Die Induktion einer tumorspezifischen Immunität ist durch eine
prospektive Stärkung der körpereigenen Abwehrmechanismen statt der Verwendung
toxischer therapeutischer Standardmittel ein attraktiver Weg für die Krebstherapie,
um einen Langzeitschutz gegen Tumorexistenz, -wachstum und -rekurrenz bereitzustellen.
Diese Strategie ist aufgrund ihres Potentials zur Zerstörung kleiner metastatischer
Tumore, die sich dem Nachweis entziehen können, und zur Bereitstellung von
Immunität gegen rekurrente Tumore attraktiv.
Prinzipiell hängt eine Immuntherapie von der Gegenwart von tumorspezifischen
Antigenen und von der Fähigkeit zur Induktion einer zytotoxischen Immunantwort
ab, die Antigene präsentierende Tumorzellen erkennt. Zytotoxische T-Lymphozyten
(CTL) erkennen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse-I-Moleküle,
die mit Peptiden komplexiert sind, die sich von auf der Zelloberfläche präsentierten
Zellproteinen ableiten, in Kombination mit co-stimulatorischen Molekülen. Müller
et al., Annu. Rev. Immunol. 7: 445–80 (1989). In der Tat wurden tumorspezifische
Antigene in einem Bereich menschlicher Tumore nachgewiesen. Roth et al., Adv. Immunol.
57: 281–351 (1994); Boon et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 337–65 (1994).
Einige Krebs-Vaccinationsstrategien haben sich auf die Verwendung
von abgetöteten Tumorzellen oder -lysaten konzentriert, die in Kombination
mit Adjuvanzien oder Zytokinen verabreicht werden. Neuerdings wird der Gentransfer
von Zytokinen, MHC-Molekülen, co-stimulatorischen Molekülen oder Tumorantigenen
auf Tumorzellen angewandt, um die Sichtbarkeit der Tumorzelle gegenüber Immuneffektorzellen
zu verstärken. Dranoff & Mulligan, Adv. Immunol. 58: 417–54 (1995).
Die therapeutische Anwendung von „Krebs-Vakzinen" hat allerdings
zu großen Schwierigkeiten geführt. Insbesondere erfordern die herkömmlichen
Wege den Erhalt und die Kultivierung autologer Tumorzellen eines Patienten zur Manipulation
in vitro, Bestrahlung oder anschließende Impfung oder die Identifizierung und
Reinigung eines spezifischen Tumorantigens.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Darum besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung
eines Verfahrens zur Auslösung einer systemischen Antitumor-Immunantwort bei
einem Patienten, der das Risiko der Entwicklung multipler metastatischer Tumore
aufweist oder bei dem dieses Risiko besteht, ohne Manipulation der autologen Tumorzellen
des Patienten oder ohne Identifizierung oder Reinigung spezifischer Antigene.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht auch in der Bereitstellung
von Vektoren zur Durchführung dieses Verfahrens.
Beim Erreichen dieser und anderer Ziele beschreibt die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Auslösung einer systemischen Antitumor-Immunantwort
bei einem Patienten, bei dem das Risiko der Entwicklung multipler metastatischer
Tumore eines gegebenen Zelltyps besteht, oder der dieses Risiko aufweist.
Darum betrifft die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung,
die ein Herpes-simplex-Virus (HSV), das sich in teilenden Zellen repliziert und
eine gedämpfte Replikation in sich nicht-teilenden Zellen aufweist und das
eine oder mehrere exprimierbare Nukleotidsequenzen einschließt, die ein oder
mehrere Zytokine oder mindestens einen weiteren Immunmodulator codiert, und ein
pharmazeutisch verträgliches Vehikel für das Virus einschließt, zur
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Metastase
eines Tumors eines gegebenen Zelltyps, die eine systemische Antitumor-Immunantwort
bei einem Patienten auslöst, bei dem das Risiko der Entwicklung multipler metastatischer
Tumore eines gegebenen Zelltyps besteht oder der das Risiko aufweist, wobei das
Medikament zur Inokulation eines Tumors bei einem Patienten geeignet ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das Virus replikationsdefekt.
Nach wieder einer anderen Ausführungsform ist das Virus konditional replikationskompetent.
Nach einer weiteren Ausführungsform stammt das Virus aus einem Vakzinstamm.
Mutierte Viren, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
geeignet sind, werden ebenfalls beschrieben, z. B. ein Herpes-simplex-Virus, das
nicht zur Expression sowohl (i) eines funktionellen &ggr;34.5-Genprodukts als
auch (ii) einer Ribonukleotidreduktase in der Lage ist, wobei das Genom des Virus
mindestens eine exprimierbare Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens einen Immunmodulator
codiert. Außerdem wird eine Herpes-Simplex-Virus-ICP4-Mutante tsK beschrieben,
deren Genom zur Einarbeitung von mindestens einer exprimierbaren Nukleotidsequenz,
die mindestens einen Immunmodulator codiert, verändert wurde.
Diese und weitere Aufgaben und Aspekte der vorliegenden Erfindung
werden dem Fachmann im Hinblick auf die hier enthaltenen Lehren klar.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A zeigt, dass die intratumorale Inokulation von CT26-Tumoren in
BALB/c-Mäusen mit G207 das Wachstum des inokulierten Tumors (Rt) und eines
nicht-inokulierten Tumors an einer beabstandeten Stelle (Lt) hemmt. Die Balken stellen
Mittelwerte ± SEM von 6 Mäusen pro Gruppe dar. Tumorvolumen = (Breite
× Länge × Höhe).
1B zeigt, dass die intradermale Inokulation von CT26-Tumoren
in BALB/c-Mäusen mit G207 keine signifikante Wirkung auf das Tumorwachstum
besitzt. Die Balken stellen den Mittelwert ± SEM von 6 Mäusen pro Gruppe
dar. Tumorvolumen = (Breite × Länge × Höhe).
1C zeigt, dass die Zunahme der intratumoralen Dosis
von G207 zu einem verminderten bilateralen Tumorwachstum von CT26-Tumoren in BALB/c-Mäusen
führt. Die Balken zeigen den Durchschnitt von 6 Tieren pro Gruppe.
2 zeigt, dass die intratumorale Inokulation von M3-Maus-Melanomzellen
in DBA/2-Mäusen mit G207 das Wachstum des inokulierten Tumors (RT) und eines
beabstandeten, nicht-inokulierten Tumors (LT) hemmt. Die Balken stellen Mittelwerte
± SEM von 6 oder 7 Mäusen pro Gruppe dar. Tumorvolumen = (Breite ×
Länge × Höhe).
3 zeigt, dass die intratumorale Inokulation von Maus-N18-Neuroblastomzellen
in syngeneischen A/J-Mäusen mit G207 das Wachstum des inokulierten Tumors (Linker
Tumor) und eines beabstandeten, nicht-inokulierten Tumors (Rechter Tumor) hemmt.
Die Balken stellen Mittelwerte ± SEM von 8 Mäusen pro Gruppe dar. Tumorvolumen
= (Breite × Länge × Höhe).
4 zeigt, dass die intratumorale Inokulation von CT26-Tumoren in
BALB/c-Mäusen mit tsK das Wachstum des inokulierten Tumors (Rt) und eines beabstandeten,
nicht-inokulierten Tumors (Lt) hemmt. Die Balken stellen Mittelwerte ± SEM
von 6 Mäusen pro Gruppe dar. Tumorvolumen = (Breite × Länge ×
Höhe).
5A zeigt das Plasmid-pHCL-tk. 5B
zeigt das Plasmid pHCIL12-tk.
6 zeigt die Sekretion von IL-12 in mit dvIL12/G207
inokulierten Zellen.
7 zeigt, dass die intratumorale Inokulation von CT26-Tumoren in
BALB/c-Mäusen mit dvlacZ/G207 oder dvIL12/G207 das Wachstum des inokulierten
Tumors (Rt) und eines beabstandeten, nicht-inokulierten Tumors (Lt) hemmt. Die Balken
stellen Mittelwerte ± SEM von 6 Mäusen pro Gruppe dar. Tumorvolumen =
(Breite × Länge × Höhe).
8 zeigt die Überlebensrate von Mäusen nach
der Inokulation mit dvlacZ/G207, dvIL12/G207 oder einer Mock-Probe.
9 zeigt, dass die Inokulation von CT26-Tumoren in BALB/c-Mäusen
mit dvIL12/tsK oder dvlacZ/tsK das Wachstum des inokuliertem Tumors (Rt) und eines
beabstandeten, nicht-inokulierten Tumors (Lt) hemmt. Die Balken stellen Mittelwerte
± SEM von 6 Mäusen pro Gruppe dar. Das Tumorvolumen = (Breite × Länge
× Höhe).
10 zeigt die Überlebensrate von Mäusen nach
der Inokulation mit dvlacZ/tsK, dvIL12/tsK oder einer Mock-Probe.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Ein neuer und verbesserter Weg zur Auslösung einer systemischen
Immunantwort bei Patienten, die multiple metastatische Tumore aufweisen, wurde entwickelt.
Gemäß diesen Entwicklungen beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Auslösung einer systemischen Antitumor-Immunantwort bei einem Patienten,
bei dem das Risiko der Entwicklung metastatischer Tumore besteht oder der das Risiko
aufweist, durch Inokulation von mindestens einem Tumor mit einem mutierten Herpes-simplex-Virus
(HSV). Die Inokulation ruft eine hochspezifische Antitumor-Immunantwort hervor,
die Zellen des inokulierten Tumors als auch Zellen der beabstandeten entwickelten
nicht-inokulierten Tumore abtötet.
Die Möglichkeit der Behandlung von Patienten, die multiple metastatische
Tumore aufweisen, stellt einen nennenswerten Fortschritt gegenüber den herkömmlichen
Wegen dar, die sich auf die Behandlung einer einzigen Tumormasse konzentrieren.
Die Wirksamkeit der herkömmlichen zytotoxischen viralen Vektor-basierenden
Wege hängt von der Virusinfektion sämtlicher Tumorzellen in dem Patienten
ab. Es ist allerdings extrem schwierig, eine breite oder systemische Verteilung
viraler Vektoren in vivo zu erhalten, und darum schwierig, sämtliche Tumorzellen
eines lokalen soliden Tumors zu infizieren und praktisch unmöglich, sämtliche
Tumorzellen bei einem Patienten, der multiple metastatische Tumore aufweist, zu
infizieren. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung, die nicht die Ausrichtung
eines viralen Vektors auf jede Tumorzelle erfordert, bietet darum eine distinkte
Verbesserung gegenüber diesem Verfahren. Ferner überleben viele Patienten
mit den jüngsten Verbesserungen in der Krebstherapie von primären Tumoren
länger und sind dem Risiko der Entwicklung multipler metastatischer Tumore
ausgesetzt. Demnach stellt die wirksame Möglichkeit der Behandlung
dieser Patienten eine benötigte Verbesserung in der Krebstherapie dar.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Viren sind mutierte Herpes-simplex-Viren,
die Tumorzellen infizieren, sich allerdings nicht wirksam auf normale Zellen oder
Gewebe ausbreiten oder sich darin wirksam replizieren, wodurch an und für sich
keine Krankheit oder Pathologie ausgelöst wird. Beispielsweise ist ein Virus,
welches sich in teilenden Zellen repliziert und eine gedämpfte Replikation
in sich nicht teilenden Zellen aufweist, erfindungsgemäß geeignet, ebenso
wie ein Virus, das replikationsdefekt ist. Das Virus kann vom Typ 1 (HSV-1) oder
vom Typ 2 (HSV-2) sein. Verschiedene HSV-1-Mutanten wurden bereits zur lokalen zytotoxischen
Tumortherapie verwendet, um Tumorzellen in situ zu zerstören und dennoch normales
Gewebe auszusparen. Mineta et al., Nature Medicine 1: 938–43 (1995); Martuza
et al., Science 252: 854–56 (1991); Boviatsis et al., Gene Therapy 1: 323–331
(1994); Randazzo et al., Virology 211: 94–101 (1995); Andreansky et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11313–18 (1996). Jede dieser Mutanten kann
erfindungsgemäß eingesetzt werden, ebenso wie Vakzinstämme von HSV.
Eine Anzahl von antiviralen Arzneimitteln (d. h. Acyclovir und Foscarnet) gegen
Herpes-simplex-Virus steht zur Verfügung, durch die sich eine unvorhergesehene
virale Ausbreitung behandeln lässt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
repliziert sich das Virus in sich teilenden Zellen und zeigt eine gedämpfte
Replikation in sich nicht teilenden Zellen. Beispielsweise beschreibt die US-Patentschrift
Nr. 5,585,096 ein geeignetes Virus, das durch den Stamm G207 erläutert wird,
das in der Lage ist, sowohl (i) ein funktionelles &ggr;34.5-Genprodukt als auch
(ii) eine Ribonukleotidreduktase zu exprimieren. (Der Inhalt der US-Patentschrift
Nr. 5,585,096 ist hier durch Bezugnahme eingeschlossen). G207 repliziert sich in
sich teilenden Zellen und bewirkt eine lytische Infektion mit nachfolgendem Zelltod,
ist allerdings in sich nicht teilenden Zellen stark abgeschwächt, wodurch sich
die Virusausbreitung auf die Tumore konzentriert. G207 ist nicht neuropathogen und
ruft bei Mäusen und nicht-humanen Primaten keine nachweisbare Erkrankung hervor.
Mineta et al., Nature Medicine 1: 938–43 (1995).
Gemäß anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist das
Virus replikationsdefekt. Beispiel für ein solches Virus ist tsK, eine temperaturempfindliche
Herpes-Simplex-Virus-Mutante in ICP4. Davison et al., J. Gen. Virol. 65: 859–63
(1984). Die Fähigkeit von tsK zu replizieren, ist temperaturabhängig,
wobei 31,5°C für die Replikation permissiv und 39,5°C nicht-permissiv
sind. TsK kann sich mit einer wechselnden Fähigkeit zwischen diesen Temperaturen
replizieren. Da die Körpertemperatur etwa 39,5°C beträgt, wird erwartet,
dass tsK in vivo replikationsdefekt ist. Dies wurde bereits durch in vivo Experimente
mit tsK bei Ratten bestätigt.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Virus
konditional replikationskompetent. Ein Beispiel für ein solches Virus ist G92A,
dessen Fähigkeit zur Replikation Zelltyp-abhängig ist. G92A wird ausführlicher
in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/486,147, eingereicht am 7. Juni 1995,
beschrieben, deren Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Die Erfindung beschreibt weiterhin eine. Zusammensetzung, bestehend
im Wesentlichen aus dem Herpes-simplex-Virus und einem pharmazeutisch verträglichen
Träger, die an einen Patienten verabreicht wird, der an der Entwicklung multipler
metastatischer Tumore leidet oder bei dem das Risiko dieser Entwicklung besteht.
Die Zusammensetzung wird direkt an die Tumorzellen in situ verabreicht. In dieser
Beschreibung schließt der Begriff „bestehend im Wesentlichen aus" einen
Schritt oder andere Merkmale aus, die einen Materialaspekt der Erfindung signifikant
beeinflussen. So eingestuft, würde eine Zusammensetzung dieser Ausführungsform
beispielsweise das vorgeschriebene Herpes-simplex-Virus mit keinem anderen Virus
oder mit einem defekten Virusvektor einschließen; und dies, da ein zusätzliches
Virus das erfinderische Protokoll im Wesentlichen komplizieren würde. Die Erfindung
umfasst auch die Verabreichung dieser Zusammensetzung in Kombination mit einer anderen
Therapie, wie Chemotherapie oder Strahlenbehandlung.
Mehr als ein mutiertes Herpes-simplex-Virus kann verabreicht werden.
Diese Ausführungsform kann durch Verabreichung einer einzigen Zusammensetzung,
die mehr als ein mutiertes Herpes-simplex-Virus und ein pharmazeutisch verträgliches
Vehikel für die Viren einschließt, oder durch Verabreichung von mehr als
einer Zusammensetzung durchgeführt werden, wobei jede Zusammensetzung mindestens
ein mutiertes Herpes-simplex-Virus und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel
für das Virus oder die Viren umfasst. Beispielsweise kann eine Zusammensetzung
verabreicht werden, die (A) ein erstes mutiertes Herpes-simplex-Virus, (b) ein zweites
mutiertes Herpes-simplex-Virus und (C) einen pharmazeutisch verträglichen Träger
für die Viren umfasst. Außerdem kann eine Zusammensetzung verabreicht
werden, die im Wesentlichen aus (A) einem ersten mutierten Herpes-simplex-Virus,
(B) einem zweiten mutierten Herpes-simplex-Virus und (C) einem pharmazeutisch verträglichen
Träger für die Viren besteht. Wie vorstehend ausgeführt, schließt
der Begriff „im Wesentlichen bestehend aus" einen Schritt oder ein weiteres
Merkmal aus, das einen Materialaspekt der Erfindung signifikant beeinflussen würde.
Somit würde diese Ausführungsform beispielsweise die
Verabreichung des vorgeschriebenen ersten und zweiten Herpes-simplex-Virus mit keinem
anderen Virus oder einem defekten Virusvektor zur Folge haben.
Die erfindungsgemäße Inokulation eines Tumors mit einem
oder mehreren mutierten Herpes-simplex-Viren löst eine systemische tumorspezifische
Immunantwort aus, die für den Zelltyp des inokulierten Tumors spezifisch ist,
und die Zellen des inokulierten Tumors und von anderen nicht-inokulierten Tumoren
abtötet. Der ausgelöste Zelltod wird beispielsweise als inhibiertes Tumorwachstum
oder als reduzierte Tumorgröße festgestellt. In den nachstehend ausgeführten
Beispielen wird der induzierte Zelltod als Hemmung des Wachstums des inokulierten
Tumors und von beabstandeten entwickelten nicht-inokulierten Tumoren festgestellt.
In einigen Fällen schrumpfen die Tumoren auf nicht nachweisbare Größen.
In einem der untersuchten murinen Modelle, CT26, wird die Immunantwort mit zytotoxischen
T-Lymphozyten (CD8+) korreliert, die ein Haupthistokompatibilitätskomplex
(MHC)-Klasse-I eingeschränktes Peptid erkennen, das ein dominantes Tumorantigen
ist.
Wie vorstehend erläutert, wird die Zusammensetzung direkt an
Tumorzellen des Patienten in situ verabreicht. Dies kann durch aus der Technik bekannte
Verfahrensweisen erreicht werden, beispielsweise durch intratumorale Inokulation
während einer Operation, wie Operation zur Massereduzierung eines Tumors, in
externe Melanome, oder stereotaktisch in das Tumorbett. Weitere Möglichkeiten
zum Zielen auf Tumore sind ebenfalls geeignet. Im Allgemeinen wird die maximale
Sicherheitsdosis in wöchentlichen Abständen verabreicht, wenn der Tumor
leicht zugänglich ist, oder wird während einer Operation oder Tumorbiopsie
verabreicht.
Das pharmazeutisch verträgliche Vehikel für das Virus kann
aus bekannten pharmazeutisch verträglichen Vehikeln ausgewählt werden
und sollte ein Vehikel sein, in dem das Virus stabil ist. Beispielsweise kann es
ein Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Puffer- oder Konservierungsmittel
sein. Ein Beispiel für ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel ist Phosphatpuffer,
der NaCl enthält. Weitere pharmazeutisch verträgliche wässrige Lösungsvehikel,
nicht-toxische Exzipienzien, einschließlich von Salzen, Konservierungsmitteln,
Puffern und dergleichen, sind in REMINGSTON's PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15. Ausgabe,
Easton: Mack Publishing Co., SS. 1405–1412 und 1461–1487 (1975) und
in THE NATIONAL FORMULARY XIV., 14. Ausgabe, Washington: American Pharmaceutical
Association (1975) beschrieben, deren Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen
ist.
Huang et al., Science 264: 961–65 (1994) zeigten, dass das
Priming einer Immunantwort gegen ein MHC-Klasse-I-eingeschränktes Tumorantigen
den Transfer dieses Antigens auf aus Wirtsknochenmark stammenden Antigen-präsentierenden
Zellen (APCs) vor seiner Präsentation gegenüber CD8+-T-Zellen
umfasst. Obgleich es nicht gewünscht ist, an eine Theorie gebunden zu sein,
glauben die vorliegenden Erfinder, dass eine lokale HSV-Infektion eines Tumors die
Zirkulation von Vorläufern auslöst, um in APCs zu differenzieren. Ein
Subset von Makrophagen ist in der Lage, exogene Antigene auf MHC-Klasse-I-Molekülen
gegenüber CD8+-T-Zellen-Klonen zu präsentieren. Rock et al.,
J. Immunol. 150: 438–46 (1993). Die lytische Zerstörung oder der viral
induzierte Tod von Tumorzellen könnte Tumorantigene freisetzen, die anschließend
von den APCs aufgenommen und an die ausleckenden Lymphknoten weitergeleitet werden.
Dort werden sie prozessiert und gegenüber CD8+-T-Zellen präsentiert.
Die assoziative Erkennung von HSV-spezifischen und tumorspezifischen Antigenen könnte
ebenfalls bei der Stärke der Antwort eine Rolle spielen. Tumorzellen, die mit
replikationskompetenten HSV infiziert sind, würden reifende Virionen aufweisen,
die aus ihren Zellmembranen ausknospen, und können auch virale Antigene zur
MHC-Klasse-I-Präsentation prozessieren, wie es bei APCs der Fall ist. Die HSV-infizierten
Tumorzellen könnten darum direkt T-Zellen-vermittelte Immunantworten auslösen.
Einige der durch Co-Präsentation von viralen und tumoralen Antigenen ausgelösten
Immunantworten können anschließend durch nur eines der co-exprimierten
Antigene ausgelöst werden.
Erfindungsgemäß sind eine oder mehrere Immunmodulatoren
an die Tumorzellen zusätzlich zu dem vorstehend beschriebenen mutierten Herpes-simplex-Virus
abzugeben. Beispiele für Immunmodulatoren, die bei der vorliegenden Erfindung
geeignet sind, umfassen Zytokine, co-stimulatorische Moleküle und Chemokine.
Die Abgabe von einem oder mehreren Immunmodulatoren kann beispielsweise mittels
eines mutierten Herpes-simplex-Virus, der eine oder mehrere exprimierbare Nukleotidsequenzen
umfasst, die ein oder mehrere Zytokine oder andere immunmodulatorische Gene codieren,
mittels mehr als einem mutierten Herpes-simplex-Virus, die jeweils eine oder mehrere
exprimierbare Nukleotidsequenzen umfassen, die ein oder mehrere Zytokine oder andere
immunmodulatorische Gene codieren, durchgeführt werden. Nicht-Herpes-Simplex-Virus-Vektoren
können ebenfalls zur Durchführung der Abgabe von einem oder mehreren Immunmodulatoren
verwendet werden. Beispielsweise können ein oder mehrere adenovirale Vektoren,
Adenovirus-assoziierte Vektoren, retrovirale Vektoren oder Vaccinia-Virus-Vektoren,
die eine oder mehrere exprimierbare Nukleotidsequenzen umfassen, die ein oder mehrere
immunmodulatorische Gene codieren, nach dieser Ausführungsform verwendet werden.
Siehe z. B. Shawler et al., Adv. Pharmacol. 40: 309–37 (1997),
die den Gentransfer von immunstimulatorischen Zytokinen erläutert.
Beispiele für Immunmodulatoren, die erfindungsgemäß
geeignet sind, umfassen IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, G-CSF, GM-CSF,
IFN-&agr;, IFN-&ggr;, TNF-&agr; und B7. Siehe z. B. Parmiani et al., Adv.
Pharmacol. 40: 259–89 (1997). Zweckmäßigerweise wird die Verwendung
von IL-12 in der folgenden Diskussion als Beispiel angeführt. Es ist allerdings
selbstverständlich, dass andere Immunmodulatoren an seiner Stelle oder zusätzlich
dazu eingesetzt werden können. Es ist ferner selbstverständlich, dass,
wo die vorliegende Beschreibung sich auf „einen Immunmodulator" bezieht,
die Erfindung einen oder mehrere Immunmodulatoren einschließt.
Das Zytokin IL-12 ist ein heterodimeres Zytokin, bestehend aus 35-kD-(p35)-
und 40-kD-(p40)-Untereinheiten, welches an auf NK- und T-Zellen vorhandene Rezeptoren
bindet. Der hochaffine Rezeptor besteht aus zwei &bgr;-artigen Zytokinrezeptor-Untereinheiten,
die sich einzeln als niederaffine Rezeptoren verhalten. IL-12 spielt im Immunsystem
eine multifunktionelle Rolle, die die Proliferation und zytotoxische Aktivität
von T-Zellen und NK-Zellen erhöht, die IFN-&ggr;-Produktion reguliert und
die Entwicklung von CD4+-T-Helfer-(Th1)-Zellen unterstützt.
Die Antitumor-Aktivität von IL-12 wurde bei einer Anzahl von
verschiedenen murinen Tumormodellen gezeigt, sowohl fest als auch metastasierend,
mit systemischer Verabreichung von rekombinantem IL-12, Fibroblasten oder Tumorzellen,
die gentechnisch hergestellt wurden, zur Sezernierung von IL-12, und viralen Vektoren,
die IL-12 exprimieren. Die IL-12-Immuntherapie ist mit anderen Tumorzelllinien,
wie CT26, C26, MCH-1-A1 und TS/A, weniger wirksam. Zitvogel et al., Eur. J. Immunol.
26: 1335–41 (1996). Es wurde gezeigt, dass die systemische Abgabe von rIL-12
bei verschiedenen Tiermodellen potente Antitumor-Auswirkungen besitzt. Eine verlängerte
Exposition gegenüber IL-12 kann allerdings nachteilige Nebenwirkungen, wie
diejenigen, die mit vielen Zytokinen festgestellt wurden, haben.
Der Transfer von immunmodulatorischen Genen direkt auf die Tumorzellen
ist zweckmäßig, da die Gene innerhalb des Tumors an der Stelle ihrer Wirkung
im Zusammenhang mit putativen Tumorantigenen exprimiert werden. Erfindungsgemäß
werden Tumore darum in situ modifiziert, um Tumorzellen zu einer Quelle der Immunmodulatorproduktion
zu machen.
Wie vorstehend erläutert, tötet die erfindungsgemäß
ausgelöste Immunantwort Zellen des inokulierten Tumors und auch nicht-inokulierte
Tumorzellen ab, einschließlich Zellen von beabstandeten nicht-inokulierten
Tumoren. Diese Wirkung macht dieses Verfahren besonders zur Behandlung von Patienten
geeignet, die multiple metastasierende Tumore eines gegebenen Zelltyps aufweisen.
Es stellt auch eine Verbesserung bei der Behandlung von lokalen, nicht-metastasierenden
Tumoren bereit, da das Verfahren Tumorzellen abtötet, auf die das verabreichte
Virus nicht direkt zielt.
Jeder Typ von Tumor kann erfindungsgemäß behandelt werden,
einschließlich nicht-metastasierender Tumore, Tumore mit metastasierendem Potenzial
und Tumore, die bereits eine Fähigkeit zur Metastasierung zeigen. Beispiele
von Tumorzelltypen, die erfindungsgemäß behandelt werden können,
umfassen Astrozytom-, Oligodendrogliom-, Meningiom-, Neurofibrom-, Glioblastom-,
Ependymom-, Schwannom-, Neurofibrosarkom- und Medullobastom-Zelltypen. Die Erfindung
ist auch bei der Behandlung von Melanomzellen, Pankreaskrebszellen, Prostatakarzinomzellen,
Kopf- und Nacken-Krebszellen, Brustkrebszellen, Lungenkrebszellen, Darmkrebszellen,
Lymphomzellen, Hepatomzellen, Eierstockkrebszellen, Nierenkrebszellen, Neuroblastomen,
Plattenepithelzellenkarzinomen, Sarkomen und Mesotheliom- und Epidermoid-Karzinomzellen
geeignet.
Die Ausführungsformen der Erfindung werden weiterhin durch Beispiele
erläutert, die die Aspekte der Erfindung im Einzelnen zeigen. Diese Beispiele
erläutern spezielle Aspekte der Erfindung und schränken ihren Umfang nicht
ein.
BEISPIELEBeispiel 1. Antitumor-Wirksamkeit von G207 in der CT26-Zelllinie
Die Antitumor-Wirksamkeit von G207 wurde in einem bilateralen entwickelten
subkutanen Tumormodell mit CT26-Zellen, wie nachstehend beschrieben, bewertet.
Zelllinie
Die murine kolorektale Karzinom-CT26-Zelllinie wurde als syngeneisches
Tumormodell zum Studium der Immuntherapie breit eingesetzt. Fearon et al., Cancer
Res. 35: 2975–80 (1988); Wang, et al., J. Immunol. 154: 4685–92 (1995);
Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9730–35 (1996). CT26 ist ein
transplantierbarer Darmepitheltumor, der durch intrarektale Injektionen von N-Nitroso-N-methylurethan
in weibliche BALB/c-Mäuse (H-2d) ausgelöst wird. Corbett et
al., Cancer Res. 35: 2434–39 (1975).
Bei normalen Mäusen ist CT26 wenig immunogenisch: 103–104
Zellen können einen letalen Tumor herbeiführen und lösen keine nachweisbaren
tumorspezifischen CTL aus. Fearon et al., supra; Wang et al., supra.
AH1, ein nicht mutiertes Nonamer, das sich von dem Hüllprotein (gp70) eines
endogenen ekotropischen murinen Leukämie-Provirus (MuLV), env-1, ableitet,
wurde als immundominantes MHC-Klasse-I-eingeschränktes Antigen für CT26
identifiziert. Huang et al., supra. Der adoptive Transfer von Peptid-spezifischen
CTL-Linien war in der Lage, entwickelte subkutane CT26-Tumore zu heilen, was die
Korrelation zwischen Induktion von tumorspezifischen CTL und einer Antitumor-Wirkung
zeigt.
Das Herpes-simplex-Virus wächst in vielen Rattenzellen nicht,
und abgeschwächte Viren, wie G207, wachsen auch in vielen Maustumoren nicht
gut. Dies steht im Gegensatz zu ihrem ausgezeichneten Wachstum in den meisten menschlichen
Tumorlinien. Allerdings erfordern Studien in menschlichen Tumorlinien die Verwendung
von athymischen Mäusen. CT26 wurde nach mehreren Jahren, in denen versucht
wurde, ein gutes syngeneisches System zum Studium der Immuneffekte von abgeschwächten
konditional replizierten Herpes-Vektoren, wie G207, zu finden, als Modell-Zelllinie
gewählt.
Infektion von CT26-Zellen
Tumorzellen (1 × 105) wurden subkutan in die bilateralen
Flanken von weiblichen BALB/c-Mäusen (National Cancer Institute (Rockville,
MD)) injiziert. Als subkutane Tumore tastbar wuchsen (ungefähr 5 mm Durchmesser),
wurden die Mäuse unilateral in den rechten Seitentumor entweder mit G207-Virus
in 50 &mgr;l Viruspuffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5) und modifiziertem Eagle-Medium
(MEM) (1:1) oder mit 50 &mgr;l mock-infiziertem Extrakt („Mock"), hergestellt
aus mock-infizierten Zellen, unter Anwendung der gleichen Verfahrensweisen, wie
diejenigen, die für das Virus-Inokulum eingesetzt wurden, inokuliert. Eine
zweite Injektion der gleichen Zusammensetzung wurde 7 Tage später in einigen
Experimenten verabreicht. Die Tumorgröße wurde durch eine äußere
Mikrometerschraube gemessen. Sämtliche tierische Prozeduren waren von dem Georgetown
University Animal Care and Use Committee genehmigt.
Wie in Figur gezeigt, ergab die Inokulation mit G207 eine Reduktion
im Tumorwachstum sowohl der inokulierten Tumore (RT) als auch ihrer nicht-inokulierten
kontralateralen Gegenstücke (LT) im Vergleich zu den mock-inokulierten Kontrollen
(p < 0,005 (Rt) und p < 0,001 (Lt) am Tag 21 nach der Infektion; ungepaarter
t-Test. Zum Zeitpunkt der zweiten Inokulation, 7 Tage nach der ersten Inokulation,
wurde die lacZ-Expression aus G207 durch X-gal-Histochemie in dem inokulierten Tumor,
jedoch nicht in dem nicht-inokulierten Tumor nachgewiesen.
Zwei intratumorale Inokulationen mit einer niedrigeren Dosis von G207
(7 × 103 Plaque-bildende Einheiten (pfu)) lösten eine signifikante
Wachstumshemmung der bilateralen Tumore im Vergleich zu den Kontrollen aus (p <
0,01 (Rt) und p < 0,05 (Lt) am Tag 21 nach der Infektion; ungepaarter t-Test),
jedoch zu einem geringeren Ausmaß als die höhere Dosis (siehe
1C).
Eine einzige unilaterale intratumorale Inokulation mit 5 × 107
pfu von G207 verursachte eine starke Reduktion im bilateralen Tumorwachstum (1A),
vergleichbar mit der doppelten Inokulation mit 7 × 105 pfu (1C).
Die Antitumor-Wirkung auf den nicht-inokulierten kontralateralen Tumor,
die von der intratumoralen Inokulation von G207 abhängt, als intradermale Inokulation
von G207 in die rechten Flanken von Mäusen mit entwickelten unilateralen Tumoren
in den linken Flanken besaß keine Auswirkung auf das Tumorwachstum (siehe
1B).
Rolle von T-Zellen bei der Immunantwort
Zur Evaluierung der potentiellen Rolle von T-Zellen bei der erfindungsgemäßen
Herpes-simplex-induzierten Hemmung des Tumorwachstums wurde die Antitumor-Wirksamkeit
der intratumoralen G207-Inokulation in athymischen Mäusen getestet. Es bestand
keine Wirkung der intratumoralen Inokulation von 7 × 105 pfu G207.
Höhere Dosen an G207-Inokulationen (5 × 107 pfu) verursachten
eine leichte Wachstumshemmung von Virus-inokulierten Tumoren im Vergleich zu mock-inokulierten
Tumoren (p = 0,08 am Tag 10), jedoch wurde keine Wirkung auf die nicht-inokulierten
kontralateralen Tumore festgestellt. Diese fehlende Wirkung auf die kontralateralen
Tumore in athymischen Mäusen zeigt für die ausgelöste Immunantwort
eine T-Zellen-Komponente.
Tumorspezifische CTL-Antwort
Zur Bestimmung, ob das Herpes-simplex-Virus eine tumorspezifische
CTL-Antwort auslöst, wurden Effektorzellen in vitro aus Splenozyten erzeugt,
die 12 Tage nach der ersten Virus-(G207)-Inokulation erhalten und in einem
51Cr-Freisetzungstest getestet wurden.
Einzelzell-Suspensionen von Splenozyten (3 × 106)
aus einzelnen Mäusen, die mit G207 oder mit einer Mock-Probe behandelt wurden,
wurden mit 1 × 106 Mitomycin-C-behandelten CT26-Zellen (100 &mgr;g/ml
Mitomycin C für 1 h) kultiviert. Effektorzellen wurden nach 6 Tagen der in
vitro Kultivierung geerntet und in den angegebenen Verhältnissen mit Zielzellen
vermischt. Die Zielzellen wurden 60 min mit 50 &mgr;Ci von Na51CrO4
(51Cr) inkubiert. Vierstündige 51Cr-Freisetzungstests
wurden wie bei Kojima et al., Immunity 1: 357–64 (1994) beschrieben, durchgeführt.
Die prozentspezifische Lyse wurde aus Dreifachproben wie folgt berechnet:
[(cpm experimentell – cpm spontan)/(cpm maximum – cpm spontan)] ×
100.
A20 ist eine B-Zellen-Lymphom-Zelllinie (Ig+, Ia+,
H-2d), die sich aus einem spontanen Retikulum-Zellneoplasma in BALB/c-Mäusen
ableitet. Kim et al., J. Immunol. 122: 549–54 (1979). Sie ist in der Lage,
Proteinantigen gegenüber MHC-eingschränkten Antigen-reaktiven T-Lymphozyten
zu präsentieren. Glimcher, et al., J. Exp. Med. 155: 445–59 (1982).
Mäuse, die intratumoral mit G207 behandelt wurden, erzeugten
eine hochspezifische CTL-Antwort gegen CT26-Zellen, allerdings nicht gegen A20-Lymphomzellen
(auch H-2d). Eine nicht-spezifische CTL-Antwort wurde bei Mäusen
nachgewiesen, die intradermal mit G207 oder intratumoral mit Mock-Extrakt behandelt
wurden. Es lag eine schwache, nicht-spezifische CTL-Antwort (gegen A20 und CT26)
vor, die in mock-inokulierten Mäusen ausgelöst wurde.
Die Fähigkeit von CTL, die in Mäusen erzeugt wurde, die
intratumoral mit dem Herpes-simplex-Virus inokuliert wurden, zur Erkennung des CT26-immundominanten
MHC-Klasse-I-eingeschränkten antigenischen Peptids AH1 wurde ebenfalls bewertet.
AH1, das Nonamer SPSYVYHQF, ist das immundominante Peptid aus CT26, das von dem
MHC-Klasse-I-Ld-Molekül präsentiert wird. Das Ld-bindende
AH1-Peptid leitet sich von gp70 ab, eines von zwei env-Genprodukten der endogenen
MuLV. Huang et al., supra, zeigten, dass CT26-Zellen das MuLV-env-Genprodukt exprimieren,
während es für das normale Gewebe von BALB/c-Mäusen nicht der Fall
war, und dass das virale Antigen gp70 als potentielles Tumor-Rejektions-Antigen
für das Immunsystem dienen kann. Das AH1-Peptid wurde von Peptide Technologies
(Washington, D.C.) mit einer Reinheit von > 99% synthetisiert, wie durch HPLC-
und Aminosäureanalyse bestimmt.
H-2Ld-eingeschränktes P815AB.35-43, LPYLGWLVF, ist
das immundominante Peptid, das aus murinen Mastozytom-P815-Zellen stammt. Van den
Eynde et al., J. Exp. Med. 173: 1373–84 (1991).
Effektorzellen aus intratumoralen G207-inokulierten Mäusen zeigten
eine spezielle Lyse von CT26-Zellen und von A20-Zellen, die mit dem Ld-eingeschränkten
Peptid AH1 gepulst wurden, jedoch nicht von A20-Zellen, die mit dem Ld-eingeschränkten
Peptid P815AB gepulst wurden. Die in vitro CTL-Aktivität war durch die Verarmung
an CD8+-Zellen, jedoch nicht durch die Verarmung an CD4+-Zellen
vollständig aufgehoben.
Die intradermale Inokulation mit G207-Virus oder die intratumorale
Inokulation mit Mock-Extrakt verstärkte die Aktivierung von spezifischen T-Zellen
gegen CT26-Tumore nicht. Im Gegensatz dazu löste das in vivo Priming gegen
Tumore, die endogene Antigene exprimieren, durch intratumorale Inokulation von G207
eine antigenische Peptid-spezifische CTL-Reaktion aus. Diese Ergebnisse zeigen,
dass die Inokulation von Tumoren mit einem Herpes-simplex-Virus die potentiellen
Mechanismen der Toleranz gegenüber der endogenen Antigen-Expression beheben
kann. Deas Fehlen einer Antitumor-Antwort gegen nicht-inokulierte Tumore in athymischen
Mäusen und der Verlust an CTL-Aktivität durch Verarmung an CD8+-Zellen
in vitro legt eine bedeutende Rolle der T-Zellen-vermittelten MHC-Klasse-I-eingeschränkten
Erkennung durch CTL nahe.
Beispiel 2. Antitumor-Wirksamkeit von G207 im M3-Maus-Melanomzellen
M3-Maus-Melanomzellen (3 × 105) wurden bilateral in
die Flanken von DBA/2-Mäusen inokuliert. Wenn die Tumore maximal 5 mm im Durchmesser
betrugen, wurden in den Tumor der rechten Flanke einmal entweder 5 × 107
pfu G207 oder eine gleichwertige Menge einer Mock-Verozellen-Präparation (als
negative Kontrolle) inokuliert.
Die Inokulation mit G207 hemmte das Wachstum des inokulierten Tumors
(p < 0,0005) und hemmte auch das Wachstum des nicht-inokulierten Tumors (p <
0,02) signifikant. 2.
Beispiel 3. Antitumor-Wirksamkeit von G207 in Maus-N18-NeuroblastomzellenBilaterale subkutane Tumore
Maus-N18-Neuroblastomzellen wurden subkutan bilateral in syngeneische
A/J-Mäuse implantiert. Acht Tage nach der Tumorimplantation wurden 107
pfu G207 oder Mock-Proben in den linken Tumor injiziert. In sechs von acht Tieren
ergab die Inokulation mit G207 das Verschwinden der Tumore auf beiden Seiten.
3.
Subkutane und intrazerebrale Tumore
N18-Neuroblastomzellen wurden subkutan bilateral in die linke Flanke
von A/J-Mäusen implantiert. Drei Tage später wurden N18-Neuroblastomzellen
intrazerebral in den rechten frontalen Lobus der Mäuse implantiert. An den
Tagen 10 und 13 wurde in die subkutanen Tumore nur G207 (11 Mäuse) oder Mock-Probe
(11 Mäuse) injiziert. Innerhalb von 35 Tagen der zerebralen Implantation starben
sämtliche mit Mock-Proben behandelten Mäuse an intrazerebralen Tumoren
oder wiesen sie auf. Vier von elf Mäusen, die mit G207 behandelt wurden, wiesen
keine intrazerebralen Tumore auf, und eine G207-behandelte Maus
war eine Langzeit-Überlebende. Die G207-Behandlung hemmte das Wachstum von
distanten intrazerebralen Tumoren und erhöhte das Überleben von Tumor-tragenden
Tieren (p < 0,05 gemäß Wilcox-Test).
Reprovokation mit N18
10 A/J-Mäuse ohne vorherige Exposition gegenüber N18-Zellen
(naive Gruppe), 30 A/J-Mäuse, die spontan vor den subkutanen Injektionen von
N18-Zellen abgestoßen hatten (Abstoßungsgruppe), und zwölf A/J-Mäuse,
die zuvor N18-subkutane Tumore aufwiesen, die durch intratumorale Injektion von
G207 geheilt wurden (geheilte Gruppe), wurden subkutan mit N18-Zellen injiziert.
Keines der Tiere aus der geheilten Gruppe zeigte ein Anzeichen von Tumorwachstum,
wohingegen eine große Anzahl von Tieren der naiven und der Abstoßungsgruppe
signifikantes Tumorwachstum zeigt.
Beispiel 4. Antitumor-Wirksamkeit von tsK
Maus-CT26-Darmkarzinomzellen wurden subkutan bilateral in syngeneische
BALB/c-Mäuse implantiert. 105 pfu tsK, eine temperaturempfindliche
Herpes-simplex-Virus-Mutante in ICP4 oder Mock-Probe, wurden in den rechten Tumor
injiziert, und eine zweite Inokulation mit der gleichen Zusammensetzung wurde sieben
Tage später verabreicht (Tag 7). Die Inokulation mit tsK ergab in beiden Tumoren
eine nennenswerte Hemmung des Tumorwachstums (p < 0,05 am Tag 21).
4.
Beispiel 5. Antitumor-Wirksamkeit eines defekten Vektors, der IL-12 und
Helfervirus-G207 enthält
Die murine kolorektale Karzinomzelllinie CT26 wurde zur Bewertung
der Antitumor-Wirksamkeit eines defekten Vektors verwendet, der IL-12 und G207 als
Helfervirus enthielt.
Erzeugung von defekten Vektoren
Zwei Amplicon-Plasmide ähnlicher Größe, pHCIL12-tk
und pHCL-tk, wurden konstruiert, die die beiden Untereinheiten von murinem IL-12
(p40 und p35) bzw. lacZ unter der Kontrolle des CMVIE-Promotors codierten
(siehe 5A und 5B). Da
IL-12 als Heterodimer funktionell ist, wurden beide Untereinheiten aus einem einzigen
defekten Vektor als bicistronische Botschaft mittels einer internen Ribosomeneintrittsstelle
(IRES) exprimiert.
Das Doppelkassetten-Amplicon-Plasmid (pHCL-tk) wurde durch Insertion
des HSV-1-Thymidinkinase-(TK)-Gens und des stumpfendigen BamH1-Fragments aus pHSV-106
(Life Technologies, Inc., Rockville, MD) in die stumpfendige Spe-I-Schnittstelle
von pHLC konstruiert (5A).
Die codierende Region von p40, das BamH1-Fragment von BL-pSV40, cDNA
für murinen IL-12-p35 und eine IRES aus dem Pferdeenzephalomyokarditisvirus
(EMCV) aus DFG-mIL-12 (IRES-p35) und das BamH1-Fragment aus DFG-mIL12 wurden in
LITMUS 28 (New England Biolabs, MA) an der BgIII/BamH1-Schnittstelle unter Erzeugung
von p40-IRES-35 subkloniert. Das IL-12, das das Doppelkassetten-Amplicon-Plasmid
pHCIL12-tk codierte, wurde durch Insertion der p40-IRES-p35-Kassette, das SnaB1/AflII-Fragment,
in die stumpfendige SalI-Schnittstelle von pSR-ori und anschließende Insertion
des HSV-TK-stumpfendigen BamH1-Fragments in die stumpfendige SphI-Schnittstelle
unter Herstellung von pHCIL12-tk konstruiert. 5B.
G207, enthaltend Deletionen in beiden Kopien des &ggr;34.5-Gens,
und eine E. coli-lac-Z-Insertion, die das ICP6-Gen inaktiviert, wurden als Helfervirus
zur Erzeugung von defekten Vektor-(dv)-Vorräten verwendet. Verozellen wurden
mit gereinigter Amplicon-Plasmid-DNA (pHCIL12-tk und pHCL-tk) und G207-Virus-DNA
unter Verwendung von lipofectAMINETM (Life Technologies, Inc., Rockville,
MD), wie vom Hersteller beschrieben, co-transfiziert und sodann bei 34,5°C
kultiviert, bis sie die vollständige zytopathische Wirkung zeigten. Das Virus
wurde anschließend geerntet und in einer 1:4-Verdünnung in Verozellen
eingeschleust, bis die Hemmung der Helfervirus-Replikation festgestellt wurde. Der
IL-12-enthaltende defekte Vektor wird dvIL12/G207 genannt, und der lacZ-enthaltende
defekte Vektor wird dvlacZ/G207 genannt.
Titration von defekten Vektormaterialien
Defekte Vektormaterialien wurden nach Gefrier-Tau/LTltrabeschallungs-Regimen
und Entfernung von Zellabfall durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit
(2000 × g 10 min bei 4°C) titriert. Der G207-Helfervirus-Titer wurde als
Anzahl von pfus nach Plaquetest auf Verozellen bei 34,5°C ausgedrückt.
Für die dvIL12/G207 wurde die IL-12-Expression bestimmt, und die Passage mit
dem höchsten Niveau (Passage 4), mit einem G207-Helfervirustiter von 5 ×
107 pfu/ml, wurde verwendet. Der Titer von dvlacZ/G207, bestimmt durch
die Zählung von X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-&bgr;-D-galactopyranosid)-Histochemie
positiven Einzelzellen (defekte Partikeleinheiten, dpu) nach Bildung von Plaques
durch G207, betrug 5 × 106 dpu/ml und 5 × 107 pfu/ml
für das Helfervirus.
Zellkultur
Nierenzellen des afrikanischen grünen Affen (Vero) wurden in
DMEM, enthaltend 10% Kälberserum (CS), kultiviert. MC-38-Maus-Darm-Adenokarzinom,
Harding-Passey-Maus-Melanom, MDA-MB-435-Humanes-Brust-Adenokarzinom und CT26-Zellen
wurden in DMEM gezüchtet, enthaltend 10% wärmeinaktiviertes FCS (Hyclone,
Logan, UT) und Penicillin-Streptomycin (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO). A20,
eine B-Zellen-Lymphomzelllinie (Ig+, Ia+, H-2d),
die sich von einem spontanen Retikulum-Zellneoplasmus in BALB/c-Mäusen (American
Type Culture Collection, Rockville, MD, ATCC TIB 208) ableitet, wurde in RPMI 1640,
enthaltend 10% wärmeinaktiviertes FCS, 50 &mgr;M 2-ME, 2mM Glutamin, 20 mM
Hepes-Puffer und Penicillin-Streptomycin, gezüchtet.
Nachweis von IL-12
Die Expression und Sekretion von IL-12 wurde durch ELISA-Test nach
Infektion von Tumorzellen in Kultur bei einer Infektionsmultiplizität (MOI)
von 1 pfu pro Zelle bestimmt.
24 Stunden nach der Infektion wurden Aliquote des infizierten Zellüberstands
entfernt, in einem Trockeneis/Ethanol-Bad schnell eingefroren und zum Nachweis von
IL-12 bei –80°C gelagert. Tumore und Blut wurden aus den mit defektem
Vektor behandelten Mäusen gesammelt und in einem Trockeneis/Ethanol-Bad schnell
eingefroren. Gefrorenes Gewebe wurde in eiskaltem PBS, enthaltend 500 &mgr;M PMSF,
0,5 &mgr;g/ml Leupeptin und 0,7 &mgr;g/ml Pepstatin, homogenisiert. Das Homogenat
wurde anschließend zweimal 10 Sekunden lang ultrabeschallt und durch Zentrifugation
in einer Mikrozentrifuge 5 min bei 4°C geklärt. Die immunreaktiven IL-12-Spiegel
wurden durch Sandwich-ELISA unter Verwendung von Ab-Paaren und rIL-12 bestimmt.
Die rIL-12-Standards wurden in dem gleichen Medium oder in Puffer wie die Proben
(d. h. Maus-Serum für die Serumproben) verdünnt.
Kurz gesagt, wurden 96-Well-Platten, die mit einem Anti-Maus-IL-12-mAb
(9A5) überzogen waren, über Nacht bei Raumtemperatur mit den Testproben
inkubiert. Nach den Waschungen wurden die Platten mit Peroxidase-markiertem Anti-Maus-IL-12-p40-Ab
(5C3) 2 h inkubiert und anschließend entwickelt. Die Extinktion wurde bei 450
nm gemessen.
Die Infektion von CT26-(murines Darmkarzinom), Harding-Passey-(murines
Melanom), MCA38-(murines Darmadenokarzinom) und MDA-MB-435-(menschliches Brustadenokarzinom)
Zellen mit dvIL12/G207 ergab die Sekretion von bis zu 1,5 ng murinen IL-12/105
Tumorzellen in 24 Stunden. 6. Kein IL-12 wurde in den
Überständen von nicht-infizierten Tumorzellkulturen oder denjenigen, die
mit dvlacZ/G207 infiziert wurden, nachgewiesen. Die Spiegel der IL-12-Synthese und
-Sekretion erreichten 1 Tag nach dvIL12/G207-Infektion von CT26-Zellen das Maximum
und nahmen auf nicht nachweisbare Niveaus 3 Tage nach Infektion, wahrscheinlich
aufgrund von Zelltod, ab.
Subkutanes Tumormodell
BALB/c- und BALB/c-(nu/nu)-Mäuse wurden vom National Cancer Institue
oder Charles River (Wilmington, MA) erhalten. Sämtliche Tierversuche waren
vom Georgetown University Animal Care and Use Committee genehmigt.
CT26-Tumorzellen (1 × 105) wurden subkutan (s. c.)
in die bilateralen Flanken von Mäusen injiziert. Wenn s. c. Tumore tastbar
wuchsen (etwa 5 mm in maximalem Durchmesser) wurden den Mäusen unilateral in
den rechten Seitentumor entweder 50 &mgr;l defekter HSV-Vektor (7 × 105
pfu Helfervirus) in Viruspuffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5) oder 50 &mgr;l
Viruspuffer injiziert, gefolgt von einer zweiten Injektion der gleichen Zusammensetzung
7 Tage später. Wo angegeben, wurde anstelle von Viruspuffer Mock-Extrakt verwendet.
DvlacZ/G207 statt Helfervirus G207 allein wurde als Kontrolle für die dvIL12/G207-Inokulation
verwendet, so dass Unterschiede in den viralen Faktoren (d. h. Partikel:pfu-Verhältnis),
die in den defekten Vektormaterialien vorhanden waren, vs. G207-Materialien herangezogen
wurden. Sowohl G207 als auch dvlacZ enthalten E-coli-lacZ, und darum wurden keine
zusätzlichen Fremdantigene durch den defekten Kontrollvektor exprimiert.
Die Tumorgröße wurde durch eine Mikrometerschraube von außen
gemessen, und das Tumorvolumen wurde berechnet (V = h × w × d). Wenn Tiere
moribund erschienen oder der Durchmesser ihrer s. c. Tumore 18 mm erreichte, wurden
sie getötet, und dies wurde als Todesdatum für die Überlebensstudien
dokumentiert. Die statistischen Unterschiede wurden unter Verwendung von StatView
4.5 (Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA) berechnet, wobei das mittlere Tumorvolumen
durch den ungepaarten t-Test bewertet wurde, das Überleben mittels ANOVA (Fisher's
Post-Hoc-Vergleiche) und Unterschiede im Überleben durch den Log-Rang-(Mantel-Cox)-Test
bewertet wurden.
Die Inokulation mit dvIL12/G207 rief eine sehr prominente Antitumor-Wirkung
hervor, wobei sowohl die inokulierten Tumore sowie ihre nicht inokulierten kontralateralen
Gegenstücke eine signifikante Reduktion im Tumorwachstum zeigten.
7. Zwei von sechs der mit dvIL12/G207 inokulierten Tumore entwickelten
sich zu einer nicht nachweisbaren Größe. Die Inokulation mit dvlacZ/G207
ergab ebenfalls eine signifikante Reduktion der Tumorgröße sowohl der
inokulierten als auch nicht-inokulierten Tumore, verglichen mit Kontrollen, jedoch
zu einem viel geringeren Ausmaß als mit dvIL12/G207. 7.
Auch das Überleben der Mäuse wurde beobachtet, wobei eine
Tötung erfolgte, wenn einer der bilateralen Tumore im Durchmesser größer
als 18 mm wurde. Das Überleben der mit defektem Vektor-behandelten Tiere spiegelt
darum das Wachstum der nicht-inokulierten Tumore wider und war wesentlich länger
als bei Kontrolltieren. Mäuse, die unilateral mit dvIL12/G207 behandelt wurden,
überlebten länger als die mit dvlacZ/G207-behandelten Mäuse (8).
IL-12 wurde in den dvIL12/G207 angeimpften Tumoren ein und fünf Tage nach Inokulation
(ungefähr 50–100 pg/Tumor) nachgewiesen, wobei kein IL-12 im Serum nachgewiesen
wurde.
Rolle der T-Zellen bei der Immunantwort
Zur Bewertung der möglichen Rolle von T-Zellen bei der durch
defekten HSV-Vektor-induzierten Antitumor-Antwort wurden bilaterale CT26 s. c. Tumore
in athymischen BALB/c-(nu/nu)-Mäusen entwickelt. Wie bei dem immunkompetenten
Maus-Modell, das vorstehend besprochen wurde, wurde eine unilaterale intratumorale
Inokulation von dvIL12/G207, dvlacZ/G207 oder Mock-Extrakt in den Tumoren auf der
rechten Seite durchgeführt, wenn sie tastbar (ungefähr 5 mm im maximalen
Durchmesser) waren, und eine zweite Inokulation mit der gleichen Zusammensetzung
wurde 7 Tage später verabreicht.
Obwohl eine leichte Verzögerung im Wachstum bei den Tumoren auf
der rechten Seite bestand, denen dvIL12/G207 injiziert wurde, wurde keine signifikante
Tumorwachstumshemmung weder in den inokulierten noch in den kontralateralen nicht-inokulierten
Tumoren festgestellt. CT26-Tumore wuchsen etwas schneller in den athymischen Mäusen
als in den immunkompetenten Mäusen.
Tumor-spezifische CTL-Antwort
Um zu testen, ob die Hemmung des Tumorwachstums mit erhöhter
CTL-Aktivität verbunden war, wurde die Fähigkeit der intratumoralen Inokulation
mit defekten HSV-Vektoren zur Auslösung von CT26-spezifischer CTL-Aktivität
in vitro unter Verwendung eines 51Cr-Freisetzungstests untersucht.
BALB/c-Mäuse wurden mit dvIL12/G207 oder dvlacZ/G207 intratumoral
inokuliert, wenn die s. c. Tumore ungefähr 5 mm im maximalen Durchmesser erreichten,
und eine zweite Inokulation mit der gleichen Zusammensetzung wurde sieben Tage später
verabreicht. Einzelzell-Suspensionen von Splenozyten wurden in RPMI-1640-Medium
mit 10 inaktiviertem FCS, 50 &mgr;M 2-ME, 2 mM Glutamin, 20 mM Hepes und Penicillin-Streptomycin
in 24-Well-Platten bei einer Konzentration von 3 × 106 Zellen/ml
kultiviert.
Zusätzlich wurden dem Medium entweder 1 × 106
inaktivierte CT26-Zellen oder 1 &mgr;g/ml Peptid AH1 zugesetzt. Zur Inaktivierung
wurden die CT26-Tumorzellen 1 h in Kulturmedium inkubiert, das 100 &mgr;g/ml Mitomycin
C enthielt, und sodann zweimal gewaschen. Die Effektorzellen wurden nach 6 Tagen
der in vitro Kultur geerntet.
Vierstündige 51Cr-Freisetzungstests wurden wie vorstehend
beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, wurden die Zellen mit 50 &mgr;Ci Na51CrO4
(51Cr) 60 min inkubiert. A20-Zellen wurden mit 1 &mgr;g/ml der Ld-eingeschränkten
Peptide AH1 oder P815AB 1 h vor dem Markieren gepulst. Die Zielzellen wurden anschließend
mit den Effektorzellen 4 h bei den angegebenen E/T-Verhältnissen vermischt.
Die Menge der 51Cr-Freisetzung wurde durch &ggr;-Zählung bestimmt,
und die prozentuale spezifische Lyse wurde aus Dreifachproben wie folgt berechnet:
[(cpm experimentell – cpm spontan)/(cpm maximal – cpm spontan)] ×
100.
Effektorzellen aus dvIL12/G207-behandelten Mäusen wurden mit
Mitomycin-C-behandelten CT26-Zellen restimuliert, die spezifische Lyse von CT26-Zielzellen
und A20-Zellen, gepulst mit dem Peptid AH1, zeigten. Es wurde keine offensichtliche
Lyse von ungepulsten A20-Zellen oder von A20-Zellen festgestellt, die mit Ld-eingeschränktem
Peptid P815AB gepulst wurden. Effektorzellen, die mit dem Peptid AH1, aus Mäusen,
die mit dvIL12/G207 oder dvlacZ/G207 behandelt wurden, restimuliert wurden, zeigten
eine spezifische Lyse von A20-Zielzellen, die mit dem Peptid AH1 gepulst wurden,
und von CT-26-Zellen, jedoch nicht von ungepulsten A20-Zellen. Das CTL-Aktivitätsniveau,
das durch dvIL12/G207 erzeugt wurde, war wesentlich größer als dasjenige,
das durch dvlacZ/G207 erzeugt wurde. Effektorzellen aus dvIL12/G207-inokulierten
nicht restimulierten Tieren waren zur spezifischen Lyse von CT26-, jedoch nicht
von A20-Zellen in der Lage.
Die Auswirkung der intratumoralen IL-12-Expression auf die Akkumulation
von bestimmten T-Lymphozyten-Subtypen oder die IFN-&ggr;-Produktion wurden ebenfalls
bestimmt. Splenozyten wurden fünf Tage nach der zweiten Inokulation von dvIL12/G207
oder dvlacZ/G207 isoliert und auf die IFN-&ggr;-Produktion durch ELISA und Milz-T-Lymphozytensubsets
durch FACS-Analyse getestet. Kurz gesagt, wurden Einzelzellsuspensionen von Splenozyten
gewaschen und in RPMI-1640-Medium resuspendiert, das 10% inaktiviertes FCS enthielt.
Die Zellen (3 × 106/ml) wurden in 24-Well-Platten 24 h kultiviert.
Die Überstände wurden gesammelt und durch Sandwich-ELISA unter Verendung
von Anti-IFN-&ggr;Ab-Paaren, erhalten von Endogen (Woburn, MA), getestet.
Ähnliche Prozentwerte von Helfer-T-Zellen (CD4)
und von zytotoxischen T-Zellen (CD8a) wurden in dvIL12/G207- und dvlacZ/G207-behandelten
Mäusen festgestellt. Splenozyten aus Mäusen, die mit dvIL12/G207 behandelt
wurden, erzeugten wesentlich größere Mengen an IFN-&ggr; als diejenigen,
die mit dvlacZ/G207 behandelt wurden, wie nachstehend gezeigt.
Beispiel 6. Antitumor-Wirksamkeit eines Vektors, der tsK und IL-12 enthält
Defekte Vektoren, die IL-12 und tsK oder lacZ und tsK enthalten, wurden
hergestellt. Defekte Vektorplasmide pHCIL12-tk und pHCL-tk wurden, wie vorstehend
beschrieben, hergestellt. Defekte Vektoren wurden durch Co-Transfektion von Verozellen
mit Helfervirus-tsK-DNA und pHCIL12-tk oder pHCL-tk erzeugt. Die transfizierten
Zellen wurden bei 31,5°C (eine Replikations-permissive Temperatur für
tsK) inkubiert, bis die gesamte zytopathische Wirkung festgestellt wurde. Anschließend
wurden die Zellen wie vorstehend beschrieben auf G207-Helfervirus passiert. Siehe
auch Kaplitt et al., Mol. Cell. Neurosci. 2: 320–30 (1991). Der defekte Vektor,
der IL-12 enthält, wird dvIL12/tsK genannt, und der defekte Vektor, der lacZ
enthält, wird dvlacZ/tsK genannt.
CT26-Maus-Darmkarzinomzellen wurden subkutan bilateral in syngeneische
BALB/c-Mäuse, wie vorstehend beschrieben, implantiert. Der rechte Tumor wurde
entweder mit dvlacZ/tsK, dvIL12/tsK oder einer Mock-Probe inokuliert, und eine zweite
Inokulation mit der gleichen Zusammensetzung wurde sieben Tage später verabreicht.
Die Inokulation mit dvlacZ/tsK ergab eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums
in beiden Tumoren (p < 0,01 am Tag 22). Die Inokulation mit dvIL12/tsK ergab
eine größere Hemmung des Tumorwachstums in beiden Tumoren im Vergleich
zu dem dvlacZ/tsK-inokulierten Tumor (p < 0,001). 9.
Das Überleben der inokulierten Mäuse wurde ebenfalls beobachtet.
Die Mäuse wurden, wenn sie moribund wurden oder wenn ihre Tumore einen Durchmesser
von mehr als 18 mm erreichten, getötet. Wie in 10
gezeigt, überlebten Mäuse, die mit dvlacZ inokuliert wurden, wesentlich
länger als Mäuse, die mit einer Mock-Probe inokuliert wurden (p < 0,01),
und Mäuse, die mit dvIL12/tsK inokuliert wurden, überlebten wesentlich
länger als Mäuse, die mit dvlacZ/tsK oder einer Mock-Probe inokuliert
wurden (p < 0,01).
Beispiel 7. Antitumor-Wirksamkeit eines Vektors, der tsK und GMCSF enthält
Harding-Passey-Melanomzellen wurden subkutan in die bilateralen Flanken
von C57BL/6-Mäusen implantiert. Wenn die Tumore etwa 5 mm im maximalen Durchmesser
(Tag 0) erreichten, wurden in die Tumore der rechten Flanke der defekte Vektor dvlacZ/tsk
(erzeugt aus dem Amplicon-Plasmid pHCL-tk, welches E-coli-lacZ exprimiert) oder
dvGMCSF/tsk (erzeugt aus dem Amplicon-Plasmid pHCGMCSF-tk, dessen Struktur die gleiche
wie pHCIL12-tk ist, mit der Ausnahme, dass es Maus-GM-CSF-cDNA anstelle von IL-12
DNA enthält; die Expression von GM-CSF wurde durch ELISA nachgewiesen) und
Helfer-tsK-Virus oder Viruspuffer injiziert. Mäuse, die mit dvGMCSF/tsK behandelt
wurden, zeigten ein erhöhtes Überleben gegenüber Mäusen, die
mit dvlacZ/tsk oder Puffer behandelt wurden, und zeigten in beiden bilateralen Tumoren
ein vermindertes Tumorwachstum.
Es ist selbstverständlich, dass die Beschreibung, die speziellen
Beispiele und Messwerte, obgleich beispielhafte Ausführungsformen vorgelegt
wurden, zur Erläuterung angegeben sind und nicht die vorliegende Erfindung
einschränken sollen. Verschiedene Änderungen und Modifikationen im Rahmen
der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der Diskussion der Offenbarung
und der hier enthaltenen Messwerte, klar und werden somit als Teil der Erfindung.
Anspruch[de]
Verwendung einer Zusammensetzung umfassend
ein Herpes Simplex Virus (HSV), das in sich teilenden Zellen repliziert und eine
attenuierte Replikation in sich nicht teilenden Zellen zeigt, und das eine oder
mehrere exprimierbare Nukleotidsequenzen umfasst, die eines oder mehrere Zytokine
oder mindestens einen anderen Immunmodulator kodieren und
ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel für das Virus
zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Vorbeugen einer Metastase eines
Tumors eines bestimmten Zelltyps durch Auslösen einer systemischen Antitumor-Immunantwort
in einem Patienten, der multiple metastatische Tumore eines bestimmten Zelltyps
aufweist oder das Risiko hat, solche zu entwickeln,
wobei das Medikament zur Inokulierung des Tumors in einem Patienten geeignet ist.Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung eine Immunantwort
induziert, die für den Tumorzelltyp spezifisch ist, und die Zellen des inokulierten
Tumors und eines nicht inokulierten Tumors tötet.Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das HSV
nicht in der Lage ist, sowohl ein funktionelles &ggr;34.5-Genprodukt als auch
eine Ribonukleotid-Reduktase zu exprimieren.Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Virus
ein HSV-Typ-1-Virus (HSV1) ist.Verwendung nach Anspruch 4, wobei das HSV von der Multigen-Mutante G207
abstammt.Verwendung nach Anspruch 4, wobei das HSV von der Mutante G92A abstammt.Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das HSV
ein HSV-Typ-2-Virus (HSV2) ist.Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das HSV
konditional replikationskompetent ist.Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das HSV
replikationsdefekt ist.Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das HSV
eine temperatursensitive Mutante ist.Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Virus von der ICP4-Mutante tsK
abstammt.Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Virus
von einem Vaccinstamm ist.Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Tumorzellen
von einem Typ sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Astrocytom, Oligodendrogliom,
Meningiom, Neurofibrom, Glioblastom, Ependymom, Schwannom, Neurofibrosarcom und
Medulloblastom.Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Tumorzellen
ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Melanomzellen, pankreatischen
Tumorzellen, Prostatakarzinomzellen, Kopf-Hals-Tumorzellen, Brustkrebszellen, Lungenkrebszellen,
Dickdarmkrebszellen, Lymphomzellen, Eierstock-Krebszellen, Nierenkrebszellen, Neuroblastome,
Plattenepithelkarzinome, Medulloblastomen, Hepatomzellen und Mesotheliomen und epidermoiden
Karzinomzellen.Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Cytokin
ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7,
IL-12, G-CSF, GM-CSF, IFN-&agr;, IFN-&ggr;, TNF-&agr;, vorzugsweise IL-12
oder GM-CSF.Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Immunmodulator
ausgewählt ist aus Genen kodierend Chemokine oder co-stimulatorische Moleküle,
vorzugsweise B7.Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Patient
multiple metastatische Tumore aufweist.