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Dokumentenidentifikation DE102006055558A1 31.05.2007
Titel Endotoxinadsorber und Verfahren zur Entfernung von Endotoxin unter dessen Verwendung
Anmelder Chisso Corp., Osaka, JP
Erfinder Nakayama, Minoru, Minamata, Kumamoto, JP;
Todokoro, Masami, Tokyo, JP
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Anmeldedatum 24.11.2006
DE-Aktenzeichen 102006055558
Offenlegungstag 31.05.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 31.05.2007
IPC-Hauptklasse B01J 20/26(2006.01)A, F, I, 20061124, B, H, DE
IPC-Nebenklasse C08B 37/00(2006.01)A, L, I, 20061124, B, H, DE   C08B 37/10(2006.01)A, L, I, 20061124, B, H, DE   
Zusammenfassung Diese Erfindung gibt ein Verfahren zum Selektieren und selektiven Eliminieren von Endotoxin von einer Lösung, bei der eine sehr saure Substanz wie Heparin koexistiert, und einen hierfür verwendeten Adsorber an.
Diese Erfindung gibt ebenfalls ein Verfahren zur Erzeugung eines Endotoxinadsorbers an, umfassend das teilweise Modifizieren von Aminogruppen, die innerhalb eines aminogruppenhaltigen Moleküls enthalten sind, das als Ligand des Endotoxinadsorbers verwendet wird, mit einem Molekül, das mit einer Aminogruppe reagieren kann.

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Diese Erfindung betrifft einen Endotoxinadsorber und ein Verfahren zur Entfernung von Endotoxin unter dessen Verwendung. Mehr spezifisch betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum selektiven Adsorbieren von Endotoxin aus einer Lösung, bei der eine Substanz koexistiert, die eine hohe Acidität aufweist, wie Heparin.

Stand der Technik

Ein Endotoxin ist eine toxische Substanz, die in bakteriellen Körperkomponenten von Bakterien vorhanden ist und beim Töten von Bakterien freigesetzt wird. Eine Strukturkomponente von Endotoxin ist Lipopolysaccharid, das im Inneren der bakteriellen Körper durch Bakterien erzeugt wird, die während des Produktionsverfahrens eines medizinischen Arzneimittelprodukts leben und das medizinische Arzneimittelprodukt kontaminieren, wenn die Bakterien getötet werden. Adsorber durch Aktivkohle oder Ionenaustauscher, unter Verwendung von Membranen, Membranfiltern oder dgl., Zersetzungsverfahren unter Verwendung von Hochtemperatur/Hochdruckbehandlungen oder Säure oder Alkali sind bekannte Verfahren zur Entfernung von Endotoxin im Stand der Technik. Alle Verfahren haben Vor- und Nachteile und weisen Probleme bei der industriellen Verwendung auf.

Beispielsweise kann manchmal die Entfernung von Endotoxin bei der medizinischen Arzneimittelproduktherstellung nicht unter strengen Bedingungen durchgeführt werden, angesichts der Aufrechterhaltung der Stabilität des ursprünglichen medizinischen Arzneimittelprodukts oder aufgrund der kleinen Mengen an vorhandenem Endotoxin. Obwohl die Adsorption erfolgreich im Labor durchgeführt wird, kann sie jedoch nicht zufriedenstellend im industriellen Maßstab durchgeführt werden, oder das medizinische Arzneimittelprodukt selbst wird am Adsorber adsorbiert, so daß es keineswegs zufriedenstellend ist. Im Gegensatz dazu wurde eine Anzahl von Adsorbern in den letzten Jahren offenbart, um zu ermöglichen, daß eine Endotoxinadsorption für die Industrie ebenfalls zufriedenstellend ist. Beispielsweise ist ein Adsorber, gebildet aus einer Polyaminosäure mit einer modifizierten Gruppe mit einer Fettseriengruppe und/oder einem Aryl am Ende einer Seitenkette und/oder einer Hauptkette offenbart (japanische Patentveröffentlichung H6-16843), und ein Adsorber, umfassend ein sphärisches Teilchen aus einer Polyaminosäure, das als Träger dient, und ein daran konjugiertes Imidazolderivat, wurde offenbart (japanische offengelegte Patentanmeldung H1-127039). Zusätzlich ist ein Verfahren offenbart, bei dem eine basische Substanz immobilisiert und die Porengröße des Adsorbers gesteuert wird, um Endotoxin selektiv zu adsorbieren (offengelegte japanische Patentanmeldung 2002-263486).

Offenbarung der Erfindung

Diese Adsorber haben jedoch das Problem, daß dann, wenn sehr saure Substanzen wie Heparin oder dgl. koexistieren, die Adsorber Heparin adsorbieren. Folglich vermindert sich die Menge an adsorbiertem Endotoxin deutlich. Insbesondere ist, weil Heparin eine Substanz ist, die in großem Umfang als Blutantikoagulanz verwendet wird, ein Verfahren zum selektiven Adsorbieren von Endotoxin von heparinhaltigem Blut und dgl. gewünscht.

Als Ergebnis von intensiven Untersuchungen zur Lösung der Probleme haben diese Erfinder festgestellt, daß teilweise modifizierende Aminogruppen, die im aminogruppenhaltigen Molekül enthalten sind, die als Liganden verwendet werden, die Adsorption von Endotoxinen und die selektive Eliminierung aus einer Lösung ermöglichen, in der eine saure Substanz wie Heparin koexistiert, und dies führte zur Vollendung dieser Erfindung.

Das heißt, diese Erfindung gibt ein Verfahren zum selektiven Selektieren und Eliminieren von Endotoxin aus einer Lösung, bei der eine sehr saure Substanz wie Heparin koexistiert, und einen hierfür verwendeten Adsorber an.

Diese Erfindung stellt die folgenden Endotoxinadsorber, ein Verfahren zum Adsorbieren und zur Entfernung von Endotoxin und dgl. zur Verfügung.

  • (1) Endotoxinadsorber, umfassend einen Liganden, bei dem Aminogruppen, die innerhalb eines Moleküls eines aminogruppenhaltigen Moleküls vorhanden sind, teilweise durch ein Molekül modifiziert sind, das in der Lage ist, mit einer Aminogruppe zu reagieren.
  • (2) Endotoxinadsorber gemäß (1), worin der Ligand an einem Träger immobilisiert ist.
  • (3) Endotoxinadsorber gemäß (2), worin der Träger ein Polysaccharid oder Derivat davon ist.
  • (4) Endotoxinadsorber gemäß (3), worin das Polysaccharid Cellulose, Agarose, Dextran, Chitin oder Chitosan ist.
  • (5) Endotoxinadsorber nach einem der Punkte (2) bis (4), worin die Form des Trägers sphärisch, membranartig, granular oder faserig ist.
  • (6) Endotoxinadsorber gemäß (5), worin der Träger sphärische Cellulose, sphärische Sepharose oder sphärisches Dextran ist.
  • (7) Endotoxinadsorber gemäß einem der Punkte (1) bis (6), worin das aminogruppenhaltige Molekül Polylysin ist.
  • (8) Endotoxinadsorber nach einem der Punkte (1) bis (6), worin das aminogruppenhaltige Molekül Polyethylenimin oder Polyallylamin ist.
  • (9) Endotoxinadsorber nach einem der Punkte (1) bis (8), worin das Molekül, das mit einer Aminogruppe reagieren kann, ein Molekül ist, das eine Aminbindung oder Amidbindung mit einer Aminogruppe bilden kann.
  • (10) Endotoxinadsorber gemäß (9), worin das Molekül, das eine Aminbindung oder eine Amidbindung mit einer Aminogruppe bilden kann, zumindest eine Spezies ist, ausgewählt aus Carbonsäure, Epoxyverbindung und Aldehyd.
  • (11) Endotoxinadsorber gemäß (9), worin das Molekül, das in der Lage ist, eine Amin- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe zu bilden, zumindest eine Spezies ist, ausgewählt aus Essigsäureanhydrid, Butylglycidylether und Phenylglycidylether.
  • (12) Endotoxinadsorber nach einem der Punkte (1) bis (11), worin das Molekül, das mit einer Aminogruppe reagieren kann, eine Amin- oder Amidbindung mit den intramolekularen Aminogruppen des aminogruppenhaltigen Moleküls bildet.
  • (13) Endotoxinadsorber gemäß einem der Punkte (1) bis (12), worin das Verhältnis der Modifizierung der Aminogruppen des aminogruppenhaltigen Moleküls 20 bis 60 % ist.
  • (14) Endotoxinadsorber, worin ein Ligand, der ein Polylysin ist, bei dem Aminogruppen teilweise durch ein Molekül modifiziert sind, das eine Amin- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe bilden kann, auf einem Träger immobilisiert ist.
  • (15) Endotoxinadsorber gemäß (14), worin das Polylysin Epsilon-Polylysin ist.
  • (16) Endotoxinadsorber gemäß (14) oder (15), worin der Träger ein Polysaccharid oder Derivat davon ist.
  • (17) Endotoxinadsorber gemäß (16), worin das Polysaccharid Cellulose, Agarose, Dextran, Chitin oder Chitosan ist.
  • (18) Endotoxinadsorber gemäß einem der Punkte (14) bis (17), worin die Form des Trägers sphärisch, membranartig, granular oder faserig ist.
  • (19) Endotoxinadsorber gemäß (18), worin der Träger sphärische Cellulose, sphärische Sepharose oder sphärisches Dextran ist.
  • (20) Endotoxinadsorber nach einem der Punkte (14) bis (19), worin das Molekül, das in der Lage ist, eine Amin- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe zu bilden, zumindest eine Spezies ist, ausgewählt aus Carbonsäure, Epoxyverbindung und Aldehyd.
  • (21) Endotoxinadsorber nach einem der Punkte (14) bis (19), worin das Molekül, das eine Amin- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe bilden kann, zumindest eine Spezies ist, ausgewählt aus Essigsäureanhydrid, Butylglycidylether und Phenylglycidylether.
  • (22) Endotoxinadsorber nach einem der Punkte (14) bis (21), worin das Verhältnis der Modifizierung der Aminogruppen des Polylysins von 20 bis 60 % ist.
  • (23) Verfahren zum Adsorbieren und Entfernen von Endotoxin durch Kontaktieren des Endotoxinadsorbers nach einem der Punkte (1) bis (22) mit einer endotoxinhaltigen Lösung.
  • (24) Verfahren zum selektiven Adsorbieren und Entfernen von Endotoxin durch Kontaktieren des Endotoxinadsorbers gemäß einem der Punkte (1) bis (22) mit einer endotoxinhaltigen Lösung, die Heparin enthält.
  • (25) Verfahren gemäß (23) oder (24), worin der Kontakt des Endotoxinadsorbers mit der endotoxinhaltigen Lösung unter Verwendung einer Säule durchgeführt wird, die mit dem Endotoxinadsorber gefüllt ist.
  • (26) Verfahren zur Herstellung des Endotoxinadsorbers gemäß einem der Punkte (1) bis (22), umfassend die Reaktion und teilweise Modifizierung der Aminogruppen, die innerhalb eines Moleküls des aminogruppenhaltigen Moleküls vorhanden sind, mit einem Molekül, das mit einer Aminogruppe reagieren kann.
  • (27) Verfahren zum Herstellen des Endotoxinadsorbers gemäß einem der Punkte (14) bis (22), umfassend das Immobilisieren von Polylysin ohne modifizierte Aminogruppen auf einem Träger, anschließende Reaktion der Aminogruppen des Polylysins mit einem Molekül, das in der Lage ist, eine Amino- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe zu bilden.

Erfindungsgemäß kann ein Verfahren zum selektiven Adsorbieren und Entfernen von Endotoxin aus einer Lösung, bei der eine sehr saure Substanz wie Heparin und dgl. koexistiert, und ein hierfür verwendeter Adsorber zur Verfügung gestellt werden. Zusätzlich kann erfindungsgemäß Endotoxin selektiv adsorbiert und aus einer Lösung (z.B. medizinisches Arzneimittelprodukt, Blut, Blutplasmakomponente und dgl.), die eine sehr saure Substanz wie Heparin enthält, adsorbiert und entfernt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 ist ein Diagramm, das zeigt, daß Endotoxin bei der Endotoxinentfernung aus heparinhaltigen Pufferlösungen durch das Säulenverfahren selektiver entfernt wird als Heparin.

Beste Art zur Durchführung der Erfindung

Nachfolgend werden der Endotoxinadsorber und das Verfahren zum Adsorbieren und Entfernen von Endotoxin unter dessen Verwendung detailliert beschrieben.

Zunächst werden die in dieser Beschreibung verwendeten Ausdrücke erläutert. "Teilweises Modifizieren der Aminogruppen, die innerhalb eines Moleküls eines aminogruppenhaltigen Moleküls vorhanden sind, mit einem Molekül, das mit einer Aminogruppe reagieren kann" bedeutet die Modifizierung eines Teils einer Vielzahl von Aminogruppen, die innerhalb eines Moleküls eines aminogruppenhaltigen Moleküls vorhanden sind, durch Reaktion mit einem Molekül, das mit einer Aminogruppe reagieren kann. "Sehr saure Substanz" bedeutet eine saure Substanz, die durch ein aminogruppenhaltiges Molekül adsorbiert wird, wobei die Menge der Adsorption an Endotoxin vermindert wird, wenn eine endotoxinhaltige Lösung mit einem aminogruppenhaltigen Molekül (beispielsweise Epsilon-Polysylin und dgl.) unter Koexistenz einer solchen Substanz in Kontakt gebracht wird.

Nachfolgend werden Ausführungsformen dieser Erfindung erläutert.

1. Endotoxinadsorber

Die erste Ausführungsform dieser Erfindung betrifft einen Endotoxinadsorber, umfassend einen Liganden, bei dem Aminogruppen, die innerhalb eines Moleküls eines aminogruppenhaltigen Moleküls vorhanden sind, teilweise durch ein Molekül modifiziert sind, das in der Lage ist, mit einer Aminogruppe zu reagieren.

Als aminogruppenhaltige Moleküle können Peptide mit basischen Aminosäuren wie Lysin, Arginin, Histidin, Tryptophan, Ornithin, 2,4-Diaminobuttersäure und 2,3-Diaminopropionsäure oder basische Proteine wie Protamin, Polymere mit basischen Aminosäuren wie Polylysin (z.B. Epsilon-Polylysin und Alpha-Polylysin), Polyhistidin, Polyarginin, Polytryptophan, Polyornithin, Poly-2,4-diaminobuttersäure und Poly-2,3-diaminopropionsäure, Polyethylenimin, Polyallylamin, copolymere Verbindungen von Allylamin und Diallylamin, basische Polymere wie Polydiallylamin und Polyvinylamin oder basische Antibiotika wie Polymyxin, Streptomycin, Amikacin und Kanamycin verwendet werden.

Als aminogruppenhaltiges Molekül kann Polylysin bevorzugt verwendet werden, und zusätzlich können Polyethylenimin und Polyallylamin ebenfalls bevorzugt verwendet werden. Insbesondere kann Epsilon-Polylysin bevorzugt verwendet werden, weil es durch Mikroorganismusfermentation in großen Mengen erzeugt werden kann.

Epsilon-Polylysin ist ein lineares Polymer, bei dem L-Lysine über eine Amidbindung zwischen einem Carboxyl an der &agr;-Position und einer Aminogruppe an der &egr;-Position gebunden sind. Epsilon-Polylysin kann durch Fermentation hergestellt werden und beispielsweise ist ein Verfahren bekannt, bei dem eine Mikrobe, die Epsilon-Polylysin erzeugt (z.B. Bakterien des Streptomyces-Genus) in einem flüssigen Kulturmedium kultiviert und das erzeugte Epsilon-Polylysin, das in der Lösung akkumuliert ist, gesammelt wird (siehe z.B. japanische Patentveröffentlichung S59-20359). Der Polymerisationsgrad (n) von Epsilon-Polylysin ist bevorzugt ungefähr 2 bis 50, mehr bevorzugt ungefähr 20 bis 40 und besonders bevorzugt ungefähr 25 bis 35. Ein solches Epsilon-Polylysin ist ebenfalls kommerziell erhältlich. Zusätzlich kann Epsilon-Polylysin ebenfalls durch chemische Synthese, beispielsweise durch Kondensation eines Lysins mit der geschützten Aminogruppe an der &agr;-Position und anschließendes Eliminieren der Schutzgruppe hergestellt werden.

Die Substanz, die verwendet wird, wenn Aminogruppen, die innerhalb eines Moleküls eines aminogruppenhaltigen Moleküls vorhanden sind, mit einem Molekül teilweise modifiziert werden, das in der Lage ist, mit einer Aminogruppe zu reagieren, ist nicht besonders beschränkt, so lange sie ein Molekül ist, das mit einer Aminogruppe reagieren kann. Ein Molekül, das eine Amin- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe bilden kann, ist als Molekül bevorzugt, das mit einer Aminogruppe reagieren kann, weil es ermöglicht, daß eine Aminogruppe durch Bilden einer Amin- oder Amidbindung mit der Aminogruppe modifiziert wird. Als Moleküle, die in der Lage sind, eine Amin- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe zu bilden, können beispielsweise Carbonsäuren (carboxylhaltige Substanzen), Aldehyde (aldehydhaltige Substanzen), Epoxyverbindungen (epoxyhaltige Substanzen), halogeniertes Alkyl und dgl. verwendet werden, unter denen Carbonsäuren, Epoxyverbindungen und Aldehyde bevorzugt verwendet werden können. Insbesondere können wasserfreie Carbonsäuren und Epoxyverbindungen bevorzugt verwendet werden, weil sie leicht mit Aminogruppen reagieren.

Als wasserfreie Carbonsäuren können beispielsweise Essigsäureanhydrid, wasserfreie Propionsäure, wasserfreie Buttersäure, Phthalsäureanhydrid, Benzoesäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid, wasserfreie Isobuttersäure, Succinsäureanhydrid, wasserfreie Glutarsäure, Aconitinsäureanhydrid, Citraconsäureanhydrid und dgl. verwendet werden, und Essigsäureanhydrid, wasserfreie Propionsäure, wasserfreie Buttersäure, wasserfreie Benzoesäure, Maleinsäureanhydrid, wasserfreie Isobuttersäure und dgl. sind bevorzugt, und weiterhin ist Essigsäureanhydrid bevorzugt.

Als Epoxyverbindungen (epoxyhaltige Substanzen) können beispielsweise Butylglycidylether, Phenylglycidylether, Allylglycidylether, 1,2-Epoxybutan, 3-(2-Biphenylyloxy)-1,2-epoxypropan, 1,4-Butandioldiglycidylether, Chlormethyloxiran, 1,2-Epoxyethylbenzol, 2,3-Epoxy-1-propanol, Propylenoxid, 1,2-Epoxyoctan, Polyethylenglycolglycidylether, Ethylenglycoldiglycidylether und dgl. verwendet werden, und Butylglycidylether und Phenylglycidylether sind bevorzugt, weiterhin ist Butylglycidylether bevorzugt. Als Aldehyde können beispielsweise Acetaldehyd, Butylaldehyd, Isobutylaldehyd, Heptylaldehyd, Benzaldehyd und Derivate davon, größere Saccharide als Disaccharide mit verminderter Extremität, Monosaccharide und dgl. verwendet werden.

Unter den Molekülen, die mit einer Aminogruppe reagieren können, sind Epoxyverbindungen und wasserfreie Carbonsäuren bevorzugt, weiterhin sind Epoxyverbindungen bevorzugt, Butylglycidylether und Phenylglycidylether sind besonders bevorzugt und Butylglycidylether ist besonders bevorzugt.

Die Modifizierung der Aminogruppen, die innerhalb eines Moleküls eines aminogruppenhaltigen Moleküls vorhanden sind, kann durch bekannte Verfahren oder durch Verfahren durchgeführt werden, die diesen entsprechen. Wenn die Modifizierung unter Verwendung von Epoxyverbindungen wie Glycidylether durchgeführt wird, kann die Modifizierung durchgeführt werden, indem ein aminogruppenhaltiges Molekül in Wasser, einem polaren Lösungsmittel (z.B. Dioxan, THF, DMF, DMSO oder dgl.) oder einer gemischten Lösung davon aufgelöst oder suspendiert wird und eine Epoxyverbindung zur Reaktion gegeben wird. Die Menge der verwendeten Epoxyverbindung ist im allgemeinen das 0,1- bis 30-fache in Bezug auf die Molzahl der primären Aminogruppen des aminogruppenhaltigen Moleküls, das im Träger enthalten ist, und bevorzugt die 0,5- bis 25-fache Menge. Die Reaktionstemperatur ist im allgemeinen von 10 bis 80°C und bevorzugt 35 bis 45°C. Die Reaktionszeit ist im allgemeinen von 10 Minuten bis 24 Stunden und bevorzugt 2 bis 5 Stunden. Diese Reaktionsbedingungen können geeignet entsprechend dem gewünschten Modifizierungsverhältnis und dgl. eingestellt werden. Bei Modifizierung unter Verwendung einer wasserfreien Carbonsäure wie Essigsäureanhydrid kann die Modifizierung durch Auflösen oder Suspendieren eines aminogruppenhaltigen Moleküls in Wasser, polarem Lösungsmittel (z.B. Dioxan, THF, DMF, DMSO oder dgl.), oder einer gemischten Lösung davon und Zugabe einer wasserfreien Carbonsäure in Gegenwart einer Base zur Reaktion (z.B. Triethylamin, Pyridin, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder dgl.). Die Menge der verwendeten wasserfreien Carbonsäure ist im allgemeinen das 0,1- bis 30-fache in Bezug auf die Anzahl der Mole der primären Aminogruppen des aminogruppenhaltigen Moleküls, das im Träger enthalten ist, und bevorzugt das 0,3- bis 25-fache. Die Reaktionstemperatur ist im allgemeinen von 10 bis 80°C und bevorzugt 35 bis 45°C. Die Reaktionszeit ist im allgemeinen von 10 Minuten bis 24 Stunden und bevorzugt 2 bis 5 Stunden. Diese Reaktionsbedingungen können geeignet gemäß dem gewünschten Modifizierungsverhältnis und dgl. eingestellt werden.

Das Modifizierungsverhältnis der intramolekularen Aminogruppen des aminogruppenhaltigen Moleküls ist bevorzugt von ungefähr 10 bis ungefähr 70 %, mehr bevorzugt ungefähr 20 bis ungefähr 60 % und besonders bevorzugt ungefähr 50 bis ungefähr 60 %. Wenn das Modifizierungsverhältnis niedrig ist, gibt es die Tendenz, daß die Adsorption der hochsauren Substanzen wie Heparin nicht ausreichend unterdrückt werden kann. Wenn das Modifizierungsverhältnis höher wird, vermindert sich das Adsorptionsverhältnis von Endotoxin, obwohl das Adsorptionsverhältnis der hochsauren Substanzen wie Heparin sich vermindert, und es gibt die Tendenz, daß das Endotoxin nicht ausreichend adsorbiert und entfernt werden kann. Derartig hochsaure Substanzen sind solche mit einem Sulfatester, Phosphoester, Carboxyl und dgl. im Molekül und sind negativ geladen im pH-Bereich von schwachsauer bis alkalisch. Als hochsaure Substanzen können beispielsweise Glucosaminoglykane und Mucopolysaccharide wie Heparin, Heparansulfat, Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und Keratansulfat oder Polyuronsäuren wie Algininsäure und Pektin oder sulfatierte Polysaccharide wie sulfatierte Cellulose, sulfatiertes Chitin und sulfatiertes Chitosan, phosphorylierte Polysaccharide wie phosphorylierte Stärke, phosphoryliertes Mannan und phosphoryliertes Galactan, Desoxyribonucleinsäure (DNA), Sialsäure, Polyglutamsäure und dgl. enthalten sein.

Das Modifizierungsverhältnis der Aminogruppen, die innerhalb eines Moleküls eines aminogruppenhaltigen Moleküls vorhanden sind, kann entsprechend der folgenden Formel durch Messen der primären Aminogruppen berechnet werden, die innerhalb des Moleküls vorhanden sind, und zwar vor und nach der Modifizierung.

Modifizierungsverhältnis der Aminogruppen (%) = [(Menge der primären Aminogruppen vor der Modifizierung – Menge der primären Aminogruppen nach der Modifizierung)/Menge der primären Aminogruppen vor der Modifizierung] × 100 Die Messung der primären Aminogruppen kann durch bekannte Verfahren, beispielsweise das Ninhydrin-Verfahren, durchgeführt werden. Mehr spezifisch kann die Menge der primären Aminogruppen beispielsweise unter Verwendung einer Ninhydrin-Testlösung für den automatisierten Aminosäureanalysator und 2-Aminoethanol als Standardlösung gemessen werden. Die Ninhydrin-Testlösung für den automatisierten Aminosäureanalysator und 2-Aminoethanol sind kommerziell erhältlich (beispielsweise Ninhydrin-Testlösung hergestellt von Wako Pure Chemical Industries Ltd. und 2-Aminoethanol hergestellt von Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.). Die quantitative Messung der primären Aminogruppen durch das Ninhydrin-Verfahren kann gemäß Verfahren durchgeführt werden, die in Kiso Seikagaku Jikken Koza (Fundamentals of Biochemical Experimental Methods), Bd. 5, Kagaku-teki Sokutei (Chemical Measurements), S. 175 (Maruzen Co., Ltd.) beschrieben sind.

Die Endotoxinselektivität (Adsorptionsverhältnis von Endotoxin/Adsorptionsverhältnis von Heparin) durch den Endotoxinadsorber dieser Erfindung ist bevorzugt 2 oder mehr, mehr bevorzugt 5 oder mehr, besonders bevorzugt 8 oder mehr und am meisten bevorzugt 10 oder mehr. Die Messung der Selektivität für Endotoxin wird im allgemeinen bei einem Anfangswert für Endotoxin von ungefähr 10 bis ungefähr 1.000 EU/ml und einem Anfangswert für Heparin von ungefähr 50 bis ungefähr 500 IU/ml durchgeführt, und bevorzugt bei einem Anfangswert für Endotoxin von 30 bis 100 EU/ml und einem Anfangswert für Heparin von 100 bis 120 IU/ml.

Das Adsorptionsverhältnis von Endotoxin kann aufgrund der folgenden Formel durch Messen der Endotoxinkonzentration in der endotoxinhaltigen Lösung vor der Adsorption durch das Endotoxinadsorptionsmittel und die Endotoxinkonzentration nach der Adsorption berechnet werden. Adsorptionsverhältnis von Endotoxin (ET) (%) = [(ET-Konzentration vor der Adsorption – ET-Konzentration nach der Adsorption)/ET-Konzentration vor der Adsorption] × 100

Die Endotoxinmessung kann durch ein bekanntes Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise durch Messen der Endotoxinkonzentration durch das kinetische Kolorimetrieverfahren. Mehr spezifisch ist die Messung beispielsweise durch das kinetische kolorimetrische Verfahren unter Verwendung eines Lysatreagens und eines Endotoxinstandards möglich. Das Lysatreagens und der Endotoxinstandard sind kommerziell erhältlich (beispielsweise hergestellt von Seikagaku Corporation und dgl.). Das kinetische kolorimetrische Verfahren kann gemäß den Verfahren durchgeführt werden, die beispielsweise in 14th Revision of Pharmacopoeia of Japan: Endotoxin Assay und dgl. beschrieben sind.

Das Adsorptionsverhältnis von Heparin kann aufgrund der folgenden Formel durch Messen der Heparinkonzentration vor der Adsorption durch den Endotoxinadsorber und die Heparinkonzentration nach der Adsorption berechnet werden. Adsorptionsverhältnis von Heparin (Hep) (%) = [(Hep-Konzentration vor der Adsorption – Hep-Konzentration nach der Adsorption)/Hep-Konzentration vor der Adsorption] × 100

Die Heparinmessung kann durch gut bekannte Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise durch Messen der Heparinkonzentration durch das Carbazol-Schwefelsäure-Verfahren. Mehr spezifisch kann beispielsweise die Konzentration einer Probenlösung von einer Kalibrierungskurve bestimmt werden, die unter Verwendung von Heparin-Standardlösungen durch das Carbazol-Schwefelsäure-Verfahren kreiert ist. Als Heparin-Standardlösung kann kommerziell erhältliches injizierbares Heparinnatrium oder dgl. verwendet werden (beispielsweise injizierbares Heparinnatrium, hergestellt von Mitsubishi Pharma Corporation, oder dgl.). Das Carbazol-Schwefelsäure-Verfahren kann gemäß Verfahren durchgeführt werden, die beispielsweise in T. Bitter, H.M. Muir, Anal. Biolchem., 4,330 (1962) und J.T. Galambos, Anal. Biochem., 19, 119 (1967) beschrieben sind.

Der Ligand dieser Erfindung kann an einem Träger immobilisiert werden, und die Immobilisierung auf einem Träger ist bevorzugt, weil der Endotoxinadsorber leicht nach Kontakt mit der endotoxinhaltigen Lösung entfernt wird.

Als Material (Träger), das für die Immobilisierung des Liganden dieser Erfindung verwendet wird, können allgemeine wie Polysaccharide wie Cellulose, Agarose, Dextran, Stärke, Chitin und Chitosan oder Derivate davon und synthetische Polymerteilchen (z.B. Polyacrylverbindungen, Polystyrolverbindungen, Polyvinylverbindungen und dgl.) verwendet werden. Zusätzlich können Silica und Glas als anorganisches Material verwendet werden; jedoch sind sie für eine alkalische Behandlung während der Entfernung von Endotoxin innerhalb des Trägers nicht geeignet. Unter diesen können die Polysaccharide bevorzugt verwendet werden, weil die innerhalb des Moleküls reichlich vorhandenen Hydroxylgruppen leicht aktiviert werden können, wodurch leicht die Immobilisierung des zu tragenden Liganden ermöglicht wird. Cellulose, Agarose, Dextran, Chitin, Chitosan und dgl. können bevorzugt als Polysaccharide verwendet werden. Diese Polysaccharide können aus Materialien natürlichen Ursprungs durch Extraktion, Isolierung und Reinigung gemäß gut bekannten Verfahren hergestellt werden und sind ebenfalls kommerziell erhältlich. Polysaccharidderivate, die erfindungsgemäß verwendet werden, bedeuten Derivate, worin eine funktionelle Gruppe in ein Polysaccharid natürlichen Ursprungs eingefügt ist. Als funktionelle Gruppen, die in Polysaccharide eingefügt sind, können beispielsweise wahlweise substituiertes Alkyl (z.B. Methyl, Ethyl, Butyl und dgl.), Alkohol (z.B. Hydroxyethyl, Hydroxypropyl und dgl.), Ester (z.B. Essigsäure, Buttersäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und dgl.), Ionenaustauschgruppe (Aminoethyl, Diethylaminoethyl, quaternäres Ammonium, Carboxymethyl und Sulfon) und dgl. enthalten sein. Polysaccharidderivate sind nicht besonders beschränkt, so lange sie die Immobilisierung des Liganden dieser Erfindung nicht behindern, und beispielsweise können methyliertes Polysaccharid, ethyliertes Polysaccharid, hydroxyethyliertes Polysaccharid, Hydroxypropylpolysaccharid und dgl. enthalten sein. Mehr spezifisch können als Cellulosederivate, die erfindungsgemäß verwendet werden, beispielsweise Hydroxypropylcellulose, Aminoethylcellulose und dgl. enthalten sein. Als Agarosederivate können beispielsweise Chlormethyloxiran-vernetzte Agarose, Agarose-Acryl-Copolymerisationsprodukt und dgl. enthalten sein. Als Dextranderivate können beispielsweise Chlormethyloxiranvernetztes Dextran, hydroxypropyliertes Dextran und dgl. enthalten sein. Als Chitinderivate können beispielsweise Chlormethyloxiran-vernetztes Chitin und dgl. enthalten sein. Als Chitosanderivat kann beispielsweise Chlormethyloxiran-vernetztes Chitosan und dgl. enthalten sein. Solche Polysaccharidderivate können durch gut bekannte Verfahren oder durch Verfahren, die diesen entsprechen, hergestellt werden und sind ebenfalls kommerziell erhältlich.

Zusätzlich können als Formen des erfindungsgemäß verwendeten Trägers Formen, die im allgemeinen als Grundmaterialien für die Trennung verwendet werden, wie sphärische (z.B. sphärisches Teilchen und dgl.), partikuläres, faseriges, granulares, Monolithsäule, Hohlfaser, membranartige (z.B. flache Membran) verwendet werden, und sphärische, membranartige, granulare, faserige und dgl. sind bevorzugt. Sphärische Teilchen können besonders bevorzugt verwendet werden, weil das verwendete Volumen geeignet eingestellt werden kann, wenn sie in einem Säulenverfahren oder absatzweise betriebenen Verfahren verwendet werden. Die Teilchengröße der sphärischen Teilchen ist im allgemeinen von 1 bis 1.000 &mgr;m und wird geeignet entsprechend dem Verwendungszweck und dgl. ausgewählt. Bei Verwendung in dem Säulenverfahren ist die Teilchengröße beispielsweise bevorzugt 50 bis 500 &mgr;m. Bei Anwendung des absatzweise betriebenen Verfahrens ist die Teilchengröße bevorzugt von 10 bis 300 &mgr;m. Als sphärische Teilchen kann sphärische Cellulose, sphärische Sepharose, sphärische Agarose, sphärisches Dextran, sphärisches Chitosan und vernetzte sphärische Teilchen davon, sphärisches Silica, Styrolkugeln, Acrylkugeln und dgl. bevorzugt verwendet werden. Solche sphärischen Teilchen sind kommerziell erhältlich, und beispielsweise können Cellufine (hergestellt von Chisso Corporation), Sepharose, Sephadex (hergestellt von Amersham Biosciences), Viscopearl (hergestellt von Rengo Co., Ltd.), Perloza MT series (hergestellt von Iontsorb), "Cellulose, Beaded" (Katalogcode: C8204; hergestellt von Sigma), Toyopearl (hergestellt von Tosoh Corporation) verwendet werden.

Unter den erfindungsgemäß verwendeten Trägern können sphärische Cellulose, sphärische Sepharose, sphärisches Dextran und dgl. bevorzugt verwendet werden.

Die Immobilisierung des Liganden dieser Erfindung kann durch bekannte Verfahren durchgeführt werden oder durch Verfahren, die diesen entsprechen. Als Liganden-Immobilisierungsverfahren können allgemeine Verfahren verwendet werden, die in den Literaturstellen beschrieben sind, wie z.B. Jikken to Oyo (Experiment and Application):

Affinity Chromatography, Ichiro Chibata, Tetsuya Tosa, Yushi Matsuo, Kodansha Scientic und Immobilized Affinity Ligand Techniques, G.T. Hermanson, A.K. Mallia, P.K. Smith, Academic Press, Inc.. Insbesondere kann das Verfahren zum Immobilisieren eines aminogruppenhaltigen Liganden durch Epoxy-Aktivierungsverfahren erfindungsgemäß bevorzugt verwendet werden, um den basischen Charakter der Aminogruppen nicht zu verlieren.

Die Immobilisierung des Liganden durch das Epoxy-Aktivierungsverfahren kann beispielsweise durch Zugabe von Wasser und einer NaOH-Lösung zu einem Träger (z.B. sphärische Cellulose oder dgl.) und Rühren, anschließendes Zugeben eines Epoxy-Aktivators (z.B. Epichlorhydrin oder dgl.) zur Reaktion zur Herstellung eines epoxyaktivierten Trägers (z.B. epoxyaktiviertes Celluloseteilchen oder dgl.) und Zugabe eines aminogruppenhaltigen Moleküls (z.B. Epsilon-Polylysin oder dgl.) zum erhaltenen epoxyaktivierten Träger für die Reaktion durchgeführt werden.

Als Verfahren zum Modifizieren der Aminogruppen innerhalb des Liganden, der auf dem Träger gemäß dieser Erfindung immobilisiert ist, sind das Verfahren, bei dem ein nicht-modifizierter Ligand (d.h. ein aminogruppenhaltiges Molekül ohne modifizierte Aminogruppen) zunächst auf einem Träger immobilisiert und dann modifiziert ist oder das Verfahren möglich, bei dem Aminogruppen innerhalb eines Liganden modifiziert werden, dann der modifizierte Ligand auf einem, Träger immobilisiert wird. Unter diesen ist das Verfahren, bei dem ein nicht-modifizierter Ligand auf einem Träger immobilisiert und dann modifiziert wird, erfindungsgemäß bevorzugt, weil das Waschen und Wiedergewinnen der Produkte möglich wird.

Folglich kann der Endotoxinadsorber dieser Erfindung, das heißt der Endotoxinadsorber, der ein immobilisierter Ligand ist, worin Aminogruppen teilweise modifiziert sind, leicht durch Immobilisieren eines nicht-modifizierten Liganden auf einem Träger und anschließendes Reagieren mit einem Molekül, das mit einer Aminogruppe reagieren kann, wie wasserfreie Carbonsäure, Epoxyverbindung und dgl., hergestellt werden.

Als Endotoxinadsorber, worin ein Ligand, der ein Polylysin ist, worin Aminogruppen teilweise durch ein Molekül modifiziert worden sind, das eine Amino- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe bilden kann, auf einem Träger immobilisiert ist, kann beispielsweise durch Immobilisieren eines Polylysins mit unmodifizierten Aminogruppen auf einem Träger, anschließende Reaktion der Aminogruppen des Polylysins mit einem Molekül, das eine Amino- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe bilden kann, hergestellt werden.

Obwohl die teilweise Modifizierung der Aminogruppen durch Modifizieren der Aminogruppen, anschließendes teilweises Entfernen der modifizierten Gruppen von den modifizierten Aminogruppen durchgeführt werden kann, ist es bevorzugt, die Aminogruppen partiell zu modifizieren und nicht die Entfernung der modifizierten Gruppen durchzuführen.

2. Verfahren zum Adsorbieren und Entfernen von Endotoxin

Das zweite Ausführungsbeispiel dieser Erfindung betrifft ein Verfahren zum Adsorbieren und Entfernen von Endotoxin, indem der Endotoxinadsorber dieser Erfindung mit einer endotoxinhaltigen Lösung kontaktiert wird.

Weil der Endotoxinadsorber dieser Erfindung Endotoxin effektiv adsorbiert, kann Endotoxin von einer endotoxinhaltigen Lösung entfernt werden, indem der Endotoxinadsorber mit der endotoxinhaltigen Lösung kontaktiert wird, zum Adsorbieren von Endotoxin mit einem Endotoxinadsorber.

Es gibt keine besondere Beschränkung bezüglich der endotoxinhaltigen Lösung, bei der das erfindungsgemäße Verfahren das Endotoxin adsorbieren und entfernen soll. Beispielsweise kann Endotoxin durch das erfindungsgemäße Verfahren von endotoxinhaltigen medizinischen Arzneimittelprodukten, Blut und dgl. adsorbiert und entfernt werden. Weil der Endotoxinadsorber dieser Erfindung ermöglicht, daß Endotoxin selektiv adsorbiert und entfernt wird, selbst wenn eine sehr saure Substanz wie Heparin koexistiert, ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders wirksam bei der Entfernung von Endotoxin von endotoxinhaltigen Lösungen wie medizinischen Arzneimittelprodukten, Blut, Blutplasmakomponenten, die Heparin enthalten.

Als endotoxinhaltige Lösungen, die eine sehr saure Substanz enthalten, können beispielsweise medizinische Arzneimittelprodukte mit Heparin wie Heparinnatriumlösung oder Heparinlösung, Blut oder Blutplasmakomponente und dgl., die im Herstellungsverfahren davon verwendet werden, enthalten sein. Blut oder Blutplasmakomponente können solche sein, die von einem Patienten stammen, dem eine sehr saure Substanz wie Heparin verabreicht ist, zusätzlich können sie ebenfalls Blut oder Blutplasmakomponenten sein, zu denen eine hochsaure Substanz wie Heparin gegeben worden ist.

Es gibt keine Beschränkung bezüglich des Verfahrens zum Adsorbieren und Entfernen von Endotoxin durch Kontaktieren eines Endotoxinadsorbers und einer endotoxinhaltigen Lösung, und Verfahren, die allgemein auf dem jeweiligen technische Gebieten verwendet werden, können eingesetzt werden; beispielsweise werden das Säulenverfahren, das absatzweise betriebene Verfahren usw. verwendet. Das Säulenverfahren und das absatzweise betriebene Verfahren können nach Verfahren durchgeführt werden, die auf den jeweiligen technischen Gebieten im allgemeinen angewandt werden. Bei dem Säulenverfahren wird eine Säule mit dem Endotoxinadsorber dieser Erfindung gefüllt, nach Waschen mit einer Pufferlösung, Saline oder dgl., wird eine Lösung, wie ein medizinisches Arzneimittel oder Blut, das Endotoxin enthält, zum Adsorbieren von Endotoxin innerhalb der Lösung mit dem Endotoxinadsorber geleitet und eine Lösung, von der Endotoxin entfernt worden ist, wird als durchfließende Fraktion erhalten. Zusätzlich wird bei dem absatzweise betriebenen Verfahren eine endotoxinhaltige Lösung zum Endotoxinadsorber dieser Erfindung gegeben, nach Rühren zum Adsorbieren des Endotoxins an den Endotoxinadsorber wird der Endotoxinadsorber getrennt und von der Lösung durch Filtration, Zentrifugaltrennung oder dgl. entfernt, unter Erhalt einer Lösung, von der Endotoxin entfernt worden ist.

Weil der Endotoxinadsorber dieser Erfindung ermöglicht, daß Endotoxin selektiv adsorbiert und entfernt wird, selbst wenn eine sehr saure Substanz wie Heparin koexistiert, kann dies besonders geeignet in der extrakorporalen Zirkulationstherapie verwendet werden, bei der zum Beispiel vor dem Zurückführen in den Körper des Patienten Blut oder Blutplasmakomponente, die aus dem Körper eines Patienten herausgenommen worden ist, das Endotoxin im Blut oder der Blutplasmakomponente unter Verwendung des erfindungsgemäßen Endotoxinadsorbers entfernt ist (z.B. unter Verwendung einer Säule, die mit dem Endotoxinadsorber dieser Erfindung gefüllt ist), und das Blut oder die Blutplasmakomponente, von der Endotoxin entfernt worden ist, wird in den Körper des Patienten zurückgebracht. Zusätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren ebenfalls geeignet verwendet werden, wenn ein Patient eine Heparinverabreichung erhält oder in Fällen, wenn Heparin zu Blut oder Blutplasmakomponenten gegeben wird, die aus dem Körper eines Patienten genommen wurden, um die Blutkoagulation zu unterdrücken.

Beispiele

Nachfolgend wird diese Erfindung unter Bezugnahme auf Beispiele und Vergleichsbeispiele beschrieben; jedoch wird diese Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt.

Vergleichsbeispiel 1 Immobilisierung von nicht-modifiziertem Liganden auf den Träger (Adsorber A)

Zu 100 g Cellufine (Naßgewicht; Feuchtigkeitsgehalt: 91,7 %), das eine sphärische Cellulose ist, hergestellt gemäß dem Verfahren der japanischen Patentveröffentlichung 563-62252, wurden 78 ml reines Wasser und 64 g 20 Gew.%ige NaOH-Lösung gegeben und 1 Stunde gerührt, wobei bei 30°C gehalten wurde. Dann wurden 38 g Epichlorhydrin zugegeben und 2 Stunden unter Rühren reagiert. Die gemischte Reaktionslösung wurde nach Reaktionsende filtriert und Gele wiedergewonnen. Das Gel wurde wiederholt mit Wasser gewaschen und filtriert, bis das Filtrat neutral wurde. Die Gesamtmenge an auf diese Weise erhaltenen epoxyaktivierten Celluloseteilchen wurde reagiert durch Zugabe von 90 ml reinem Wasser, 30 ml 25 %iger Epsilon-Poly-L-lysinlösung (hergestellt von Chisso Corporation; durchschnittliches Molekulargewicht: 4.700) und Rühren für 2 Stunden bei 45°C. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Produkt gewaschen unter Erhalt eines Endotoxinadsorbers (Adsorber A).

Die Menge an eingeführtem Epsilon-Poly-L-lysin wurde durch die folgende Berechnung durch Messung des gesamten Stickstoffgehalts (TN-Menge) bestimmt.

Die Probe für die Messung des gesamten Stickstoffgehalts (TN-Menge) wurde durch das Kehldahl-Verfahren unter Verwendung einer Probe gemessen, die gespült und anschließend bei 80°C getrocknet wurde. Menge an Epsilon-Poly-L-lysin (mg/g Trockengewicht) = (Lys – H2O) × (TN-Menge ÷ 2 × N) ÷ 1.000

Hierin ist Lys – H2O der Wert eines Molekulargewichts das Lysinmoleküls minus dem Molekulargewicht des Wassermoleküls, 128,17. N ist das Atomgewicht von Stickstoff. Weiterhin bedeutet mg/g Trockengewicht die Menge des Polylysins (mg) pro Gramm der trockenen Probe.

Als Ergebnis war der Polylysingehalt von Vergleichsbeispiel 1 140 mg/g Trockengewicht.

Vergleichsbeispiel 2 Immobilisierung des nicht-modifizierten Liganden auf den Träger (Adsorber B)

Zu 100 g Cellufine (Naßgewicht; Feuchtigkeitsgehalt: 91,7 %), das eine sphärische Cellulose ist, hergestellt gemäß den Verfahren gemäß der japanischen Patentveröffentlichung 563-62252, wurden 163 ml reines Wasser und 49 g 20 Gew.%ige NaOH-Lösung zugegeben, und dies wurde 1 Stunde unter Halten bei 30°C gerührt. Dann wurden 47 g Epichlorhydrin zugegeben und durch Führen 2 Stunden lang reagiert. Die reaktionsvermischte Lösung wurde nach Reaktionsende filtriert und Gele wurden wiedergewonnen. Das Gel wurde wiederholt mit Wasser gewaschen und filtriert, bis das Filtrat neutral wurde. Die gesamte Menge an epoxyaktivierten Celluloseteilchen, die auf diese Weise erhalten wurden, wurde reagiert durch Zugabe von 90 ml reinem Wasser, 30 ml 25 %iger Epsilon-Poly-L-lysinlösung (hergestellt von Chisso Corporation; durchschnittliches Molekulargewicht: 4.700) und Rühren bei 45°C für 2 Stunden. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Produkt gewaschen, unter Erhalt eines Endotoxinadsorbers (Adsorber B).

Das Polylysingehalt von Vergleichsbeispiel 2 war 94 mg/g Trockengewicht.

Beispiel 1 Modifizierung der Aminogruppen des Adsorbers A durch Butylglycidylether

Aminogruppen des Endotoxinadsorbers (Adsorber A), erhalten gemäß Vergleichsbeispiel 1, wurden mit Butylglycidylether modifiziert.

Zu 100 g Adsorber A (Naßgewicht; Feuchtigkeitsgehalt: 89 %) wurden 150 ml reines Wasser gegeben. Eine Menge an 11,5 g Butylglycidylether wurden zugegeben und 4 Stunden bei 35 bis 40°C reagiert. Nach der Reaktion wurde das Produkt 5-mal mit Methanol und 5-mal mit reinem Wasser gewaschen, unter Erhalt des Endotoxinadsorbers (ABu-1) von Beispiel 1.

Beispiele 2 bis 14 Modifizierung der Aminogruppen des Adsorbers B durch Glycidylether

Mit dem Adsorber B, erhalten gemäß Vergleichsbeispiel 2, als Ausgangsmaterial wurden Aminogruppen von Epsilon-Poly-L-lysin, das ein immobilisierter Ligand ist, durch Glycidylether modifiziert.

Bei den Beispielen 2 bis 12 wurden 40 ml reines Wasser zu 30 g des Adsorbers B (Naßgewicht; Feuchtigkeitsgehalt: 89,5 %) zugegeben. Bei den Beispielen 13 und 14 wurden 40 ml Dioxan anstelle von 40 ml reinem Wasser zugegeben. Glycidylether gemäß Tabelle 1 wurden zu einer Suspension des Adsorbers gegeben und 4 Stunden bei 35 bis 40°C reagiert. Nach der Reaktion wurde das Produkt 5-mal mit Methanol und 5-mal mit einem Wasser gewaschen.

Glycidylether, die bei den Beispielen 2 bis 14 verwendet wurden, und die Mengen davon sind in Tabelle 1 gezeigt.

Cas Nr. 122-60-1 (hergestellt von Kishida Chemical Co., Ltd.) wurde als Phenylglycidylether, Cas Nr. 2426-08-6 (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als Butylglycidylether und DENACOL EX-830 und DENACOL EX-861, (hergestellt von Nagase ChemteX Corporation) als Polyethylenglycoldiglycidylether verwendet.

Beispiele 15 bis 21 Modifizierung der Aminogruppen des Adsorbers B durch Essigsäureanhydrid

Mit dem Adsorber B, erhalten gemäß Vergleichsbeispiel 2, als Ausgangsmaterial wurden Aminogruppen von Epsilon-Poly-L-lysin, das ein immobilisierter Ligand ist, durch Essigsäureanhydrid modifiziert.

Zu 30 g des Adsorbers B (Naßgewicht; Feuchtigkeitsgehalt: 89,5 %) wurden 40 ml reines Wasser gegeben. Zu einer Suspension des Adsorbers B wurden Triethylamin und Essigsäureanhydrid gemäß Tabelle 2 zugegeben und 4 Stunden bei 35 bis 40°C reagiert. Nach der Reaktion wurde das Produkt 3-mal mit reinem Wasser, dann 3-mal mit 0,2 N Natriumhydroxidlösung und weiterhin mit reinem Wasser gewaschen, bis die Waschlösung neutral wurde.

Die Mengen an Triethylamin und Essigsäureanhydrid bei den Beispielen 15 bis 21 sind in Tabelle 2 gezeigt.

Testbeispiel 1 Messung des Modifizierungsverhältnisses der Aminogruppen innerhalb des Liganden

Das Modifizierungsverhältnis der Aminogruppen innerhalb eines Liganden wurde aufgrund der folgenden Berechnungsformel vom Wert berechnet, der durch das Ninhydrin-Verfahren bestimmt wurde. Mit Fortlauf der Ninhydrin-Reaktion im Hinblick auf primäre Aminogruppen ist das Ausmaß der Modifizierung der Aminogruppen durch Messen der Aminogruppen vor und nach der Modifizierung unter Anwendung des Ninhydrin-Verfahrens bekannt.

1 ml ionenausgetauschtes Wasser mit 0,004 g getrocknetem Adsorber wurden in ein Testrohr mit einem Schraubdeckel gegeben. 1 ml Ninhydrin-Testlösung (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) wurden in das Testrohr gegeben und das Rohr wurde in siedendem Wasser für 20 Minuten erwärmt. Nach Kühlen mit Leitungswasser wurden 8 ml Ethylcellusolve (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) zugegeben und sorgfältig vermischt. Die Adsorption des Überstands bei 570 nm wurde gemessen. 2-Aminoethanol (hergestellt von Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) wurde als Standard für die Aminogruppe verwendet. Modifizierungsverhältnis der Aminogruppen (%) = [(Menge der primären Aminogruppen vor der Modifizierung – Menge der primären Aminogruppen nach der Modifizierung)/Menge der primären Aminogruppen vor der Modifizierung] × 100

Die Modifizierungsverhältnisse der Aminogruppen innerhalb der jeweiligen Liganden für den Endotoxinadsorber gemäß den Beispielen 1 bis 21 sind in Tabelle 3 gezeigt.

Der primäre Aminogruppengehalt für den Adsorber A war 820 &mgr;mol/g (Trockengewicht). Der primäre Aminogruppengehalt für den Adsorber B war 680 &mgr;mol/g (Trockengewicht).

Testbeispiel 2 Messung der Entfernungsfähigkeit für Endotoxin in der Gegenwart von Heparin

Adsorber B und die Endotoxinadsorber der Beispiele 2 bis 14 und 18 bis 21 wurden in einer 0,2 N Natriumhydroxidlösung 18 Stunden oder mehr getaucht und dann mit injizierbarem destilliertem Wasser gewaschen, bis die Lösung neutral wurde, um diese endotoxinfrei zu machen.

0,7 g (Naßgewicht) eines jeden endotoxinfreien Adsorbers wurden in einen trockenen wärmesterilisierten Erlenmeyer-Kolben gegeben. 10 ml der Testlösung mit den in der unten gezeigten Tabelle angegebenen Zusammensetzung wurden in den Kolben gegeben, und der Kolben wurde 2 Stunden bei 30°C geschüttelt. Danach wurden die Menge an Endotoxin und an Heparin im Überstand gemessen (Tabelle 4).

LPS (E. coli 0110: B4, hergestellt von Sigma) wurde für Endotoxin verwendet, und injizierbares Heparinnatrium (hergestellt von Mitsubishi Pharma Corporation) wurde als Heparin verwendet.

Es wurde ersichtlich, daß durch Modifizieren der Aminogruppen der Wert Endotoxin/Heparin, der die Selektivität für Endotoxin bedeutet, größer als beim Vergleichsbeispiel 2 (Adsorber B) wurde.

Verfahren zum Messen von Endotoxin

Die Endotoxinkonzentration wurde unter Verwendung eines Lysatreagens (hergestellt von Seikagaku Corporation) und eines Endotoxinstandards (hergestellt von Seikagaku Corporation) durch das kinetische kolorimetrische Verfahren (14th Revision of Pharmacopoeia of Japan: Endotoxin Assay) gemessen.

Verfahren zum Quantifizieren von Heparin

Die Quantifizierung von Heparin wurde durchgeführt durch Messen der Heparinkonzentration einer jeden Probenlösung und einer jeden Standardlösung für die Kalibrierungskurve durch das Carbazol-Schwefelsäure-Verfahren, wobei kommerzielles 1.000 IU/ml injizierbares Heparinnatrium als Standardlösung diente.

Das injizierbare 1.000 IU/ml Heparinnatrium, verdünnt mit physiologischer Saline, zur Herstellung von 50 IU/ml- und 25 IU/ml-Lösungen und physiologische Saline, die als 0 IU/ml diente, wurden als Standardlösungen verwendet. Jede Probenlösung wurde zweifach mit physiologischer Saline verdünnt. 2,5 ml Natriumborat in Schwefelsäurelösung (9,5 mg/ml konzentrierter Schwefelsäurelösung) wurden in ein Testrohr mit einem Schraubdeckel gegeben und das Rohr wurde auf Eis ungefähr 20 Minuten gekühlt, dann wurden 0,5 ml einer Probenlösung in das Rohr gegeben und die Lösung durch Rühren vermischt. Nach 10-minütigem Sieden in siedendem Wasser wurde das Rohr auf Eis gekühlt, dann wurden 0,1 ml Carbazollösung (1,25 mg/ml Ethanollösung) in das Rohr gegeben und die Lösung durch Rühren gemischt. Nach 15-minütigem Sieden und Kühlen mit Wasser wurde die Adsorption bei 530 nm zum Quantifizieren von Heparin gemessen.

Testbeispiel 3 Messung der Fähigkeit zum Entfernen von Endotoxin in einem System mit koexistierendem Endotoxin, BSA und Heparin

Die Endotoxinadsorbenzien von Vergleichsbeispiel 1 (Adsorber A), Beispiel 1 (ABu-1) und Beispiel 9 (BBu-2) wurden bezüglich ihrer Fähigkeit zur Entfernung von Endotoxin in einem koexistierenden System aus Endotoxin, Rinderserumalbumin (BSA) und Heparin verglichen.

LPS (E. coli 0110: B4, hergestellt von Sigma) wurde als Endotoxin, injizierbares Heparinnatrium (hergestellt von Mitsubishi Pharma Corporation) als Heparin und Albumin von Rinderserum (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als Rinderserumalbumin verwendet.

Die Adsorbenzien wurden in eine 0,2 N Natriumhydroxidlösung 18 Stunden oder länger getaucht, dann mit injizierbarem destilliertem Wasser gewaschen, bis sie neutral wurden, um sie endotoxinfrei zu machen.

0,7 g (Naßgewicht) eines jeden endotoxinfreien Adsorbers wurden in einen trockenen wärmesterilisierten Erlenmeyer-Kolben gegeben. 10 ml Testlösung mit der unten in der Tabelle gezeigten Zusammensetzung wurde in den Kolben gegeben und der Kolben wurde 2 Stunden bei 30°C geschüttelt. Danach wurden die Menge an Endotoxin, an Heparin und an BSA im Überstand gemessen (Tabelle 5).

In Tabelle 5 bedeutet ET Endotoxin, Hep Heparin und BSA Rinderserumalbumin.

Verfahren zum Quantifizieren von BSA

Die BSA-Quantifizierung wurde durch Messen der Absorption bei 280 nm durchgeführt.

Testbeispiel 4 Entfernung von Endotoxin von Heparin koexistierender Lösung durch das Säulenverfahren

Eine Säule wurde mit 5 ml Endotoxinadsorber von Beispiel 1(ABu-1) gefüllt, mit 0,2 N Natriumhydroxidlösung 18 Stunden kontaktiert und dann mit injizierbarem destilliertem Wasser gewaschen, bis sie neutral wurde, um sie endotoxinfrei zu machen. 25 ml Pufferlösung, die unten beschrieben ist, wurde zum Äquilibrieren durch die Säule geleitet.

Eine Testlösung mit Heparin und eine endotoxinhaltige Testlösung mit der folgenden Zusammensetzung wurde durchgeleitet, und die Menge an Endotoxin und Heparin im Säuleneluat wurden gemessen (Tabelle 6).

Das Ergebnis der Endotoxinentfernung von einer heparinhaltigen Pufferlösung durch das Säulenverfahren ist in 1 gezeigt. In 1 bedeutet [C/Co] die Konzentration von Heparin oder Endotoxin, die Konzentration im Eluenten wird durch [C] dargestellt und die Konzentration in der Testlösung (Anfangswert) wird durch [Co] dargestellt.

Wie in 1 gezeigt ist, wurde Heparin nicht stark adsorbiert, und [C/Co] hat einen Wert, der eng bei eins liegt. Auf der anderen Seite ist ersichtlich, daß Endotoxin selektiv adsorbiert wurde, wobei [C/Co] von 0,01 oder weniger selbst bei einer Fraktion von 30 war.

Industrielle Anwendbarkeit

Weil der Endotoxinadsorber dieser Erfindung das selektive Adsorbieren und Entfernen von Endotoxin aus einer Lösung mit einer hochsauren Substanz wie Heparin ermöglicht, ist er als Basismaterial für die medizinische Therapie, Adsorber oder Füllstoff für die Chromatographie oder dgl. nützlich, um Endotoxin aus Lösungen zu entfernen, bei denen sehr saure Polysaccharide wie Heparin und dgl. koexistieren.


Anspruch[de]
Endotoxinadsorber, umfassend einen Liganden, bei dem Aminogruppen, die innerhalb eines Moleküls eines aminogruppenhaltigen Moleküls vorhanden sind, teilweise durch ein Molekül modifiziert sind, das in der Lage ist, mit einer Aminogruppe zu reagieren. Endotoxinadsorber gemäß Anspruch 1, worin der Ligand an einen Träger immobilisiert ist. Endotoxinadsorber gemäß Anspruch 2, worin der Träger ein Polysaccharid oder Derivat davon ist. Endotoxinadsorber gemäß Anspruch 3, worin das Polysaccharid Cellulose, Agarose, Dextran, Chitin oder Chitosan ist. Endotoxinadsorber nach einem der Ansprüche 2 bis 4, worin die Form des Trägers sphärisch, membranartig, granular oder faserig ist. Endotoxinadsorber gemäß Anspruch 5, worin der Träger sphärische Cellulose, sphärische Sepharose oder sphärisches Dextran ist. Endotoxinadsorber gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das aminogruppenhaltige Molekül Polylysin ist. Endotoxinadsorber nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das aminogruppenhaltige Molekül Polyethylenimin oder Polyallylamin ist. Endotoxinadsorber nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Molekül, das mit einer Aminogruppe reagieren kann, ein Molekül ist, das eine Aminbindung oder Amidbindung mit einer Aminogruppe bilden kann. Endotoxinadsorber gemäß Anspruch 9, worin das Molekül, das eine Aminbindung oder eine Amidbindung mit einer Aminogruppe bilden kann, zumindest eine Spezies ist, ausgewählt aus Carbonsäure, Epoxyverbindung und Aldehyd. Endotoxinadsorber gemäß Anspruch 9, worin das Molekül, das in der Lage ist, eine Amin- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe zu bilden, zumindest eine Spezies ist, ausgewählt aus Essigsäureanhydrid, Butylglycidylether und Phenylglycidylether. Endotoxinadsorber nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin das Molekül, das mit einer Aminogruppe reagieren kann, eine Amin- oder Amidbindung mit den intramolekularen Aminogruppen des aminogruppenhaltigen Moleküls bildet. Endotoxinadsorber gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Verhältnis der Modifizierung der Aminogruppen des aminogruppenhaltigen Moleküls 20 bis 60 % ist. Endotoxinadsorber, worin ein Ligand, der ein Polylysin ist, bei dem Aminogruppen teilweise durch ein Molekül modifiziert sind, das eine Amin- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe bilden kann, auf einem Träger immobilisiert ist. Endotoxinadsorber gemäß Anspruch 14, worin das Polylysin Epsilon-Polylysin ist. Endotoxinadsorber gemäß Anspruch 14 oder 15, worin der Träger ein Polysaccharid oder Derivat davon ist. Endotoxinadsorber gemäß Anspruch 16, worin das Polysaccharid Cellulose, Agarose, Dextran, Chitin oder Chitosan ist. Endotoxinadsorber gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, worin die Form des Trägers sphärisch, membranartig, granular oder faserig ist. Endotoxinadsorber gemäß Anspruch 18, worin der Träger sphärische Cellulose, sphärische Sepharose oder sphärisches Dextran ist. Endotoxinadsorber nach einem der Ansprüche 14 bis 19, worin das Molekül, das in der Lage ist, eine Amin- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe zu bilden, zumindest eine Spezies ist, ausgewählt aus Carbonsäure, Epoxyverbindung und Aldehyd. Endotoxinadsorber nach einem der Ansprüche 14 bis 19, worin das Molekül, das eine Amin- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe bilden kann, zumindest eine Spezies ist, ausgewählt aus Essigsäureanhydrid, Butylglycidylether und Phenylglycidylether. Endotoxinadsorber nach einem der Ansprüche 14 bis 21, worin das Verhältnis der Modifizierung der Aminogruppen des Polylysins von 20 bis 60 % ist. Verfahren zum Adsorbieren und Entfernen von Endotoxin durch Kontaktieren des Endotoxinadsorbers nach einem der Ansprüche 1 bis 22 mit einer endotoxinhaltigen Lösung. Verfahren zum selektiven Adsorbieren und Entfernen von Endotoxin durch Kontaktieren des Endotoxinadsorbers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 mit einer endotoxinhaltigen Lösung, die Heparin enthält. Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24, worin der Kontakt des Endotoxinadsorbers mit der endotoxinhaltigen Lösung unter Verwendung einer Säule durchgeführt wird, die mit dem Endotoxinadsorber gefüllt ist. Verfahren zur Herstellung des Endotoxinadsorbers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22, umfassend die Reaktion und teilweise Modifizierung der Aminogruppen, die innerhalb eines Moleküls des aminogruppenhaltigen Moleküls vorhanden sind, mit einem Molekül, das mit einer Aminogruppe reagieren kann. Verfahren zum Herstellen des Endotoxinadsorbers gemäß einem der Ansprüche 14 bis 22, umfassend das Immobilisieren von Polylysin ohne modifizierte Aminogruppen auf einem Träger, anschließende Reaktion der Aminogruppen des Polylysins mit einem Molekül, das in der Lage ist, eine Amino- oder Amidbindung mit einer Aminogruppe zu bilden.






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