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Dokumentenidentifikation DE69932699T2 09.08.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001021721
Titel ASSAYS FÜR TSH-REZEPTOR-AUTOANTIKÖRPER
Anmelder RSR Ltd., Cardiff, GB
Erfinder SANDERS, Jane, Thornhill, Cardiff CF4 9HT, GB;
SMITH, Rees, Bernard, St. Mellons, Cardiff CF3 9XE, GB;
FURMANIAK, Jadwiga, Thornhill, Cardiff CF4 9HZ, GB
Vertreter MÜLLER FOTTNER STEINECKE Rechtsanwälte Patentanwälte, 80335 München
DE-Aktenzeichen 69932699
Vertragsstaaten AT, CH, DE, ES, FR, GB, IT, LI
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 04.06.1999
EP-Aktenzeichen 999252026
WO-Anmeldetag 04.06.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/GB99/01774
WO-Veröffentlichungsnummer 1999064865
WO-Veröffentlichungsdatum 16.12.1999
EP-Offenlegungsdatum 26.07.2000
EP date of grant 09.08.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 09.08.2007
IPC-Hauptklasse G01N 33/564(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse G01N 33/577(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 9/02(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/76(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/543(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/566(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 14/72(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 16/28(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/78(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung befasst sich mit Untersuchungen (Kits und analytischen Verfahren) zum Nachweis oder Monitoring von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern.

Hyperthyreose, die mit der Basedowschen Erkrankung assoziiert ist, ist bekannterweise auf Autoantikörper gegen den Schilddrüsenrezeptor für Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH) zurückzuführen. Die Autoantikörper binden an den Rezeptor und imitieren die Aktivität des natürlichen Liganden (TSH) und veranlassen dadurch die Drüse, große Mengen an Schilddrüsenhormonen zu produzieren (wie beschrieben in Endocrine Reviews 1988, Bd. 9, Nr. 1, Seiten 106 bis 117).

Der Nachweis oder das Monitoring von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern (TRAB) ist wichtig für die Diagnose und das Management der Basedowschen Erkrankung, wobei derzeit zwei Arten von Untersuchungen verwendet werden, nämlich:

  • (a) kompetitive Bindungsassays, welche die Fähigkeit von TRAb messen, die Bindung von 125I-markiertem TSH an TSH-Rezeptorpräparationen zu inhibieren; und
  • (b) Bioassays, welche die Fähigkeit von TRAb messen, Schilddrüsenzellen (oder andere Zellen, die mit dem TSH-Rezeptorgen transfiziert sind) in Kultur zu stimulieren.

Gegenwärtig sind kompetitive Bindungsassays (Typ (a) oben) weiter verbreitet, weil Bioassays vom in (b) oben genannten Typ teuer sind, zeitintensiv sind, hochqualifiziertes Personal erfordern, und für die breite Verwendung in der Routine ungeeignet sind. In gegenwärtigen kompetitiven Bindungsassays werden Testserumproben (50 &mgr;l) üblicherweise mit gereinigtem solubilisiertem TSH-Rezeptor vom Schwein (50 &mgr;l) inkubiert. In den Testseren vorhandene TRAb binden während dieser Inkubation an den TSH-Rezeptor. 125I-markiertes TSH wird anschließend zugesetzt und die Inkubation fortgesetzt. Während dieser zweiten Inkubation bindet das markierte TSH an TSH-Rezeptoren, die noch nicht von TRAb belegt sind. Schließlich wird das an den Rezeptor gebundene 125I-markierte TSH vom freien markierten TSH durch Zugabe von Polyethylenglykol (PEG) abgetrennt, welches das Rezeptor-gebundene TSH, jedoch nicht das freie TSH präzipitiert. Die Radioaktivität in den Präzipitaten (abgetrennt durch Zentrifugation) wird anschließend gezählt. In diesem Assay inhibiert das TRAb in den Testproben die Bindung von markiertem TSH an den TSH-Rezeptor, und dies resultiert in einem Abfall der Radioaktivität in den Präzipitaten. Assayergebnisse können als ein Inhibitionsindex der Bindung von markiertem TSH oder durch Verwendung eines Satzes an Assay-Eichgeräten angegeben werden.

Die Hauptbeschränkungen dieser konventionellen Assays lauten wie folgt:

  • (a) Der Assay misst die Kompetition zwischen markiertem TSH und dem TSH-Rezeptor, kann allerdings nicht die TRAb nachweisen, die zwar sehr gut an den Rezeptor binden, jedoch auf solche Weise, dass sie die TSH-Bindung nicht sehr stark inhibieren.
  • (b) Der Assay verwendet Polyethylenglykol, um Rezeptor-gebundenes und freiem markiertes TSH zu separieren. Dies resultiert in Kopräzipitation von allen Serumimmunglobulinen und der Bildung eines verhältnismäßig großen Pellets. Obwohl das Pellet auf Radioaktivität gezählt werden kann, stellt es keine geeignete Präparation dar, um TSH (oder andere Proteine oder Peptide) nachzuweisen, welche mit nicht-radioaktiven Substanzen wie Enzymen oder chemilumineszierenden Materialien markiert sind. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Serumkomponenten im Pellet mit solchen Prozessen wie Lichtemission interferieren. Zusätzlich erfordert die Verwendung von PEG-Präzipitation die Verwendung von Zentrifugation, und dies ist ein zeitaufwändiges und lästiges Verfahren, ungeeignet für die Automatisierung.

EP 0719858 A2 beschreibt die Identifizierung einer Myelom-Zelllinie für die Expression von rekombinantem humanen TSH-Rezeptor und die Verwendung von solchem rekombinanten TSH-Rezeptor in Assays und Kits. Allerdings enthält EP 0719858 A2 keine Offenbarung oder Andeutung der Verwendung eines Antikörpers, welcher an einen Bereich des TSH-Rezeptors binden würde, der nicht in die Autoantikörperbindung involviert ist. Darüber hinaus sind keine speziellen Präparationstechniken für die Präparation eines solchen Antikörpers offenbart.

Des Weiteren offenbart WO95/06258 ein Verfahren zum Bestimmen eines Analyten in einem Volumen einer flüssigen Probe und insbesondere zum Bestimmen von Anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern in einem Patientenserum. WO95/06258 offenbart die Verwendung eines Antikörpers gegen eine Substanz, der den TSH-Rezeptor eher bindet als ein Antikörper gegen den TSH-Rezeptor selbst.

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Kits für Untersuchungen auf TRAb nach dem oben genannten kompetitiven Bindungstyp. Die Erfindung betrifft ebenso Verfahren und Kits für TRAb-Assays des direkten Bindungstyps, in denen eine direkte Interaktion zwischen dem Rezeptor und TRAb verwendet wird.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Durchmustern einer Probe einer Körperflüssigkeit auf Autoantikörper gegen den Rezeptor für Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH) bereitgestellt, welche mit demselben Teil des TSH-Rezeptors interagieren wie TSH, das

  • (a) Bereitstellen einer Quelle für den TSH-Rezeptor;
  • (b) Inkubieren des TSH-Rezeptors mit einer Probe einer Körperflüssigkeit, um ein Inkubationsgemisch bereitzustellen;
  • (c) qualitatives oder quantitatives Bestimmen von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern im Inkubationgemisch von (b), die an den TSH-Rezeptor gebunden sind;


dadurch gekennzeichnet, dass in dem Verfahren weiterhin mindestens ein Antikörper gegen den TSH-Rezeptor oder ein Fragment dieses Antikörpers eingesetzt wird, welcher den TSH-Rezeptor an einer Stelle bindet, die verschieden von dem Teil des Rezeptors ist, der TSH und TSH-Rezeptor-Autoantikörper bindet, wobei dieser mindestens eine Antikörper gegen den TSH-Rezeptor oder das Fragment dieses Antikörpers mit dem TSH-Rezeptor von (a) in Kontakt gebracht wird und damit interagiert, um entweder (i) den TSH-Rezeptor an einer festen Phase zu immobilisieren und wobei der resultierende TSH-Rezeptor, der durch diesen mindestens einen Antikörper gegen den TSH-Rezeptor oder das Fragment dieses Antikörpers immobilisiert wird, gleichzeitig TSH oder TSH-Rezeptor-Autoantikörper binden kann, oder um (ii) Mittel zum Markieren des TSH-Rezeptors bereitzustellen und wobei der resultierende TSH-Rezeptor, der durch diesen mindestens einen Antikörper gegen den TSH-Rezeptor oder das Fragment dieses Antikörpers markiert wird, gleichzeitig TSH oder TSH-Rezeptor-Autoantikörper binden kann.

Gemäß einer bevorzugten Besonderheit der vorliegenden Erfindung umfasst die Probe einer Körperflüssigkeit Blut, Plasma oder Serum.

Die Erfindung umfasst die Verwendung von Antikörpern, um einen TSH-Rezeptor zu markieren oder zu immobilisieren, wobei der immobilisierte oder markierte TSH-Rezeptor derart, dass er seine Fähigkeit, TSH und/oder TRAb zu binden, beibehält.

Die vorliegende Erfindung betrifft vorzugsweise die Verwendung eines monoklonalen (oder polyklonalen) Antikörpers gegen den TSH-Rezeptor, der von dem Rezeptor an einer Stelle stark gebunden wird, welche sich von dem Teil des Rezeptors unterscheidet, der TSH und TRAB bindet. Der Antikörper kann gleichzeitig mit TSH oder TRAb stark an den Rezeptor binden und kann verwendet werden, um viele der Beschränkungen der gegenwärtigen TRAb-Assayverfahren zu mindern.

In einer ersten Ausführungsform der Erfindung kann der Antikörper unter Verwendung von Standardverfahren an einer festen Phase (wie einem Plastikröhrchen oder einer Plastikplatte oder magnetischen oder nicht-magnetischen Partikeln) immobilisiert werden. Diese feste Phase kann anschließend anstelle von PEG verwendet werden, um markiertes TSH, das an den TSH-Rezeptor gebunden ist, von freiem markiertem TSH abzutrennen. Das TSH (oder gleichartige Liganden) kann mit isotopischen oder nicht-isotopischen Markierungen markiert werden.

Für diese Ausführungsform existieren verschiedene Anwendungen, für welche Nachfolgendes schematische Beispiele darstellt:

  • (i)
  • (ii)
  • (iii) In obigem (i) und (iii) kann der Rezeptor Ab indirekt an die feste Phase gebunden werden. Beispielsweise kann der Antikörper biotinyliert und mit der festen Phase zur Reaktion gebracht werden, die Avidin oder Streptavidin enthält.
  • (a)
  • (b)

In einer zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform kann der Antikörper direkt mit einem Isotop wie 125I oder mit einer nicht-isotopischen Markierung wie einem Enzym, Farbstoff oder einer chemilumineszierenden Verbindung markiert werden. Alternativ kann der Antikörper unter Verwendung von beispielsweise dem Avidin-Biotin-System indirekt markiert werden. Der markierte Antikörper kann anschließend verwendet werden, um den TSH-Rezeptor selbst zu markieren, und dieser Komplex aus Rezeptor und Antikörper kann anschließend verwendet werden, um TRAb (entweder qualitativ oder quantitativ) nachzuweisen und/oder zu kontrollieren.

Beispiele dieses Ansatzes sind wie folgt schematisch beschrieben:

  • (i)

In diesem System werden ansteigende Mengen von TRAb in einer Probe zu zunehmenden Mengen markierten Antikörpers im finalen Komplex führen.

  • (ii) Dieses Beispiel hängt ab von der Kopplung von TSH (oder einem ähnlichen Liganden) direkt oder indirekt an einen Feste-Phase (⎕-TSH)-Rezeptor, markiert mit dem Antikörper (der selbst mit einer isotopischen oder nicht-isotopischen Markierung markiert ist), welcher an dieses immobilisierte TSH (oder einen ähnlichen Liganden) binden kann. Diese Bindung wird durch TRAb, wie nachstehend illustriert, inhibiert werden:

Die vorstehend mit Bezug auf die ersten und zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsformen beschriebenen Schemen veranschaulichen bestimmte Vorteile der vorliegenden Erfindung. Der immobilisierte Antikörper kann verwendet werden, um den TSH-Rezeptor in einer Weise zu markieren oder zu immobilisieren, dass der Rezeptor seine Fähigkeit, TSH und/oder TRAb zu binden, beibehält. Alternativ kann der immobilisierte Antikörper zum Kontrollieren von TRAb (oder anderer Liganden, die mit dem TSH-Rezeptor interagieren) in Patientenseren verwendet werden, oder zur Reinigung des TSH-Rezeptors.

Die Fähigkeit, den TSH-Rezeptor unter Verwendung des Antikörpers zu markieren, erlaubt insbesondere das Kontrollieren der direkten Interaktion von TRAb mit dem TSH-Rezeptor wie in der vorstehend beschriebenen zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform. Ferner erlaubt die vorliegende Erfindung die Immobilisierung des Rezeptors vor, während oder nach der Interaktion mit TSH und TRAb. Diese Fähigkeit, den Rezeptor zu immobilisieren, kann verwendet werden, um neue TRAb-Assays zu entwerfen, die nicht von PEG und/oder isotopischen Markierungen abhängen. Solche Assays können geeignet sein für Automatisierungs- und immunchromatographische Systeme.

Der TSH-Rezeptor (TSHR) ist in sehr geringer Anzahl auf der Oberfläche von Thyreozyten vorhanden (etwa 103 Rezeptoren pro Zelle), was die Reinigung des Rezeptors aus nativen Quellen sehr schwierig gestaltet hat (wie beschrieben in "Bailliere's Clinical Endocrinology and Metabolism", 1997, Bd. II, Seiten 451 bis 474 – Sanders).

Im Gegensatz dazu kann rekombinanter TSHR in Säugerzellen (zum Beispiel in Ovarzellen Chinesischer Hamster (CHO)-Zellen) in sehr viel größeren Mengen von etwa 105–106 Rezeptoren pro Zelle exprimiert werden (Sanders). Zudem sind rekombinante TSHR-Präparationen, die in Nicht-Schilddrüsenzellen produziert werden, nicht mit anderen Schilddrüsen-Autoantigenen wie Thyreoglobulin oder Schilddrüsenperoxidase kontaminiert (Springer Seminars in Immunopathology, 1993, Seiten 309–318 – Furmaniak).

Rekombinante TSHR-Präparationen, die in Säugerzellen produziert wurden, sind die einzigen, die TSH- und TRAb-Bindungscharakteristika zeigen, welche denen der nativen Rezeptoren ähnlich sind. Solche Bindungscharakteristika werden nicht produziert zum Beispiel in Hefe, Insektenzellen oder Bakterien. Dies ist auf die sehr komplexe Beziehung zwischen der TSHR-Struktur und den TSH/TRAb-Bindungsstellen zurückzuführen. Die posttranslationale Prozessierung von TSHR und die Faltung des "reifen" Proteins wird am besten in der Säugerzellumgebung erreicht (siehe Sanders).

Reinigung von großen Mengen rekombinanten TSHRs aus Säugetierzellen mit seinen intakten TSH- und TRAb-Bindungsaktivitäten wurde nicht berichtet. Eines der Hauptprobleme ist der Verlust der TSH/TRAb-Bindungsaktivität im Anschluss an die Bindung mit Mausmonoklonalen Antikörpern, die mit dem extrazellulären Teil von TSHR interagieren (Sanders). Außerdem war zu diesem Zeitpunkt die Entwicklung von neuen und geeigneten Strategien zur Routinemessung von TRAb nicht erfolgreich.

Bevorzugte Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden illustriert durch die nachfolgenden, jedoch keinesfalls einschränkend zu verstehenden, detaillierten und durchgeführten Beispiele.

BEISPIELE 1. Klonieren von Schweine-TSHR-cDNA

RNA wurde extrahiert aus Schweine-Schilddrüsengewebe unter Anwendung der Guanidin-Thiozyanat-Phenol-Chloroform-Methode (Chromczynski und Sacchi, Anal. Biochem. Bd. 162, 1987, Seiten 156 bis 159). mRNA wurde aus Gesamt-RNA unter Verwendung eines Dynal bead mRNA-Reinigungskits (Dynal, Wirral L62 SAZ UK) gereinigt. Diese mRNA wurde benutzt, um unter Verwendung des ZapExpress cDNA Gigapack Kloning Kit III (Stratagene Ltd., Cambridge, CB4 4DF UK) eine cDNA-Bibliothek zu erstellen. Vier degenerierte Oligonukleotide wurden für die bekannten TSHR-Sequenzen erzeugt (Maus, Ratte, Mensch, Hund und Rind) sowie zwei Fragmente des unter Verwendung von PCR amplifizierten Schweine-TSHR. Diese wurden sequenziert, um ihre Homologie mit TSHR-cDNA zu verifizieren und verwendet, um die cDNA-Bibliothek auf full-length Schweine-TSHR-Klone zu screenen. Drei full-length Klone wurden erhalten und vollständig sequenziert.

2. Expression des rekombinanten TSHR-Proteins aus Schwein in CHO-Zellen

Ein ATG-Startkodon im 5'-untranslatierten Bereich (5'UTR) der "full-length" pTSHR-cDNA wurde durch PCR entfernt und die cDNA in pcDNA 3.1 (+) (Invitrogen BV, 9351 NV Leek, Niederlande) kloniert. DNA, die für den "full-length" TSHR kodiert, wurde durch Elektroporation in CHO-Zellen (CHO-KI von ECACC, Porton Down SP4 OJG UK) transfiziert. TSHR-exprimierende Klone wurden unter Verwendung von 125I-TSH-Bindung direkt auf den Zellen, die auf 24-Well-Platten wuchsen, nachgewiesen. Die Klone, welche die stärkste TSH-Bindung zeigten, wurden expandiert und zweimal durch limitierende Verdünnung rekloniert. Eine stabile Zelle, die etwa 4 × 105 TSHR pro Zelle exprimierte, wurde zur Expansion und Herstellung von rekombinantem TSHR ausgewählt.

3. Präparation von in Detergens solubilisiertem rekombinantem Schweine-TSHR

TSHR-exprimierende CHO-Zellen wurden bis zur Konfluenz kultiviert, von den Rollflaschen abgelöst und die Zellpellets mit eiskaltem 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, enthaltend 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), gewaschen, anschließend im gleichen Puffer homogenisiert. Die Zellmembranen wurden nach Zentrifugation bei 12000 g für 30 Min. bei 4°C im gleichen Puffer (4 ml Puffer für etwa 4 × 108 Zellen), wie er für die Homogenisierung verwendet wurde, mit Ausnahme des Zusatzes von 1% Triton X-100. Die solubilisierten Rezeptorpräparationen wurden bei 90000 g für zwei Stunden bei 4°C zentrifugiert und der Überstand bei –70°C gelagert.

4. Expression des C-terminalen Endes des Schweine-TSHR-Proteins

Die Expression in Escherichia coli als Fusionsprotein mit Glutathion S-Transferase (GST) wurde unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt (wie beschrieben im Journal of Molecoular Endocrinology (1998), Bd. 20, Seiten 233–244 – Oda). Das für die letzten 160 Aminosäuren kodierende 3'-Ende der cDNA (1809 bis 2295 bp) wurde "in-frame" mit dem GST-Fusionsprotein in den pGEX2T-Vektor kloniert (Pharmacia Biotech, St. Albans AL1 3AW UK). Eine Übernacht-Kultur von E. coli (Stamm UT580), die mit pGEX-2T/TSHR-Plasmiden transformiert wurde, wurde 1:5 verdünnt in 2 × YTG-Medium (16 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 20 g Glucose pro Liter, pH 7,0) und für 3 Stunden bei 30°C inkubiert. Daran anschließend wurde Isopropyl-3-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) zugesetzt in einer finalen Konzentration von 1 mM, um die Proteinexpression zu induzieren, gefolgt von einer Inkubation für weitere drei Stunden. Die Bakterienpellets wurden in PBS resuspendiert (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 und 0,24 g KH2PO4 pro Liter, pH 7,4), enthaltend 1% Triton X-100, und wurden dreimal für eine Minute auf Eis sonifiziert. Die Einschlusskörperchen (engl. Orig.: inclusion bodies) wurden pelletiert, in 4 M Harnstoff gewaschen, in 8 M Harnstoff solubilisiert und auf 9%igen Polyacrylamidgelen (SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese, SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Die TSHR/GST-Fusionsproteine (Molekulargewicht 44 kDa) wurden aus den Polyacrylamidgelstücken in 0,1 M NaHCO3 und 0,1% SDS pH 7,8 elektroeluiert, gegen 50 mM Tris-HCl pH 8,0 dialysiert und in Aliquots bei –70°C gelagert.

5. Präparation und Reinigung von monoklonalen Antikörpern gegen Schweine-TSHR

Elektroeluiertes TSHR/GST-Protein wurde verwendet, um BALB C-Mäuse zu immunisieren (50 &mgr;g pro Maus je Injektion), bis der Titer der Antikörper gegen TSHR hoch war. Der TSHR-Antikörperspiegel in den Mausseren wurde getestet unter Verwendung eines Immunopräzipitationsassays, der auf 35S-markiertem TSHR basierte, welches in einem in vitro Transkriptions-/Translationssystem hergestellt wurde (siehe das im Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, Bd. 82 (1997), Nr. 4, auf den Seiten 1288–1292 – Prentice beschriebene Verfahren).

Maus-Milzzellen wurden fusioniert mit der Maus-Myelom-Zelllinie (X63-Ag8.653 von ECACC) und unter Verwendung von Standardtechniken (Oda) kloniert, um stabile, TSHR-Antikörper-sekretierende Hybridomas zu produzieren. Für den Antikörper 4E31 wurde gezeigt, dass er im Immunopräzipitationsassay 35S-TSHR präzipitiert und in Western Blot Analysen sehr gut mit dem TSHR reagiert.

4E31 wurde durch Chromatographie über eine Prosep-A-Säule (Bioprocessing, Consett DH8 6TJ UK) aus Hybridomakulturüberständen gereinigt. Fab2-Fragmente wurden im Anschluss an Verdau mit Pepsin (Pepsinkonzentration von 1 mg/ml in 70 mM Natriumazetat, 50 mM NaCl pH 4,0, Verhältnis IgG zu Enzym von 5:1) und Chromatographie über Prosep A, um intaktes IgG zu adsorbieren, erhalten. 4E31-Fab2-Präparationen von etwa 1 mg/ml wurden in Aliquots bei –70°C gelagert.

6. TSH-Rezeptor-Bindungscharakteristika des 4E31-Antikörpers

Solubilisierter rekombinanter Schweine-TSH-Rezeptor wurde mit 125I-markiertem TSH inkubiert, um einen 125I-markierten TSH-TSH-Rezeptorkomplex zu bilden. Das 4E31-IgG (oder Kontroll-IgG) wurde immobilisiert, indem es an magnetische Latex-Beads gebunden wurde und diese Beads (100 &mgr;l; 1 &mgr;g von 4E31) wurden inkubiert mit dem zuvor gebildeten 125I-markierten TSH-TSH-Rezeptorkomplex (100 &mgr;l). Nach 1 Std. bei 37°C wurden die Beads mit einem Magneten abgetrennt, gewaschen und auf 125I gezählt. Eine Probe des 125I-markierten TSH-TSH-Rezeptorkomplexes wurde mit PEG präzipitiert, um die Menge des vorhandenen freiem markierten TSH zu bestimmen. Tabelle 1 zeigt die erzielten Ergebnisse:

Tabelle 1
  • (Als Kontroll-IgG wurde ein Maus-monoklonaler Antikörper gegen Glutaminsäuredecarboxylase verwendet)

Diese Untersuchungen zeigen deutlich, dass 4E31 gleichzeitig mit TSH an den TSH-Rezeptor binden kann. Ferner kann 4E31, das an einen festen Träger gebunden ist, verwendet werden, um, mit Ergebnissen ähnlich wie denjenigen, die mit PEG erzeugt werden, das an den TSH-Rezeptor gebundene TSH von freiem TSH abzutrennen.

Tabelle 2 zeigt, dass in Anwesenheit einzelner gesunder Blutspenderseren etwa 55% des zugesetzten markierten TSH an mit 4E31 und rekombinantem Schweine-TSH-Rezeptor beschichtete Röhrchen band (gemäß der ersten erfindungsgemäßen Ausführungsform, Schema ii oben). Ähnliche Bindung wurde im Falle der Seren von Patienten mit Hashimotos Schilddrüsenentzündung sowie von Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) beobachtet. Dennoch zeigten die Seren der 5 Patienten mit Basedowscher Erkrankung merklich weniger Bindung von markiertem TSH (etwa 35%). Alle 5 Seren beinhalteten leicht detektierbare Mengen des TSH-Rezeptor-Autoantikörpers, wie bei der Inhibierung von TSH-Bindung an nativen Schweine-TSH-Rezeptor und bei Separation von Rezeptor-gebundenem und freiem TSH mit PEG festgestellt.

Tabelle 2 Bindung von markiertem TSH an Plastikröhrchen, beschichtet mit 4E31 (Fab)2 und anschließend mit rekombinantem TSH-Rezeptor aus Schwein – Effekt verschiedener Seren

Tabelle 3 zeigt ähnliche Ergebnisse mit Röhrchen, die mit nativem (d. h. nichtrekombinantem) Schweine-TSH-Rezeptor via 4E31 beschichtet waren. Abermals sind die Ergebnisse, die mit dem Assay mit beschichteten Röhrchen erzielt wurden, ähnlich den mit dem PEG-Separationsverfahren erzielten.

Tabelle 3 Bindung von markiertem TSH an Plastikröhrchen, beschichtet mit 4E31 (Fab)2 und anschließend mit TSH-Rezeptor aus Schwein, solubilisiert mit nativem Detergens

Der in den Tabellen 2 und 3 gezeigte inhibierende Effekt auf 125I-TSH-Bindung war abhängig von der TRAb-Konzentration im Serum. Wie in Tabelle 4 gezeigt, übten zunehmende Mengen von TRAb-Standardpräparation (Schilddrüsen-stimulierender Antikörper 1. Internationaler Standard 90/672) einen Dosis-abhängigen Effekt auf die Inhibierung der TSH-Bindung aus.

Tabelle 4

Direkte Präzipitation von 125I-4E31 Fab2-TSH-Komplexen

Ein weiteres Beispiel der Erfindung (gemäß der zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform, Schema (i) oben ist ein Assay, in dem 4E31 (Fab)2 mit 125I markiert und mit dem TSH-Rezeptor zur Reaktion gebracht wurde. Dieser Komplex wird anschließend mit den in Patientenseren vorhandenen TSH-Rezeptor-Autoantikörpern inkubiert und der daraus resultierende termolekulare Komplex durch Zugabe des Feste-Phase-Proteins A präzipitiert. Ein Beispiel ist in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5 Reaktion zwischen rekombinantem Schweine-TSH-Rezeptor, markiert mit 125I-4E31 (Fab)2 und TSH-Rezeptor-Autoantikörpern

Basedow-Seren 18 und 19 ergaben im PEG-Präzipitationsverfahren unter Verwendung von nativem Schweine-TSH-Rezeptor TSH-Bindungs-Inhibitionswerte von 31% beziehungsweise 73%.

4E31 kann mit Biotin markiert, an Streptavidin-beschichtete Röhrchen gebunden und anschließend mit Schweine-TSH-Rezeptor zur Reaktion gebracht werden – siehe die erste erfindungsgemäße Ausführungsform, Schema (iii) b. Rezeptor, der auf diese Weise immobilisiert wurde, band 125I-markiertes TSH leicht und diese Bindung wurde durch die in Patientenseren vorhandenen TSH-Rezeptor-Autoantikörper inhibiert. Ein Beispiel ist in Tabelle 6 gezeigt.

Tabelle 6 Bindung von markiertem TSH an TSH-Rezeptor, gebunden an Streptavidinbeschichtete Röhrchen via biotinylierte 4E31 (Fab)2 und Effekte von TRAB.

Die vorliegende Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf die ausschließlich exemplarischen Figuren illustriert.

1 illustriert die Korrelation zwischen Ergebnissen unter Verwendung eines Verfahrens zur Kontrolle von Autoantikörpern gegen den Rezeptor für Schilddrüsen-stimulierendes Hormon unter Verwendung von TRAb-beschichteten Röhrchen und eines ein PEG-Präzipitationsassays verwendendes Verfahrens, wobei beide Verfahren 125I-markiertes bovines TSH verwenden. Ferner sind Ergebnisse in verschiedenen Patientengruppen gezeigt, die mit dem Verfahren erzielt wurden, welches TRAb-beschichtete Röhrchen verwendet.

2 illustriert Ergebnisse eines ELISA-Verfahrens, unter Verwendung von TSH-Rezeptorbeschichteten Platten; 2a zeigt den Effekt von TRAb-Standard 90/672 auf Schweine-TSH-Bindung gegen Rezeptor-beschichtete Platten; 2b zeigt einen Vergleich eines ELISA-Verfahrens und eines PEG-Präzipitationsassays; und Ergebnisse in verschiedenen Patientengruppen, die mit einem TRAb-ELISA-Verfahren unter Verwendung von bovinem TSH erzielt wurden, sind in 2c dargestellt.

3 illustriert die Korrelation zwischen einem üblicherweise verwendeten TRAb-Assayverfahren und einem erfindungsgemäßen direkten Präzipitationsassayverfahren. Ferner sind Ergebnisse in verschiedenen Patientengruppen mit einem direkten TRAb-Assay gezeigt.


Anspruch[de]
Verfahren zum Durchmustern einer Probe einer Körperflüssigkeit auf Autoantikörper gegen den Rezeptor für Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH), die mit demselben Teil des TSH-Rezeptors interagieren wie TSH, das Verfahren umfassend:

(a) Bereitstellen einer Quelle für den TSH-Rezeptor;

(b) Inkubieren des TSH-Rezeptors mit einer Probe einer Körperflüssigkeit, um ein Inkubationsgemisch bereitzustellen;

(c) qualitatives oder quantitatives Bestimmen von TSH-Rezeptor-Autoantikörpern im Inkubationgemisch von (b), die an den TSH-Rezeptor gebunden sind;

dadurch gekennzeichnet, dass in dem Verfahren weiterhin mindestens ein Antikörper gegen den TSH-Rezeptor oder ein Fragment dieses Antikörpers eingesetzt wird, welcher den TSH-Rezeptor an einer Stelle bindet, die verschieden von dem Teil des Rezeptors ist, der TSH und TSH-Rezeptor-Autoantikörper bindet, wobei dieser mindestens eine Antikörper gegen den TSH-Rezeptor oder das Fragment dieses Antikörpers mit dem TSH-Rezeptor von (a) in Kontakt gebracht wird und damit interagiert, um entweder (i) den TSH-Rezeptor an einer festen Phase zu immobilisieren und wobei der resultierende TSH-Rezeptor, der durch diesen mindestens einen Antikörper gegen den TSH-Rezeptor oder das Fragment dieses Antikörpers immobilisiert wird, gleichzeitig TSH oder TSH-Rezeptor-Autoantikörper binden kann, oder um (ii) Mittel zum Markieren des TSH-Rezeptors bereitzustellen und wobei der resultierende TSH-Rezeptor, der durch diesen mindestens einen Antikörper gegen den TSH-Rezeptor oder das Fragment dieses Antikörpers markiert wird, gleichzeitig TSH oder TSH-Rezeptor-Autoantikörper binden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der mindestens eine Antikörper gegen den TSH-Rezeptor ein monklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der mindestens eine Antikörper gegen den TSH-Rezeptor oder das Fragment dieses Antikörpers an einer festen Phase immobilisiert ist. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der mindestens eine Antikörper gegen den TSH-Rezeptor oder das Fragment dieses Antikörpers markiert ist. Verfahren nach Anspruch 4, wobei Schritt (c) das Hinzufügen eines Anti-human-IgG-Reagens zu dem Inkubationsgemisch, das im Anschluss an Schritt (b) erhalten wird, umfasst. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Inkubationsgemisch weiterhin TSH umfasst. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das TSH markiert ist. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das TSH an einer festen Phase immobilisiert ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das TSH mit dem TSH-Rezeptor nach Inkontaktbringen des TSH-Rezeptors mit dem mindestens einen Antikörper gegen den TSH-Rezeptor oder einem Fragment dieses Antikörpers in Kontakt gebracht wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das TSH mit dem TSH-Rezeptor vor Inkontaktbringen des TSH-Rezeptors mit dem mindestens einen Antikörper gegen den TSH-Rezeptor oder einem Fragment dieses Antikörpers in Kontakt gebracht wird.






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