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Dokumentenidentifikation DE102005040827A1 21.06.2007
Titel Verfahren zur Kompensation des Farblängsfehlers der Abbildungsoptik eines Mikroskops
Anmelder Carl Zeiss Jena GmbH, 07745 Jena, DE
Erfinder Höring, Lutz, Dr., 73432 Aalen, DE;
Nolte, Andreas, Dr., 37124 Rosdorf, DE
DE-Anmeldedatum 25.08.2005
DE-Aktenzeichen 102005040827
Offenlegungstag 21.06.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 21.06.2007
IPC-Hauptklasse G02B 21/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
Zusammenfassung Um ein Verfahren zur automatischen Kompensation des Farblängsfehlers einer Abbildungsoptik eines Mikroskops, das insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie einsetzbar ist, zu schaffen, wird ein Verfahren vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass vor der Bildaufnahme einer zu untersuchenden Probe zunächst eine Kalibrierung der Abbildungsoptik hinsichtlich des Farblängsfehlers mit einer Kalibrierprobe vorgenommen wird, dadurch, dass zunächst die zu kalibrierende Optikkonfiguration und die Beleuchtungswellenlänge ausgewählt wird und dass abschließend mit einem Autofokus mit monochromer Beleuchtung eine Speicherung des n-ten z-Werts für die einzelnen Wellenlängen in Form einer Wertetabelle (Look up table-LUT) erfolgt. Nach der Kalibrierung wird anschließend für jede Optikkonfiguration eine Eichkurve für den Farblängsfehler aus der Wertetabelle erstellt, die den Farblängsfehler der Abbildungsoptik in z-Richtung wiedergibt, und in weiteren Verfahrensschritten wird durch eine Verstellung in z-Richtung für ausgewählte Wellenlängen eine Bildaufnahme durchgeführt, bei der man n-Farben erhält, die über die Eichkurve abgefragt werden, und in einem letzten Verfahrensschritt entsteht durch eine Überlagerung der n Einzelbilder ein Bild mit verschiedenen Farben.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatischen Kompensation des Farblängsfehlers der Abbildungsoptik eines Mikroskops, das insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie zur Korrektur des verbleibenden Farblängsfehlers der Abbildungsoptik einsetzbar ist.

Bekannt ist, dass bei den konventionellen Mikroskopen, bei denen in der Fluoreszenzmikroskopie die Fluoreszenzsignale verschiedener Farbstoffe einer Probe nacheinander mit einer monochromen Kamera aufgenommen werden und zwischen den einzelnen Bildern bei verschiedenen Farben nicht nachfokussiert wird man eine Unschärfe in den Bildern erhält, die bei einer Überlagerung der Einzelbilder zu einem unscharfen Gesamteindruck führt. Grund dafür ist der Farblängsfehler der Abbildungsoptik, der zu einer Tiefendifferenz zwischen den Fokusebenen für verschiedene Wellenlängen führt. Aus der DE 41 28 506 A1 ist ein Verfahren zum Betreiben eines Spektrometers bekannt, das gewährleistet, dass unabhängig von der zur Messung ausgewählten Spektrallinie stets an derselben ausgewählten Stelle des Objektes gemessen wird, indem optische Elemente rechnergestützt in dem Beobachtungs- und/oder Beleuchtungsstrahlengang in Abhängigkeit von der am Monochromator eingestellten Wellenlänge rechnergestützt so verschoben werden, dass durch die chromatische Längsaberration dieser Elemente entstehende Fehler korrigiert werden. Aus der DE 101 56 506 C1 ist weiterhin ein Verfahren zur Erzeugung eines mehrfarbigen Bildes und ein Mikroskop bekannt, bei dem die beiden wellenlängenspezifischen Abbildungen zu einem mehrfarbigen und auf einem Display darstellbaren Bild überlagert werden und der Abstand der zu den beiden Wellenlängen gehörenden Fokalebenen durch eine Referenzmessung ermittelt wird. Aus der DE 103 34 162 A1 ist weiterhin eine Anordnung zur Korrektur von Farbfehlern in optischen Systemen, insbesondere in UV-Optiken, bekannt, mit der der Farbfehler des Objektivs in einem Hilfswellenlängenbereich weitgehend kompensiert und dem Objektiv dadurch ein farbkorrigiertes Bild zur Verfügung gestellt wird.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur automatische Kompensation des Farblängsfehlers der Abbildungsoptik eines Mikroskops, insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie, zu schaffen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass vor der Bildaufnahme einer zu untersuchenden Probe zunächst eine Kalibrierung der Abbildungsoptik hinsichtlich des Farblängsfehlers mit einer Kalibrierprobe vorgenommen wird, indem in einem ersten Verfahrensschritt die zu kalibrierenden Optikkonfiguration ausgewählt wird, dass in einem zweiten Verfahrensschritt die Kalibrierprobe eingelegt wird,

dass in einem anschließenden Verfahrensschritt die Beleuchtungswellenlänge ausgewählt wird und

dass abschließend mit einem Autofokus mit monochromer Beleuchtung eine Speicherung des n-ten z-Werts für die einzelnen Wellenlängen in Form einer Wertetabelle (Look up table, LUT) durchgeführt wird.

Nach der Kalibrierung wird anschließend für jede Optikkonfiguration eine Eichkurve für den Farblängsfehler aus der Wertetabelle erstellt, die den Farblängsfehler der Abbildungsoptik in z-Richtung aufzeigt. Die Eichkurve wird in einen Rechner eingelesen, um in Verbindung mit einem Hardwareautofokus des Mikroskopsystems bei Bedarf automatisch nachzufokussieren.

In weiteren Verfahrensschritten wird dann durch eine Verstellung in z-Richtung für ausgewählte Wellenlängen eine Bildaufnahme durchgeführt, bei der man n-Farben erhält, die über die Eichkurve abgefragt werden.

Abschließend erhält man in einem letzten Verfahrensschritt durch eine Überlagerung der n Einzelbilder analog oder digital ein Bild mit verschiedenen Farben ohne Nachfokussierung über einen Softwareautofokus.

Die Kalibrierprobe ist vorzugsweise ein Stufenpräparat, beispielsweise ein Gitter mit Bereichen, die hochtransparent sind und mit Bereichen, die für sichtbares Licht undurchlässig sind. Die Beleuchtungswellenlänge kann so gewählt werden, dass monochromes Licht oder eine Bande des sichtbaren Lichtes verwendet wird.

Wesentlich ist an dem neuen Verfahren zur automatischen Kompensation des Farblängsfehlers, dass eine Nachfokussierung über einen Softwareautofokus nicht mehr stattfindet, sondern dass durch die vor der eigentlichen Bildaufnahme vorgenommene Kalibrierung der Abbildungsoptik mittels einer Kalibrierprobe und einen Autofokus mit monochromer Beleuchtung hinsichtlich des Farblängsfehlers das Scharfeinstellen für die einzelnen Farben nicht mehr gemessen werden muss, im Gegensatz zu den bekannten Verfahren zur Kompensation des Farblängsfehlers, bei denen vorher für ein Objektiv die Eichkurve ermittelt und dann die einzelnen Farben gemessen werden müssen. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer verminderten Probenbelastung. Ist die Eichkurve genügend genau bestimmbar, kann damit auch das optische System für spezielle Objektive, die überwiegend für monochrome Aufnahmen benutzt werden, entlastet werden, da die Korrektur durch die andere Hard- und Software des Mikroskopsystems vorgenommen wird.

Dieses neue Verfahren zur automatischen Kompensation des Farblängsfehlers für die Fluoreszenzmikroskopie eignet sich auch für den Einsatz in Systemen, bei denen von Hand eine Verstellung in z-Richtung für ausgewählte Wellenlängen zwischen den verschiedenfarbigen Fluoreszenzaufnahmen durchgeführt wird, aber nicht für den Einsatz bei paralleler Mehrkanaldetektion von Fluoreszenzfarbstoffen oder für mehrfarbige Hellfeldaufnahmen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines schematisch in Ablaufdiagrammen dargestellten Verfahrens näher erläutert.

Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung des Farblängsfehlers einer Abbildungsoptik in z-Richtung für verschiedene Wellenlängen;

2 ein Ablaufdiagramm mit den erfindungsgemäßen Verfahrensschritten zur Kalibrierung;

3 ein Ablaufdiagramm des gesamten Verfahrens zur Bildaufnahme von beliebigen Proben.

1 zeigt eine Abbildungsoptik 1, bei der bei Lage eines Objektes in einer Objektebene 2 in z-Richtung aufgrund des Farblängsfehlers das Bild für unterschiedliche Wellenlängen in unterschiedlichen Bildebenen entsteht, Bild 3 bei blauem Licht, Bild 4 bei grünem Licht und Bild 5 bei rotem Licht. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird der Farblängsfehlers der Abbildungsoptik 1 eines nicht näher dargestellten Mikroskops, das insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie zur Korrektur des verbleibenden Farblängsfehlers einer Abbildungsoptik einsetzbar ist, automatisch kompensiert.

2 zeigt in einem Ablaufdiagramm die neuen Verfahrensschritte zur Kalibrierung einer Abbildungsoptik 1 für die Fluoreszenzmikroskopie hinsichtlich der automatischen Korrektur des Farblängsfehlers vor der eigentlichen Bildaufnahme von beliebigen Proben. Die Kalibrierung erfolgt dabei mit einer Kalibrierprobe für alle weiteren beliebigen Proben, wobei diese Kalibrierprobe spezielle Eigenschaften aufweisen muss, d.h. alle Farben der Kalibrierprobe müssen innerhalb der Schärfentiefe des Objektivs liegen. Die Messung erfolgt mit einem Autofokussystem mit monochromer Beleuchtung, wobei die Beleuchtungswellenlänge so gewählt wird, dass monochromes Licht oder eine Bande des sichtbaren Lichtes verwendet wird.

Vor der Bildaufnahme einer Probe wird zunächst eine Kalibrierung der Abbildungsoptik 1 hinsichtlich des Farblängsfehlers durchgeführt, indem in einem ersten Verfahrensschritt die zu kalibrierende Optikkonfiguration ausgewählt wird. In einem zweiten Verfahrensschritt wird die Kalibrierprobe eingelegt. Die Kalibrierprobe ist vorzugsweise ein Stufenpräparat, beispielweise ein Gitter mit Bereichen, die hochtransparent sind, und mit Bereichen, die durchlässig sind für sichtbares Licht.

In einem anschließenden Verfahrensschritt wird die Beleuchtungswellenlänge ausgewählt. Die Beleuchtungswellenlänge kann so gewählt werden, dass monochromes Licht oder eine Bande des sichtbaren Lichts verwendet wird. In einem abschließenden Verfahrensschritt erfolgt mit einem Autofokus mit einer monochromen Beleuchtung eine Speicherung des n-ten z- Werts für die einzelnen Wellenlängen in Form einer Wertetabelle (Look up table-LUT).

Nach dem Abschluss der Kalibrierung beginnt die Bildaufnahme von beliebigen Proben entsprechend dem in 3 dargestellten Ablaufdiagramm des gesamten Verfahrens zur Bildaufnahme. In weiteren Verfahrensschritten wird dann durch eine z-Verstellung für ausgewählte Wellenlängen eine Bildaufnahme durchgeführt bei der man n-Farben erhält, die über eine Eichkurve, die entsprechend dem in 2 dargestellten Verfahren ermittelt wurde, abgefragt wird.

Abschließend erhält man in einem letzten Verfahrensschritt durch eine Überlagerung der n Einzelbilder analog oder digital ein Bild mit verschiedenen Farben ohne Nachfokussierung über einen Softwareautofokus.


Anspruch[de]
Verfahren zur automatischen Kompensation des Farblängsfehlers der Abbildungsoptik eines Mikroskops, das insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie zur Korrektur des verbleibenden Farblängsfehlers der Abbildungsoptik einsetzbar ist,

dadurch gekennzeichnet,

dass vor der Bildaufnahme einer zu untersuchenden Probe zunächst eine Kalibrierung einer Abbildungsoptik hinsichtlich des Farblängsfehlers mit einer Kalibrierprobe vorgenommen wird dadurch,

dass in einem ersten Verfahrensschritt die zu kalibrierenden Optikkonfiguration ausgewählt wird,

dass in einem anschließenden Verfahrensschritt die Kalibrierprobe eingelegt und in einem weiteren Verfahrensschritt die Beleuchtungswellenlänge ausgewählt wird und dass in einem abschließenden Verfahrensschritt vorzugsweise mit einem Autofokus mit monochromer Beleuchtung eine Speicherung des n-ten z- Werts für die einzelnen (n-ten) Wellenlängen in Form einer Wertetabelle erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Kalibrierprobe insbesondere ein Stufenpräparat, in Form eines Gitters mit Bereichen, die hochtransparent sind, und mit Bereichen, die undurchlässig sind für sichtbares Licht, eingesetzt wird. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungswellenlänge so gewählt wird, dass monochromes Licht oder eine Bande des sichtbaren Lichtes verwendet wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Kalibrierung für jede Optikkonfiguration aus der Wertetabelle eine Eichkurve erstellt wird, die den Farblängsfehler der Abbildungsoptik für die Wellenlängen 1-n in z-Richtung darstellt und dass die Eichkurve anschließend in einen Rechner eingelesen wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass durch eine Verstellung in z-Richtung für ausgewählte Wellenlängen eine Bildaufnahme durchgeführt wird, bei der man n-Farben erhält, die über die Eichkurve abgefragt werden. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass durch eine Überlagerung der n Einzelbilder analog oder digital ein scharfes Bild mit verschiedenen Farben entsteht.






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