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Dokumentenidentifikation DE102006004165A1 09.08.2007
Titel Breitbandextraktion aus Blut für massenspektrometrische Proteinprofile
Anmelder Bruker Daltonik GmbH, 28359 Bremen, DE
Erfinder Franzen, Jochen, 28359 Bremen, DE;
Baum, Hans-Jakob, 28832 Achim, DE;
Michelmann, Karsten, 27243 Harpstedt, DE
DE-Anmeldedatum 30.01.2006
DE-Aktenzeichen 102006004165
Offenlegungstag 09.08.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 09.08.2007
IPC-Hauptklasse G01N 33/48(2006.01)A, F, I, 20060130, B, H, DE
IPC-Nebenklasse B01L 3/02(2006.01)A, L, I, 20060130, B, H, DE   G01N 33/68(2006.01)A, L, I, 20060130, B, H, DE   G01N 27/62(2006.01)A, L, I, 20060130, B, H, DE   G01N 1/40(2006.01)A, L, I, 20060130, B, H, DE   
Zusammenfassung Die Erfindung bezieht sich auf die Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Bestimmung von Proteinprofilen aus Blut, wobei die zu messenden Proteine mit möglichst reproduzierbaren Verhältnissen ihrer Konzentration durch eine Breitbandextraktion gewonnen werden. Die Proteinprofile können beispielsweise für medizinische Diagnosen, aber auch zur Kontrolle der Wirksamkeit von Medikationen verwendet werden.
Die Erfindung stellt ein Probenvorbereitungsverfahren bereit, das die Breitbandextraktion durch reversible Immobilisierung an bindungsaktiven Festkörper-Oberflächen nach Entnahme des Blutes noch im ärztlichen Labor aus dem frischen Vollblut, dem Blutplasma oder dem Blutserum vornimmt und nur die extrahierten Substanzen, vorzugsweise im immobilisierten Zustand, dem massenspektrometrischen Labor für die Messung des Substanzprofils zuführt. Damit wird weitgehend vermieden, dass sich die Substanzkonzentrationen durch chemische oder enzymatische Prozesse im stets reaktiven Blut während der wechselnd langen Transportzeiten nichtreproduzierbar verändern, und es kann auf den Zusatz von Enzymhemmern oder auf ein Einfrieren auf minus 80°C für den Transport zum massenspektrometrischen Laboratorium verzichtet werden.

Beschreibung[de]

Die Erfindung bezieht sich auf die Probenvorbereitung für die massenspektrometrische Bestimmung von Proteinprofilen aus Blut, wobei die zu messenden Proteine mit möglichst reproduzierbaren Verhältnissen ihrer Konzentrationen durch eine Breitbandextraktion gewonnen werden. Die Proteinprofile können beispielsweise für medizinische Diagnosen, aber auch zur Kontrolle der Wirksamkeit von Medikationen verwendet werden.

Die Erfindung stellt ein Probenvorbereitungsverfahren bereit, das die Breitbandextraktion durch reversible Immobilisierung an bindungsaktiven Festkörper-Oberflächen nach Entnahme des Blutes noch im ärztlichen Labor aus dem frischen Vollblut, dem Blutplasma oder dem Blutserum vornimmt und nur die extrahierten Substanzen, vorzugsweise im immobilisierten Zustand, dem massenspektrometrischen Labor für die Messung des Substanzprofils zuführt. Damit wird weitgehend vermieden, dass sich die Substanzkonzentrationen durch chemische oder enzymatische Prozesse im stets reaktiven Blut während der wechselnd langen Transportzeiten nichtreproduzierbar verändern, und es kann auf den Zusatz von Enzymhemmern oder auf ein Einfrieren auf minus 80 Grad Celsius für den Transport zum massenspektrometrischen Laboratorium verzichtet werden.

Stand der Technik

Die massenspektrometrische Diagnostik durch die Messung und Auswertung von Substanzprofilen, die aus Körperflüssigkeiten gewonnen wurden, ist sehr aussichtsreich, steckt aber noch in den Kinderschuhen. Es kommen zur Zeit die ersten Massenspektrometer auf den Markt, die entsprechende Zulassungen für medizinische Diagnostik haben. Die Zulassung wird durch eine streng von staatlichen Stellen überwachte IVD-Kompatibilitätserklärung (CE) der Hersteller-Firmen bewirkt. Die Abkürzung IVD steht für „in vitro Diagnostik". In Deutschland ist diese Zulassung durch das Medizinproduktegesetz (MPG) geregelt, das auf der europäischen Richtlinie 98/79/EG beruht.

Besonders aussichtsreich ist eine Diagnostik durch die Messung von Proteinprofilen aus Körperflüssigkeiten, insbesondere aus Blut. Die Abnahme von Blut aus einer Vene wird routinemäßig in jeder allgemeinärztlichen Praxis durchgeführt; das Risiko durch Nebenwirkungen ist dabei sehr klein. Noch geringer ist das Risiko, wenn überhaupt nur ein Tropfen Blut aus der Fingerkuppe oder dem Ohrläppchen entnommen wird.

In den Proteinprofilen aus dem Blut können signifikante Über- oder Unterexprimierungen von bestimmten Proteinen gemessen werden, die sich in zu hohen oder zu geringen Konzentrationen widerspiegeln. Es können des Weiteren chemische Veränderungen von Proteinen gemessen werden, die dann mit anderem Molekulargewicht an anderen Stellen des massenspektrometrischen Proteinprofils auftauchen. Statistisch signifikante Veränderungen dieser Art sind immer ein Zeichen für eine bestimmte Stresssituation des Körpers, in einigen Fällen sogar charakteristisch für eine bestimmte Erkrankung oder Anomalie des Körpers. Solche in ihrer Konzentration oder in ihrem Molekulargewicht stressbedingt charakteristisch veränderliche Proteine werden heute „Biomarker" genannt, wobei sich der Begriff „Biomarker" aber in der Regel nicht nur auf ein einzelnes Protein, sondern eher auf ein Muster mehrerer Proteine in ihrem Konzentrationsverhältnis zueinander bezieht. Die Messung solcher Biomarker oder Biomarkermuster kann für medizinische Diagnosen auf Krankheiten oder Anomalien verwendet werden, aber auch für die Einstellung oder Überwachung von Medikationen und viele andere Zwecke bis hin zu pharmakokinetischen Untersuchungen.

Blut besteht hauptsächlich aus Wasser (etwa 90%), aus den verschiedenartigen Blutpartikelchen, aus geringen Mengen Salzen, einigen nicht-proteinischen organischen Substanzen und aus etwa sieben Prozent Proteinen, unter denen die Albumine, Globuline und Fibrinogene den größten Anteil bilden. Wenn im Folgenden ganz allgemein von „Blutproben" gesprochen wird, so kann es sich um „Vollblut", um „Blutserum" oder auch um „Blutplasma" handeln; die Unterschiede werden unten näher erläutert. Die hier als mögliche Biomarker interessierenden Proteine sind in den Blutproben mit geringeren Konzentrationen von unter einem Prozent bis hinunter zu 10–8 Prozent vorhanden, wobei sich aber die Proteine sehr geringer Konzentration einer direkten Messung entziehen, wenn sie nicht in besonderer Weise substanzspezifisch „gefischt" oder durch ihre Wirkungen indirekt gemessen werden können.

In einem guten Massenspektrometer können hundert Attomol eines Proteins (60 Millionen Moleküle) noch ein messbares Signal ergeben; für die Erkennbarkeit in einem Proteinprofil mit seinem Untergrundrauschen liegt aber diese Grenze wegen des unvermeidlichen Untergrundrauschens höher; sie liegt bei etwa zehn Femtomol. Das entspricht für ein Peptid des Molekülgewichts von 1000 Dalton einer Menge von zehn Picogramm, für ein Protein des Molekülgewichts von 10 000 Dalton einer Menge von hundert Picogramm. In einem kleinen Blutstropfen von nur zehn Mikroliter Blut (zehn Milligramm) können also Proteine bis hinunter zu einer Konzentration von 10–6 Prozent gemessen werden, falls es gelingt, die interessierenden Proteine alle der Messung zuzuführen und ein Proteinprofil zu messen, das nicht vollständig mit Proteinen überladen ist. Direkt über der Nachweisgrenze ist jedoch die Genauigkeit der Messung nicht sehr gut, daher beschränkt sich die Messung und Ausweitung der Proteinprofile im Allgemeinen auf den Konzentrationsbereich von 10–1 bis 10–4 Prozent.

Die kleineren Proteine mit Molekülgewichten bis zu einigen Tausend Dalton, die aus nur einigen Zehn Aminosäuren bestehen, werden Peptide genannt; sie werden jedoch hier in den Begriff „Proteine" mit eingeschlossen. Die Grenze zwischen Peptiden und Proteinen ist sehr unscharf. Die weit überwiegende Anzahl der Peptide im Blut sind so genannte „Verdaupeptide", die durch den ständig stärker oder schwächer stattfindenden enzymatischen Abbau von größeren Proteinen, beispielsweise von Albuminen und Fibrinogen, aber auch von Fremdproteinen, entstehen. Diese Verdaupeptide wurden bis vor kurzem als „Müll" betrachtet, in dem keine Information über den Zustand des Körpers zu finden sei. In einer kürzlich erschienenen Arbeit wurde jedoch nachgewiesen, dass in Blut, das ein bis zwei Tage ohne Enzymhemmer bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde, mit zeitlich ansteigender Konzentration charakteristische Muster von Peptiden zu messen waren, die jeweils auf bestimmte Enzyme hinwiesen. Diese Enzyme waren wiederum eindeutig bestimmten Arten von Krebserkrankungen zuzuordnen. Die Muster dieser Verdaupeptide konnten auch im Blutserum oder Blutplasma, beide ohne Enzymhemmer aufbewahrt, nachgewiesen werden. Die Enzyme selbst entzogen sich der massenspektrometrischen Messung durch ihre sehr niedrige Konzentration; sie verrieten sich nur durch die Produkte ihrer Aktivität. Somit können diese Peptidmuster sehr wohl als Biomarker dienen, wenn auch nur durch eine bestimmte Behandlung und Aufbewahrung des frischen Blutes.

Die Anzahl verschiedenartiger Proteine im Blut ist extrem hoch, sie übersteigt den Wert 100 000 bei Weitem. Selbst im Messbereich der Proteinprofile sind viele Tausend Proteine zu finden. Ein Profil mit einer so hohen Anzahl von Proteinen würde das einzelne Protein nicht mehr erkennen lassen, da sich die massenspektrometrischen Signale unaufgelöst überlagern würden. Es ist also notwendig, vor einer Messung eines Proteinprofils die Anzahl der Proteine drastisch zu reduzieren, jedoch immer noch viele Proteine zur Messung anzubieten. Das geschieht durch Breitbandextraktionen, die Proteine bestimmter gemeinsamer Eigenschaften aus dem Blut zu extrahieren vermögen. Solche Breitbandextraktionen können in der Regel einige Zehn bis einige Hundert Proteine, deren Konzentrationen im messbaren Bereich liegen, gemeinsam extrahieren. Der Begriff „Breitbandextraktion" soll hier aber nicht zu eng verstanden werden, auch solche Extraktionen, die beispielsweise nur zwei Proteine für eine Bestimmung ihres Konzentrationsverhältnisses reproduzierbar extrahieren, soll hier durchaus noch unter dem Begriff Breitbandextraktion verstanden werden.

Es gibt verschiedenartige Breitbandextraktionen, verschiedenartig sowohl nach dem „Was" (Arten der extrahierten Proteine) wie auch nach dem „Wie" (Mechanismus der Extraktion). Unter den Mechanismen der Extraktion ist die reversible Immobilisierung von Proteinen an entsprechend bindungsaktiven Festkörperoberflächen am bequemsten zu handhaben. Sie wird hier ausschließlich betrachtet. Die bindungsaktiven Festkörperoberflächen werden in der Regel durch eine feste Beschichtung der Festkörperoberflächen mit geeigneten Substanzen hergestellt.

Die verschiedenen Wirkungsarten der Breitbandextraktionen zeichnen sich durch unterschiedlich beschichtete bindungsaktive Festkörperoberflächen aus, sie ziehen ganz verschiedenartige Proteine aus der Blutprobe. Die Proteine können beispielsweise über elektrische Wechselwirkungen an der Oberfläche gebunden werden, so durch die feste Beschichtung der Oberflächen mit Anionen- oder Kationenaustauschern. Dadurch werden Proteine verschiedener Ionenladung aus dem Blut extrahiert. Andere Proteine können über hydrophobe Bindungen affin gebunden werden, wie in der Umkehrphasen-Chromatographie (reversed phase chromatography). Wiederum andere Arten von Proteinen können über chelatartige Bindungen verschiedener Art, über Ligandenbindungen, aber auch durch maßgeschneiderte, proteinspezifische Bindungen nach Art der Antigen-Antikörperbindung an der Oberfläche festgehalten werden. Dabei lassen sich durch eine Mischung von verschiedenen fest an Festkörperoberflächen gebundenen Antikörpern ebenfalls Proteinprofile extrahieren, nicht nur einzelne Proteine.

Verschiedene Arten der Breitbandextraktion ergeben in der Regel völlig verschiedene Proteinprofile, da jeweils ganz andere Arten von Proteinen durch reversible Immobilisierung an der Festkörperoberfläche extrahiert werden. Muster von charakteristischen Biomarkern können sich aus Signalen in verschiedenartigen Proteinprofilen zusammensetzen, sie brauchen also nicht einem einzigen Proteinprofil zu entstammen.

Die bindungsaktiven Festkörperoberflächen für diese Breitbandextraktion können zu verschiedenartigen Festkörpern gehören. So können die Gefäßwände der Probenbehälter selbst aktiv beschichtet sein oder es können sich bindungsaktive Beprobungsflecken auf speziellen Probenträgern befinden. Die Beschichtungen sollen fest, also irreversibel gebunden sein. Es können die Proben durch bindungsaktives Filtermaterial in Form von Vliesen, offenporigen Schäumen oder partikelgefüllten Hohlräumen gepresst werden. Es können makroskopische Kügelchen oder Körperchen, aber auch Suspensionen von Mikro- oder Nanoteilchen mit bindungsaktiven Oberflächen zur flüssigen Probe zugegeben und später durch Filtration, durch Zentrifugieren oder durch magnetische Kräfte wieder aus der Probenflüssigkeit herausgeholt werden.

Ein Problem der Diagnostik anhand von Proteinen aus Blutproben ist die ungewollte, stetige Veränderung mindestens einiger Proteine während der Lagerung und des Transports. Blut ist eine stets reaktive Flüssigkeit, die in ihr enthaltenen Enzyme verlieren ihre Wirksamkeit nicht zum Zeitpunkt der Blutentnahme. Die Enzyme verdauen andere Proteine, oder sie verändern sie in charakteristischer Weise. Hinzu kommen chemische Prozesse, wie beispielsweise Oxidation, oft ebenfalls enzymatisch gesteuert. Eine weitere Rolle spielt die Gerinnung, die durch die Veränderung der Fibrinogene zu faserartigem Fibrin erzeugt wird, ebenfalls durch Enzyme wie beispielsweise Thrombin gesteuert. Das Thrombin entsteht durch den Zerfall der Thrombozyten, die zu den Blutpartikelchen gehören. Die Geschwindigkeit der Veränderung der Proteine in Blut ist von vielen Faktoren abhängig: unter anderem spielt die Temperatur der Probe eine Rolle, ihr Bewegungszustand und die individuelle Zusammensetzung des Blutes selbst. Das Blut muss also stets für einen Transport oder eine Lagerung stabilisiert werden.

Eine erste Maßnahme zur Stabilisierung ist die Zugabe von Gerinnungshemmern wie Heparin, Hirudin, EDTH, Zitronensäure oder anderen. Diese Art der Gerinnungsstabilisierung ist aber befristet und stellt einen erheblichen Eingriff in die Probe dar. Eine daher meist gewählte und längerfristig wirksame Maßnahme ist die Entfernung der Blutpartikel, in der Regel durch leichtes Zentrifugieren in Zentrifugen, wie sie in praktisch jeder ärztlichen Praxis vorhanden sind. Dabei bleibt das farblose (leicht gelbliche) Blutserum übrig, das aber ebenfalls vor Gerinnung geschützt werden muss. Werden durch künstlich eingeleitete Gerinnung auch die Fibrinogene entfernt, so erhält man das Blutplasma, das an sich als sehr stabil gilt, dessen Proteine aber immer noch durch Enzyme laufend verändert werden. Für längere Lagerungen oder Transporte ist es daher immer noch notwendig, auch dem Blutserum oder dem Blutplasma Enzymhemmer, weitere chemische Stabilisatoren und auch Antibiotika zuzugeben. Die Zugabe von Substanzen ist jedoch immer auch eine Verfälschung der originalen Probe.

Als eine wesentlich bessere Art der Stabilisierung hat sich daher das Einfrieren der Vollblutprobe, des Blutserums oder des Blutplasmas bei minus 80° Celsius durchgesetzt, das aber nur in wenigen ärztlichen Praxen, meist nur in Krankenhäusern, durchgeführt werden kann. Für den Transport über längere Strecken müssen dann auf Kältetransporte spezialisierte Transportfirmen eingeschaltet werden; der Transport wird dadurch teuer.

Für eine massenspektrometrische Diagnostik sind stets weiträumige Probentransporte notwendig, da Massenspektrometer in Kosten und Bedienung aufwändig und nur in zentralen Einrichtungen zu finden sind. Die massenspektrometrische Diagnostik ist daher bislang auf Einfrieren bei minus 80 Grad Celsius und Spezialtransporte eingestellt, was einer Verbreitung dieser Diagnostik entgegensteht.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein preiswertes Verfahren der Probenvorbereitung und des Probentransports für die reproduzierbare Messung von Proteinprofilen aus Blutproben bereitzustellen. Dabei soll das Blut in ärztlichen Praxen abgenommen und die Proteinprofile sollen in massenspektrometrischen Laboratorien gemessen werden. Im Regelfall befinden sich die massenspektrometrischen Laboratorien nicht am Ort der ärztlichen Praxis, es müssen also die Proben so vorbereitet werden, dass ein preiswerter Transport der Proben bei Normaltemperatur ohne transportabhängige Verfälschungen ermöglicht wird.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung wird durch das Probenvorbereitungsverfahren des Anspruchs 1 dargestellt. Günstige Ausführungsformen und Gerätschaften sind durch die weiteren Ansprüche gegeben.

Es ist der Kerngedanke der Erfindung, die Breitbandextraktionen durch reversible Immobilisierung an bindungsaktiven Festkörperoberflächen bereits in der ärztlichen Praxis in fertig konfektionierten Gefäßen vorzunehmen und die extrahierten Proteine bei Normaltemperatur in gereinigtem und vorzugsweise immobilisiertem Zustand an das massenspektrometrische Laboratorium zu versenden. Der immobilisierte Zustand verhindert Reaktionen der Proteine untereinander. Die Extraktion mit reversibler Immobilisierung an Oberflächen und das anschließende Waschen kann direkt in den Gefäßen für die Blutentnahme am Vollblut vorgenommen werden, aber auch in besonderen Gefäßen, in die verfahrensspezifisch in der ärztlichen Praxis erzeugtes Blutserum oder Blutplasma eingefüllt wird.

So können die Gefäße zur Blutabnahme oder die Gefäße zur Extraktion aus Blutserum oder Blutplasma durch eine fest gebundene Beschichtung mit einer entsprechenden Extraktionsschicht für die Breitbandextraktion der gewünschten Art vorbereitet sein. Die Beschichtung kann sich beispielsweise an der Innenoberfläche der Gefäße befinden, aber auch an makroskopischen oder mikroskopischen Füllkörpern oder andersartigem Füllmaterial wie Vliesen, offenporigen Kunststoffschäumen oder Fritten. Verschiedenartige makroskopische Füllkörper, unterscheidbar durch Form, Größe oder Farbe, oder verschiedene Füllzonen der Gefäße können verschiedenartige Proteine für verschiedenartige Proteinprofile extrahieren.

Die röhrchenförmigen Gefäße zur Blutabnahme in der ärztlichen Praxis sind üblicherweise evakuiert und mit einer Membran versehen, die von einer einfachen Blutentnahme-Doppelnadel durchstochen werden kann. Der Unterdruck befällt das Gefäß durch Ansaugen. Für die Extraktion aus dem Vollblut kann dann die bindungsaktive Beschichtung die erwünschten Proteine in einfacher Weise binden. Es ist allerdings dafür zu sorgen, dass das Blut möglichst intensiv mit den beschichteten Oberflächen in Kontakt kommt, die einfache Diffusion dauert im doch recht viskosen Blut in der Regel zu lange. Der innige Kontakt kann beispielsweise durch ständiges Wenden (wie bei einer Sanduhr) oder durch Rühren hergestellt werden (beispielsweise mit magnetischen Rührkörpern, deren Oberfläche auch wiederum bindungsaktiv beschichtet sein kann).

Für die Breitbandextraktion von Proteinen aus nur jeweils einem Tropfen Blut, beispielsweise einem Blutstropfen nach Anstich der Fingerkuppe oder des Ohrläppchens, können besonders vorbereitete Extraktionspipetten vorzugsweise aus Kunststoff verwendet werden, die einerseits einen kleinen Gummiball zum Ansaugen von Flüssigkeiten und andererseits interne bindungsaktive Beschichtungen der Innenoberfläche oder Füllung besitzen. Durch mehrmaliges Aufziehen kann ein guter Oberflächenkontakt hergestellt werden.

In allen so für die Breitbandextraktion vorbereiteten Gefäßen werden die immobilisierten Proteine anschließend mit einer geeigneten Waschflüssigkeit mehrfach gewaschen. Die Waschflüssigkeit ist ebenfalls konfektioniert. Die Gefäße werden anschließend mit einer Verschlusskappe verschlossen und an das massenspektrometrische Laboratorium eingeschickt. Dabei kann, je nach Verfahren, die Waschflüssigkeit im Gefäß verbleiben, oder eine ebenfalls konfektionierte Stabilisierungsflüssigkeit eingefüllt werden, oder aber das Gefäß leer in feuchtem oder getrocknetem Zustand verschlossen werden.

Kurze Beschreibung der Abbildung

zeigt eine Extraktionspipette für die Breitbandextraktion von Proteinen aus einem Blutstropfen mit Saugball (7) und zwei verschiedenen Füllzonen (2) und (5) für zwei verschiedenartige Breitbandextraktionen.

Besonders günstige Ausführungsformen

Eine erste, sehr einfach Ausfährungsform bezieht sich auf eine Breitbandextraktion von Proteinen aus einem Tröpfchen Blut, das durch Anstich der Fingerkuppe oder des Ohrläppchens austritt und sehr einfach in einer Extraktionspipette aus unzerbrechlichem Kunststoff aufgenommen werden kann.

Hier wird die Breitbandextraktion der Proteine aus Vollblut in der ärztlichen Praxis sofort beim Aufziehen des Blutes in der Extraktionspipette durchgeführt. Die Innenoberfläche der Extraktionspipette ist bereits vorkonfektioniert mit der bindungsaktiven Extraktionsschicht versehen. Das eine Ende der Extraktionspipette trägt zur Handhabung einen kleinen Gummiball; das anderen Ende ist zum Versand mit einer gasdichten Verschlusskappe versehen. Die Extraktionspipette ist konfektioniert mit einem Schutzgas befällt.

Eine nicht mit anderem Material befüllte Extraktionspipette von etwa acht Zentimeter Länge mit einem Innendurchmesser von 0,4 Millimeter kann etwa 10 Mikroliter Blut aus einem kleinem Blutstropfen aufsaugen, wie er durch Anstich der Fingerkuppe oder des Ohrläppchens austritt. Die Innenoberfläche dieser sehr einfachen, nicht befüllten Extraktionspipette beträgt etwa 100 Quadratmillimeter. Sie kann in monomolekularer Bedeckung etwa 100 Nanogramm einer Substanz eines Molekulargewichts von 1000 Dalton aufnehmen, das entspricht rund 100 Picomol. Sind die extrahierten Substanzen schwerer, so kann mehr aufgenommen werden, weil die Molekülschicht dicker ist. Diese maximale Extraktionsmenge verteilt sich allerdings auf alle 50 bis 200 Proteine, die üblicherweise in einem Extraktionsschritt extrahiert werden. Da die Nachweisgrenze im Massenspektrometer bei etwa zehn Femtomol liegt, kann mit dieser einfachen, nicht befüllten Extraktionspipette der interessierende Konzentrationsbereich durchaus abgedeckt werden. (Konkurrierende Systeme arbeiten mit ebenen Extraktionsflächen von nur etwa vier Millimeter Durchmesser auf metallenen Probenträgern, das entspricht einem kleinem Bruchteil der Fläche in den Kapillarpipetten.)

zeigt eine Extraktionspipette, die mit Füllmaterial versehen ist, hier sogar mit zwei Arten von Füllmaterial in zwei Kapillarfüllzonen (3) und (4). Vor der ersten Kapillarfüllzone (3) befindet sich ein Leerraum (1), der beispielsweise genau 10 Mikroliter groß ist und zunächst mit Vollblut befällt wird. Sodann wird das Blut durch Entspannen des Saugballs (7) durch die beiden Kapillarfüllzonen (3) und (4) in einen weiteren Leerraum (6) gezogen und wieder zurück in den Leerraum (1) gedrückt. Dieser Vorgang kann mehrfach wiederholt werden. Die Füllung in den Kapillarfüllzonen (3) und (4) kann beispielsweise aus Kunststoffschaum, aus Vlies oder gepackten Teilchen bestehen, damit kann die bindungsaktive Oberfläche gegenüber einer nicht befüllten Extraktionspipette leicht auf das zehn- bis tausendfache vergrößert werden. Die Füllungen der beiden Kapillarfüllzonen (3) und (4) bestehen aus verschiedenartig bindungsaktiv beschichtetem Füllmaterial, um zwei oder mehrere verschiedenartige Breitbandextraktionen aus nur einem Blutstropfen vornehmen zu können. So kann beispielsweise eine Kapillarfüllzone mit einer hydrophoben Beschichtung aus kovalent gebundenen Alkanen mit je acht Kohlenstoffatomen Länge („C8"), die andere Kapillarfüllzone mit schwach bindendem Anionenaustauscher („WAX" = weak anion exchanger) versehen sein. Die Pipettenkapillare aus Kunststoff kann später im massenspektrometrischen Laboratorium zerschnitten werden, um die einzelnen Proteinextraktionen getrennt zu eluieren und zu messen.

Die Extraktionspipette ist für eindeutige Identifizierungen mit Kennungen versehen, wobei die verschiedenen Kapillarfüllzonen (3), (4) jeweils solche Kennungen tragen, um auch nach einem Zerschneiden noch identifizierbar zu sein. Die Kennungen können aus aufgedruckten Barcodes, angeklebten bedruckten Fahnen (2), (5) aus Papier oder Kunststoff mit Barcodes oder anderen Informationen, oder aus Chips mit elektronisch auslesbaren Informationen (RFID = radio frequency identification) bestehen.

Das Blut kann durch mehrmaliges Aufziehen in guten und innigen Kontakt mit den Innenoberflächen gebracht werden. Anschließend kann das Blut entfernt und eine konfektioniert gelieferte Waschflüssigkeit aufgezogen werden. Mehrfaches Waschen führt zur restlosen Entfernung der Blutflüssigkeit. Die Extraktionspipette kann nun mit der Verschlusskappe verschlossen und zum massenspektrometrischen Labor versandt werden. Dabei kann, je nach Verfahrensvorschrift, die letzteingefüllte Waschflüssigkeit in der Extraktionspipette verbleiben, eine besondere, ebenfalls konfektioniert gelieferte Transportflüssigkeit eingefüllt werden, oder die gezielt entleerte Extraktionspipette feucht oder getrocknet, dann vorzugsweise mit Schutzgas befüllt, zum Versand kommen. Die Wasch- oder Transportflüssigkeit kann antibiotische Stoffe, beispielsweise Bleiacid, enthalten.

Außerdem können sich in der Extraktionspipette eine oder mehrere Substanzen befinden, vorzugsweise ebenfalls Proteine, die sich sofort im Blut lösen, und die ebenfalls extrahiert werden und bei der massenspektrometrischen Messung als Konzentrationsreferenz dienen können. Diese Referenzproteine sollen dabei nach Möglichkeit nicht bereits an der bindungsaktiven Beschichtung immobilisiert sein, sondern sich zunächst frei im aufgenommenen Blut lösen können, um später die extrahierte Menge widerspiegeln zu können. Sie können sich beispielsweise vor der Benutzung im Leerraum (1) befinden.

Im massenspektrometrischen Labor können die reversibel immobilisierten Proteine einfach durch Aufnehmen mit etwa einem Mikroliter eines scharfen organischen Lösungsmittels, beispielsweise Aceton, Acetonitril oder Methanol, aus der Extraktionspipette oder ihren Teilstücken entfernt und auf den massenspektrometrischen Probenträger aufgegeben werden. Die Menge des Lösungsmittels ist unkritisch, da es anschließend eingedampft wird. Das Lösungsmittel kann dabei bereits mit einer Matrixsubstanz versehen sein, wie sie zur Ionisierung im MALDI-Massenspektrometer benötigt wird, diese kann sich aber auch bereits auf dem Probenträger befinden oder nachträglich zugegeben werden. Dieser Vorgang kann leicht automatisiert werden.

Dabei kann auch leicht eine Barcode-Kennung ausgelesen werden, die sich auf der Kapillarpipette befindet, damit Probenverwechslungen möglichst gut ausgeschlossen werden können.

Als Massenspektrometer können sowohl solche mit MALDI-Ionenquellen wie auch mit Elektrosprühionenquellen (ESI) zur Anwendung kommen. Im Falle von MALDI-Massenspektrometern wird das der Extraktionspipette entnommene Eluat mit einer geeigneten Matrix versetzt und auf einem Probenträger eingetrocknet. Die feste Probe auf dem Probenträger wird dann in der Ionenquelle des Massenspektrometers mit Laserlichtblitzen beschossen; die entstehenden Ionen werden durch ihre Flugzeit im Flugzeitmassenspektrometer nach Massen getrennt, in einem Ionendetektor nachgewiesen und der Menge nach gemessen. Dieser Ionisierungsprozess durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) liefert nur einfach geladene, unzerstörte Ionen der Moleküle; das Massenspektrum ist daher ein getreues Abbild des Proteinprofils. Einem Massenspektrometer mit Elektrosprühionenquelle (ESI) kann das Eluat entweder direkt oder aber nochmals über einen Chromatographen aufgetrennt dem Massenspektrometer zugeführt werden. Diese Art der Ionisierung liefert aber auch mehrfach geladene Ionen der Analytmoleküle; das Massenspektrum ist daher schwieriger auszuwerten. Im Allgemeinen wird daher die MALDI-Massenspektrometrie bevorzugt.

Eine weitere, ebenfalls noch sehr einfache Ausführungsform besteht darin, die in jeder ärztlichen Praxis vorhandene Technik der Blutabnahme mit Einstich in die Vene zu verwenden. Es wird dabei ein evakuiertes Blutentnahmegefäß mit einigen zehn Millilitern Blut befüllt. Soll die Breitbandextraktion aus dem Vollblut vorgenommen werden, so ist dieses Gefäß bereits für die Breitbandextraktion vorbereitet. Das kann durch eine Aktivschicht an der Innenoberfläche, aber auch durch Füllkörper oder Füllmaterial mit bindungsaktiven Oberflächen im Gefäß oder durch beides bewirkt werden.

Wird die Breitbandextraktion durch eine Aktivschicht an der Innenoberfläche des Entnahmegefäßes durchgeführt, so ähnelt das Verfahren dem oben geschilderten Verfahren mit Kapillarpipetten. Es ist aber dafür zu sorgen, dass der Kontakt des Blutes mit der Gefäßwand sehr innig ist. Das kann durch häufiges Umwenden, gegebenenfalls in einem kleinen Wendeautomaten, insbesondere aber auch durch eine Befüllung des Entnahmegefäßes mit geeigneten Füllkörpern geschehen. Die Füllkörper sinken beim Umwenden jeweils ab und rühren so das Blut ständig um. Magnetische Rührkörper können in einem magnetischen Drehfeld eine andauernde Rührbewegung erzeugen.

Die Füllkörper können aber auch ihrerseits mit aktiven Oberflächen zur Breitbandextraktion versehen sein. Dabei können Füllkörper verschiedener Form oder verschiedener Farbe sogar mit verschiedenartigen Schichten für die Extraktion verschiedener Proteinprofile versehen sein. Es können sich auch bindungsaktive Oberflächen für die Extraktion von Globulinen und Albuminen darunter befinden, die eine Abreicherung dieser hoch konzentrierten Proteine bewirken.

Die Füllkörper können makroskopisch groß, aber auch mikroskopisch klein sein. Mikropartikelchen mit magnetischem Kern lassen sich besonders gut mit einfachen Permanentmagneten an der Gefäßwand sammeln oder durch die Flüssigkeit ziehen. Die Mikropartikel zeichnen sich durch eine besonders große aktive Oberfläche aus, sind aber wegen der Gefahr einer Koalgulation mit den Blutkörperchen nicht gut für eine Vollblutextraktion einsetzbar.

Diesen Breitbandextraktionen am Vollblut stehen die Breitbandextraktionen am Blutserum und Blutplasma gegenüber, die in der Regel ebenfalls in jeder ärztlichen Praxis aus dem Vollblut gewonnen werden können. Diese Extraktionen werden ebenfalls in konfektioniert gelieferten Gefäßen durchgeführt. Auch hier können die Innenoberflächen der Gefäße, aber auch Befüllungen mit Füllkörpern oder anderem Füllmaterial für die Extraktion eingesetzt werden. Hier können beispielsweise sehr gut magnetische Mikropartikel eingesetzt werden.

Für die Breitbandextraktion aus Blutserum oder Blutplasma können natürlich auch die oben geschilderten Extraktionspipetten eingesetzt werden.

Ein besonderes Diagnoseverfahren besteht darin, die charakteristischen Enzyme, die bei besonderen Krankheiten gebildet werden, zunächst nach der Abnahme des Blutes im Vollblut, im Blutserum oder im Blutplasma ohne die Zugabe von Enzymhemmern wirken zu lassen. Die Verfahrensvorschrift enthält genaue Angaben über Temperatur und Dauer der Lagerung, die in der Regel bei etwa 48 Stunden liegt. Erst dann wird das Vollblut, das Blutserum oder das Blutplasma in die Gefäße für die Breitbandextraktion eingefüllt, und es werden insbesondere die Verdaupeptide der Enzymarbeit extrahiert. Diese lassen sich häufig besonders gut mit hydrophoben Oberflächen extrahieren, die mit Alkanmolekülen einer Länge von 18 Kohlenstoffatomen („C18") kovalent gebunden belegt sind. Dadurch können anhand ihrer Verdauungsprodukte solche Enzyme nachgewiesen werden, die sich wegen ihrer viel zu geringen Konzentration jeder normalen massenspektrometrischen Messung eines Proteinprofils entziehen. Dieses sehr viel versprechende Verfahren wird durch die vorliegende Erfindung in besonderer Weise unterstützt, da die Arbeit der Enzyme direkt nach der Abnahme des Blutes, gegebenenfalls nach Entfernung der Blutkörperchen und Gerinnungsstoffe, in gut kontrollierter Weise noch in der ärztlichen Praxis ablaufen muss.

Es gibt jedoch noch weitere Verfahren, auch Proteine sehr geringer Konzentration noch sicher zu messen. Dazu müssen diese Proteine allerdings genau bekannt sein. Sie können dann durch fest kovalent gebundene, also nicht nur reversibel immobilisierte, monoklonale Antikörper für genau diese Proteine aus dem Blutserum oder dem Blutplasma gezielt herausextrahiert („gefischt") werden. Die Antikörper zur Extraktion einer Reihe von interessierenden Proteinen können sich beispielsweise auf der Oberfläche von Magnetpartikelchen befinden. Da hier nur einige wenige Proteine sauber extrahiert werden, ist das Proteinprofil, das so massenspektrometrische gemessen wird, ebenfalls sehr sauber; es können so Konzentrationen an Mengen bis herunter zu 100 Femtomol (etwa 10–10 bis 10–9 Gramm) gut vermessen werden. Aus nur zehn Millilitern Blut (10 Gramm) können also Proteine mit Konzentrationen von nur 10–9 bis 10–8 Prozent gemessen werden, wenn es gelingt, diese Proteine restlos zu extrahieren. An diesen Verfahren wird zur Zeit gearbeitet. Es ist noch nicht bekannt, ob die theoretischen Vorhersagen auch eintreffen. Es ist ebenfalls nicht bekannt, inwieweit sich in diesen Konzentrationsbereichen wirklich Biomarker finden lassen.

Seit Neuestem ist es auch möglich, die Wirkung der Antikörper, die im Bereich der Molekulargewichte von 150 000 bis 190 000 atomaren Masseneinheiten liegen, durch computermodellierte Peptide im Bereich von nur 20 Aminosäuren (nur etwa 2400 atomaren Masseneinheiten) zu erzielen und damit die teueren Antikörper durch preiswert synthetisierbare Peptide zu ersetzen. Es besteht aber die Gefahr erhöhter Kreuzreaktivität, die jedoch massenspektrometrisch leicht erkannt wird. Es sind auch andere spezifisch wirksame Interaktionspartner bekannt, wie Lektine, Metallchelate zur Phosphatbindung (IMAC), Protein Nucleic Acids (PNA), Oligonukleotide, Inhibitoren, Rezeptoren, Liganden und andere.

Um also die Konzentrationsverhältnisse verschiedener Proteinabkömmlinge in einer flüssigen Probe zu messen, wird der Probe eine festgelegte Menge einer Suspension mit Mikropartikeln zupipettiert, wobei die Mikropartikel mit Fängermolekülen in fester Bindung belegt sind. Die Mikropartikel sind vorzugsweise magnetisierbar. Es haben sich Suspensionen aus magnetisierbaren Mikrokügelchen („magnetic beads") mit 900 Nanometern Durchmesser bereits für andere Anwendungen bestens bewährt; Suspensionen dieser Kügelchen bleiben lange brauchbar. Die Fängermoleküle können beispielsweise monoklonale Antikörper oder Moleküle ähnlicher Spezifität sein. Es ist dabei in diesem Fall sorgfältig darauf zu achten, dass die Mikropartikel für keine der zu messenden Proteinabkömmlinge bis zur Sättigung belegt werden, da sonst die Verhältnisse der Konzentrationen nicht mehr richtig gemessen werden können.

Anschließend werden die Partikelchen von der Flüssigkeit separiert. Magnetisierbare Partikelchen können beispielsweise durch einen starken Permanentmagneten an die Wand des Gefäßes gezogen werden. Das Gefäß sollte zu diesem Zweck nicht allzu ausgedehnt sein, da die Magnetwirkung sich nur über etwa fünf bis zehn Millimeter erstreckt. Auch hier hilft ein vorsichtiges Rühren oder Schwenken, um alle Partikel langsam in den Wirkungsbereich des Magneten zu bringen und so schließlich in Büscheln an der Wand einzufangen.

Die wandverhafteten oder sedimentierten Partikelansammlungen werden dann durch Abgießen oder Pipettieren von der Probenlösung befreit, und es wird eine Waschflüssigkeit zugegeben. Die Partikel werden durch Entfernen des Magneten und durch Umrühren gewaschen. Der Waschvorgang kann erforderlichenfalls mehrmals wiederholt werden. Zuletzt wird der weitgehend flüssigkeitsfreien Partikelansammlung eine Eluierungsflüssigkeit zugegeben, die die Proteine von den Antikörpern oder den andersartigen Fängermolekülen trennt. Solche Eluierungsflüssigkeiten sind in der Regel scharfe, polare organische Lösungsmittel wie Aceton, Acetonitril oder Alkohole.

Die Eluierungsflüssigkeiten mit den Proteinen werden dann der massenspektrometrischen Messung zugeführt.

Der Fachmann auf diesem Gebiet kann sich in Kenntnis dieser Erfindung weitere Ausführungsformen der Verfahren und Gerätschaften entwickeln. Alle diese Ausführungsformen sollen im Erfindungsgedanken eingeschlossen sein.


Anspruch[de]
Verfahren zur Probenvorbereitung für eine massenspektrometrischen Messung eines Profils von Proteinen, die durch eine Breitbandextraktion aus Vollblut, aus Blutserum oder aus Blutplasma extrahiert werden können,

dadurch gekennzeichnet,

dass die Breitbandextraktion in der ärztlichen Praxis durchgeführt wird, in der das Blut abgenommen wird,

dass die Breitbandextraktion in vorkonfektionierten Gefäßen durch reversible Immobilisierung an bindungsaktiven Schichten auf der Innenoberfläche der Gefäße oder auf der Oberfläche von Füllmaterial vorgenommen wird,

dass die immobilisierten Proteine der Breitbandextraktion anschließend gewaschen und so von allen nicht immobilisierten Substanzen befreit werden, und

dass die Proteine der Breitbandextraktion im immobilisierten Zustand an das massenspektrometrische Laboratorium versandt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gefäße zur Breitbandextraktion direkt bei der Blutentnahme mit Blut gefällt werden und dass die Breitbandextraktion aus dem Vollblut erfolgt. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gefäße zur Breitbandextraktion erst nach einer standardisierten Vorbehandlung des Blutes mit Blutserum oder Blutplasma befällt werden und dass die Breitbandextraktion aus diesen Flüssigkeiten erfolgt. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Breitbandextraktion aus dem Vollblut in einer Extraktionspipette erfolgt, in die ein Tropfen Blut aufgezogen wird. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Breitbandextraktion durch reversible Immobilisierung der zu extrahierenden Proteine an hydrophoben Beschichtungen, an Beschichtungen mit Anionen- oder Kationenaustauschern, an fest gebundene Metallen verschiedener Art, an Beschichtungen mit fest gebundenen Antikörpern oder mit synthetischen proteinspezifisch bindenden Molekülen vorgenommen wird. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass durch eine verschiedenartige Beschichtung unterscheidbarer Füllkörper oder des Füllmaterials in unterscheidbaren Füllzonen gleichzeitig mehrere Breitbandextraktionen verschiedener Art in einem Arbeitsgang vorgenommen werden. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass den Gefäßen für die Breitbandextraktion eine oder mehrere interne Referenzsubstanzen für ein oder mehrere Proteinprofile zugegeben werden. Gefäße für die Blutabnahme in ärztlichen Praxen, in üblicher Form evakuiert und mit einer durchstechbaren Membran versehen, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine bindungsaktiven Beschichtung von Oberflächen im Inneren des Gefäßes für die reversible Immobilisierung von Proteinen enthalten. Extraktionspipette für die Breitbandextraktion von Proteinen aus Vollblut,

bestehend aus

a) einer Pipettenkapillare,

b) einem aufgesteckten Saugball aus Gummi zum Aufziehen und Ausdrücken von Blut und Waschflüssigkeiten, und

c) einer bindungsaktiven Beschichtung von Oberflächen im Inneren der Pipettenkapillare für die reversible Immobilisierung von Proteinen.
Extraktionspipette nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei verschiedenartige bindungsaktive Beschichtungen in zwei unterscheidbaren Kapillarfüllzonen für die Extraktion zweier verschiedenartiger Proteinextrakte vorhanden sind. Extraktionspipette nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit Kennungen für die Zuordnung der Proteinextrakte zu den Blutproben versehen ist.






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