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Dokumentenidentifikation DE69636601T2 09.08.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000856063
Titel VERFAHREN ZUR VERFLÜSSIGUNG VON STÄRKE
Anmelder Genencor International, Inc., Palo Alto, Calif., US
Erfinder Mitchinson, Colin, Palo Alto, Calif., US;
Solheim, Leif P., Palo Alto, Calif., US
Vertreter WUESTHOFF & WUESTHOFF Patent- und Rechtsanwälte, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69636601
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 30.05.1996
EP-Aktenzeichen 969168442
WO-Anmeldetag 30.05.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/US96/08144
WO-Veröffentlichungsnummer 1996038578
WO-Veröffentlichungsdatum 05.12.1996
EP-Offenlegungsdatum 05.08.1998
EP date of grant 04.10.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 09.08.2007
IPC-Hauptklasse C12P 19/14(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C08B 30/12(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Modifizierung der Verwendung von &agr;-Amylase bei der Umwandlung von Getreidestärke zu Abbauprodukten wie z.B. Dextrose, Fructose und Alkohol. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Zugabe von Natriumionen zu einer Stärkemischung, vor oder während der Verflüssigung, um die Effizienz der Verflüssigung bei einem niedrigen pH, d.h. zwischen pH 4,5 und 5,5, zu erhöhen.

Getreide wie z.B. Mais (corn) sind seit langem als eine Quelle für Stärke verwendet worden. Eines der wohlbekannten Verfahren zum Trennen und Reinigen von Stärke zur Verwendung in industriellen Prozessen ist der Nassmahlprozess. Dieses Verfahren wurde zu einem hochspezifischen und integrierten System entwickelt, welches ausgelegt ist, um die Hauptkomponenten eines Getreidekorns so vollständig wie möglich zu trennen (siehe Stanley A. Watson, Starch: Chemistry & Technology, Bd. II, Industrial Aspects, Academic Press, New York, 1967, Seiten 30-51).

In einem üblichen Nassmahlprozess werden trockene Getreide, die zur Erzeugung von Stärkeprodukten verwendet werden, zuerst einem Tränkungsprozess unterzogen, der Einweichen (steeping) genannt wird. Während des Einweichens werden die Getreide einem Gegenflusswasserstrom ausgesetzt, der viele lösliche Stoffe einschließlich Phytat und Phytinsäure, Zuckern, Salzen und Proteinen von den Getreidegranalien trennt. Die eingeweichten Getreide werden von dem Tränkwasser (Einweichwasser) getrennt und mechanischen Aufbrech- und Mahlvorgängen unterzogen. Flotations- und Zentrifugationstechniken werden dann verwendet, um Keime von der Stärke, Faser und Protein abzutrennen. Die resultierende Aufschlämmung von Endosperm (Stärke), Faser und Protein wird dann weiter gemahlen und gesiebt, um die Faser abzutrennen. Schließlich werden das Protein und mit dem Endosperm zusammenhängende Komponenten auf der Basis der Dichte durch Spülen im Gegenstrom und Zentrifugation getrennt, um die Stärke von dem Protein/Glutenstrom zu trennen. Der isolierte Stärkestrom wird dann gründlich gespült, um jegliche nicht granulären mit der Stärke zusammenhängenden löslichen Stoffe, einschließlich löslicher Stoffe wie z.B. anorganischer Salze, und Verbindungen wie z.B. Phytat und Salzen der Phytinsäure, zu entfernen. Das resultierende Produkt ist eine in hohem Maße gereinigte Aufschlämmung von unlöslicher granulärer Stärke, welche als das Ausgangsprodukt zur Umwandlung in Fructose dient.

Im Allgemeinen besteht die Verarbeitung von Stärke zu Fructose aus vier Schritten: Verflüssigung der granulären Stärke, Saccharifizierung der verflüssigten Stärke zu Dextrose, Reinigung und Isomerisierung zu Fructose. Die Aufgabe eines Stärkeverflüssigungsprozesses ist es, eine konzentrierte Suspension von Stärkepolymergranalien in eine Lösung von löslichen Dextrinen mit kürzerer Kettenlänge mit geringer Viskosität umzuwandeln. Dieser Schritt ist essentiell für eine bequeme Handhabung in einer Standardausrüstung und für eine effiziente Umwandlung in Glucose oder andere Zucker. Um granuläre Stärke zu verflüssigen, ist es notwendig, die Granalien durch ein Erhöhen der Temperatur der granulären Stärke auf über ca. 72°C zu gelatinieren. Der Erwärmungsprozess spaltet die unlöslichen Stärkegranalien sofort auf, um eine wasserlösliche Stärkelösung zu erzeugen. Die solubilisierte Stärkelösung wird dann durch &agr;-Amylase (EC 3.2.1.1.) verflüssigt.

Ein üblicher enzymatischer Verflüssigungsprozess beinhaltet das Einstellen des pH einer granulären Stärkeaufschämmung auf zwischen 6,0 und 6,5, das pH-Optimum der &agr;-Amylase, die aus Bacillus licheniformis stammt, unter Zugabe von Calciumhydroxid, Natriumhydroxid oder Natriumcarbonat. Die Zugabe von Calciumhydroxid hat den Vorteil, dass ebenfalls Calciumionen bereitgestellt werden, von welchen bekannt ist, dass diese die &agr;-Amylase gegen eine Inaktivierung stabilisieren. Bei der Zugabe der &agr;-Amylase wird die Suspension durch einen Dampfstrahl gepumpt, um die Temperatur sofort auf zwischen 80°C-115°C zu erhöhen. Die Stärke wird sofort gelatiniert und aufgrund des Vorliegens der &agr;-Amylase durch zufällige Hydrolyse von &agr;-(1-4)-glykosidischen Bindungen durch &agr;-Amylase zu einer fluiden Masse depolymerisiert, welche leicht gepumpt werden kann.

Bei einer zweiten Variation des Verflüssigungsprozesses wird &agr;-Amylase zu der Stärkesuspension zugegeben, die Suspension wird bei einer Temperatur von 80-100°C gehalten, um die Stärkegranalien teilweise zu hydrolysieren, und die teilweise hydrolysierte Stärkesuspension wird durch einen Strahl bei Temperaturen über ca. 105°C gepumpt, um jegliche verbleibende granuläre Struktur gründlich zu gelatinieren. Nach dem Abkühlen der gelatinierten Stärke kann eine zweite Zugabe von &agr;-Amylase durchgeführt werden, um die Stärke weiter zu hydrolysieren.

Eine dritte Variation dieses Prozesses wird der Trockenmahlprozess genannt. Beim Trockenmahlen wird das vollständige Getreide gemahlen und mit Wasser vereinigt. Der Keim wird gegebenenfalls durch Flotationstrennung oder entsprechende Techniken entfernt. Die resultierende Mischung, welche Stärke, Faser, Protein und andere Komponenten des Getreides enthält, wird unter Verwendung von &agr;-Amylase verflüssigt. Die allgemeine Praxis im Stand der Technik ist es, eine enzymatische Verflüssigung bei einer niedrigeren Temperatur zu unternehmen, wenn der Trockenmahlprozess verwendet wird. Im Allgemeinen wird von einer Verflüssigung bei niedriger Temperatur angenommen, dass diese bei der Umwandlung von Stärke in lösliche Dextrine weniger effizient ist als eine Verflüssigung bei hoher Temperatur.

Typischerweise wird die Stärkelösung nach der Gelatinierung, gewöhnlich über einen Zeitraum von 1-3 Stunden, in der Gegenwart von &agr;-Amylase bei einer erhöhten Temperatur gehalten, bis ein DE von 10-20 erreicht ist. Das Dextroseäquivalent (DE) ist der Industriestandard zur Messung der Konzentration der gesamten reduzierenden Zucker, welches als D-Glucose auf einer Trockengewichtsbasis berechnet wird. Nicht hydrolysierte granuläre Stärke weist ein DE von praktisch Null auf, wogegen das DE von D-Glucose als 100 definiert ist.

Die maximale Temperatur, bei welcher die Stärkelösung, welche &agr;-Amylase enthält, gehalten werden kann, hängt von der Mikrobenquelle, aus welcher das Enzym erhalten wurde, und von der molekularen Struktur des &agr;-Amylasemoleküls ab. &agr;-Amylasen, welche durch Wildtyp-Stämme von B. subtilis oder B. amyloliquefaciens erzeugt wurden, werden typischerweise bei Temperaturen verwendet, die nicht höher als ca. 90°C sind, aufgrund einer übermäßig schnellen thermischen Inaktivierung oberhalb dieser Temperatur, wogegen &agr;-Amylasen, welche durch Wildtyp-Stämme von B. licheniformis erzeugt wurden, bei Temperaturen bis zu ca. 110°C verwendet werden können.

Von dem Vorliegen von Stärke und Calciumionen ist bekannt, dass dieses &agr;-Amylasen gegen eine Inaktivierung stabilisiert. Nichtsdestotrotz werden &agr;-Amylasen bei pH-Werten über 6 verwendet, um gegen eine schnelle Inaktivierung zu schützen. Bei niedrigen Temperaturen ist von &agr;-Amylase aus B. licheniformis bekannt, dass diese eine ausgezeichnete Hydrolyseaktivität an einem Stärkesubstrat bei pH-Werten zeigt, die so niedrig wie 5 sind. Wenn jedoch das Enzym für die Stärkehydrolyse bei üblichen Strahltemperaturen, z.B. zwischen 102°C und 109°C, verwendet wird, muss der pH bei wenigstens über pH 5,7 gehalten werden, um eine übermäßig schnelle Inaktivierung zu vermeiden. Die Anforderung an den pH führt unglücklicherweise zu einem engen Fenster für die Verarbeitungsmöglichkeit, da pH-Werte über 6,0 zu unerwünschten Nebenprodukten, z.B. Maltulose, führen. Daher muss in Wirklichkeit der pH der Verflüssigung zwischen 5,9 und 6,0 gehalten werden, um eine zufrieden stellende Ausbeute an hydrolysierter Stärke zu erzielen.

Ein anderes Problem, das den pH der Verflüssigung betrifft, ist die Notwendigkeit, den pH der Stärkesuspension von ca. 4, dem pH einer Maisstärkesuspension wie sie aus der Nassmahlstufe kommt, auf 5,9-6,0 zu erhöhen. Diese pH-Einstellung erfordert die teure Zugabe von säureneutralisierenden Chemikalien und erfordert ebenfalls ein zusätzliches Aufreinigen durch Ionenaustauscher des endgültigen Stärkeumwandlungsprodukts, um die Chemikalie zu entfernen. Darüber hinaus erfordert der nächste Schritt des Prozesses nach der Verflüssigung, welcher typischerweise die Saccharifizierung der verflüssigten Stärke zu Glucose ist, einen pH von 4-4,5; daher muss der pH von 5,9-6,0 nach unten auf 4-4,5 eingestellt werden, was die Zugabe einer zusätzlichen Chemikalie und Aufreinigungsschritte erfordert.

In dem U.S.-Patent Nr. 5,322,778 wurde eine Verflüssigung zwischen pH 4,0 und 6,0 erreicht, indem ein Antioxidationsmittel wie z.B. Bisulfit oder ein Salz von diesem, Ascorbinsäure oder ein Salz von dieser, Erythorbinsäure oder phenolische Antioxidationsmittel wie z.B. butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluol oder &agr;-Tocopherol zu der Verflüssigungsaufschlämmung zugegeben wurden. Gemäß den Ansprüchen dieses Patents muss das Antioxidationsmittel in einer Konzentration von größer als 5 mM zugegeben werden.

In dem U.S.-Patent Nr. 5,180,669 wurde eine Verflüssigung zwischen einem pH von 5,0 bis 6,0 durch die Zugabe von Carbonationen im Überschuss zu der Menge, die benötigt wird, um die Lösung abzupuffern, zu der Aufschlämmung der gemahlenen Stärke erreicht. Aufgrund der Wirkung eines erhöhten pH, die bei Zugabe von Carbonationen auftritt, wird die Aufschlämmung im Allgemeinen neutralisiert, indem eine Quelle für Wasserstoffionen, beispielsweise eine anorganische Säure wie z.B. Salzsäure oder Schwefelsäure, zugegeben wird.

In der PCT-Schrift Nr. WO 94/02597 wird eine mutierte &agr;-Amylase mit verbesserter Oxidationsstabilität beschrieben, in welcher ein oder mehrere Methionine durch irgendeine Aminosäure außer Cystein oder Methionin ersetzt sind.

In den Patentzusammenfassungen von Japan, Bd. 4, (C-12) [555], 1980, wurde Stärke mit 0,1-2 Gew./Gew.-% eines gereinigten Verflüssigungsenzyms, das eine wärmebeständige Amylase ist, die in einem Bakterium wie z.B. Bacillus subtilis erzeugt wird und frei von Protease und Fett zersetzendem Enzym ist, und 0,05-5 Gew./Gew.-% eines Enzymstabilisators wie z.B. Calciumcarbonat oder Natriumchlorid vereinigt.

In Chemical Abstracts, Bd. 75, Nr. 89, 1971, wurde eine Wärmestabilität von bakterieller Amylase bei pH 5,5 oder höher, vorzugsweise 6,2, beobachtet. Die schützende Wirkung von Stärke wurde bei Konzentrationen, die größer als 25% waren, beobachtet. Natrium- und Calciumionen waren ebenfalls wirksame Protektoren für die Amylase.

In der FR-A-1556626 wird eine Prozedur für die Verflüssigung von Stärke beschrieben, welche die Zugabe von Calcium- und Natriumsalzen zu der Stärkemischung und die Zugabe von &agr;-Amylase einschließt. Ein pH-Bereich von 5,7-7,5, mit einem bevorzugten pH von 6,2, wurde vorgeschlagen.

Die EP-A-0189838 offenbart ein Verfahren zur Erhöhung der thermischen Stabilität von mikrobieller &agr;-Amylase. Das Verfahren beinhaltet das Zugeben einer stabilisierenden Menge eines Amphiphils zu dem Enzym in seiner wässrigen Lösung.

Die EP-A-0180952 betrifft einen Prozess zum Verflüssigen von Stärke durch Verwendung einer thermostabilen &agr;-Amylase, welche einen optimalen Arbeits-pH-Bereich in einem sauren Bereich aufweist und einen geringen Calciumbedarf hat.

In der PCT-Schrift Nr. 94/18314 wird eine mutierte Amylase mit verbesserter Oxidationsstabilität beschrieben, in welcher einer oder mehrere der Methionin-, Tryptophan-, Cystein-, Histidin- oder Tyrosinreste durch eine nicht oxidierbare Aminosäure ersetzt ist (sind).

In der PCT-Schrift Nr. WO 91/00353 werden die Probleme, die mit der Verflüssigung zusammenhängen, durch gentechnische Veränderung von &agr;-Amylase angegangen, um Merkmale einschließlich einer erhöhten thermischen, Säure- und Alkalistabilität zu erhalten.

In dem U.S.-Patent Nr. 4,914,029 wird Phytase zu der Maiseinweichflüssigkeit zugegeben, um die Menge an Phytinsäure in der Maiseinweichflüssigkeit zu verringern und somit die Maiseinweichflüssigkeit effizienter in Tierfutter zu verwenden.

Trotz der Fortschritte, die im Stand der Technik gemacht wurden, besteht ein fortgesetzter Bedarf für ein effizientes Mittel zur Verflüssigung von Stärke bei niedrigen pH-Werten unter Verwendung von im Handel verfügbarer &agr;-Amylase.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, eine Verflüssigung von Stärke mit verbesserter Effizienz und bei niedrigem pH bereit zu stellen, welche leicht verfügbare mutierte oder Wildtyp-&agr;-Amylaseenzyme verwendet.

Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Verflüssigung von Stärke ohne die Zugabe teurer Antioxidationsmittel bereit zu stellen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zum Verflüssigen einer Stärkelösung die folgenden Schritte: (a) Zugeben einer Natriumzusammensetzung zu der Stärkelösung, wobei die endgültige Natriumkonzentration der Stärkelösung größer als 20 ppm ist; (b) Zugeben von &agr;-Amylase zu der Stärkelösung; und (c) Inkubieren der Stärkelösung, welche die Natriumzusammensetzung und die &agr;-Amylase umfasst, für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die geeignet sind, um die Stärkelösung zu verflüssigen, um eine verflüssigte Stärkelösung zu bilden; wobei Schritt (c) unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dass ein Antioxidationsmittel in der Stärkelösung in einer Endkonzentration von weniger als 2,5 mM vorliegt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Natriumzusammensetzung in einer Endkonzentration von 20 ppm oder mehr, vorzugsweise von ca. 20 ppm bis ca. 10.000 ppm, insbesondere von ca. 50 ppm bis ca. 1000 ppm und am meisten bevorzugt von ca. 100-500 ppm vorhanden. Schritt (c) wird bei einem pH zwischen 4,5 und 5,5 durchgeführt.

Wie nachstehend detaillierter ausgeführt wird, bietet die Praktizierung der vorliegenden Erfindung wichtige Vorteile gegenüber kommerziellen Stärkeverflüssigungsprozessen. Während sie nicht an ein Theorie gebunden sein möchten, glauben die Anmelder, dass die Zugabe einer Natriumzusammensetzung Problemen, die mit einer Verflüssigung von Stärke bei niedrigem pH mit &agr;-Amylase verbunden sind, wegen entweder einer Zunahme bei der Stabilität des Enzyms selbst oder durch die Reaktion von Natrium mit einer Zusammensetzung oder Zusammensetzungen in der Stärkelösung, welche die Stärke destabilisiert, entgegenwirkt. Der überraschende Fund der Anmelder, dass die Zugabe von Natrium &agr;-Amylase eine erhöhte Aktivität bei niedrigem pH verleiht, erlaubt eine effiziente Verflüssigung von granulärer Stärke bei pH-Werten unter ca. 5,9 mit im Handel erhältlichen &agr;-Amylasen.

Die Erfindung selbst, zusammen mit weiteren Gegenständen und begleitenden Vorteilen, wird am besten durch Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung, zusammengenommen mit den begleitenden Zeichnungen, verstanden werden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

„Verflüssigung" oder „verflüssigen" bedeutet einen Prozess, durch welchen Stärke in kürzerkettige und weniger viskose Dextrine umgewandelt wird. Im Allgemeinen beinhaltet dieser Prozess die Gelatinierung von Stärke, gleichzeitig mit oder gefolgt von der Zugabe von &agr;-Amylase. Bei kommerziellen Prozessen ist es bevorzugt, dass die granuläre Stärke aus einer Quelle stammt, die Mais, Weizen, Milo, Sorghum, Roggen oder Bulgher umfasst. Jedoch ist die vorliegende Erfindung auf jegliche Getreidestärkequelle, die zur Verflüssigung nützlich ist, z.B. jedes andere Getreide oder jede pflanzliche Quelle, von der bekannt ist, dass diese Stärke produziert, die zur Verflüssigung geeignet ist, anwendbar.

„Einweichflüssigkeit" bedeutet eine Flüssigkeit, die aus eingeweichten Getreidekörnern während des Einweichprozesses abgezogen wird. Die Einweichflüssigkeit enthält einen signifikanten Teil der löslichen Komponenten des Getreides.

„Granuläre Stärke" oder „Stärkegranalien" bedeutet eine wasserunlösliche Komponente von essbaren Getreiden, welche nach der Entfernung von der Schale, Faser, Protein, Fett, Keim und löslichen Stoffen durch das Einweichen, mechanische Aufbrechen, Trennungen, Sieben, Spülen im Gegenstrom und Zentrifugationsschritte, welche für den Nassmahlprozess von Getreide typisch sind, zurück bleibt. Granuläre Stärke umfasst intakte Stärkegranalien, welche fast ausschließlich gepackte Stärkemoleküle (d.h. Amylopektin und Amylose) enthalten. Im Mais umfasst die Komponente der granulären Stärke ca. 99% Stärke; wobei das verbleibende 1% aus Protein, Fett, Asche, Faser und Spurenkomponenten zusammengesetzt ist, die eng mit den Granalien verbunden sind. Die Packungsstruktur der granulären Stärke verzögert deutlich die Fähigkeit von &agr;-Amylase, Stärke zu hydrolysieren. Eine Gelatinierung der Stärke wird verwendet, um die Granalien aufzubrechen, um eine lösliche Stärkelösung zu bilden und die enzymatische Hydrolyse zu erleichtern.

„Stärkelösung" bedeutet die wasserlösliche gelatinierte Stärke, welche aus dem Erwärmen granulärer Stärke resultiert. Beim Erwärmen der Granalien auf über ca. 72°C dissoziiert die granuläre Stärke unter Bildung einer wässrigen Mischung von losen Stärkemolekülen. Diese Mischung, welche in gelbem Zahnmais beispielsweise ca. 75% Amylopektin und 25% Amylose umfasst, bildet in Wasser eine viskose Lösung. Bei kommerziellen Prozessen, um Glucose oder Fructose zu bilden, ist es die Stärkelösung, welche verflüssigt wird, um eine lösliche Dextrinlösung zu bilden.

„&agr;-Amylase" bedeutet eine enzymatische Aktivität, welche die &agr;-(1,4)-glykosidische Bindung, z.B. die in Stärke, Amylopektin oder Amylosepolymeren, spaltet oder hydrolysiert. Geeignete &agr;-Amylasen sind die natürlich vorkommenden &agr;-Amylasen wie auch rekombinante oder mutierte Amylasen, welche bei der Verflüssigung von Stärke nützlich sind. Bevorzugte Amylasen in der vorliegenden Erfindung sind &agr;-Amylasen, die aus Bacillus und insbesondere Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus stearothermophilus stammen.

„Natriumzusammensetzung" oder „Natrium" bedeutet eine Zusammensetzung oder Mischung, die Natrium enthält, welche, wenn sie in einer wässrigen Lösung gelöst wird, zu dem Vorliegen von freien Natriumionen führt. Natriumzusammensetzungen können freie Natriumionen, Natriummetall, Natrium enthaltende Salze sein oder irgendeine andere im Stand der Technik anerkannte Methode, um freie Natriumionen in eine wässrige Lösung einzuführen. Geeignete Natriumsalze umfassen Natriumchlorid, Natriumbenzoat, Natriumsulfat, Natriumbisulfit, Natriumascorbat, Natriumnitrat, Natriumtartrat, Natriumtetraborat, Natriumpropionat, Natriumcitrat, Natriumsuccinat, Mononatriumglutamat, Trinatriumcitrat oder eine Mischung von diesen.

Die Endkonzentration der Natriumzusammensetzung in der Stärkelösung sollte im Allgemeinen eine Konzentration sein, welche ausreichend ist, um eine effiziente Verflüssigung der Stärke gemäß der vorliegenden Erfindung zu erlauben. Im Allgemeinen ist die Endkonzentration der Natrium enthaltenden Zusammensetzung, die zu der Stärke zugegeben wird, 20 ppm oder größer, vorzugsweise von ca. 20 ppm bis ca. 10.000 ppm, insbesondere von ca. 50 ppm bis ca. 1.000 ppm und am meisten bevorzugt von ca. 100-500 ppm.

Die Verflüssigung der Stärke gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt, dass die Verflüssigungsreaktion, d.h. die enzymatische Hydrolyse von Stärke, Amylopektin oder Amylose, effizient bei einem pH zwischen 4,5 und 5,5 durchgeführt wird.

Den Temperaturbereich der Verflüssigung bildet im Allgemeinen jede Verflüssigungstemperatur, von welcher bekannt ist, dass diese bei der Verflüssigung von Stärke wirksam ist. Vorzugsweise liegt die Temperatur der Stärke zwischen ca. 80°C bis ca. 115°C, insbesondere von ca. 100°C bis ca. 110°C und am meisten bevorzugt von ca. 105°C bis ca. 108°C.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Natrium enthaltende Verbindung zu einer granulären Stärke oder einer Stärkelösung vor oder gleichzeitig mit der Zugabe von &agr;-Amylase und der Verflüssigung der Stärke zugegeben. Die Aufschlämmung wird dann für eine geeignete Zeitdauer bei einem geeigneten pH und bei einer geeigneten Temperatur gemäß wohlbekannten Techniken inkubiert, um die Stärke zu verflüssigen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Fähigkeit, Stärke effizient zu verflüssigen, wesentlich verbessert, indem die Natriumzusammensetzung vor der Verflüssigung, d.h. vor der Zugabe von &agr;-Amylase, zu der Stärkelösung zugegeben wird.

Die folgenden Beispiele sind repräsentativ, und nicht beschränkend, für die Vorteile, die durch die Verwendung der Erfindung mit sich gebracht werden. Jedoch wäre ein Durchschnittsfachmann in der Lage, Bedingungen, Getreidearten, Temperatur, Enzyme und dergleichen gemäß der obigen Offenbarung auszutauschen.

BEISPIELE Beispiel 1 Versuch zur Bestimmung der Aktivität von &agr;-Amylase

Die Aktivität von &agr;-Amylase wurde durch einen Versuch bestimmt, welcher von der Fähigkeit der Stärke, mit Iod einen blau gefärbten Komplex zu bilden, und dem Verschwinden dieser Farbe, wenn Stärke zu kürzeren Dextrinmolekülen hydrolysiert wird, abhängt. Die Aktivität von &agr;-Amylase wurde definiert im Hinblick auf die Zeitdauer des Verdaus, die nötig war, um eine Farbänderung zu erzeugen, welche einen definierten Status der Dextrinierung der Stärke anzeigte.

Die verwendeten Reagenzien waren wie folgt: Phosphatpuffer- Kaliumdihydrogenphosphat (340 g) und Natriumhydroxid (25,3 g) wurden in Wasser gelöst und auf ~2 Liter verdünnt. Der Puffer wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und der pH wurde auf 6,2 ± 0,1 eingestellt. Der Puffer wurde in einem Messkolben auf 2 Liter verdünnt. Stärkesubstrat - Zehn Gramm (Trockensubstanz) von löslicher Lintner-Stärke wurden in 50 ml Wasser suspendiert und in 300 ml kochendes Wasser gespült. Die Suspension wurde wieder zum Kochen gebracht und wurde für 5 Minuten unter konstantem Rühren gekocht. Die Stärkelösung wurde unter konstantem Rühren auf Raumtemperatur abgekühlt, und 125 ml Phosphatpuffer wurden zugegeben. Die Lösung wurde mit Wasser auf 500 ml verdünnt. Iodstammlösung - Iodkristalle (5,5 g) und Kaliumiodid (11,0 g) wurden in Wasser gelöst und wurden volumetrisch auf 250 ml verdünnt. Die Lösung wurde vor Licht geschützt aufbewahrt. Verdünnte Iodlösung - Kaliumiodid (20 g) und 2 ml der Iodstammlösung wurden in Wasser gelöst und volumetrisch auf 500 ml verdünnt. Enzymverdünnungslösung - Calciumchlorid (11,1 g) wurde in 4 Litern Wasser gelöst. Das Wasser, welches für alle Reagenzien verwendet wurde, war entweder destilliert oder entionisiert.

Die &agr;-Amylaseprobe, für welche die Aktivität bestimmt werden sollte, wurde mit der Enzymverdünnungslösung auf zwischen 10-15 LU/ml (wie nachstehend definiert) verdünnt. Es wurde gefunden, dass für viele kommerzielle &agr;-Amylasepräparate 2000fach eine geeignete Verdünnung war. Fünf Milliliter-Aliquots der verdünnten Iodlösung wurden in 13 × 100 mm-Teströhrchen verteilt, und 10 ml des Stärkesubstrats wurden in ein 23 × 200 mm-Teströhrchen gegeben. Alle Röhrchen wurden in das Wasserbad mit 30°C gestellt. Ein Hellige-Vergleichsgerät, das mit einer speziellen &agr;-Amylase-Farbscheibe ausgerüstet war (Katalognummer 620-s5), wurde verwendet, um die Ablesungen vorzunehmen. Fünf Milliliter des verdünnten Enzyms (ebenfalls bei 30°C) wurden mit dem Stärkesubstrat gemischt, und die Zeitmessung wurde begonnen. In geeigneten Zeitintervallen, z.B. 1 Minuten-Intervallen früh in der Reaktion und 15 Sekunden-Intervallen später in der Reaktion, wurden 1 ml-Aliquots der Enzym-Substrat-Mischung in ein Röhrchen überführt, das die temperierte verdünnte Iodlösung enthielt. Die Stärke-Iod-Lösung wurde gemischt und in ein 13 mm-Präzisionsvierkantröhrchen überführt, und die Farbe wurde mit der Standard-&agr;-Amylase-Farbscheibe in dem Hellige-Vergleichsgerät verglichen. Wenn die Zeit des Endpunkts erreicht war, wurden Proben in Intervallen von 0,25 Minuten entnommen.

Die Zeit, die benötigt wurde, damit die Farben der Proben mit der Farbscheibe übereinstimmten, wurde aufgezeichnet, und die Aktivität (in Liquefon pro Gramm oder ml) wurde gemäß der folgenden Formel berechnet:

wobei
LU
= Einheit Liquefon
V
= Volumen des Enzyms (5 ml)
t
= Dextrinierungsdauer (Minuten)
D
= Verdünnungsfaktor: Verdünnungsvolumen geteilt durch die Milliliter oder Gramm des verdünnten Enzyms.

Beispiel 2 Stärkeverflüssigungsbedingungen – Bestimmung des DE (Dextroseäquivalents) der verflüssigten Stärke

Die Verflüssigung der Stärke wurde unter Verwendung eines Reaktors durchgeführt, der aus 15,2 m (50 feet), mit 0,61 cm (0,24 inch) Durchmesser (0,21 inch i.D.), rostfreiem Stahlrohr aufgebaut war, das zu einer Spule mit ungefähr 25,4 cm (10 inch) Durchmesser, die ~14 cm (5,5 inch) hoch war, gebogen war. Die Spule war ausgerüstet mit einem statischen Mischer im Rohr von 29,2 cm (11,5 inch) (Cole-Parmer #G-04669-60), welcher 1,22 m (4 feet) von dem vorderen Ende entfernt angebracht war. Das hintere Ende der Spule war ausgerüstet mit einem einstellbaren Swagelok Druckentlastungsventil (# SS-4CA-3) im Rohr, welches auf einen Berstdruck von ca. 138 kPA (20 psi) eingestellt war. Die Aufschlämmung der Stärke wurde bei einer Geschwindigkeit von ~70 ml/Minute mit einer Kolbendosierpumpe in die Spule eingefüllt. Die Spule wurde durch Eintauchen in ein Glycerol-Wasser-Bad, das auf 105,5°C erwärmt wurde, erwärmt. Die Temperatur in dem Bad wurde aufrechterhalten, indem ein Zirkulationsheizgerät/Temperatursteuergerät (Fisher Scientific Modell 7305) verwendet wurde.

Granuläre Stärke wurde aus einer Maisnassmahlvorrichtung erhalten und innerhalb von zwei Tagen verwendet. Als eine andere Quelle von Stärke wurde LO-DEXTM 10 (ein wasserlösliches gereinigtes Dextrin, welches durch die begrenzte Hydrolyse von Maisstärke erzeugt wird) von der American Maize-Products Company, Hammond, Indiana, gekauft. Das hierin verwendete LO-DEXTM 10 wies zu Beginn ein DE von ~9,5 auf.

Die Stärke oder das Maltodextrin wurden mit entionisiertem Wasser auf ein gewünschtes Feststoffniveau von ca. 30-35% Trockenfeststoffe verdünnt, und der pH wurde nach Bedarf mit 2,5% NaOH oder 6% HCl eingestellt. Calcium wurde in der Form von CaCl2·2H2O zugegeben. Typische Verflüssigungsbedingungen waren: Stärke oder LO-DEXTM 10 32%–35% Feststoffe Calcium 40–60 ppm (30 ppm zugegeben) pH 5,0–6,0 &agr;-Amylase 12–14 LU/g an Kohlenhydrat (Trockenbasis)

Stärke oder LO-DEXTM 10, welche Enzym und Calcium in der Form von CaCl2·2H2O enthielten, wurden mit ca. 70 ml/min in den Reaktor eingeführt. Die Temperatur des Reaktors wurde durch Eintauchen des Reaktors in ein Glycerol-Wasser-Bad bei 105,5°C gehalten. Proben der Stärke wurden aus dem Reaktor in ein Verflüssigungsbad einer zweiten Stufe bei 95°C überführt und dort für 90 Minuten gehalten. Der Grad der Verflüssigung der Stärke wurde unmittelbar nach der Verflüssigung in der zweiten Stufe gemessen, indem das Dextroseäquivalent (DE) der Probe gemäß dem Verfahren, das in den Standard Analytical Methods of the Member Companies of the Corn Refiners Association, Inc., 6. Ausg., Analytical Procedure Committee (1980) beschrieben wird, bestimmt wurde.

Alternativ wurde die Stärke verflüssigt, indem ein Dampfstrahl-Hydroheizgerät M 103-M (Hydro-Thermal Corp., Milwaukee, WI) verwendet wurde, welches mit einer 2,5 Liter-Verzögerungsspule hinter der Mischkammer und einem Gegendruckventil am Ende ausgerüstet war. Die Stärke wurde in den Strahl bei ungefähr 360 ml/min durch eine Moyno-Pumpe eingeführt, und Dampf wurde durch eine 1030 kPa (150 psi) Dampfleitung zugeführt, auf 621-689 kPa (90-100 psi) vermindert und gesteuert, um eine Temperatur der Aufschlämmung von ca. 105,5°C, gemessen an der rückwärtigen Temperatursonde, zu ergeben. Temperatursonden wurden ungefähr 10 cm nach dem Hydroheizgerätstrahl und ungefähr 5 cm vor dem Gegendruckventil installiert.

Beispiel 3 Wirkung von Kationen auf die Verflüssigung von Maisstärke durch &agr;-Amylase bei niedrigem pH

Getrocknete Maisstärke (Clinton Brand 106-B Pearl Maisstärke, ADM Corn Processing, Clinton, Iowa) wurde mit entionisiertem Wasser (~23 kg in ~50 Litern) aufgeschlämmt und für 16 Stunden hydratisieren gelassen. Die Stärke wurde zweimal durch Filtration und Resuspendierung in entionisiertem Wasser gewaschen, um lösliche Materialien zu entfernen, und dann mit entionisiertem Wasser auf 35% Feststoffe verdünnt. Calcium (50 ppm, zugegeben als CaCl2·2H2O) wurde zu der Stärke zugegeben, und der pH wurde mit 2,5% NaOH auf ungefähr 5,5 eingestellt. Ungefähr 5 mM des auszuwertenden Kations wurden zu der Stärkeaufschlämmung zugegeben, und &agr;-Amylase (SPEZYME AA20, das durch einen Stamm von B. licheniformis erzeugt wurde und im Handel bei Genencor International, Inc. erhältlich ist) wurde in einem Verhältnis von 12 LU/g Kohlenhydrat zugegeben, und der pH der Lösung wurde durch die Zugabe von nach Bedarf 2,5% NaOH oder 6% HCl auf pH 5,5 eingestellt. Die Lösung wurde unter Verwendung des Reaktorsystems und der Prozedur, wie sie in Beispiel 2 beschrieben werden, hydrolysiert. Der Grad der Hydrolyse der Stärkeaufschlämmung wurde gemessen, indem das Dextroseäquivalent (DE) unmittelbar nach dem sekundären Halt bestimmt wurde.

Die folgende Tabelle zeigt, dass die Inaktivierung von &agr;-Amylase während der Verflüssigung von Maisstärke bei pH 5,5 durch die Zugabe von Natriumsalzen, nicht aber durch andere Kationen, verhindert wird.

TABELLE 1 Wirkung von Kationen auf die Verflüssigung von Maisstärke bei pH 5,5

Die Anmelder haben belegt, dass kleine Wirkungen, die bei gewissen Kationen (d.h. K+ und NH4 +) beobachtet werden, mit kleinen Variationen in der Menge von NaOH, das zur Einstellung des pH zugegeben wurde, konsistent waren. Nichtsdestotrotz glauben die Anmelder, dass eine kleine Wirkung, z.B. ungefähr 10-25% von der, die durch eine Natriumzusammensetzung bewirkt wird, ebenfalls durch das Kaliumion bereitgestellt wird.

Beispiel 4 (Referenz) Die Wirkung des Variierens des Gegenanions auf die Natriumstabilisierung von &agr;-Amylase

Getrocknete Maisstärke (Clinton Brand 106-B Pearl Maisstärke, ADM Corn Processing, Clinton, Iowa) wurde mit entionisiertem Wasser (~23 kg in ~50 Litern) aufgeschlämmt und für 16 Stunden hydratisieren gelassen. Die Stärke wurde zweimal durch Filtration und Resuspendierung in entionisiertem Wasser gewaschen, um lösliche Materialien zu entfernen, und dann mit entionisiertem Wasser auf 35% Feststoffe verdünnt. Calcium (50 ppm, zugegeben als CaCl2·2H2O) wurde zu der Stärke zugegeben, und der pH wurde mit 5% KOH auf ungefähr 5,5 eingestellt. Verschiedene Natriumsalze wurden zu der Stärkeaufschlämmung zugegeben, um Natriumendkonzentrationen von 5 mM zu ergeben. &agr;-Amylase (SPEZYME AA20, das durch einen Stamm von B. licheniformis erzeugt wurde und im Handel bei Genencor International, Inc. erhältlich ist) wurde in einem Verhältnis von 12 LU/g Kohlenhydrat zugegeben, und der pH der Lösung wurde durch die Zugabe von nach Bedarf 5% KOH oder 6% HCl auf pH 5,5 eingestellt. Die Lösung wurde unter Verwendung des Reaktorsystems und der Prozedur, wie sie in Beispiel 2 beschrieben werden, hydrolysiert. Der Grad der Hydrolyse der Stärkeaufschlämmung wurde durch das Dextroseäquivalent (DE) unmittelbar nach dem sekundären Halt gemessen.

Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, wird die Inaktivierung von &agr;-Amylase während der Verflüssigung von Maisstärke bei pH 5,5 durch die Zugabe von Natriumionen aus einer Vielzahl von Quellen verhindert. Wenn auch Natriumbromat offensichtlich unwirksam war, wird dieses der starken Oxidationswirkung zugeschrieben, von der bekannt ist, dass sie zwischen Bromat und Protein vorkommt.

TABELLE 2 Wirkung von Natriumionen auf die Stabilität von &agr;-Amylase während der Verflüssigung bei pH 5,5

Beispiel 5 Wirkung der Konzentrationen von Natriumionen und &agr;-Amylase auf die Verflüssigung von Maisstärke

Eine Aufschlämmung von Maisstärke aus einer Mais-Nassmahlanlage wurde mit entionisiertem Wasser auf 35% Feststoffe verdünnt, und 30 ppm Calcium wurden als Ca(OH)2 zugegeben. Verschiedene Konzentrationen an Natriumionen wurden zu der Stärkeaufschlämmung zugegeben, um die gewünschte Natriumionenkonzentration zu ergeben. Wenigstens zwei Natriumionenkonzentrationen wurden bei jeder &agr;-Amylasekonzentration ausgewertet. Die Konzentration an Natriumionen in der Stärkeaufschlämmung wurde durch eine Natriumionenelektrode (Corning # 476138) gemessen. Die Stärkeaufschlämmung von bekannten Feststoffen wurde durch Whatman #3 Filterpapier filtriert, und die Natriumkonzentration des Filtrats wurde gemessen, wie in dem Handbuch für die Natriumelektrode beschrieben wird. Natriumionenkonzentrationen werden als Teile pro Million der gesamten Stärkeaufschlämmung angegeben.

Der pH der Stärkeaufschlämmung wurde nach Bedarf mit 5% KOH oder 6% HCl auf ungefähr den gewünschten pH (zwischen 5,5 und 5,9) eingestellt. &agr;-Amylase (SPEZYME AA20, das durch einen Stamm von B. licheniformis erzeugt wurde und im Handel bei Genencor International, Inc. erhältlich ist) wurde in einem Verhältnis von 12, 15 oder 18 LU/g Kohlenhydrat Trockenfeststoffe zugegeben, und der pH der Lösung wurde durch die Zugabe von nach Bedarf 5% KOH oder 6% HCl auf den gewünschten pH eingestellt. Die Lösung wurde unter Verwendung des Dampfstrahls und der Prozedur, wie sie in Beispiel 2 beschrieben werden, hydrolysiert. Der Grad der Hydrolyse der Stärkeaufschlämmung wurde durch das Dextroseäquivalent (DE) unmittelbar nach dem sekundären Halt gemessen.

Die Natriumionenkonzentrationen, die bei den Verflüssigungen verwendet wurden, wurden so eingestellt, dass DEs über und unter 10 bei jeder ausgewerteten &agr;-Amylasedosierung erhalten wurden. Die Natriumionenkonzentration, die benötigt wurde, um eine verflüssigte Stärke mit DE 10 bei jeder Enzymdosierung zu erzeugen, wurde dann bestimmt, indem die DE-Werte gegen die Natriumionenkonzentrationen aufgetragen wurden und zwischen den Datenpunkten interpoliert wurde.

Wie in Tabelle 3 gezeigt ist, werden, wenn der pH der Verflüssigung sinkt oder wenn die Konzentration der &agr;-Amylase erniedrigt wird, mehr Natriumionen benötigt, um eine verflüssigte Stärke mit DE 10 zu erzeugen.

TABELLE 3 Natriumkonzentration, die nötig ist, um ein DE 10-Liquefact zu erzeugen

Natürlich sollte man verstehen, dass eine große Anzahl von Änderungen und Modifikationen mit der oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsform durchgeführt werden kann. Es ist daher beabsichtigt, dass die vorstehende detaillierte Beschreibung so verstanden wird, dass es die folgenden Ansprüche, einschließlich aller Äquivalente, sind, welche den Umfang dieser Erfindung definieren sollen.


Anspruch[de]
Ein Verfahren zum Verflüssigen einer Stärkelösung, welche eine Aufschlämmung ist, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Zugeben einer Natriumzusammensetzung zu der Stärkelösung, wobei die endgültige Natriumkonzentration der Stärkelösung größer als 20 ppm ist, wobei die Natriumzusammensetzung Natriumchlorid, Natriumbenzoat, Natriumsulfat, Natriumbisulfit, Natriumascorbat, Natriumnitrat, Natriumtartrat, Natriumtetraborat, Natriumpropionat, Natriumcitrat, Natriumsuccinat, Mononatriumglutamat, Trinatriumcitrat oder eine Mischung von diesen umfasst;

(b) Zugeben von &agr;-Amylase zu der Stärkelösung; und

(c) Inkubieren der Stärkelösung, welche die Natriumzusammensetzung und die &agr;-Amylase umfasst, bei einem pH zwischen 4,5 und 5,5, bei einer Temperatur zwischen 80°C bis 115°C und für eine Zeitdauer, die geeignet ist, um die Stärkelösung zu verflüssigen, um eine verflüssigte Stärkelösung zu bilden;

wobei der Schritt (c) unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, dass ein Antioxidationsmittel in der Stärkelösung in einer Endkonzentration vorliegt, die weniger als 2,5 mM eines Antioxidationsmittels umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Natriumzusammensetzung in einer Endkonzentration von 20 ppm bis 10.000 ppm vorliegt. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Natriumzusammensetzung in einer Endkonzentration von 50 ppm bis 1000 ppm vorliegt. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Natriumzusammensetzung in einer Endkonzentration von 100 ppm bis 500 ppm vorliegt. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt (a) vor dem Schritt (b) stattfindet. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt (a) gleichzeitig mit dem Schritt (b) stattfindet.






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