacell-Aufschlämmung (unmittelbar vor der Zugabe geschüttelt) wurden zu jeder Vertiefung gegeben. 100 &mgr;l von geeignet verdünnten LBG-Konjugaten (siehe nachstehend) wurden zu dem Sigmacell in den 96-Vertiefungs-Platten gegeben und 10 Minuten inkubiert, um das Binden an die Celluloseoberfläche zu erlauben. Nach 10 Minuten wurde die Lösung unter Vakuum abgezogen und die Cellulose durch Zugabe von 150 &mgr;l PBS + Tween (0,05%) fünfmal gewaschen. Die Assays wurden dann, wie nachstehend gezeigt, für jedes der Konjugate fortgesetzt.

Assay von LBG/GOX-Konjugat

Das Stamm-LBG/GOX-Konjugat, enthaltend 25 mg/ml Glucoseoxidase und 0,1% (Gewicht/Volumen) LBG, wurde zu einer Konzentration von 25 &mgr;g/ml in PBST + BSA (2% Gewicht/Volumen) verdünnt. Ein Kontrollgemisch, enthaltend 25 mg/ml Glucoseoxidase mit unmodifiziertem LBG, wurde auch zu der gleichen Konzentration verdünnt, um auf nichtspezifisches Binden zu untersuchen. Nach Inkubation mit den Konjugaten wurden die Sigmacellteilchen gewaschen und dann wurde TMB-GOx-Substrat zu jeder Vertiefung gegeben. Das TMB-Substrat wurde durch Auflösen der nachstehenden Bestandteile in 20 ml Wasser hergestellt:

  • – Dinatriumphosphat (0,45 mg),
  • – Zitronensäure (150 mg),
  • – D-Glucose (0,54 g),
  • – Meerrettich-Peroxidase (100 ng) und
  • – 200 &mgr;l einer 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-(TMB)-Stammlösung in DMSO (100 mg/10 ml DMSO).

Das Substrat. wurde mit den Teilchen für einige Minuten, bis sich eine blaue Farbe entwickelte, belassen. Bevor die optischen Dichten aufgezeichnet wurden, wurde die Substratlösung Ansäuerung durch Zugabe von 50 &mgr;l 2M HCl zu jeder Vertiefung unterzogen und das gelbe Produkt wurde auf einer Flachboden-96-Vertiefungs-Platte ausgezogen. Die OD bei 450 nm wurde bestimmt und an einem automatischen Plattenleser aufgezeichnet.

ERGEBNISSE

Das reduktive Aminierungs-Konjugationsverfahren ergab ein aktives Konjugat der zwei Moleküle, GOx und LBG, wie durch die optischen Dichtewerte in Tabelle 1 gezeigt. Sowohl die Cellulosebindungsaktivität des Galactomannans als auch die Enzymaktivität des GOx wurden zurückbehalten und wurden wirksam in dem Konjugat vereinigt. Im Gegensatz dazu liefert der niedrige OD-Wert für das einfache Gemisch von LBG und GOx Bestätigung, dass sich eine Konjugatleistung aus der chemischen Konjugation der zwei Moleküle ergab.

BEISPIEL 2: Konjugation von Johannisbrotbaumgummi mit monoklonalem Antikörper 3299 MATERIALIEN UND VERFAHREN

LBG wurde gereinigt und wie in Beispiel 1 beschrieben oxidiert.

Konjugation von monoklonalem Antikörper 3299 an oxidiertes LBG

Eine Lösung eines monoklonalen Antikörpers, bezeichnet 3299 (MAb 3299, erhalten von Unipath), spezifisch für das Schwangerschaftshormon von humanem chorionischem Gonadotrophin (HCG), wurde über Nacht gegen 0,1M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, dialysiert. Die Endkonzentration des Antikörpers wurde durch weitere Verdünnung mit dem gleichen Puffer, falls geeignet, auf 10 mg/ml eingestellt. MAb 3299 hat ein geeignetes Molekulargewicht von 150 000.

Eine Probe (20 &mgr;l) von dieser MAb 3299-Lösung wurde mit 20 1 der oxidierten LBG-Lösung (wie vorstehend) vermischt und das Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen lassen. Eine Lösung (1 &mgr;l) von NaBH3CN (19 mg/ml) wurde zugegeben und die Reaktion über Nacht bei Umgebungstemperatur belassen.

Assay für LBG/monoklonaler Antikörper-3299-Konjugat

LBG/MAb-3299-Konjugat-Stammlösung, enthaltend 5 mg/ml MAb 3299 und 0,05 LBG, wurde in PBST + BSA (2% Gewicht/Volumen) auf eine Antikörperkonzentration von 25 &mgr;g/ml verdünnt. Ein Kontrollgemisch, enthaltend 25 mg/ml MAb 3299, mit unmodifiziertem LBG, wurde auch auf die gleiche Konzentration verdünnt, um auf nichtspezifisches Binden zu untersuchen. Nach Inkubation mit den Celluloseteilchen und anschließendem Waschen, wurde Cellulose-gebundener, monoklonaler Antikörper mit Hilfe von alkalischer Phosphatase-konjugierten Tracermolekülen bestimmt. Diese waren entweder (a) Kaninchen-anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase oder (b) HCG-alkalische Phosphatase. Diese Tracerkonjugate wurden in PBST + BSA (2% Gewicht/Volumen) verdünnt.

  • a) Kaninchen-anti-Maus-IgG-alkalisches Phosphatase-Tracerkonjugat (Sigma) wurde 1:1000 verdünnt und 150 &mgr;l davon wurden zu jedem LBG/MAb-Cellulosegemisch in den Filterplatten gegeben. Nach 1 Stunde wurde das Tracerkonjugat durch Filtration entfernt und die Platten 10 × mit 200 &mgr;l pro Vertiefung PBST gewaschen. Alkalisches Phosphatasesubstrat (Sigma 104) wurde zu jeder Vertiefung (200 &mgr;l para-Nitrophenylphosphat, pNPP, 1 mg/ml in Diethanolaminpuffer, pH 10) gegeben und bei Umgebungstemperatur gehalten, bis sich eine gelbe Farbe entwickelt hatte (etwa 30 Minuten). Das gelbe Produkt wurde dann in der üblichen Weise auf einer Mikrotiterplatte ausgezogen und OD bei 405 nm bestimmt.
  • b) HCG-alkalische Phosphatase-Tracerkonjugat wurde 1:200 verdünnt und 150 &mgr;l davon wurden zu jedem LBG/MAb Cellulosegemisch in den Filterplatten gegeben. Der Versuch wurde dann wie vorstehend in a) ablaufen lassen.

ERGEBNISSE

Das reduktive Aminierungsverfahren erwies sich als wirksam zum Konjugieren von Antikörpern an LBG, wie durch die Werte in Tabelle 2 gezeigt. Wie für GOx zeigen die Werte, dass ein chemisches Vernetzungsverfahren notwendig war (anstatt einfachen Vermischens), um ein aktives Konjugat herzustellen, und das Verfahren ergab keinen Verlust an Bindungsaktivität in beiden Molekülen. Die verschiedenen Tracermoleküle (anti-Maus-IgG und HCG) bestätigten, dass der Antikörper an die Cellulose in einer Form gebunden war, die ihre spezifische, immunologische Bindungsfähigkeit (HCG) sowie ihre allgemeinen Immunoglobulineigenschaften (anti-Maus-IgG) erhielt.

Die niedrigen, jedoch messbaren Bindungswerte, die mit der gemischten Probe gefunden wurden, sind ein Beweis für ein allgemeines „Haftvermögen", das mit dem monoklonalen Antikörper und den Celluloseteilchen (nichtspezifische Adsorption) einhergeht. Jedoch ist der Unterschied zwischen den zwei Einstellungen ein deutlicher Beweis einer annehmbaren Konjugationswirksamkeit.

BEISPIEL 3: Konjugation von Johannisbrotbaumgummi mit scFv3299 MATERIALIEN UND VERFAHREN

LBG wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt und oxidiert.

Das Einzelketten-Fv-Antikörperfragment von 3299 (scFv3299) ist ein genetisch erzeugtes Fragment, das aus den Variablenbereichen des 3299-Stamm-Antikörpers besteht, erzeugt in Mikroorganismen, transformiert mit den relevanten Genen, geeigneterweise für den Wirt formatiert. Um mit diesem Material zu arbeiten, war es zunächst erforderlich, den transformierten Wirtsorganismus zu züchten, Expression des Gens einzuleiten und dann den scFv aus der Überstandsflüssigkeit der Kultur zu reinigen. Das gentechnisch erzeugte scFv3299 trägt auch einen kurzen Oligohistidin„schwanz", der an immobilisierte Nickelionen als Mittel der Reinigung binden könnte (das IMMAC-Verfahren). scFv3299 hat ein ungefähres Molekulargewicht von 26 000.

Herstellung und Reinigung von ScFv

Das Antikörperfragment scFv3299, modifiziert durch die Zugabe eines kurzen Oligohistidinschwanzes, wurde in einem transformierten Wirtsmikroorganismus (z.B. E. coli) unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, erzeugt. Das scFv3299-Protein wurde durch Standardverfahren durch ein IMMAC-Verfahren und dann durch Mono-S-(Kationenaustausch)-Chromatographie gereinigt. Die gereinigte Proteinlösung wurde einem Pufferaustauschverfahren durch eine PD-10-Gel-Filtrationssäule (Pharmacia) in 0,1M Phosphatpuffer, pH 6,5, unterzogen.

Thiolierung von ScFv3299 mit 5-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid (SAMSA)

Gereinigtes scFv3299 mit 1,4 mg/ml in Phosphatpuffer, pH 6,5, 0,1M (150 &mgr;l), wurde in 0,6 ml „Reactivial" (Pierce) angeordnet. Eine Lösung (20 &mgr;l) von SAMSA (bezogen von Sigma), gelöst in Dimethylformamid mit einer Geschwindigkeit von 6 mg/ml, wurde dann zu dem Fläschchen gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Nachstehende wurde dann nacheinander zugegeben, wobei das erhaltene Gemisch 5 Minuten nach jeder Zugabe gerührt wurde:

25 &mgr;l 0,1M EDTA, pH 8,0

100 &mgr;l 0,1M Tris-HCl, pH 7,0

100 &mgr;l 1M Hydroxylamin

Nach der Endzugabe wurde das Gemisch mit 2,5 ml in 0,1M Natriumphosphat + 5 mM EDTA, pH 6,5, verdünnt und auf eine PD-10-Gel-Filtrationssäule aufgetragen. Das Protein-Thiol-Konjugat wurde in 3 ml Phosphat + EDTA-Puffer eluiert, was wiederum durch Vermindern des Volumens auf 150 &mgr;l durch eine Centricon-10-Vorrichtung (Amicon) auf konzentriert wurde.

Derivatisierung von LBG mit MPBH

4-(4-N-Maleimidophenyl)buttersäurehydrazid.HCl (MPBH, Pierce Product Nr. 22305) wurde in 10 mg/ml in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Oxidiertes LBG wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass am Ende des Verfahrens die Galactoseoxidase, die mit dem Produkt zurückblieb, durch Erhitzen auf 98°C für 15 Minuten denaturiert wurde. Die erhaltene Lösung wurde Pufferaustausch mit 0,1M Natriumacetat, pH 5,5, mit Hilfe einer Centricon-30-Vorrichtung (Amicon) unterzogen, und dann wurde das Volumen durch die Zugabe von weiterer Pufferlösung, falls geeignet, zurück auf das Ausgangsvolumen eingestellt. An diesem Punkt in dem Verfahren wurde MPBH in DMSO (21, 3 &mgr;l) zu 600 &mgr;l der oxidierten LBG-Lösung gegeben, unter Gewinnung einer End-MPBH-Konzentration von 1 mM. Dieses Reaktionsgemisch wurde unter mildem Rühren 2 Stunden bei Umgebungstemperatur gehalten. Das derivatisierte LBG-Produkt wurde dann Pufferaustausch mit 0,1M Phosphatpuffer, pH 6,5, mit Hilfe einer Centricon-30-Vorrichtung unterzogen, wonach das Volumen erneut auf 600 &mgr;l eingestellt wurde.

Konjugation von SAMSA-derivatisiertem ScFv mit MPBH-derivatisiertem LBG

Die ScFv-SAMSA-Lösung (75 &mgr;l, enthaltend 0,105 mg) wurde mit LBG-MPBH (25 &mgr;l) vermischt und das Volumen auf 125 &mgr;l mit Phosphatpuffer aufgefüllt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur belassen.

Assay für LBG/scFv3299-Konjugat

LBG/scFv3299-Konjugat-Stammlösung, enthaltend 0,34 mg/ml scFv3299 und 0,02 LBG, wurde in PBST + BSA (2% Gewicht/Volumen) auf eine scFv-Konzentration von 34 &mgr;g verdünnt. Wie mit dem gesamten Antikörperkonjugat, wurde ein Gemisch von scFv und LBG, enthaltend die gleichen relativen Mengen, auf die gleiche Konzentration verdünnt. Das Assayverfahren war wie vorstehend für das Ganz-Antikörper-Konjugat beschrieben, jedoch nur mit dem HCG-alkalischen Phosphatase-Tracerkonjugat (da ein scFv-Fragment nicht mit anti-Maus-IgG nachgewiesen werden konnte).

ERGEBNISSE

Es wurde gefunden, dass das scFv3299-Antikörperfragment mit LBG konjugiert ist, wie aus den Werten in Tabelle 3 gezeigt; auch wenn ein anderes, komplexeres Konjugationsverfahren verwendet wurde. Der Unterschied zwischen den Kontrollgemischwerten und den Konjugatwerten ist weniger als mit anderen Systemen, was entweder eine niedrigere Wirksamkeit der Konjugation oder eine größere Tendenz für das unkonjugierte Material, unspezifisch adsorbiert zu werden, ausweist. Eine niedrigere Konjugationswirksamkeit ist wahrscheinlicher, da eine längere Inkubationszeit mit Substrat zum Erzeugen von hinreichenden OD-Werten benötigt wurde.

Jedoch zeigen die Ergebnisse deutlich, dass auch mit dem scFv-Fragment ein wesentlicher und verwendbarer Grad an chemischer Konjugation erreicht wurde.

Beispiel 4: Konjugation von aktiven Proteinen an Tamarindensamenxyloglucan (TXG)

Tamarindensamenpolysaccharid (Glyoid 3S von Dainippon Pharmaceutical Co., Osaka, Japan) wurde in desionisiertem Wasser (16 Stunden bei 25°C oder 10 Minuten bei 80°C, gefolgt von 2–3 Stunden bei 25°C) gelöst, unter Gewinnung einer 0,5–1,0%-Gewicht/Volumen-Suspension, die durch Zentrifugation (20000 G, 30 Minuten) gereinigt wurde, sorgfältig gegen desionisiertes Wasser dialysiert und lyophilisiert wurde.

Das erhaltene TXG wurde dann in Konjugate mit Glucoseoxidase, MAb 3299 und scFv 3299 exakt, wie in Beispielen 1, 2 und 3 beschrieben, gebildet und es wurde gefunden, dass die erhaltenen Konjugate an Cellulose gebunden sind.


Anspruch[de]
Polysaccharidkonjugat, umfassend ein Polysaccharid mit einer gebundenen Einheit mit einem Molekulargewicht von mindestens 5000, wobei das Polysaccharidkonjugat in der Lage ist, an Cellulose zu binden und die gebundene Einheit ein Enzym, einen Antikörper oder ein Antikörperfragment darstellt, wobei das Polysaccharid eine 1-4-gebundene &bgr;-Glycan-Gerüststruktur hat und wobei das Polysaccharid ausgewählt ist aus Xyloglucanen und Galactomannanen. Polysaccharidkonjugat nach Anspruch 1, wobei die Xyloglucane aus Tamarindensamenxyloglucan (TXG) und Erbsenxyloglucan und die Galactomannane, aus Johannisbrotbaumgummi (LBG), Enzym-modifiziertem Guar (EMG), Taragalactomannan und Cassiagalactomannan, ausgewählt sind. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Polysaccharid Seitenkettengalactosereste aufweist, die gegen Oxidation durch Galactoseoxidase anfällig sind. Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Enzym eine Oxidase, Peroxidase, Katalase oder Urease ist. Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Einheit durch physikalische oder chemische Mittel an das Polysaccharid gebunden ist. Konjugat nach Anspruch 5, wobei die Einheit verfügbare Aminogruppen aufweist und chemisch an auf dem Polysaccharid gebildete Aldehydgruppen gebunden ist. Konjugat nach Anspruch 6, wobei eine Proteineinheit chemisch an TXG, LBG oder EMG über Aldehydgruppen, die durch enzymatische Oxidation von Galactoseseitenketten erzeugt wurden, gebunden ist. Produkt, unter Einbezug eines Polysaccharidkonjugats gemäß einem der vorangehenden Ansprüche. Produkt nach Anspruch 8, umfassend ein Wäschereiprodukt, wie ein Textilwaschprodukt, z.B. ein Waschmittelprodukt, oder ein Textil-konditionierendes Produkt. Produkt nach Anspruch 9, wobei die gebundene Einheit ein Enzym ist. Verfahren zum gezielten Binden einer Einheit an Cellulose durch Verwendung eines Polysaccharidkonjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 7.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com