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Dokumentenidentifikation DE60031268T2 24.05.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001181013
Titel VERFAHREN UND ZUSAMMANSETZUNG ZUR BEHANDLUNG VON KREBS
Anmelder Dana-Farber Cancer Institute, Inc., Boston, Mass., US
Erfinder PARDEE, B., Arthur, Brookline, MA 02445, US;
LI, J., Chiang, West Roxbury, MA 02132, US;
LI, You-Zhi, Dedham, MA 02026, US
Vertreter Klunker, Schmitt-Nilson, Hirsch, 80797 München
DE-Aktenzeichen 60031268
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 14.04.2000
EP-Aktenzeichen 009222373
WO-Anmeldetag 14.04.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/US00/10169
WO-Veröffentlichungsnummer 2000061142
WO-Veröffentlichungsdatum 19.10.2000
EP-Offenlegungsdatum 27.02.2002
EP date of grant 11.10.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 24.05.2007
IPC-Hauptklasse A61K 31/352(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 31/337(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61P 35/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Behandlung von Krebs hat sich bisher als problematisch erwiesen. Zwar haben „Krebse" viele gemeinsame Eigenschaften, aber jeder bestimmte Krebs hat seine eigenen speziellen Eigenschaften. Genetische Faktoren und Umweltfaktoren stehen in einem komplizierten Wechselspiel mit der Schwere und der Prognose der Behandlung. Daher muss eine Behandlung sorgfältig zugeschnitten werden.

Bestimmte pharmazeutische Behandlungen haben sich für eine Form von Krebs, aber nicht für andere, als nützlich erwiesen (Hollad and Frei, et al., Cancer Medicine, 4. Ausgabe, Hrsg. Williams & Wilkens). Andere Behandlungen wie Bestrahlung sind zwar für eine Reihe von Krebsen bzw. Krebsarten teilweise nützlich, führen aber typischerweise nicht zu einer vollständigen Heilung. Tatsächlich kann bei der Schwere vieler Krebsarten und der Sterblichkeitsrate ein Arzneimittel als erfolgreich betrachtet werden, wenn es die Lebensqualität verbessert, z.B. durch Verzögerung des Wachstums von Tumoren, oder das Leben verlängert – ohne den Zustand tatsächlich zu heilen. So wird unter vielen Umständen ein Individuum mit einer Verbindung oder einer Kombination von Behandlungen behandelt, die 90 bis 95% der malignen Zellen eliminieren kann, aber die verbleibenden Zellen können erneut wachsen und metastasieren, was am Ende zum Tod führt. Unter den Krebsarten mit besonders schlechten endgültigen Prognosen ist Eierstockkrebs.

Kombinationstherapien sind zwar wünschenswert, aber ein Unterfangen aufs Geratewohl. Die Behandlungen sind typischerweise nicht suchterzeugend. In vielen Fällen können Wechselwirkungen und die Behandlungsbelastung für die Kombinationen zu einer geringeren Wirksamkeit führen als jede Behandlung alleine. Zu Problemen, auf die man trifft, gehört die multiple Arzneimittelresistenz (MDR – multiple drug resistance), bei der die maligne Zelle im Wesentlichen die zytotoxischen Verbindungen und andere Verbindungen aus der Zelle herauspumpt, wodurch sie eine dauerhafte nutzbringende Behandlung des Krebses verhindert.

Es gibt eine Anzahl zytotoxischer Mittel, die zur Zeit zur Behandlung von Krebs verwendet oder studiert werden. Eines von diesen, Paclitaxel (auch als TAXOL® bezeichnet), wurde zuerst 1971 von Wani und Mitarbeitern identifiziert (Wani MC et al., 1971 J. Am. Chem. Soc., 93: 2325–2327), die ein Durchmusterungsprogramm von Pflanzenextrakten am nationalen Krebsinstitut befolgten. Dieses komplexe Diterpen zeigt zytotoxische Aktivität gegen mehrere Arten von Tumoren und wird gegenwärtig bei der Behandlung mancher Krebsarten wie Eierstockkrebs und Brustkrebs verwendet. Klinische Studien legen nahe, dass TAXOL® möglicherweise bei der Behandlung von über 70% der menschlichen Krebsarten verwendet werden könnte.

Paclitaxel unterscheidet sich von anderen zytotoxischen Arzneimitteln durch seinen einzigartigen Wirkungsmechanismus. Es stört die Zellteilung durch Manipulation der molekularen Regulierung des Zellzyklus. Paclitaxel bindet an Tubulin, die Hauptstrukturkomponente von Mikrokanälchen, die in allen eukaryotischen Zellen vorhanden sind. Anders als andere antimitotische Mittel wie Vinca-Alkaloide und Colchicin, die die Polymerisation von Tubulin hemmen, fördert Paclitaxel diesen Zusammenbau von Tubulin und stabilisiert die sich ergebenden Mikrokanälchen. Dieses Ereignis führt zur Unterbrechung der Zellteilung und schließlich zum Zelltod.

Die Antitumor-Eigenschaft taxoider Verbindungen hat auch zur Erzeugung neuer Arzneimittel gegen Krebs, die von Taxanen abgeleitet sind, geführt. TaxotereTM (verkauft von Rhône-Poulenc Rorer), das halbsynthetisch aus 10-Deacetylbaccatin III hergestellt wird, wird gegenwärtig bei der Behandlung von Eierstockkrebs und Brustkrebs verwendet.

Mittel wie TAXOL® und Taxotere haben zwar für einen Fortschritt bei der Behandlung von metastasierendem Eierstockkrebs und metastasierendem Brustkrebs gesorgt, aber die Mehrzahl der Behandelten erliegt diesen Krankheiten am Ende immer noch.

US-A-5 728 687 offenbart Zusammensetzungen zur Behandlung neoplastischer Krankheiten, die TAXOL® oder Taxotere in Kombination mit mindestens einer der Substanzen Alkylierungsmittel, Epidophyllotoxin, Antimetabolit oder Vinca-Alkaloid aufweisen.

&bgr;-Lapachon, ein Chinon, ist von Lapachol (einem Naphthochinon) abgeleitet, das aus dem Lapachobaum (Tabebuia avellanedae), einem Mitglied der Katalpa-Familie (Bignoniaceae), isoliert werden kann. Wie Camptothecin und Topotecan hemmt &bgr;-Lapachon DNA-Topoisomerase I (Li, C. J., et al., J. Biol. Chem., 1993). Es wurde gefunden, dass diese Verbindung in vitro gegen mehrere Arten von Krebszellen wirksam ist, einschließlich Lungen-, Brust-, Kolon- und Prostata-Krebs und malignes Melanom (Li, C. J., et al., Cancer Research 55: 3712–3715 (1995) und unveröffentlichte Daten).

&bgr;-Lapachon wirkt durch Unterbrechung der DNA-Replikation. Topoisomerase I ist ein Enzym, das die DNA, die die Chromosomen ausmacht, abwickelt. Die Chromosomen müssen abgewickelt bzw. entwirrt sein, damit die Zelle die genetische Information zur Synthese von Proteinen nutzen kann; &bgr;-Lapachon hält die Chromosomen eng gewickelt, so dass die Zelle keine Proteine machen kann. Als ein Ergebnis hört die Zelle auf zu wachsen. Weil sich Krebszellen dauernd replizieren und viele Mechanismen, die die Replikation einschränken, wie es bei normalen Zellen der Fall ist, umgehen, sind sie für eine Topoisomerase-Hemmung verwundbarer als es normale Zellen sind. Die Behandlung mit diesen Verbindungen ist jedoch auch nur teilweise erfolgreich – sie hemmt und verzögert das Wachstum der malignen Zellen.

Gemäß Boothman et al. (Cancer Research, 49, 605–612, 1. Feb. 1989) aktiviert &bgr;-Lapachon die DNA-Abwickelaktivität von Topoisomerase I, wodurch es die Reparatur potenziell tödlicher DNA-Schäden bei menschlichen Tumorzellen hemmt.

Li et al. (J. Biol. Chem. Vol. 268, Nr. 30; 22463–22468, 1993) schlagen mittlerweile vor, dass die direkte Wechselwirkung zwischen &bgr;-Lapachon und Topoisomerase I die Bildung von spaltbarem Komplex hemmt.

Katz et al. (Eur J Cancer, Vol 26, Nr. 6; 724–727, 1990) berichten über eine Untersuchung der Wechselwirkung von Cisplatin mit Arzneimitteln, die Topoisomerase beeinflussen, einschließlich &bgr;-Lapachon. Die Wirkungen der zwei Substanzen sind additiv, was nahelegt, dass sie nicht synergistisch wirken.

WO 96/33988 beschreibt verschiedene Analoge von &bgr;-Lapachon, die verwendet werden können, um den programmierten neoplastischen Zelltod einzuleiten.

Kein einziges Arzneimittel oder Arzneimittel-Kombination heilt fortgeschrittenen metastasierenden Krebs, und die Patienten erliegen den Krebsarten typischerweise in mehreren Jahren. Daher sind neue Arzneimittel oder Kombinationen, die den Ausbruch lebensbedrohlicher Tumore verzögern und/oder die Lebensqualität verbessern können, indem sie die Tumorbelastung weiter verringern, sehr wichtig.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Wir haben überraschenderweise entdeckt, dass die Verabreichung einer Verbindung, die auf Zellen in der G1- und/oder der S-Phase abzielt, wie ein Topoisomerase I-Hemmstoff wie &bgr;-Lapachon, in Kombination mit einer Verbindung, die auf derartige Zellen in der G2/M-Phase abzielt, z.B. ein Taxan-Derivat wie Paclitaxel, zu einer unerwartet größeren als additiven (d.h. synergistischen) Verringerung der Anzahl an Tumoren (und des Tumorvolumens bei einem Säugetier mit metastasierenden Tumoren), verglichen mit der Verabreichung dieser Mittel allein führt. Außerdem wuchsen die Tumoren in mehreren Monaten der Beobachtung nicht wieder. Zusätzlich wurden bei so behandelten Säugetieren keine Anzeichen für Toxizität oder Gewichtsverlust beobachtet.

Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Kombination eines G2/M-Phasen-Arzneimittels einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Taxan, seine Derivate und Analogen, bevorzugter Paclitaxel, und eines G1- und/oder S-Phasen-Arzneimittels, bevorzugt &bgr;-Lapachon oder ein Derivat oder Analogon davon, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugetiers mit einem soliden Tumor.

Eine Liste von zwei repräsentativen Verbindungen ist in Tabelle I unten beschrieben. Die Kombination der vorliegenden Erfindung ist besonders vorteilhaft zur Behandlung von Patienten, die chemotherapeutisch refraktive, metastasierende Krebsarten haben. Die Verwendungen der vorliegenden Erfindung beabsichtigen, einem Säugetier in Kombination eine wirksame Menge eines G1- und S-Phasen-Arzneimittels, eines G1-Phasen-Arzneimittels, eines S-Phasen-Arzneimittels, in Kombination mit einem G2/M-Arzneimittel zu verabreichen. Bevorzugt ist die Kombination (1) ein Topoisomerase I-Hemmstoff wie &bgr;-Lapachon oder seine Derivate oder Analoge davon; und (2) Taxan, seine Derivate oder Analoge und pharmazeutisch annehmbare Salze davon.

Die Formulierung „Taxan-Derivat", wie sie hierin verwendet wird, bedeutet irgendein Taxan, das wegen seiner antineoplastischen Eigenschaften in der Krebs-Chemotherapie verwendet wird oder verwendet werden kann. Taxol® ist ein bevorzugtes Taxan-Derivat.

Die Formulierung „&bgr;-Lapachon", wie sie außerdem hierin verwendet wird, bedeutet Lapachon (3,4-Dihydro-s,3-dimethyl-2H-naphthol[1,3-b]pyran-5,6-clon) und Derivate und Analoge davon. Bevorzugte Derivate und Analoge werden unten diskutiert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die 1A und 1B veranschaulichen die Ergebnisse des Experiments 1.

Die 2A und 2B veranschaulichen die Ergebnisse des Experiments 2.

3 ist eine Fotografie der Kontrollgruppe, die Hunderte von Tumorknötchen zeigt, von denen manche miteinander verschmolzen sind, um größere Tumormassen zu bilden (z.B. Pfeil 2).

4 ist eine Fotografie der mit &bgr;-Lapachon behandelten Gruppe, die mehrere Tumorknötchen zeigt (z.B. Pfeil 2).

5 ist eine Fotografie der mit Paclitaxel behandelten Gruppe, die mehrere Tumorknötchen zeigt (z.B. Pfeil 2).

6 ist eine Fotografie der mit der Kombination behandelten Gruppe. Keine Tumorknötchen sind sichtbar. Es ist auch wichtig, die Farbe des Peritonealüberzugs zu beachten. Anders als bei dem in den 3 bis 5 zu sehenden Überzug ist die Farbe des Überzugs in der Kombinationsgruppe nicht hellrot, sondern mehr wie die, die bei gesunden Mäusen zu sehen ist. Dies liefert einen Hinweis, dass kein Tumorwachstum und keine Tumor-induzierte Angiogenese auftraten.

Die 7A und 7B sind Fotografien, die eine Kombinationsbehandlung bei einem Prostata-Tumor zeigen. 7A ist die Kontrolle. 7B ist die Kombination.

GENAUE BESCHREIBUNG

Diese Erfindung stellt vorteilhafte Kombinationstherapien für Krebsarten bereit, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Brust-, Eierstock- und Prostata-Krebs, wobei Verfahren verwendet werden, die eine Verabreichung einer G1- und/oder S-Phasen-Verbindung mit einer G2/M-Phasen-Verbindung einsetzen.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Individuums mit malignen Zellen oder zur Hemmung des weiteren Wachstums derartiger maligner Zellen durch Verwendung einer Verbindung, die auf derartige Zellen an G1- und/oder S-Phasen-Kontrollpunkten abzielt, gleichzeitig mit/oder gefolgt von der Verwendung eines Arzneimittels, das an G2/M-Kontrollpunkten wirkt. Individuelle Verbindungen, die diese Kriterien erfüllen, sind Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet bekannt. Beispielsweise sind &bgr;-Lapachon und seine Derivate G1- und S-Phasen-Arzneimittel. Während Taxol und seine Derivate G2/M-Arzneimittel sind. Eine Liste von repräsentativen Verbindungen ist unten in Tabelle 1 dargelegt:

Die Kombinationen der vorliegenden Erfindung sind besonders vorteilhaft, wie durch das Beispiel mit &bgr;-Lapachon und Taxol, in dem synergistische Ergebnisse erhalten wurden, gezeigt ist. Molekulare Veränderungen, die einer Zellzyklus-Verzögerung an mehreren Kontrollpunkten, beispielsweise der G1- und/oder S-Phase und der G2/M-Phase, zugrunde liegen, können beispielsweise zur synergistischen Einleitung der Apoptose bei malignen Zellen führen. Man glaubt, wenn auch ohne durch die Theorie gebunden sein zu wollen, dass die synergistische Wirkung durch Hemmung von cdc2-Kinasen und Hochregulierung von p21 vermittelt wird. p21 kontrolliert die G1- und S-Phasen-Kontrollpunkte (Elledge, S. J. (1996) Science 274, 1664–1672) und ist an der Regulierung des G2/M-Kontrollpunkts beteiligt (Hartwell L. H. et al., M. B. (1994) Science, 266, 1821–1828). Die Zellzyklus-Kontrollpunkte werden ebenfalls durch cdc2-Kinasen und ihre Hemmstoffe reguliert (Elledge, S. J. (1996) Science 274, 1664–1672 und Nurse, P. (1997) Cell 91, 865–867).

Bevorzugt werden die G1- und/oder S-Phasen-Verbindungen vor oder gleichzeitig mit Verbindungen, die auf eine Zelle am G2/M-Phasen-Kontrollpunkt abzielen, verabreicht. Bevorzugter werden die Verbindungen vor den Verbindungen, die auf eine Zelle am G2/M-Kontrollpunkt abzielen, verabreicht.

Zu bevorzugten Verbindungen, die auf einen G1- und/oder S-Phasen-Kontrollpunkt abzielen, gehören G1- und/oder S-Phasen-Arzneimittel (beispielsweise &bgr;-Lapachon), G1-Phasen-Arzneimittel (beispielsweise Lovastatin, Mimosin, Tamoxifen, etc.) und S-Phasen-Arzneimittel (beispielsweise Gemcitabin, 5-FU, MTX, etc.). &bgr;-Lapachon, seine Derivate und Analogen, sind bevorzugter.

Außerdem gehören zu Arzneimitteln, die auf G1- und/oder S-Phasen-Kontrollpunkte abzielen, Derivate von reduziertem &bgr;-Lapachon. Es wurde gezeigt, dass die Reduktion von &bgr;-Lapachon ein wesentlicher Bestandteil der &bgr;-Lapachon-Aktivität ist (siehe J. J. Pink et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 5416–5424). Bevorzugt enthalten Arzneimittel, die auf G1- und/oder S-Phasen-Kontrollpunkte abzielen, außerdem reduziertes &bgr;-Lapachon, d.h. reduzierte &bgr;-Lapachon-Derivate oder Analoge und/oder eine Kombination von &bgr;-Lapachon-Derivaten oder Analogen (Chinin-Form) mit reduzierten &bgr;-Lapachon-Derivaten oder Analogen (Hydrochinon-Form). Am meisten bevorzugt enthält das reduzierte &bgr;-Lapachon, seine Derivate oder Analogen, modifizierte Hydrochinon-Gruppen in dem reduzierten &bgr;-Lapachon wie in Formel Ia gezeigt, worin die R'- und/oder R''-Gruppe(n) in, beispielsweise, Succinate, Aminosäuren, etc. umgewandelt ist (sind).

Zu bevorzugen Verbindungen, die auf den G2/M-Phasen-Kontrollpunkt abzielen, gehören Arzneimittel, die auf Mikrokanälchen abzielen (beispielsweise Taxol, Docetaxel, Vincristin, Vinblastin, Nocodazol, Epothilone, Navelbin, etc.), und Topoisomerase-Gifte (beispielsweise Teniposid, Etoposid, Adriamycin, Camptothecin, Daunorubicin, Dactinomycin, Mitoxantrin, Amsacrin, Epirubicin, Idarubicin, etc.).

Epothilone (Epothilon-polyketide) sind auf Mikrokanälchen abzielende Arzneimittel, die Mikrokanälchen mittels derselben Mechanismen wie Taxol stabilisieren (siehe Litang, et al. (2000) Science 287, 640–642). Die Epothilone sind insofern vorteilhaft, als sie gegen Taxol-resistente Tumore wirksam sind und ausreichend wasserlöslich sind. Die Epothilone A und B sind die in der Natur am häufigsten vorkommenden, und 12,13-Desoxy-epothilon B (Epothilon D) hat den höchsten therapeutischen Index. Epothilone (A, B, C, D oder Gemische davon) können in Kombination mit &bgr;-Lapachon verwendet werden, und dies könnte zu einer synergistischen Induzierung von Apoptose bei malignen Zellen, die ähnlich der Kombination von &bgr;-Lapachon und Taxol ist, wie vorher beschrieben. Für den Zweck dieser Erfindung bezieht sich Epothilon auf die Epothilone A, B, C oder D (Desoxy-Epothilon).

Zu bevorzugten Kombinationen gehören:

&bgr;-Lapachon mit Taxol; &bgr;-Lapachon mit Docetaxel; &bgr;-Lapachon mit Vincristin; &bgr;-Lapachon mit Vinblastin; &bgr;-Lapachon mit Nocodazol; &bgr;-Lapachon mit Teniposid; &bgr;-Lapachon mit Etoposid; &bgr;-Lapachon mit Adriamycin; &bgr;-Lapachon mit Epothilon; &bgr;-Lapachon mit Navelbin; &bgr;-Lapachon mit Camptothecin; &bgr;-Lapachon mit Daunorubicin; &bgr;-Lapachon mit Dactinomycin; &bgr;-Lapachon mit Mitoxantron; &bgr;-Lapachon mit Amsacrin; &bgr;-Lapachon mit Epirubicin; oder &bgr;-Lapachon mit Idarubicin.

Reduziertes &bgr;-Lapachon mit Taxol; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Docetaxel; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Vincristin; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Vinblastin; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Nocodazol; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Teniposid; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Etoposid; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Adriamycin; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Epothilon; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Navelbin; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Camptothecin; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Daunorubicin; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Dactinomycin; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Mitoxantron; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Amsacrin; reduziertes &bgr;-Lapachon mit Eporubicin; oder reduziertes &bgr;-Lapachon mit Idarubicin.

Lovastatin mit Taxol; Lovastatin mit Docetaxel; Lovastatin mit Vincristin; Lovastatin mit Vinblastin; Lovastatin mit Nocodazol; Lovastatin mit Teniposid; Lovastatin mit Etoposid; Lovastatin mit Adriamycin; Lovastatin mit Epothilon; Lovastatin mit Navelbin; Lovastatin mit Camptothecin; Lovastatin mit Daunorubicin; Lovastatin mit Dactinomycin; Lovastatin mit Mitoxantron; Lovastatin mit Amsacrin; Lovastatin mit Epirubicin; oder Lovastatin mit Idarubicin.

Mimosin mit Taxol; Mimosin mit Docetaxel; Mimosin mit Vincristin; Mimosin mit Vinblastin; Mimosin mit Nocodazol; Mimosin mit Teniposid; Mimosin mit Etoposid; Mimosin mit Adriamycin; Mimosin mit Epothilon; Mimosin mit Navelbin; Mimosin mit Camptothecin; Mimosin mit Daunorubicin; Mimosin mit Dactinomycin; Mimosin mit Mitoxantron; Mimosin mit Amsacrin; Mimosin mit Epirubicin; oder Mimosin mit Idarubicin.

Tamoxifen mit Taxol; Tamoxifen mit Docetaxel; Tamoxifen mit Vincristin; Tamoxifen mit Vinblastin; Tamoxifen mit Nocodazol; Tamoxifen mit Teniposid; Tamoxifen mit Etoposid; Tamoxifen mit Adriamycin; Tamoxifen mit Epothilon; Tamoxifen mit Navelbin; Tamoxifen mit Camptothecin; Tamoxifen mit Daunorubicin; Tamoxifen mit Dactinomycin; Tamoxifen mit Mitoxantron; Tamoxifen mit Amsacrin; Tamoxifen mit Epirubicin; oder Tamoxifen mit Idarubicin.

Gemcitabin mit Taxol; Gemcitabin mit Docetaxel; Gemcitabin mit Vincristin; Gemcitabin mit Vinblastin; Gemcitabin mit Nocodazol; Gemcitabin mit Teniposid; Gemcitabin mit Etoposid; Gemcitabin mit Adriamycin; Gemcitabin mit Epothilon; Gemcitabin mit Navelbin; Gemcitabin mit Camptothecin; Gemcitabin mit Daunorubicin; Gemcitabin mit Dactinomycin; Gemcitabin mit Mitoxantron; Gemcitabin mit Amsacrin; Gemcitabin mit Epirubicin; oder Gemcitabin mit Idarubicin.

5-FU mit Taxol; 5-FU mit Docetaxel; 5-FU mit Vincristin; 5-FU mit Vinblastin; 5-FU mit Nocodazol; 5-FU mit Teniposid; 5-FU mit Etoposid; 5-FU mit Adriamycin; 5-FU mit Epothilon; 5-FU mit Navelbin; 5-FU mit Camptothecin; 5-FU mit Daunorubicin; 5-FU mit Dactinomycin; 5-FU mit Mitoxantron; 5-FU mit Amsacrin; 5-FU mit Epirubicin; oder 5-FU mit Idarubicin.

MTX mit Taxol; MTX mit Docetaxel; MTX mit Vincristin; MTX mit Vinblastin; MTX mit Nocodazol; MTX mit Teniposid; MTX mit Etoposid; MTX mit Adriamycin; MTX mit Epothilon; MTX mit Navelbin; MTX mit Camptothecin; MTX mit Daunorubicin; MTX mit Dactinomycin; MTX mit Mitoxantron; MTX mit Amsacrin; MTX mit Epirubicin; oder MTX mit Idarubicin.

Die Kombination der vorliegenden Erfindung führt zu einer überraschenden Synergie, die vorteilhaft ist bei der Verringerung der Tumorbelastungsbürde und/oder beim Zurückentwickeln des Tumorwachstums, insbesondere bei Patienten mit einer metastasierenden Erkrankung.

Bevorzugt sind die zu behandelnden Krebsarten Brust-, Eierstock-, Prostata-, Lungen-, Kolon-Krebs und Melanom. Bevorzugter ist der Krebs Eierstock-Krebs.

Das Arzneimittel kann zur Verabreichung auf eine beliebige in der Technik bekannte Weise angepasst sein. Solche Arten umfassen orale, rektale, nasale, topische (einschließlich buccaler und sublingualer) oder parenterale (einschließlich subkutaner, intramuskulärer, intravenöser und intradermaler) Verabreichung.

Wegen der Einfachheit für den Patienten ist die orale Verabreichung bevorzugt. Typischerweise erfordert jedoch die orale Verabreichung eine höhere Dosis als eine intravenöse Verabreichung. Daher ist es erforderlich, in Abhängigkeit von der Situation – der Fachmann muss feststellen, welche Verabreichungsform in einem bestimmten Fall am besten ist – eine Ausgewogenheit zwischen der benötigten Dosis und der Anzahl an Verabreichungen pro Monat herzustellen.

Bei der Verabreichung der Verbindungen kann man die normale Dosis jeder Verbindung einzeln verwenden. Bevorzugt verwendet man jedoch einen niedrigeren Anteil – typischerweise 75% oder weniger der Einzel-Menge, bevorzugter 50% oder weniger, noch bevorzugter 40% oder weniger.

Die einzelnen Komponenten werden unten detaillierter angesprochen.

Eine bevorzugte Komponente der beschriebenen Kombinationstherapie ist ein Taxan-Derivat. Die Taxane sind eine Familie von Terpenen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Paclitaxel und Docetaxel (Taxotere), die in erster Linie aus der pazifischen Eibe, Taxus brevifoilia, gewonnen wurden, und die Aktivität gegen bestimmte Tumore haben, insbesondere Brust- und Eierstock-Tumore. Paclitaxel ist ein bevorzugtes Taxan. Es wird als ein Mittel gegen Mikrokanälchen betrachtet, das den Aufbau von Mikrokanälchen aus Tubulin-Dimeren fördert und Mikrokanälchen stabilisiert, indem es die Depolymerisierung verhindert. Diese Stabilität führt zur Hemmung der normalen dynamischen Umorganisierung des Mikrokanälchen-Netzwerks, die wesentlich ist für vitale Interphasen- und Mitose-Zellfunktionen. Der Begriff „Paclitaxel" umfasst sowohl natürlich gewonnene und verwandte Formen als auch chemisch synthetisierte Verbindungen oder Derivate davon mit antineoplastischen Eigenschaften, wozu desoxidierte Paclitaxel-Verbindungen wie jene, die in dem US-Patent Nr. 5 440 056 beschrieben sind, und die von Bristol-Myers Oncology als TAXOL® verkauft wird, gehören. Chemische Formeln für Paclitaxel sind bekannt und in dem US-Patent Nr. 5 440 056 offenbart. Zusätzlich zu TAXOL® sind andere Derivate wohlbekannt, z.B. jene, die in „Synthesis and Anticancer Activity of TAXOL®; other Derivatives", D. G. I. Kingston et al., Studies in Organic Chemistry, vol. 26, mit dem Titel „New Trends in Natural Products Chemistry" (1986), Atta-ur-Rahman, P. W. le Queene, Eds. (Elvesier, Amsterdam 1986), Seiten 219–235, erwähnt sind. Noch andere Taxan-Derivate sind in der Technik bekannt und umfassen beispielsweise jene, die in den US-Patenten Nr. 5 773 461; Nr. 5 760 072; Nr. 5 807 888; und Nr. 5 854 278 offenbart sind.

Die G2/M-Verbindung wie das Taxan-Derivat kann in irgendeiner beliebigen Weise, die ein Kliniker geeignet findet, in allgemein akzeptierten wirksamen Dosisbereichen wie jenen, die in Physician Desk Reference, 53. Ausgabe (1999), Publisher Edward R. Barnhart, New Jersey („PDR") für Paclitaxel beschrieben sind, verabreicht werden.

Im Allgemeinen ist die G2/M-Verbindung wie das Taxan-Derivat intravenös in Dosierungen von etwa 135 bis etwa 300 mg/m2, bevorzugt von etwa 135 bis etwa 175 mg/m2, und am meisten bevorzugt etwa 175 mg/m2, zu verabreichen. Es ist bevorzugt, dass die Dosierungen über eine Zeitspanne von etwa 1 bis etwa 24 h, typischerweise über eine Dauer von etwa 3 h, verabreicht werden. Die Dosierungen können 1 bis etwa 4 Wochen lang oder länger, bevorzugt von etwa 2 bis etwa 3 Wochen lang, wiederholt werden.

Das Arzneimittel kann in jeder beliebigen Form verabreicht werden, wie durch Injektion oder durch orale Formen. Beispielsweise wurden Liposom-Formulierungen beschrieben. Siehe z.B. US-Patent 5 424 073.

Wie vorher erwähnt, kann das G2/M-Arzneimittel wie das Taxan-Derivat, bevorzugt Paclitaxel, in einem ähnlichen Bereich mit einem G1- und/oder S-Phasen-Arzneimittel wie &bgr;-Lapachon oder einem Derivat davon verabreicht werden, wenn auch die Mengen gegenüber den normalerweise gegebenen bevorzugt verringert werden. Es ist bevorzugt, dass beispielsweise das Taxan zur gleichen Zeit wie beispielsweise das &bgr;-Lapachon oder nachdem das &bgr;-Lapachon dem Patienten gegeben wurde, verabreicht wird, typischerweise etwa 24 h nachdem das &bgr;-Lapachon verabreicht wurde.

Die andere Komponente der beschriebenen Kombinationstherapie ist &bgr;-Lapachon oder ein Derivat oder Analogon davon.

&bgr;-Lapachon (3,4-Dihydro-s,3-dimethyl-2H-naphthol[1,3-b]pyran-5,6-clon) ist ein einfaches Pflanzenprodukt mit einer chemischen Struktur, die sich von gegenwärtig verwendeten Arzneimitteln gegen Krebs unterscheidet. Es wird durch Schwefelsäure-Behandlung des natürlich vorkommenden Lapachols, das leicht aus der hauptsächlich in Brasilien wachsenden Tabebuia avellanedae isoliert wird, oder es wird einfach aus Lomatiol synthetisiert, das aus Samen der in Australien wachsenden Lomatia isoliert wird, erhalten (Hooker, S., et al., J. Am. Chem. Soc., 58: 1181–1190 (1936); Goncalves de Lima, O., et al., Rev. Inst. Antibiot. Iniv. Recife, 4: 3–17 (1962)).

Es hat sich gezeigt, dass &bgr;-Lapachon eine Vielfalt pharmakologischer Wirkungen hat. &bgr;-Lapachon ist ein Topoisomerase I-Inhibitor, wirkt aber durch einen anderen Mechanismus als Camptothecin (Li, C. J., et al., J. Biol. Chem., 268: 22463–22468 (1993). Zahlreiche &bgr;-Lapachon-Derivate wurden synthetisiert und als Mittel gegen Viren und gegen Parasiten getestet (Goncalves, A. M., et al., Mol. Biochem. Parasitology, 1: 167–176 (1980); Schaffner-Sabba, K., et al., J. Med. Chem., 27: 990–994 (1984); Li, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1842 (1993)). &bgr;-Lapachon und seine Derivate, z.B. 3-Allyl-&bgr;-lapachon, zeigen Wirkung gegen Trypanosomen (Goncalves, A. M., et al., supra), wobei der Mechanismus unklar ist. Es wurde auch gezeigt, dass &bgr;-Lapachon ein DNA-Reparatur-Inhibitor ist, der Zellen für DNA-schädigende Mittel sensibilisiert (Boorstein, R. J., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 118: 828–834, (1984); Boothman, D. A., et al., J. Cancer Res., 49: 605–612 (1989)). &bgr;-Lapachon wird von Hunden, Ratten, Mäusen und Hühnern gut vertragen. Die maximale Toleranzdosis, wenn es einen Monat lang täglich p.o. gegeben wird, ist 200 mg/kg bei Ratten und 100 mg/kg bei Hunden. Höhere Dosierungen verursachen Magengeschwürbildung und Verlust von Enthrozyten, aber keine Anzeichen für Knochenmark-Suppression (Ciba-Geigy, persönliche Mitteilung).

&bgr;-Lapachon-Derivate und Analoge sind auf ihrem Gebiet bekannt und werden beispielsweise in USP 5 828 700; WO97/08162; und USP 5 703 625 offenbart. Bevorzugte Derivate und Analogen umfassen Verbindungen der folgenden Formeln I und II. worin R und R1 jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Hydroxy, Thio (SH), Halogen (z.B. Fluor, Chlor und Brom), substituiertem und unsubstituiertem Aryl, substituiertem und unsubstituiertem Alkenyl, substituiertem und unsubstituiertem Alkyl und substituiertem und unsubstituiertem Alkoxy, und Salzen davon besteht, wobei die gestrichelte Doppelbindung zwischen den Ring-Kohlenstoffatomen, an die R und R1 gebunden sind, eine optionale Ring-Doppelbindung repräsentiert. Die Alkyl-Gruppen haben bevorzugt von 1 bis etwa 15 Kohlenstoffatome, bevorzugter von 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatome, noch bevorzugter von 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome. Der Begriff Alkyl, wie er hierin verwendet wird, betrifft, wenn er nicht anders modifiziert wird, sowohl cyclische als auch nicht-cyclische Gruppen, obwohl cyclische Gruppen natürlich mindestens drei Kohlenstoff-Ringglieder haben. Geradkettige oder verzweigtkettige nicht-cyclische Alkyl-Gruppen sind im Allgemeinen bevorzugter als cyclische Gruppen. Geradkettige Alkyl-Gruppen sind im Allgemeinen bevorzugter als verzweigte. Die Alkenyl-Gruppen haben bevorzugt von 2 bis 15 Kohlenstoffatome, bevorzugter von 2 bis etwa 10 Kohlenstoffatome, noch bevorzugter von 2 bis etwa 6 Kohlenstoffatome. Besonders bevorzugte Alkenyl-Gruppen haben 3 Kohlenstoffatome (d.h. 1-Propenyl oder 2-Propenyl), wobei die Allyl-Baueinheit besonders bevorzugt ist. Phenyl und Naphthyl sind allgemein bevorzugte Aryl-Gruppen. Alkoxy-Gruppen umfassen jene Alkoxy-Gruppen mit einer oder mehreren Sauerstoff-Bindungen und haben bevorzugt von 1 bis 15 Kohlenstoffatome, bevorzugter von 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome. Die substituierten Gruppen R und R-1 können an einer oder mehreren verfügbaren Positionen durch eine oder mehrere geeignete Gruppen substituiert sein, wie beispielsweise durch Alkyl-Gruppen wie Alkyl-Gruppen mit von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, durch Alkenyl-Gruppen wie Alkenyl-Gruppen mit von 2 bis 10 Kohlenstoffatomen oder 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, durch Aryl-Gruppen mit von 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, durch Halogen wie Fluor, Chlor und Brom, und durch N, O und S, einschließlich Heteroalkyl, z.B. Heteroalkyl mit einer oder mehreren der Heteroatom-Bindungen (und wozu daher Alkoxy, Aminoalkyl und Thioalkyl gehören) und von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

Verbindungen der Formeln I und II können leicht hergestellt oder erhalten werden. (Siehe Pardee, A., et al., Cancer Research, 49, 1–8 (1989); Schaffner-Sabba, K., et al., Journal of Medicinal Chemistry, 27, Nr. 8 990–994 (1984); S. Hooker, 58, 1181–1197 (1936)).

Bevorzugte Verbindungen der Formel I umfassen &bgr;-Lapachon, 3-Allyl-&bgr;-Lapachon, 3-Brom-&bgr;-Lapachon und 3-OH-&bgr;-Lapachon. 3-Allyl-&bgr;-Lapachon und 3-Brom-&bgr;-Lapachon sind bevorzugter.

Bevorzugte Verbindungen der Formel II umfassen 3-Brom-&agr;-Lapachon.

&bgr;-Lapachon-Analoge der Formel III, wie unten dargelegt ist, können ebenfalls in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. worin R (CH2)n-R1 ist, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist und R1 Wasserstoff, eine Alkyl-, eine Aryl-, eine heteroaromatische, eine heterocyclische, eine aliphatische, eine Alkoxy-, eine Hydroxy-, eine Amin-, eine Thiol-, eine Amid-, oder eine Halogen-Seitengruppe ist.

Bevorzugte Analogen der Formel III umfassen 3-Ethoxycarbonylmethyl-&bgr;-lapachon, 3-(2'-Hydroxyethyl-&bgr;-lapachon, 3-Methyl-&bgr;-lapachon, 3-(2'-Aminoethyl)-&bgr;-lapachon, 3-Methoxy-&bgr;-lapachon, 3-Benzyloxy-&bgr;-lapachon, 3-Ethoxycarbonylmethoxy-&bgr;-lapachon und 3-Allyloxy-&bgr;-lapachon.

Analogen der Formel III können nach den in USP 5 763 625 offenbarten Verfahren hergestellt werden.

&bgr;-Lapachon-Derivate der Formel IV und V, die unten dargelegt sind, können darüber hinaus in den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. worin R1-R6 jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus H, C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkenyl, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Alkoxycarbonyl, --(CH2)n-Aryl, (CH2)n-Heteroaryl, --(CH2)n-Heterocyclus und --(CH2)n-Phenyl besteht; oder R1 und R2 zusammen ein einziger Substituent sind, der aus der obigen Gruppe ausgewählt ist, und R3 und R4 zusammen ein einziger Substituent sind, der aus der obigen Gruppe ausgewählt ist, in welchem Fall -- eine Doppelbindung ist; und R7 H, OH, C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkenyl, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Alkoxycarbonyl, --(CH2)n-Amino, -(CH2)n-Aryl, --(CH2)n-Heteroaryl, --(CH2)n-Hetrocyclus oder -(CH2)n-Phenyl ist, wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist.

Bevorzugte Analogen der Formeln IV und V umfassen 3-(-&bgr;-Alanyl)-&bgr;-lapachon und 3-Malonyl-&bgr;-lapachon.

Analogen der Formeln IV und V können nach den in USP 5 824 700 offenbarten Verfahren hergestellt werden.

Unter den hier beschriebenen Kombinationstherapien wird &bgr;-Lapachon oder ein Derivat oder Analoges davon einem Patienten in mindestens einer Dosis in dem Bereich von 10 bis 500.000 &mgr;g pro kg Körpergewicht des Empfängers pro Tag, bevorzugter in dem Bereich von 1.000 bis 50.000 &mgr;g pro kg Körpergewicht pro Tag, am meisten bevorzugt in dem Bereich von 5.000 bis 25.000 &mgr;g pro kg Körpergewicht pro Tag, verabreicht. Die gewünschte Dosis wird geeigneterweise einmal verabreicht, oder es werden mehrere Sub-Dosen in geeigneten Intervallen im Laufe des Tages verabreicht, oder ein anderes geeignetes Schema. Diese Sub-Dosen können als Einheitsdosierungsformen, die beispielsweise 1 bis 20.000 &mgr;g, bevorzugt 10 bis 10.000 &mgr;g, pro Einheitsdosierungsform enthalten, verabreicht werden.

Wie bei der Verwendung von anderen chemotherapeutischen Arzneimitteln wird der einzelne Patient in einer Weise überwacht, die von dem behandelnden Arzt für geeignet erachtet wird. Typischerweise finden keine zusätzlichen Arzneimittelbehandlungen statt, bis, beispielsweise, die Neutrophilenzahl des Patienten mindestens 1.500 Zellen/mm3 beträgt. Die Dosierungen können auch verringert werden, wenn eine schwere Neutropenie oder eine schwere periphere Neuropathie auftritt, oder wenn eine Schleimhautentzündung zweiten Grades oder einer größeren Stärke beobachtet wird, wobei die allgemeinen Toxizitätskriterien des nationalen Krebsinstituts angewendet werden.

Die hier beschriebenen Kombinationstherapie-Mittel können einzeln oder in einem Cocktail, der beide Mittel oder eines der Mittel mit anderen therapeutischen Mitteln, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, immunsuppressive Mittel, Verstärker und Nebenwirkungen verringernde Mittel, enthält, verabreicht werden. Wie vorher gesagt, ist die therapeutische Kombination, wenn sie sequenziell verabreicht wird, wirksamer, wenn die &bgr;-Lapachon-Komponente vor dem Taxan-Derivat verabreicht wird. Die therapeutischen Mittel werden bevorzugt intravenös oder in anderer Weise systemisch durch intramuskuläre, subkutane, intrathekale oder intraperitoneale Injektion verabreicht.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung, die in Kombination zu finden sind, können in der Dosierungsform eines Feststoffs, eines Halb-Feststoffs oder einer Flüssigkeit, wie z.B. Suspensionen, Aerosole oder dergleichen, sein. Bevorzugt werden die Zusammensetzungen in Einheitsdosierungsformen, die für eine einzige Verabreichung präziser Dosierungsmengen geeignet sind, verabreicht. Die Zusammensetzungen können auch, abhängig von der gewünschten Formulierung, pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Träger oder Verdünnungsmittel, die als Vehikel definiert sind, die üblicherweise verwendet werden, um pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verabreichung an Tiere oder Menschen zu formulieren, enthalten. Das Verdünnungsmittel wird so ausgewählt, dass es die biologische Aktivität der Kombination nicht beeinträchtigt. Beispiele für solche Verdünnungsmittel sind destilliertes Wasser, physiologische Salzlösung, Ringers Lösung, Dextrose-Lösung und Hanks-Lösung. Zusätzlich kann die pharmazeutische Zusammensetzung oder Formulierung auch andere Träger, Hilfsstoffe oder nicht-toxische, nicht-therapeutische, nicht-immunogene Stabilisatoren und dergleichen enthalten. Wirksame Mengen eines derartigen Verdünnungsmittels oder Trägers sind jene Mengen, die wirksam sind, eine bezüglich der Löslichkeit der Komponenten oder bezüglich der biologischen Aktivität und dergleichen pharmazeutisch annehmbare Formulierung zu erhalten.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfassen die hierin beschriebenen G1- und/oder S-Phasen-Verbindungen, Derivate oder Analogen und G2/M-Verbindungen, Derivate oder Analogen ihre pharmakologisch annehmbaren Salze, bevorzugt Natrium; Analogen, die Halogen-Substitutionen enthalten, bevorzugt Chlor oder Fluor; Analogen, die Ammoniumsalze oder substituierte Ammoniumsalze enthalten, bevorzugt sekundäre oder tertiäre Ammoniumsalze; Analogen, die Alkyl, Alkenyl; Aryl oder ihre Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, Halogen-, Alkoxy-, Alkenyloxy-substituierten Derivate, bevorzugt Methyl, Methoxy, Ethoxy, oder Phenylacetat enthalten; und natürliche Analogen wie Naphthylacetat. Außerdem können die hierin beschriebenen G- und/oder S-Phasen-Verbindungen, Derivate oder Analogen und G2/M-Verbindungen, Derivate oder Analogen an wasserlösliche Polymere konjugiert sein oder mit wasserlöslichen Chelatbildnern oder Radionucliden derivatisiert sein. Beispiele für wasserlösliche Polymere sind, aber ohne darauf beschränkt zu sein: Polyglutaminsäure-Polymer, Copolymere mit Polycaprolacton, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, Polyacrylsäure, Poly(2-Hydroxyethyl-1-glutamin), Carboxymethyl-dextran, Hyaluronsäure, menschliches Serumalbumin, Polyalginsäure oder eine Kombination davon. Beispiele für wasserlösliche Chelatbildner sind, ohne darauf beschränkt zu sein: DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure), EDTA, DTTP, DOTA oder ihre wasserlöslichen Salze, etc. Beispiele für Radionuclide sind, aber ohne darauf beschränkt zu sein: 111In, 90Y, 166Ho, 68Ga, 99mTc, etc.

Bei therapeutischen Anwendungen variieren die Dosierungen der erfindungsgemäß verwendeten Mittel in Abhängigkeit von, unter anderen die gewählte Dosierung beeinflussenden Faktoren, dem Alter, Gewicht und klinischen Zustand des Empfängerpatienen, und der Erfahrung und Beurteilung des Klinikers oder Praktikers, der die Therapie verabreicht. Allgemein sollte die Dosis ausreichend sein, um zu einer Verlangsamung, und bevorzugt Rückbildung, des Wachstums der Tumore zu führen, und auch bevorzugt eine vollständige Rückbildung des Krebses bewirken. Eine wirksame Menge eines pharmazeutischen Mittels ist diejenige, die eine objektiv feststellbare Verbesserung, wie von dem Kliniker oder einem anderen qualifizierten Beobachter bemerkt, schafft. Die Rückbildung eines Tumors bei einem Patienten wird typischerweise unter Bezugnahme auf den Durchmesser eines Tumors gemessen. Eine Verringerung des Durchmessers eines Tumors zeigt eine Rückbildung an. Eine Rückbildung wird auch dadurch angezeigt, dass Tumore nicht wieder auftreten, nachdem die Behandlung beendet wurde.

Diese Erfindung umfasst außerdem pharmazeutische Kombinationen, die ein Taxan-Derivat und eine Dosis &bgr;-Lapachon oder eines Derivats oder Analogen davon, wie oben vorgesehen, aufweisen, und Kits zur Behandlung von Krebspatienten, die eine Ampulle des Taxan-Derivats und eine Ampulle &bgr;-Lapachon oder eines Derivats oder Analogen davon in den oben vorgesehenen Dosen aufweisen. Bevorzugt enthält der Kit Anweisungen, die ihre Verwendung in Kombination beschreiben.

Es versteht sich, dass die vorstehende genaue Beschreibung und die folgenden Beispiele nur veranschaulichend sind und nicht als Beschränkungen der Erfindung zu betrachten sind.

BEISPIELE In Vivo-Tests Experiment 1

Kurze Beschreibung des Tumormodells (Cannistra-Modell, Cannistra, et al., Cancer Res., 57: 1228–1232 (1997) – Eierstock-Krebs ist eine hochgradig letale Erkrankung. Metastasen treten vorwiegend durch weit verbreitete Implantation überall in der Bauchhöhle auf. Um die Wirksamkeit von &bgr;-Lapachon alleine und in Kombination mit TAXOL® zu testen, verwendeten wir menschliche Eierstock-Krebszellen (36M2), die ursprünglich von einem Patienten mit maligner Bauchwassersucht stammten. Eine Inokulation dieser Zellen in weibliche Nacktmäuse rekapituliert den metastatischen Prozess, wie er bei Patienten beobachtet wird. Dies ist ein hochgradig metastasierendes und malignes Krebszellenmodell. Im Allgemeinen entwickeln sich Tumorknötchen auf dem Bauchfell und maligner Aszites 4 bis 5 Wochen nach einer Inokulation von 10 × 106 Zellen. Metastasierende Herde sind ab einer Woche nach der Inokulation zu sehen.

Tiere – In allen Experimenten wurden athymische weibliche Nacktmäuse (nu/nu) verwendet.

Arzneimittel – &bgr;-Lapachon wurde unter Verwendung von Lipidol, einem klinisch verwendeten Trägermittel, zu einer Lösung formuliert. Unser Erfolg mit diesem Formulierungsmittel (Lipidol) löste das seit langem bestehende Problem der Unlöslichkeit von &bgr;-Lapachon.

Alternativ finden wir auch, dass &bgr;-Lapachon in Cremophor plus Ethanol [2(Cremophor):1(Ethanol)] formuliert werden kann. Eine Lösung von 20 mg/ml kann bei Raumtemperatur hergestellt werden.

Eine formulierte TAXOL®-Lösung (Ciba-Geigy) (Standard zur Patienten-Verwendung) wurde aus der Apotheke erworben und für das Maus-Experiment mit Lipidol (Sumitome Pharmaceuticals, Osaka) verdünnt.

Sowohl &bgr;-Lapachon als auch die TAXOL®-Lösung können entweder intraperitoneal oder intravenös verabreicht werden. Für beide Arzneimittel wurden intraperitoneale Wege verwendet. Es wurde eine Lipidol-Formulierung von &bgr;-Lapachon verwendet.

Aufbau der Tierversuche:

Sechs Mäuse pro Gruppe.

Gruppe 1, behandelt mit Kontrollvehiculum (wie in Gruppe 4);

Gruppe 2, behandelt mit &bgr;-Lapachon mit 50 mg/kg;

Gruppe 3, behandelt mit TAXOL® mit 0,1 mg/kg;

Gruppe 4, zuerst &bgr;-Lapachon mit 50 mg/kg, gefolgt von TAXOL® mit 0,1 mg/kg am nächsten Tag. Wiederholung des Zyklus nach zwei Tagen.

Alle Behandlungen wurden eine Woche nach der Tumor-Inokulation begonnen. Die Mäuse wurden insgesamt 10 Zyklen lang behandelt und wurden 2 Wochen (am 50. Tag) nach dem Absetzen der Arzneimittelbehandlung zwecks Tumorknötchenzählung geopfert.

Bei der Opferung wurde die Aktivität gegen Tumore in jeder Gruppe durch Zählen der Anzahl an Tumorknötchen in der Peritonealhöhle, Messen des Durchmessers der Tumore, Messen des Volumens des Aszites, und durch qualitative Betrachtung der Farbe der Peritonealwand als ein Hinweis auf das Ausmaß der Tumor-induzierten Vaskularisierung untersucht.

Die Toxizität wurde durch qualitative Beobachtung des allgemeinen Aussehens und Verhaltens der Mäuse vor der Opferung und durch Messen ihres Körpergewichts in verschiedenen Intervallen während des Verlaufs der Behandlungen untersucht.

Die Ergebnisse dieses Experiments sind in den 1A und 1B dargelegt. Wie zu sehen ist, verringerte die Kombination von &bgr;-Lapachon und TAXOL® die Anzahl an Tumor-Implantaten im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe und den mit jedem Mittel alleine behandelten Gruppen dramatisch. Es wurde keine Toxizität beobachtet.

Experiment 2

Tumormodelle und Arzneimittel-Formulierung waren identisch mit Experiment 1. Wieder wurden 6 Mäuse für jede Gruppe verwendet. Beim experimentellen Aufbau gibt es die folgenden Abwandlungen: 1) Die TAXOL®-Dosis wurde um das Zehnfache erhöht; 2) Die Mäuse wurden 4 Wochen lang nach dem Einstellen der Arzneimittel-Behandlung beobachtet.

Gruppe 1, behandelt mit Kontrollvehiculum (wie in Gruppe 4);

Gruppe 2, behandelt mit &bgr;-Lapachon mit 50 mg/kg;

Gruppe 3, behandelt mit TAXOL® mit 1 mg/kg;

Gruppe 4, zuerst &bgr;-Lapachon mit 50 mg/kg, gefolgt von TAXOL® 1 mg/kg am nächsten Tag. Der Zyklus wurde nach zwei Tagen wiederholt.

Alle Behandlungen wurden eine Woche nach der Tumor-Inokulation begonnen. Die Mäuse wurden insgesamt 10 Zyklen lang behandelt und wurden am 62. Tag zur Tumor-Zählung geopfert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in den 2A und 2B dargelegt. Wie bei Experiment 1 verringerte die Kombination von &bgr;-Lapachon und TAXOL® die Anzahl an Tumor-Implantaten im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe und den mit jedem Mittel alleine behandelten Gruppen dramatisch. Es wurde keine Toxizität beobachtet.

Die 3 bis 6 stellen die in jeder Gruppe zu sehenden Ergebnisse visuell dar. In den 3 bis 5 ist der Peritonealüberzug rot (Farbe nicht gezeigt), was ein durch einen Tumor stimuliertes Blutgefä&bgr;-Wachstum oder eine durch einen Tumor stimulierte Angiogenese anzeigt.

Die unbehandelten Säugetiere enthalten Hunderte von Tumorknötchen. Einige der Knötchen haben sich miteinander verschmolzen und bildeten große Tumormassen (3).

Sowohl die Behandlung mit &bgr;-Lapachon (4) als auch die Behandlung mit TAXOL® (5) führte zu einem Weniger-Werden der Tumore. Das Fleisch in beiden Bereichen war jedoch noch rot, was signalisierte, dass eine mit den Tumoren im Zusammenhang stehende beträchtliche Angiogenese noch weiterging. In beiden mit einzelnen therapeutischen Segmenten behandelten Gruppen gab es noch mehrere Tumorknötchen.

In der die Kombinationstherapie erhaltenden Gruppe ist die Farbe des Fleisches nicht länger hellrot, sondern ähnlich derjenigen, die man bei gesunden Mäusen sieht (6). Dies zeigt an, dass die Tumor-induzierte Angiogenese, die in den Gruppen mit Einzelbehandlung zu sehen ist, beträchtlich gehemmt ist oder nicht auftritt. Ein oder zwei kleine Knötchen wurden visuell beobachtet, sind aber in der fotografischen Aufnahme nicht sichtbar.

Experiment 3

Starke Hemmung des Prostata-Tumorwachstums in vivo durch &bgr;-Lapachon und TAXOL®. Männliche SCID (ICR)-Mäuse wurden mit Androgen-unabhängigen menschlichen Prostata-Krebszellen (DU145; 8 × 106 s.c.) inokuliert. Die Verabreichung von Arzneimitteln wurde begonnen, wenn die Tumorknötchen einen Durchmesser von 0,5 cm erreichten. In diesem Experiment wurden vier Mäuse pro Gruppe verwendet. Die Kontrollgruppe (7A) wurde mit Vehiculum alleine behandelt. Die Gruppe mit &bgr;-Lapachon alleine wurde mit 50 mg/kg i.p. behandelt, und die Gruppe mit Taxol alleine wurde mit 1 mg/kg i.p. behandelt, 24 h später gefolgt von i.p. Injektion von Vehiculum. In der Kombinationsgruppe (7B) wurden die Mäuse mit &bgr;-Lapachon alleine behandelt, 24 h später gefolgt von Taxol mit 1 mg/kg. Es gab eine Unterbrechung von einem Tag zwischen jedem Zyklus. Die Mäuse wurden insgesamt 6 Zyklen lang behandelt. Bilder wurden 3 Wochen nach 6 Behandlungszyklen aufgenommen.

In einem vorausgehenden Experiment mit 4 Mäusen pro Gruppe wurden Androgen-unabhängige DU145-Prostata-Krebszellen in abwehrgeschwächte Mäuse xenotransplantiert (7A). Wiederum wurde, um die Stringenz zu erhöhen, und anders als bei den meisten Antitumor-Experimenten, die Behandlung verzögert, bis die Tumore ~0,5 cm Durchmesser erreichten. Sowohl &bgr;-Lapachon als auch Taxol alleine zeigten eine mäßige Hemmung des Tumorwachstums (Daten nicht gezeigt). &bgr;-Lapachon plus Taxol zeigte eine dramatische Aktivität gegen Tumoren (7B). Außerdem wuchsen Tumore bei den behandelten Mäusen nicht zurück, wie bei der Nachsorge 5 Wochen nach der Behandlung festgestellt wurde.

Experiment 4

Zellkulturen. Alle in dieser Studie verwendeten Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection erhalten, wenn nichts anderes angegeben ist. Die Zellen wurden bei 37°C in 5% CO2 in völliger Feuchtigkeit gehalten. Die menschlichen Brustkrebs-Zelllinien MCF-7, 21 MT, 21 PT und 21 NT (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von R. Sager, Dana-Farber Cancer Institute) wurden in MEM-&agr; (Liffe Technologies, Grand Island, NY), ergänzt mit 10% (vol/vol)) FCS, 2 mM L-Glutamin und 1 mg/ml Insulin, kultiviert. Die menschlichen Eierstockcarcinom-Zelllinien AD2780s und AD2780DDP, eine großzügige Gabe von K. J. Scanlon (City of Hope Medical Center, Duarte, CA); die menschlichen Kolon-Adenocarcinom-Zelllinien SW1116, HT-29 und DLD; die menschliche Lungencarcinom-Zelllinie G480; die menschliche Melanom-Zelllinie SkmeI-28, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von G. Dranoff (Dana-Farber Cancer Institute); und die menschlichen Prostatatumor-Zelllinien PC-3, DU145 und LNCaP wurden in DMEM (Life Technologies), ergänzt mit 10% (vol/vol) FCS und 2 mM L-Glutamin, kultiviert. Die menschliche Pancreaskrebs-Zelllinie ASPC-1 wurde in RPMI-Medium 1640, ergänzt mit 20% (vol/vol) FCS, kultiviert.

Koloniebildungs-Assay. Exponentiell wachsende Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen mit 1.000 Zellen pro Vertiefung angesetzt und 48 h lang anhaften lassen. Die Arzneimittel wurden in weniger als 5 &mgr;l konzentrierter Lösung (entsprechend einer End-DMSO-Konzentration von weniger als 0,1%) direkt zu den Schalen gegeben. Die Kontrollplatten erhielten dasselbe Volumen an DMSO alleine. Nach 1 bis 4 h wurden die Zellen gespült, und es wurde frisches Medium zugegeben. Die Kulturen wurden 10 bis 20 Tage lang täglich betrachtet, und dann wurden sie fixiert und mit modifiziertem Wright-Giemsa-Farbstoff (Sigma) gefärbt. Kolonien mit mehr als 30 Zellen wurden als Überlebende gezählt.

Zelltod-Assay. Der Zelltod wurde durch den MTT (Thiazolylblau)-Assay oder durch Trypanblau-Ausschluss, wie angegeben, bestimmt. In Kürze, die Zellen wurden in einer Platte mit 96 Vertiefungen mit 10.000 Zellen pro Vertiefung aufgetragen, 48 h lang in einem vollständigen Wachstumsmedium kultiviert, dann 4 h lang mit &bgr;-Lapachon behandelt, und 24 h lang mit arzneimittelfreiem Medium kultiviert. Zu dem Kulturmedium wurde MTT-Lösung zugegeben, und nach 2 h wurde die optische Dichte mit einem ELISA-Lesegerät abgelesen. Für den Trypanblau-Exklusions-Assay wurden die Zellen in derselben Weise kultiviert und behandelt. Sie wurden geerntet, und Trypanblau-Farbstoff-Lösung wurde zu der Zellsuspension zugegeben. Die Zahl an Zellen insgesamt und die Zahl lebensfähiger Zellen wurde mit einem Hämozytometer bestimmt.

Apoptose-Assays. Apoptose wurde durch drei unabhängige Assays bestimmt. Einer bestimmte die Sub-G1-Fraktion von mit Propidiumiodid gefärbten Kernen, wie beschrieben [Li, Y.-Z, et al. Mol. Med. 5: 232–239 (1999); Li, C. J., et al., Science 268: 429–431 (1995); Li, C. J., et al., Cancer Res. 55: 3712–3715 (1995)]. Der Annexin-Assay maß die Membranveränderungen, bestimmt durch die Externalisierung von Phosphatidylerin (Fadok, V. A., et al., J. Immunol. 148: 2207–2216 (1992)). Der dritte Assay, die Analyse der DNA-Leiter, wurde ausgeführt wie von Li, Y.-Z, supra beschrieben.

Synergistische Einleitung des Zelltods durch &bgr;-Lapachon und Taxol. Die Koloniebildung wurde wie oben beschrieben ausgeführt. In einem typischen Experiment wurden die Kontrollzellen DU145 in Vertiefung 1 an den Tagen 1 und 2 mit Lösungsmittel behandelt. Die Zellen in Vertiefung 2 wurden am Tag 1 4 h lang mit 4 &mgr;M &bgr;-Lapachon behandelt, 20 h lang in Arzneimittel-freiem Medium inkubiert, und dann am Tag 2 mit Lösungsmittel-Kontrolle behandelt. Vertiefung 3 mit Taxol alleine wurde am Tag 1 4 h lang mit Lösungsmittel-Kontrolle behandelt und am Tag 2 4 h lang mit 0,02 &mgr;M Taxol behandelt. Die Zellen in Vertiefung 4 wurden am Tag 1 mit &bgr;-Lapachon und am Tag 2 mit Taxol behandelt. In Vertiefung 5 wurden die Zellen am Tag 1 mit Taxol und am Tag 2 mit &bgr;-Lapachon behandelt. In Vertiefung 6 wurden die Zellen am Tag 2 mit &bgr;-Lapachon und Taxol behandelt.

Synergismus der Arzneimittel-Kombination. Die Koloniebildung von DU145-Zellen in der Kontrollschale (Vertiefung 1) wurde aufgehoben, wenn sowohl Taxol als auch &bgr;-Lapachon angewendet wurden. Sie nahm nur teilweise ab, wenn Taxol alleine (Vertiefung 2) oder &bgr;-Lapachon alleine (Vertiefung 3) angewendet wurden. Um zu bestimmen, ob die Reihenfolge des Arzneimittel-Zusatzes diesen beobachteten wirkungsvollen Synergismus der Zellen-Abtötung beeinflusst, variierten wir das Behandlungsschema. Ein ähnlicher Synergismus wurde beobachtet, wenn die Zellen mit Taxol und &bgr;-Lapachon gleichzeitig (Vertiefung 6) oder mit &bgr;-Lapachon, gefolgt von Taxol (Vertiefung 4), behandelt wurden. Kein Synergismus wurde beobachtet, wenn Taxol vor der &bgr;-Lapachon-Behandlung zugegeben wurde (Vertiefung 5). Diese Schema-Abhängigkeit wurde bei allen Zelllinien beobachtet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Reihenfolge der künstlichen Kontrollpunkt-Ausnutzung für den Synergismus-Mechanismus wichtig ist.

Abtragung von in vitro-Kolonien bei einem breiten Spektrum menschlicher Karzinomzellen durch die Kombination von &bgr;-Lapachon und Taxol. Menschliche Karzinom-Zelllinien unterschiedlicher histologischer Typen wurden verwendet, um das Überleben von Zellen in dem Koloniebildungs-Assay zu bestimmen (Tabelle 2). Die Kombination von &bgr;-Lapachon und Taxol verringerte das Überleben von Zellen bei einer Vielfalt menschlicher Krebszellen, einschließlich Eierstock-, Brust-, Prostata-, Melanom-, Lungen- und Pankreas-Krebszelllinien, dramatisch. &bgr;-Lapachon oder Taxol alleine bei den verwendeten Konzentrationen waren viel weniger wirksam bei der Verringerung der Krebszellen-Koloniebildung. Dieses verringerte Überleben von Zellen wurde durch eine Einleitung des Zelltods erzielt, wie bestimmt durch den MTT (Thiazolylblau)- und den Trypanblau-Assay. Der Zelltod erfolgte durch Apoptose, wie bestimmt durch DNA-Leiterbildung und durch Annexin-Färbung (Daten nicht gezeigt). Taxol war in Anwesenheit von &bgr;-Lapachon mindestens zehnfach wirksamer, wie gemessen durch IC50 (Daten nicht gezeigt).

Die Zellen wurden 4 h lang mit &bgr;-Lapachon und/oder Taxol in den folgenden Konzentrationen behandelt: A2780DDP, 2 &mgr;M &bgr;-Lapachon und/oder 0,2 &mgr;M Taxol; MCF-7 und 21-MT, 4 &mgr;M &bgr;-Lapachon und/oder 0,1 &mgr;M Taxol; HT-29, 4 &mgr;M &bgr;-Lapachon; G480, 4 &mgr;M &bgr;-Lapachon und/oder 0,2 &mgr;M Taxol; DU145, 4 &mgr;M &bgr;-Lapachon und/oder 0,2% &mgr;M Taxol. Die Anzahl an Kolonien in der Kontrollvertiefung wurde als 100% Überleben hergenommen. Die behandelten Vertiefungen werden als Prozentsatz der Kontrolle vorgestellt. Die Daten sind als Durchschnitt (+SEM) aus drei unabhängigen Experimenten angegeben.


Anspruch[de]
Verwendung einer wirksamen Menge einer ersten Verbindung, aufweisend &bgr;-Lapachon oder Derivate davon als wirksamer Bestandteil, und einer wirksamen Menge eines Taxan-Derivats zur Herstellung eines Arzneimittels oder von Arzneimitteln zur Behandlung eines Säugetiers mit einem soliden Tumor (oder mit soliden Tumoren). Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Taxan-Derivat Paclitaxel ist. Verwendung einer wirksamen Menge einer ersten Verbindung, aufweisend &bgr;-Lapachon oder Derivate davon als wirksamer Bestandteil zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers mit einem soliden Tumor (oder mit soliden Tumoren), wobei das Verfahren ein Verabreichen eines Taxan-Derivats an das Säugetier nach Verabreichen des Arzneimittels aufweist. Verwendung einer wirksamen Menge einer ersten Verbindung, aufweisend &bgr;-Lapachon oder Derivate davon als wirksamer Bestandteil zur Herstellung eines Arzneimittels, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers mit einem soliden Tumor (oder mit soliden Tumoren), wobei das Verfahren ein Verabreichen eines Taxan-Derivats an das Säugetier innerhalb von 24 h nach Verabreichen des Arzneimittels aufweist. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Taxan-Derivat Paclitaxel ist. Verwendung nach Anspruch 5; wobei das Paclitaxel intravenös verabreicht wird. Kit zur Behandlung eines Säugetier-Tumors, aufweisend separate Gefäße, welche ein &bgr;-Lapachon oder ein Derivat oder Analogon davon und ein Taxan-Derivat enthalten. Kit nach Anspruch 7, aufweisend Anweisungen, dass &bgr;-Lapachon zuerst verabreicht wird. Kit nach Anspruch 7, wobei das Taxan-Derivat Paclitaxel ist. Pharmazeutische Zusammensetzung, aufweisend &bgr;-Lapachon oder ein Derivat oder Analogon davon und ein Taxan-Derivat und ein pharmazeutisch annehmbares Trägermittel. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Taxan-Derivat Paclitaxel ist. Verwendung nach Anspruch 1, 3 oder 4 oder Kit nach Anspruch 7 oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Taxan-Derivat Docetaxel ist.






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