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Dokumentenidentifikation DE60123819T2 02.08.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001328814
Titel METHODE ZUR IN VIVO IDENTIFIZIERUNG VON INTRAZELLULAREN EPITOPEN
Anmelder S.I.S.S.A. Scuola Internazionale Superiore die Studi Avanzati, Triest/Trieste, IT
Erfinder CATTANEO, S.I.S.S.A. Scuola Intern., Antonino, I-34014 Trieste, IT;
VISINTIN, S.I.S.S.A. Scuola Intern., Michela, I-34014 Trieste, IT
Vertreter Lederer & Keller, 80538 München
DE-Aktenzeichen 60123819
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 22.10.2001
EP-Aktenzeichen 019837764
WO-Anmeldetag 22.10.2001
PCT-Aktenzeichen PCT/IT01/00535
WO-Veröffentlichungsnummer 2002035237
WO-Veröffentlichungsdatum 02.05.2002
EP-Offenlegungsdatum 23.07.2003
EP date of grant 11.10.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.08.2007
IPC-Hauptklasse G01N 33/68(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 15/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vivo-Identifizierung intrazellulärer Epitope. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum in vivo-Kartieren von Epitopen eines Antigens, das normalerweise in einer Zelle vorhanden ist, unter Verwendung intrazellulärer Antikörper.

Ein wesentliches Element zur effizienten Verwendung von Antikörpern sowie von intrazellulären Antikörpern ist die Identifizierung seines Epitops/seiner Epitope, d. h. des Antigenanteils, den der Antikörper selbst erkennt. Es ist in der Tat für Forschung, Diagnostik und Therapie erwünscht, das Epitop eines Antigens zu kennen und Antikörper zu selektieren, die an dasselbe binden können.

Es sind viele verschiedene Ansätze verwendet worden, um die Epitope eines Antigens zu kartieren, die alle in vitro-Technologien und sehr arbeitsintensive Verfahren verwenden. Die Einschränkung der in vitro-Technologien leitet sich aus der Tatsache ab, dass die Antigen-Antikörper-Bindung nicht in dem natürlichen funktionalen Kontext des Antigens untersucht worden ist, d. h. der intrazellulären Umgebung.

Ein Verfahren (Peptid-Scanning) verwendet: a) Synthese von Peptiden, die wenige um Aminosäuren überlappen und als ganzes die vollständige Aminosäuresequenz des untersuchten Antigens umfassen, und b) Provozieren jedes Peptids mit Antikörpern. Das Verfahren ist sehr zeitraubend, arbeitsintensiv, teuer und liefert insgesamt nicht immer befriedigende Ergebnisse. In der Tat besteht ein Epitop, das von einem Antikörper erkannt wird, nicht immer aus einer linearen Aminosäuresequenz.

Derzeit ist die nützlichste Technologie zur Identifizierung von Epitopen, die von unterschiedlichen Antikörpern erkannt werden, die Verwendung von Peptiden mit Zufallssequenzen, die entweder aus Peptid-Phagen-Bibliotheken ausgewählt oder synthetisch synthetisiert worden sind. Die Strategie ermöglicht ferner das Identifizieren von Peptiden, die als Epitope aktiv sind, ohne Homologie mit der Antigen-Primärsequenz zu haben, was zu einem diskontinuierlichen oder Konformationsepitop führt. Die Methodik ermöglicht damit das Kartieren einer virtuellen Kollektion von Epitopen, die von einem gegebenen Antikörper erkannt werden, selbst ohne strukturelle Korrelation mit dem Ausgangsantigen.

Alternativ können mutierte, abgeschnittene oder deletierte Formen des Ziel-Antigens gentechnisch verändert, in geeigneten zellulären Systemen exprimiert, gereinigt und individuell Assays unterzogen werden. Dieses Verfahren ist offensichtlich auch sehr arbeitsintensiv.

Die Autoren der vorliegenden Erfindung stellen nun ein Verfahren zur Verfügung, das in vivo in der natürlichen Umgebung Epitope von intrazellulären Antigenen mittels Antikörpern identifiziert, die in der zellulären Umgebung exprimiert werden und aktiv sind (intrazelluläre Antikörper).

Die Verwendung intrazellulärer Antikörper, d. h. Antikörpern oder Teilen davon, die innerhalb einer Zelle exprimiert werden und aktiv sind, stellt eine erfolgreiche Technologie dar, um mit der Funktion eines Proteins innerhalb seiner physiologischen intrazellulären Umgebung in Wechselwirkung zu treten (Cattaneo & Neuberger, 1987; Carlson, 1988; Biocca & Cattaneo, 1995; Cattaneo & Biocca, 1997; Cattaneo & Biocca, 1999; Marasco, 1997). Die Technologie ermöglicht somit das Erreichen des funktionalen Ausschaltens des Zielproteins. Es ist damit möglich, einer Zelle oder einem Organismus mittels geeigneter intrazellulärer Antikörper einen gegebenen Phänotyp zu verleihen.

Die Technologie von intrazellulären Antikörpern basiert auf zwei vorteilhaften Aspekten: 1) der praktisch unbegrenzten Verfügbarkeit des (natürlichen oder künstlichen) Repertoires des Immunsystems, wodurch eine Quelle für Moleküle bereitgestellt wird, die für Reaktionen gegen jegliches Protein mit hoher Affinität und Spezifität geeignet sind, und 2) der Möglichkeit, ein Protein (und danach einen Antikörper) durch geeignete autonome und dominante intrazelluläre Lokalisierungssignale zu unterschiedlichen intrazellulären Kompartments zu führen.

Die Technologie wird geeigneterweise für Forschungs- und Biotechnologieanwendungen verwendet, insbesondere für die Gentherapie für Pathologien bei Mensch und Tier, um experimentelle Modelle für Pathologien zu liefern, sowie in der Pflanzenbiotechnologie, um pathogenresistente transgene Pflanzen zu produzieren.

Die in letzter Zeit erfolgte umfassende Entwicklung von Genomsequenzierungstechnologien sowohl für Menschen als auch für andere Spezies führte zu einer erhöhten Nachfrage nach der Bereitstellung von Technologien, die zur Aufklärung der Funktion der identifizierten Gene geeignet sind, was somit zu einem neuen Forschungsgebiet führte, das als funktionale Genomforschung bezeichnet wird. Hierzu gehören Verfahren und Technologien, die zum Identifizieren von Genfunktionen in einer Weise geeignet sind, die so weit wie möglich parallel, mit hohem Durchsatz und automatisierungsgeeignet ist. Derzeit stellt diese Stufe einen bedeutsamen Flaschenhals für die Industrie und insbesondere für die Verfahren dar, die von Genen zu neuen Klassen von Arzneimitteln führen.

In neuerer Zeit wurde eine Entwicklung der intrazellulären Antikörpertechnologie eingeführt, die ihre Verwendung als elektive Methodik für Programme der funktionalen Genomforschung ermöglicht, die sogenannte ITT (intrabody trap technology; Technologie des Einfangens innerhalb des Körpers). Die Methodik ermöglicht das Isolieren oder Selektieren der Subpopulation, die effizient in vivo arbeiten kann, von allen Antikörpern, die gegen ein Zielprotein gerichtet sind, in der intrazellulären Umgebung. Die Technologie ist in der Internationalen Patentanmeldung PCT WO 00/54057 beschrieben. Sie besteht zusammengefasst aus einem Verfahren zum Selektieren von Antikörpern aus Phagenbibliotheken oder aus Immun-Splenozyten, wobei ihre Fähigkeit zur Bindung eines Antigens in der intrazellulären Umgebung gegeben ist. Das Verfahren ermöglicht das Überwinden einer Einschränkung in der intrazellulären Antikörpertechnologie, d. h. der Tatsache, dass nicht alle Antikörper, die in vitro ein Antigen binden können, danach in der Lage sind, das gleiche Antigen zu binden, wenn sie als zytoplasmische Antikörper exprimiert werden. Antikörper, die durch das ITT-Verfahren auf Basis des Doppelhybridsystems selektiert sind, können sich in der intrazellulären Umgebung korrekt falten und dort an das Zielantigen binden. Sie sind daher für die Verwendung als intrazelluläre Antikörper "validiert" worden (Visintin et al., 1999). In allen Anwendungen der ITT wird das Antigen mit einer Antikörperbibliothek provoziert.

Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben diese Technologie zur Identifizierung von Epitopen, d. h. den Antigenabschnitten, die einen Antikörper erkennen und an ihn binden können, vorteilhaft angepasst und modifiziert. Derartige Epitope werden mittels der Selektierungstechnik in vivo von dem Antikörper selbst erkannt. Gemäß der Technologie der Erfindung ist im Gegensatz zu ITT der Antikörper das konstante Element, das mit einer Bibliothek oder einer Reihe von Antigenen provoziert wird. Diese neue Technik der in vivo-Epitopkartierung eines spezifischen intrazellulären Antikörpers (IVEM) stellt eine geeignete Alternative zu den bekannten in vitro-Techniken dar.

Die Einfachheit der Technik macht dieselbe für Screening im Großmaßstab anwendbar. Der Vorteil des Verfahrens resultiert auch aus der Tatsache, dass die Epitopidentifizierung in vivo ohne Notwendigkeit von Peptidsynthese stattfindet, jedoch mit der gleichen, wenn nicht einer höheren Genauigkeit als bekannte Verfahren. Das Verfahren ist auch in der Lage, die Identifizierung von Epitopen, die für klinische, diagnostische und pharmakologische Anwendungen brauchbar sein sollen, mit Screenings im Großmaßstab innerhalb einer physiologischen Umgebung zu beschleunigen.

Weil sich zunehmend abzeichnet, dass die aktiven Stellen eines Proteins besser konserviert werden als die Gesamtstruktur, ist es ferner durch das erfindungsgemäße Verfahren möglich, ancestrale Proteine (Urproteine) mit ähnlichen Funktionen zu identifizieren.

Das Verfahren ermöglicht daher die in vivo-Identifizierung der Epitope eines intrazellulären Proteins. Es ist bekannt, dass viele intrazelluläre Proteine strukturell homologe Domänen oder Module enthalten, die an Protein-Protein-(z. B. SH2, SH3, PH, WW, PTB, PDZ-Domänen; Pawson, 1965) oder Protein-DNA-Wechselwirkungen beteiligt sind (z. B. Zinkfinger, Homeo-box, Helix-Schleife-Helix, Chromodomänen, Bromodomänen). Die Kenntnis der Spezifität des Antikörpers für eine Domäne in Bezug auf ähnliche Domänen, die zu anderen Proteinen gehören, ist eine wesentliche Vorbedingung für Anwendungen, die für intrazelluläre Antikörper vorgesehen sind.

Die Informationen sind auch in allen der konventionelleren Verwendungen von Antikörpern wesentlich, und die Einfachheit des vorliegenden Verfahrens bietet eine einfache Lösung für diesen Bedarf. Demnach wird ein interessierender Antikörper, der auf eine(n) dieser Proteinmodule oder -domänen zielt, mit einer Bibliothek der Proteindomänen derselben Familie provoziert.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit in analoger Weise das Identifizieren der Spezifität eines gegebenen Antikörpers für eine Familie korrelierter Proteine sowie Isoformen eines Proteins (d. h. Isoformen, die aus alternativem Splicing resultieren) und der Spezifität eines gegebenen Antikörpers für Familien von evolutionär korrelierten Proteinen. Dadurch können phylogenetische Studien sehr leicht durchgeführt werden.

Eine weitere sehr interessante Anwendung, die durch die vorliegende Erfindung möglich wird, wird durch die leichtere Isolierung spezifischer Antikörper für mutierte Formen eines gegebenen Proteins wiedergegeben. In diesem Aspekt besteht die Antigenbibliothek aus einer Sammlung von Punktmutanten des interessierenden antigenen Proteins. Die Isolierung von Antikörpern für mutierte Formen von intrazellulären tau-Proteinen, die in neurodegenerativen Pathologien als tau-Pathien vorhanden sind (M. Hong et al., 1998; M. G. Spillantini et al., 1998; Goedert et al., 1999), oder für p21-ras, das in vielen menschlichen Krebsen vorhanden ist (Barbacid, 1987; Grand und Owen, 1991), kann leichter als zuvor durchgeführt werden.

Als beispielhaftes experimentelles System haben die Autoren tau-Protein verwendet, ein Protein, das an Morbus Alzheimer beteiligt ist. Die Erfindung betrifft jedoch ein allgemeines Verfahren für die Epitopidentifizierung.

Daher ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von Epitopen des tau-Proteins, die intrazellulär an einen spezifischen Antikörper binden können, umfassend:

  • a) Cotransformieren von Zellen mittels eines ersten Vektors, der die Nukleotidsequenz enthält, die die Region eines Anti-tau-Antikörpers kodiert, die das tau-Protein erkennen und intrazellulär daran binden kann, und mittels einer zweiten Vektorfamilie, wobei jedes Mitglied der Familie eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Peptid kodiert, wobei eine Peptidbibliothek als Ganzes gebildet wird;
  • b) Züchten cotransformierter Zellen in einer derartigen Umgebung, dass nur Zellen, bei denen die Antikörperregion und das Peptid einander erkennen und miteinander in Wechselwirkung treten, sich replizieren können und/oder erkennen können, weil die Antikörperregion, die das Peptid erkennen und intrazellulär daran binden kann, mit einem ersten Molekül assoziiert ist; das Peptid mit einem zweiten Molekül assoziiert ist; die Wechselwirkung zwischen dem ersten und dem zweiten Molekül einen selektierbaren Phänotyp und/oder ein erkennbares Signal erzeugt; und die Wechselwirkung zwischen dem ersten und dem zweiten Molekül nur erfolgt, wenn die Antikörperregion und das Peptid einander erkennen und miteinander in Wechselwirkung treten;
  • c) Selektieren der Zellen und Identifizieren des Peptids als Epitop.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Peptidbibliothek eine Bibliothek von tau-Peptidfragmenten oder phylogenetischen Varianten oder mit Pathologie assoziierten Mutanten oder Splicing-Isoformen davon.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Zellen Hefezellen.

Die Erfindung wird nun gemäß bevorzugten Ausführungsformen in Bezug auf die folgenden Figuren beschrieben: 1 ist ein Schema von tau-Protein-Deletionsmutanten; 2 zeigt die Western-Blot-Analyse von lexA-tau-Deletionsmutanten-Fusionsproteinen, die unter Verwendung eines polyklonalen Anti-lexA-Antikörpers (Gruppe a), eines generischen monoklonalen Anti-tau-Antikörpers (Tau-1) (Gruppe a), eines weiteren generischen monoklonalen Anti-tau-Antikörpers (7.51) (Gruppe c) sichtbar gemacht wurden.

3 zeigt die Karte der tau-Deletionsmutanten, wie beschrieben in Fasulo et al. 200 (Gruppe a), und die Anti-tau-Spezifität von scFv2, scFv14 und scFv52-Fragmenten in Bezug auf verschiedene Deletionsmutanten in vivo (Gruppe b). Die Epitop-scFv-Bindung wird mittels ITT-Technologie detektiert, wobei die Transaktivierung von HIS3 und lacZ-Genen und daher die Fähigkeit der Zellen gemessen wird, in einem Medium ohne Histidin zu wachsen und &bgr;-Galactosidase zu synthetisieren.

Beispiel 1 Tau-Mutanten und Fusionskonstrukte mit lexA

Deletionsmutanten des tau-Proteins wurden "in frame" an lexA-Bindungsdomänen fusioniert. Diese DNA-Bindungsdomäne stammt von einem Repressorprotein von E. coli (Brent & Ptashne, 1985) (Golemis & Brent, 1992) (Silver et al., 1986). LexA-Bindungsstellen sind stromaufwärts von Reportergenen an der Transkriptionsaktivierungsregion oder dem Promoter lokalisiert. Die Bindung von lexA-tau-Deletionsmutantenproteinen kann lexA-Bindungsstellen erreichen und binden, sie können die Transkription der Reportergene jedoch nicht aktivieren, weil die Transkriptionsaktivierungsdomäne fehlt. Tau-Fragmente sind in 1 dargestellt und sind:

  • – Tau 151-274 einschließlich der Prolin-reichen Domäne und der R1-Wiederholungssequenz, die an Mikrotubuli binden kann;
  • – Tau 151-305 einschließlich der Prolin-reichen Domäne und der R1- und R2-Wiederholungssequenzen, die an Mikrotubuli binden können;
  • – Tau 151-336 einschließlich der Prolin-reichen Domäne und der R1-, R2- und R3-Wiederholungssequenzen, die an Mikrotubuli binden können;
  • – Tau 151-368 einschließlich der Prolin-reichen Domäne und der R1-, R2-, R3- und R4-Wiederholungssequenzen, die an Mikrotubuli binden können;
  • – Tau 151-391 einschließlich der Prolin-reichen Domäne und der R1-, R2-, R3- und R4-Wiederholungssequenzen, die sich bis zu dem Glu-391-Rest erstrecken;
  • – Tau 151-402 einschließlich der Prolin-reichen Domäne und all der Wiederholungssequenzen, die sich bis zu dem Asp-402-Rest erstrecken;
  • – Tau 151-412 einschließlich der Prolin-reichen Domäne und all der Wiederholungssequenzen, die sich bis zu dem Ser-412-Rest erstrecken;
  • – Tau 151-422 einschließlich der Prolin-reichen Domäne und all der Wiederholungssequenzen, die sich bis zu dem Ser-422-Rest erstrecken;
  • – dGAE einschließlich der minimalen Region, die den PHF-Filamentkern bildet, der bei Patienten mit Morbus Alzheimer beobachtet wurde.

Beispiel 2 Transformation mit tau-Mutanten und deren Exprimierung

Plasmid-DNA, die lexA-Domäne kodiert, fusioniert an tau-Protein-Deletionsmutanten, wurde nach einem Standardverfahren, das Lithiumacetat enthielt, zum Transformieren des L40 Hefestamms (Hollenberg et al., 1995) verwendet, um permeable Hefezellen herzustellen. Das Verfahren wurde von Clontech auf Basis der zuvor veröffentlichten Protokolle bereitgestellt (Gietz et al., 1992; Hill et al., 1991; Schiestl & Gietz, 1989). Hefezellen wurden unter Verwendung von 0,1 &mgr;g Plasmid-DNA und 100 &mgr;g Lachssperma als Träger in einer Lösung, die Lithiumacetat, Polyethylenglykol und Dimethylsulfoxid enthielt, transformiert. Transformierte Zellen wurden auf Minimalmedium (Synthetic Dropout) ausgestrichen, das alle Aminosäuren außer Tryptophan enthielt, um den erhaltenen Phänotyp zu identifizieren. Der Vektor, der zum Exprimieren der an tau-Deletions-Mutantproteine fusionierten lexA-Domäne verwendet wurde, konnte in der Tat das Ernährungsdefizit ausgleichen, das aus dem Mangel an Tryptophan resultierte, wodurch Hefewachstum ohne diese Aminosäure möglich war.

Von Hefezellen produzierte Hybridproteine wurden aus transformierter Hefekultur mit einem Extraktionspuffer extrahiert, der 10% &bgr;-Merkaptoethanol, 2% SDS, 0,1% Bromphenolblau und 10% Glycerin enthielt (Sambrook et al., 1990).

Das Exprimierungsniveau von Fusionsproteinen wurde durch Western Blot-Analyse unter Verwendung polyklonaler Anti-lexA-Protein-Antikörper (2a), Anti-tau mAbs: Tau-1 (Roche) (2b) und 7.51 (Novak et al., 1991) (2c) bewertet.

Die Experimente zeigen, dass tau-Deletionsmutanten durch die beiden Anti-tau-Antikörper in unterschiedlicher Weise erkannt werden, wodurch gezeigt wird, dass gut exprimierte Proteine ein geeignetes Molekulargewicht haben und dann die Translation korrekt durchlaufen und korrekt bekannte Epitope exprimieren, die von verschiedenen verwendeten Antikörpern erkannt werden.

Beispiel 3 Cotransformation von tau-Mutanten mit einkettigen (ScFv) Anti-tau-Antikörperfragmenten, die mit der ITT-Methode selektiert wurden

Das Experiment verwendete eine Gruppe von einkettigen Fv-Fragmenten (scFv), die mittels ITT-Technologie selektiert worden waren (Visintin et al., 1999 und PCT WO 00/54057). Eine scFv-Fragmentbibliothek, die auf der Oberfläche filamentförmiger Bakteriophagen offenlag, wurde Screening mit dem gereinigten rekombinanten tau-Protein unterzogen, das an eine feste Phase gebunden war. Nach zwei Adsorptionszyklen, Eluierung, Wachstum der eluierten Phagen in E. coli, wurde die "polyklonale" Population von mit Anti-tau-Protein angereicherten Antikörperfragmenten in dem Doppelhybrid-Expressionsvektor subkloniert und in dem Doppelhybridsystem auf tau-Protein-Bindungsfähigkeit getestet. Aus Hefezellen, die in Abwesenheit von Histidin selektiert worden waren, wurden Anti-tau-scFv-Antikörperfragmente isoliert, die tau intrazellulär binden konnten.

Hefekolonien, die mit tau-Mutanten und mit jedem der ITT-selektierten scFvs transformiert worden waren, wurden auf Medium ausgestrichen, das für die Identifizierung des Phänotyps aus dem Ernährungsreporter HIS3 selektiv war, der sich unter der Kontrolle der lexA-Bindungsstellen befand, dessen Exprimierung den Zellen das Wachstum in Abwesenheit von Histidin ermöglicht.

Die Rekonstitution des Transkriptionsfaktors durch spezifische Antigen-Antikörper-Wechselwirkung ermöglicht die Transkription von sowohl HIS3- als auch lacZ-Reportergenen. Die Identifizierung dieser Wechselwirkung erfolgt durch qualitative Analyse von Kolonien, die in Abwesenheit von Histidin gewachsen sind, und durch Farbveränderung (von weiß nach blau) der gleichen Kolonie in einem kolorimetrischen Assay auf Exprimierung von &bgr;-Galactosidase.

Die Spezifität der drei unterschiedlichen scFv-Fragmente (2, 14, 52) gegen die Gruppe der tau-Antikörperfragmente ist in 3 gezeigt und in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1 Antigen

3 zeigt die Identifizierung von tau-Proteinepitopen durch einkettige variable Anti-tau-Fragmente, scFv2, scFv14 und scFv52. Das Wachstum auf His-Schalen und der &bgr;-Gal-Phänotyp zeigen, dass tau-Peptide mit einem oder mehreren der drei scFv-Fragmente in Wechselwirkung treten. Insbesondere die S412-S422- und N368-E391-Fragmente enthalten ein in vivo erkennbares Epitop.

Beispiel 4 Selektion mit dem IACT-Verfahren

Gemäß dem Verfahren, das in der PCT-Anmeldung WO 00/54057 offenbart wird, wurde eine Reihe von 18 neuen Anti-tau-ScFvs (A bis Y) selektiert und mit der gleichen Gruppe der Tau-Deletionsmutanten von Beispiel 1 außer dGAE charakterisiert.

Jeder Antikörper wurde in vivo mit jeder der tau-Deletionsmutanten gemäß dem Verfahren von WO 00/54057 provoziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt und zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren (IVEM) die Identifizierung von drei Hauptregionen (I151-K274; N368-E391; D402-S412) von tau ermöglichte, die von mit dem IACT-Verfahren selektierten Antikörpern erkannt wurden.

Tabelle 2

Dann ermöglichte das Selektionsverfahren (IVEM) eine rasche Identifizierung der Epitope, die in vivo von ScFvs erkannt wurden, welche zuvor mit dem IACT-Verfahren selektiert worden waren, wodurch eine wirksame Alternative zu traditionellen teuren und zeitraubenden Verfahren geboten wird. Außerdem wird nur mit Hilfe der vorliegenden Technik eine leichte und präzise Identifizierung der in vivo erkennenden Antigenregion erreicht.

Bibliographie

  • – Barbacid (1987) ras genes. Annu. Rev. Biochem. 56, 779–828.
  • – S. Biocca & A. Cattaneo (1995). Intracellular immunization: antibody targeting to subcellular compartments. Trends Cell Biol 5, 248–252.
  • – R. Brent & M. Pthashne (1985) A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor. Cell 43 (3 Pt 2), 729–36.
  • – J. R. Carlson (1988). A new means of inducibly inactivating a cellular protein. Mol Cell Biol 8(6), 2638–46.
  • – A. Cattaneo & S. Biocca (1997). Intracellular Antibodies: Development and Applications (Springer, Herausgeber).
  • – A. Cattaneo & S. Biocca (1999). The selection of intracellular antibodies. Trends Biotechnol 17(3), 115–21.
  • – A. Cattaneo & M. S. Neuberger (1987). Polymeric immunoglobulin M is secreted by transfectants of non-lymphoid cells in the absence of immunoglobulin J chain. Embo J 6(9), 2753–8.
  • – A. Fasulo et al. (2000). J. Neurochem. 75, 624–633.
  • – D. Gietz et al., (1992). Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res 20(6), 1425.
  • – Goedert et al., (1999). Tau gene mutation in familial progressive subcortical gliosis. Nature Medicine, 5, 454–457.
  • – E. A. Golemis & R. Brent (1992). Fused protein domains inhibit DNA binding by LexA. Mol Cell Biol 12(7), 3006–14
  • – Grand und Owen (1991). The biochemistry of ras p21. Biochem. J. 279, 609–631.
  • – J. Hill et al., (1991). DMSO-enhanced whole cell yeast transformation [veröffentlichtes Erratum erschien in Nuclei Acids Res, 11. Dezember 1991; 19(23): 6688] Nucleic Acids Res 19(20), 5791.
  • – S. M. Hollenberg et al., (1995). Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Molecular and Cellular Biology 15(7), 3813–3822.
  • – M. Hong et al. (1998). Mutation-specific functional impairments in Distinct Tau isoforms of Heriditary FTDP-17. Science, 282, 1914–1917.
  • – W. A. Marasco (1997). Intrabodies: turning the humoral immune system outside in for intracellular immunization. Gene Ther 4(1), 11–5.
  • – M. Novak et al. (1991). Difference between the tau protein of Alzheimer paired helical filament core and normal tau revealed by epitope analysis of monoclonal antibodies 423 and 7.51. Proc Natl Acad Sci USA 88(13), 5837–41.
  • – J. Sambrook, E. F. Fritsch & R. Maniatis (1990). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor NY edit (Press, C. S. H. I., Herausgeber)
  • – R. H. Schiestl & R. D. Gietz (1989). High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier Curr Gen 16(5–6), 339–46.
  • – P. A. Silver, R. Brent & M. Ptashne (1986). DNA binding is not sufficient for nuclear localization of regulatory proteins in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 6(12), 4763–6.
  • – M. G. Spillantini et al. (1998). Mutation in the gene in familial multiple system taupathy with presenile dementia. Proc. Natl. Acad Sci USA, 95, 7737–7741.
  • – Visintin et al. (1999). Selection of antibodies for intracellular function using a two-hybrid system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 11723–11728.


Anspruch[de]
Verfahren zum Identifizieren von Epitopen des tau-Proteins, die intrazellulär an einen spezifischen Antikörper binden können, umfassend:

a) Cotransformieren von Zellen mittels eines ersten Vektors, der die Nukleotidsequenz enthält, die die Region eines Anti-tau-Antikörpers kodiert, die das tau-Protein erkennen und intrazellulär daran binden kann, und mittels einer zweiten Vektorfamilie, wobei jedes Mitglied der Familie eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Peptid kodiert, wobei eine Peptidbibliothek als Ganzes gebildet wird;

b) Züchten cotransformierter Zellen in einer derartigen Umgebung, dass nur Zellen, bei denen die Antikörperregion und das Peptid einander erkennen und miteinander in Wechselwirkung treten, sich replizieren können und/oder erkennen können, weil die Antikörperregion, die das Peptid erkennen und intrazellulär daran binden kann, mit einem ersten Molekül assoziiert ist; das Peptid mit einem zweiten Molekül assoziiert ist; die Wechselwirkung zwischen dem ersten und dem zweiten Molekül einen selektierbaren Phänotyp und/oder ein erkennbares Signal erzeugt; und die Wechselwirkung zwischen dem ersten und dem zweiten Molekül nur erfolgt, wenn die Antikörperregion und das Peptid einander erkennen und miteinander in Wechselwirkung treten;

c) Selektieren der Zellen und Identifizieren des Peptids als Epitop.
Verfahren zum Identifizieren von Epitopen des tau-Proteins, die intrazellulär an einen spezifischen Antikörper binden können, nach Anspruch 1, wobei die Peptidbibliothek eine Bibliothek von tau-Peptidfragmenten oder phylogenetischen Varianten oder mit Pathologie zusammenhängenden Mutanten oder Splicing-Isoformen davon ist. Verfahren zum Identifizieren von Epitopen des tau-Proteins, die intrazellulär an einen spezifischen Antikörper binden können, nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zellen Hefezellen sind.






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