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Dokumentenidentifikation DE69836219T2 23.08.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001003533
Titel VERWENDUNG VON HERPES-VEKTOREN ZUR TUMORTHERAPIE
Anmelder Georgetown University, Washington, D.C., US
Erfinder RABKIN, D., Samuel, Chevy Chase, MD 20815, US;
TODA, Masahiro, Yokohama 227-0043, JP;
MARTUZA, L., Robert, Chevy Chase, MD 20815, US
Vertreter Patentanwälte Isenbruck Bösl Hörschler Wichmann Huhn, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69836219
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 12.08.1998
EP-Aktenzeichen 989398862
WO-Anmeldetag 12.08.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/US98/16447
WO-Veröffentlichungsnummer 1999007394
WO-Veröffentlichungsdatum 18.02.1999
EP-Offenlegungsdatum 31.05.2000
EP date of grant 18.10.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.08.2007
IPC-Hauptklasse A61K 35/76(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 7/01(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 48/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61P 35/04(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Induktion einer tumorspezifischen Immunität ist durch eine prospektive Stärkung der körpereigenen Abwehrmechanismen statt der Verwendung toxischer therapeutischer Standardmittel ein attraktiver Weg für die Krebstherapie, um einen Langzeitschutz gegen Tumorexistenz, -wachstum und -rekurrenz bereitzustellen. Diese Strategie ist aufgrund ihres Potentials zur Zerstörung kleiner metastatischer Tumore, die sich dem Nachweis entziehen können, und zur Bereitstellung von Immunität gegen rekurrente Tumore attraktiv.

Prinzipiell hängt eine Immuntherapie von der Gegenwart von tumorspezifischen Antigenen und von der Fähigkeit zur Induktion einer zytotoxischen Immunantwort ab, die Antigene präsentierende Tumorzellen erkennt. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) erkennen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse-I-Moleküle, die mit Peptiden komplexiert sind, die sich von auf der Zelloberfläche präsentierten Zellproteinen ableiten, in Kombination mit co-stimulatorischen Molekülen. Müller et al., Annu. Rev. Immunol. 7: 445–80 (1989). In der Tat wurden tumorspezifische Antigene in einem Bereich menschlicher Tumore nachgewiesen. Roth et al., Adv. Immunol. 57: 281–351 (1994); Boon et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 337–65 (1994).

Einige Krebs-Vaccinationsstrategien haben sich auf die Verwendung von abgetöteten Tumorzellen oder -lysaten konzentriert, die in Kombination mit Adjuvanzien oder Zytokinen verabreicht werden. Neuerdings wird der Gentransfer von Zytokinen, MHC-Molekülen, co-stimulatorischen Molekülen oder Tumorantigenen auf Tumorzellen angewandt, um die Sichtbarkeit der Tumorzelle gegenüber Immuneffektorzellen zu verstärken. Dranoff & Mulligan, Adv. Immunol. 58: 417–54 (1995).

Die therapeutische Anwendung von „Krebs-Vakzinen" hat allerdings zu großen Schwierigkeiten geführt. Insbesondere erfordern die herkömmlichen Wege den Erhalt und die Kultivierung autologer Tumorzellen eines Patienten zur Manipulation in vitro, Bestrahlung oder anschließende Impfung oder die Identifizierung und Reinigung eines spezifischen Tumorantigens.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Darum besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Auslösung einer systemischen Antitumor-Immunantwort bei einem Patienten, der das Risiko der Entwicklung multipler metastatischer Tumore aufweist oder bei dem dieses Risiko besteht, ohne Manipulation der autologen Tumorzellen des Patienten oder ohne Identifizierung oder Reinigung spezifischer Antigene.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht auch in der Bereitstellung von Vektoren zur Durchführung dieses Verfahrens.

Beim Erreichen dieser und anderer Ziele beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Auslösung einer systemischen Antitumor-Immunantwort bei einem Patienten, bei dem das Risiko der Entwicklung multipler metastatischer Tumore eines gegebenen Zelltyps besteht, oder der dieses Risiko aufweist.

Darum betrifft die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung, die ein Herpes-simplex-Virus (HSV), das sich in teilenden Zellen repliziert und eine gedämpfte Replikation in sich nicht-teilenden Zellen aufweist und das eine oder mehrere exprimierbare Nukleotidsequenzen einschließt, die ein oder mehrere Zytokine oder mindestens einen weiteren Immunmodulator codiert, und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel für das Virus einschließt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention einer Metastase eines Tumors eines gegebenen Zelltyps, die eine systemische Antitumor-Immunantwort bei einem Patienten auslöst, bei dem das Risiko der Entwicklung multipler metastatischer Tumore eines gegebenen Zelltyps besteht oder der das Risiko aufweist, wobei das Medikament zur Inokulation eines Tumors bei einem Patienten geeignet ist.

Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das Virus replikationsdefekt. Nach wieder einer anderen Ausführungsform ist das Virus konditional replikationskompetent. Nach einer weiteren Ausführungsform stammt das Virus aus einem Vakzinstamm.

Mutierte Viren, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, werden ebenfalls beschrieben, z. B. ein Herpes-simplex-Virus, das nicht zur Expression sowohl (i) eines funktionellen &ggr;34.5-Genprodukts als auch (ii) einer Ribonukleotidreduktase in der Lage ist, wobei das Genom des Virus mindestens eine exprimierbare Nukleotidsequenz umfasst, die mindestens einen Immunmodulator codiert. Außerdem wird eine Herpes-Simplex-Virus-ICP4-Mutante tsK beschrieben, deren Genom zur Einarbeitung von mindestens einer exprimierbaren Nukleotidsequenz, die mindestens einen Immunmodulator codiert, verändert wurde.

Diese und weitere Aufgaben und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann im Hinblick auf die hier enthaltenen Lehren klar.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1A zeigt, dass die intratumorale Inokulation von CT26-Tumoren in BALB/c-Mäusen mit G207 das Wachstum des inokulierten Tumors (Rt) und eines nicht-inokulierten Tumors an einer beabstandeten Stelle (Lt) hemmt. Die Balken stellen Mittelwerte ± SEM von 6 Mäusen pro Gruppe dar. Tumorvolumen = (Breite × Länge × Höhe).

1B zeigt, dass die intradermale Inokulation von CT26-Tumoren in BALB/c-Mäusen mit G207 keine signifikante Wirkung auf das Tumorwachstum besitzt. Die Balken stellen den Mittelwert ± SEM von 6 Mäusen pro Gruppe dar. Tumorvolumen = (Breite × Länge × Höhe).

1C zeigt, dass die Zunahme der intratumoralen Dosis von G207 zu einem verminderten bilateralen Tumorwachstum von CT26-Tumoren in BALB/c-Mäusen führt. Die Balken zeigen den Durchschnitt von 6 Tieren pro Gruppe.

2 zeigt, dass die intratumorale Inokulation von M3-Maus-Melanomzellen in DBA/2-Mäusen mit G207 das Wachstum des inokulierten Tumors (RT) und eines beabstandeten, nicht-inokulierten Tumors (LT) hemmt. Die Balken stellen Mittelwerte ± SEM von 6 oder 7 Mäusen pro Gruppe dar. Tumorvolumen = (Breite × Länge × Höhe).

3 zeigt, dass die intratumorale Inokulation von Maus-N18-Neuroblastomzellen in syngeneischen A/J-Mäusen mit G207 das Wachstum des inokulierten Tumors (Linker Tumor) und eines beabstandeten, nicht-inokulierten Tumors (Rechter Tumor) hemmt. Die Balken stellen Mittelwerte ± SEM von 8 Mäusen pro Gruppe dar. Tumorvolumen = (Breite × Länge × Höhe).

4 zeigt, dass die intratumorale Inokulation von CT26-Tumoren in BALB/c-Mäusen mit tsK das Wachstum des inokulierten Tumors (Rt) und eines beabstandeten, nicht-inokulierten Tumors (Lt) hemmt. Die Balken stellen Mittelwerte ± SEM von 6 Mäusen pro Gruppe dar. Tumorvolumen = (Breite × Länge × Höhe).

5A zeigt das Plasmid-pHCL-tk. 5B zeigt das Plasmid pHCIL12-tk.

6 zeigt die Sekretion von IL-12 in mit dvIL12/G207 inokulierten Zellen.

7 zeigt, dass die intratumorale Inokulation von CT26-Tumoren in BALB/c-Mäusen mit dvlacZ/G207 oder dvIL12/G207 das Wachstum des inokulierten Tumors (Rt) und eines beabstandeten, nicht-inokulierten Tumors (Lt) hemmt. Die Balken stellen Mittelwerte ± SEM von 6 Mäusen pro Gruppe dar. Tumorvolumen = (Breite × Länge × Höhe).

8 zeigt die Überlebensrate von Mäusen nach der Inokulation mit dvlacZ/G207, dvIL12/G207 oder einer Mock-Probe.

9 zeigt, dass die Inokulation von CT26-Tumoren in BALB/c-Mäusen mit dvIL12/tsK oder dvlacZ/tsK das Wachstum des inokuliertem Tumors (Rt) und eines beabstandeten, nicht-inokulierten Tumors (Lt) hemmt. Die Balken stellen Mittelwerte ± SEM von 6 Mäusen pro Gruppe dar. Das Tumorvolumen = (Breite × Länge × Höhe).

10 zeigt die Überlebensrate von Mäusen nach der Inokulation mit dvlacZ/tsK, dvIL12/tsK oder einer Mock-Probe.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Ein neuer und verbesserter Weg zur Auslösung einer systemischen Immunantwort bei Patienten, die multiple metastatische Tumore aufweisen, wurde entwickelt. Gemäß diesen Entwicklungen beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Auslösung einer systemischen Antitumor-Immunantwort bei einem Patienten, bei dem das Risiko der Entwicklung metastatischer Tumore besteht oder der das Risiko aufweist, durch Inokulation von mindestens einem Tumor mit einem mutierten Herpes-simplex-Virus (HSV). Die Inokulation ruft eine hochspezifische Antitumor-Immunantwort hervor, die Zellen des inokulierten Tumors als auch Zellen der beabstandeten entwickelten nicht-inokulierten Tumore abtötet.

Die Möglichkeit der Behandlung von Patienten, die multiple metastatische Tumore aufweisen, stellt einen nennenswerten Fortschritt gegenüber den herkömmlichen Wegen dar, die sich auf die Behandlung einer einzigen Tumormasse konzentrieren. Die Wirksamkeit der herkömmlichen zytotoxischen viralen Vektor-basierenden Wege hängt von der Virusinfektion sämtlicher Tumorzellen in dem Patienten ab. Es ist allerdings extrem schwierig, eine breite oder systemische Verteilung viraler Vektoren in vivo zu erhalten, und darum schwierig, sämtliche Tumorzellen eines lokalen soliden Tumors zu infizieren und praktisch unmöglich, sämtliche Tumorzellen bei einem Patienten, der multiple metastatische Tumore aufweist, zu infizieren. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung, die nicht die Ausrichtung eines viralen Vektors auf jede Tumorzelle erfordert, bietet darum eine distinkte Verbesserung gegenüber diesem Verfahren. Ferner überleben viele Patienten mit den jüngsten Verbesserungen in der Krebstherapie von primären Tumoren länger und sind dem Risiko der Entwicklung multipler metastatischer Tumore ausgesetzt. Demnach stellt die wirksame Möglichkeit der Behandlung dieser Patienten eine benötigte Verbesserung in der Krebstherapie dar.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Viren sind mutierte Herpes-simplex-Viren, die Tumorzellen infizieren, sich allerdings nicht wirksam auf normale Zellen oder Gewebe ausbreiten oder sich darin wirksam replizieren, wodurch an und für sich keine Krankheit oder Pathologie ausgelöst wird. Beispielsweise ist ein Virus, welches sich in teilenden Zellen repliziert und eine gedämpfte Replikation in sich nicht teilenden Zellen aufweist, erfindungsgemäß geeignet, ebenso wie ein Virus, das replikationsdefekt ist. Das Virus kann vom Typ 1 (HSV-1) oder vom Typ 2 (HSV-2) sein. Verschiedene HSV-1-Mutanten wurden bereits zur lokalen zytotoxischen Tumortherapie verwendet, um Tumorzellen in situ zu zerstören und dennoch normales Gewebe auszusparen. Mineta et al., Nature Medicine 1: 938–43 (1995); Martuza et al., Science 252: 854–56 (1991); Boviatsis et al., Gene Therapy 1: 323–331 (1994); Randazzo et al., Virology 211: 94–101 (1995); Andreansky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11313–18 (1996). Jede dieser Mutanten kann erfindungsgemäß eingesetzt werden, ebenso wie Vakzinstämme von HSV. Eine Anzahl von antiviralen Arzneimitteln (d. h. Acyclovir und Foscarnet) gegen Herpes-simplex-Virus steht zur Verfügung, durch die sich eine unvorhergesehene virale Ausbreitung behandeln lässt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung repliziert sich das Virus in sich teilenden Zellen und zeigt eine gedämpfte Replikation in sich nicht teilenden Zellen. Beispielsweise beschreibt die US-Patentschrift Nr. 5,585,096 ein geeignetes Virus, das durch den Stamm G207 erläutert wird, das in der Lage ist, sowohl (i) ein funktionelles &ggr;34.5-Genprodukt als auch (ii) eine Ribonukleotidreduktase zu exprimieren. (Der Inhalt der US-Patentschrift Nr. 5,585,096 ist hier durch Bezugnahme eingeschlossen). G207 repliziert sich in sich teilenden Zellen und bewirkt eine lytische Infektion mit nachfolgendem Zelltod, ist allerdings in sich nicht teilenden Zellen stark abgeschwächt, wodurch sich die Virusausbreitung auf die Tumore konzentriert. G207 ist nicht neuropathogen und ruft bei Mäusen und nicht-humanen Primaten keine nachweisbare Erkrankung hervor. Mineta et al., Nature Medicine 1: 938–43 (1995).

Gemäß anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist das Virus replikationsdefekt. Beispiel für ein solches Virus ist tsK, eine temperaturempfindliche Herpes-Simplex-Virus-Mutante in ICP4. Davison et al., J. Gen. Virol. 65: 859–63 (1984). Die Fähigkeit von tsK zu replizieren, ist temperaturabhängig, wobei 31,5°C für die Replikation permissiv und 39,5°C nicht-permissiv sind. TsK kann sich mit einer wechselnden Fähigkeit zwischen diesen Temperaturen replizieren. Da die Körpertemperatur etwa 39,5°C beträgt, wird erwartet, dass tsK in vivo replikationsdefekt ist. Dies wurde bereits durch in vivo Experimente mit tsK bei Ratten bestätigt.

Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Virus konditional replikationskompetent. Ein Beispiel für ein solches Virus ist G92A, dessen Fähigkeit zur Replikation Zelltyp-abhängig ist. G92A wird ausführlicher in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/486,147, eingereicht am 7. Juni 1995, beschrieben, deren Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.

Die Erfindung beschreibt weiterhin eine. Zusammensetzung, bestehend im Wesentlichen aus dem Herpes-simplex-Virus und einem pharmazeutisch verträglichen Träger, die an einen Patienten verabreicht wird, der an der Entwicklung multipler metastatischer Tumore leidet oder bei dem das Risiko dieser Entwicklung besteht. Die Zusammensetzung wird direkt an die Tumorzellen in situ verabreicht. In dieser Beschreibung schließt der Begriff „bestehend im Wesentlichen aus" einen Schritt oder andere Merkmale aus, die einen Materialaspekt der Erfindung signifikant beeinflussen. So eingestuft, würde eine Zusammensetzung dieser Ausführungsform beispielsweise das vorgeschriebene Herpes-simplex-Virus mit keinem anderen Virus oder mit einem defekten Virusvektor einschließen; und dies, da ein zusätzliches Virus das erfinderische Protokoll im Wesentlichen komplizieren würde. Die Erfindung umfasst auch die Verabreichung dieser Zusammensetzung in Kombination mit einer anderen Therapie, wie Chemotherapie oder Strahlenbehandlung.

Mehr als ein mutiertes Herpes-simplex-Virus kann verabreicht werden. Diese Ausführungsform kann durch Verabreichung einer einzigen Zusammensetzung, die mehr als ein mutiertes Herpes-simplex-Virus und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel für die Viren einschließt, oder durch Verabreichung von mehr als einer Zusammensetzung durchgeführt werden, wobei jede Zusammensetzung mindestens ein mutiertes Herpes-simplex-Virus und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel für das Virus oder die Viren umfasst. Beispielsweise kann eine Zusammensetzung verabreicht werden, die (A) ein erstes mutiertes Herpes-simplex-Virus, (b) ein zweites mutiertes Herpes-simplex-Virus und (C) einen pharmazeutisch verträglichen Träger für die Viren umfasst. Außerdem kann eine Zusammensetzung verabreicht werden, die im Wesentlichen aus (A) einem ersten mutierten Herpes-simplex-Virus, (B) einem zweiten mutierten Herpes-simplex-Virus und (C) einem pharmazeutisch verträglichen Träger für die Viren besteht. Wie vorstehend ausgeführt, schließt der Begriff „im Wesentlichen bestehend aus" einen Schritt oder ein weiteres Merkmal aus, das einen Materialaspekt der Erfindung signifikant beeinflussen würde. Somit würde diese Ausführungsform beispielsweise die Verabreichung des vorgeschriebenen ersten und zweiten Herpes-simplex-Virus mit keinem anderen Virus oder einem defekten Virusvektor zur Folge haben.

Die erfindungsgemäße Inokulation eines Tumors mit einem oder mehreren mutierten Herpes-simplex-Viren löst eine systemische tumorspezifische Immunantwort aus, die für den Zelltyp des inokulierten Tumors spezifisch ist, und die Zellen des inokulierten Tumors und von anderen nicht-inokulierten Tumoren abtötet. Der ausgelöste Zelltod wird beispielsweise als inhibiertes Tumorwachstum oder als reduzierte Tumorgröße festgestellt. In den nachstehend ausgeführten Beispielen wird der induzierte Zelltod als Hemmung des Wachstums des inokulierten Tumors und von beabstandeten entwickelten nicht-inokulierten Tumoren festgestellt. In einigen Fällen schrumpfen die Tumoren auf nicht nachweisbare Größen. In einem der untersuchten murinen Modelle, CT26, wird die Immunantwort mit zytotoxischen T-Lymphozyten (CD8+) korreliert, die ein Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse-I eingeschränktes Peptid erkennen, das ein dominantes Tumorantigen ist.

Wie vorstehend erläutert, wird die Zusammensetzung direkt an Tumorzellen des Patienten in situ verabreicht. Dies kann durch aus der Technik bekannte Verfahrensweisen erreicht werden, beispielsweise durch intratumorale Inokulation während einer Operation, wie Operation zur Massereduzierung eines Tumors, in externe Melanome, oder stereotaktisch in das Tumorbett. Weitere Möglichkeiten zum Zielen auf Tumore sind ebenfalls geeignet. Im Allgemeinen wird die maximale Sicherheitsdosis in wöchentlichen Abständen verabreicht, wenn der Tumor leicht zugänglich ist, oder wird während einer Operation oder Tumorbiopsie verabreicht.

Das pharmazeutisch verträgliche Vehikel für das Virus kann aus bekannten pharmazeutisch verträglichen Vehikeln ausgewählt werden und sollte ein Vehikel sein, in dem das Virus stabil ist. Beispielsweise kann es ein Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Puffer- oder Konservierungsmittel sein. Ein Beispiel für ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel ist Phosphatpuffer, der NaCl enthält. Weitere pharmazeutisch verträgliche wässrige Lösungsvehikel, nicht-toxische Exzipienzien, einschließlich von Salzen, Konservierungsmitteln, Puffern und dergleichen, sind in REMINGSTON's PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15. Ausgabe, Easton: Mack Publishing Co., SS. 1405–1412 und 1461–1487 (1975) und in THE NATIONAL FORMULARY XIV., 14. Ausgabe, Washington: American Pharmaceutical Association (1975) beschrieben, deren Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.

Huang et al., Science 264: 961–65 (1994) zeigten, dass das Priming einer Immunantwort gegen ein MHC-Klasse-I-eingeschränktes Tumorantigen den Transfer dieses Antigens auf aus Wirtsknochenmark stammenden Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) vor seiner Präsentation gegenüber CD8+-T-Zellen umfasst. Obgleich es nicht gewünscht ist, an eine Theorie gebunden zu sein, glauben die vorliegenden Erfinder, dass eine lokale HSV-Infektion eines Tumors die Zirkulation von Vorläufern auslöst, um in APCs zu differenzieren. Ein Subset von Makrophagen ist in der Lage, exogene Antigene auf MHC-Klasse-I-Molekülen gegenüber CD8+-T-Zellen-Klonen zu präsentieren. Rock et al., J. Immunol. 150: 438–46 (1993). Die lytische Zerstörung oder der viral induzierte Tod von Tumorzellen könnte Tumorantigene freisetzen, die anschließend von den APCs aufgenommen und an die ausleckenden Lymphknoten weitergeleitet werden. Dort werden sie prozessiert und gegenüber CD8+-T-Zellen präsentiert. Die assoziative Erkennung von HSV-spezifischen und tumorspezifischen Antigenen könnte ebenfalls bei der Stärke der Antwort eine Rolle spielen. Tumorzellen, die mit replikationskompetenten HSV infiziert sind, würden reifende Virionen aufweisen, die aus ihren Zellmembranen ausknospen, und können auch virale Antigene zur MHC-Klasse-I-Präsentation prozessieren, wie es bei APCs der Fall ist. Die HSV-infizierten Tumorzellen könnten darum direkt T-Zellen-vermittelte Immunantworten auslösen. Einige der durch Co-Präsentation von viralen und tumoralen Antigenen ausgelösten Immunantworten können anschließend durch nur eines der co-exprimierten Antigene ausgelöst werden.

Erfindungsgemäß sind eine oder mehrere Immunmodulatoren an die Tumorzellen zusätzlich zu dem vorstehend beschriebenen mutierten Herpes-simplex-Virus abzugeben. Beispiele für Immunmodulatoren, die bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Zytokine, co-stimulatorische Moleküle und Chemokine. Die Abgabe von einem oder mehreren Immunmodulatoren kann beispielsweise mittels eines mutierten Herpes-simplex-Virus, der eine oder mehrere exprimierbare Nukleotidsequenzen umfasst, die ein oder mehrere Zytokine oder andere immunmodulatorische Gene codieren, mittels mehr als einem mutierten Herpes-simplex-Virus, die jeweils eine oder mehrere exprimierbare Nukleotidsequenzen umfassen, die ein oder mehrere Zytokine oder andere immunmodulatorische Gene codieren, durchgeführt werden. Nicht-Herpes-Simplex-Virus-Vektoren können ebenfalls zur Durchführung der Abgabe von einem oder mehreren Immunmodulatoren verwendet werden. Beispielsweise können ein oder mehrere adenovirale Vektoren, Adenovirus-assoziierte Vektoren, retrovirale Vektoren oder Vaccinia-Virus-Vektoren, die eine oder mehrere exprimierbare Nukleotidsequenzen umfassen, die ein oder mehrere immunmodulatorische Gene codieren, nach dieser Ausführungsform verwendet werden. Siehe z. B. Shawler et al., Adv. Pharmacol. 40: 309–37 (1997), die den Gentransfer von immunstimulatorischen Zytokinen erläutert.

Beispiele für Immunmodulatoren, die erfindungsgemäß geeignet sind, umfassen IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, G-CSF, GM-CSF, IFN-&agr;, IFN-&ggr;, TNF-&agr; und B7. Siehe z. B. Parmiani et al., Adv. Pharmacol. 40: 259–89 (1997). Zweckmäßigerweise wird die Verwendung von IL-12 in der folgenden Diskussion als Beispiel angeführt. Es ist allerdings selbstverständlich, dass andere Immunmodulatoren an seiner Stelle oder zusätzlich dazu eingesetzt werden können. Es ist ferner selbstverständlich, dass, wo die vorliegende Beschreibung sich auf „einen Immunmodulator" bezieht, die Erfindung einen oder mehrere Immunmodulatoren einschließt.

Das Zytokin IL-12 ist ein heterodimeres Zytokin, bestehend aus 35-kD-(p35)- und 40-kD-(p40)-Untereinheiten, welches an auf NK- und T-Zellen vorhandene Rezeptoren bindet. Der hochaffine Rezeptor besteht aus zwei &bgr;-artigen Zytokinrezeptor-Untereinheiten, die sich einzeln als niederaffine Rezeptoren verhalten. IL-12 spielt im Immunsystem eine multifunktionelle Rolle, die die Proliferation und zytotoxische Aktivität von T-Zellen und NK-Zellen erhöht, die IFN-&ggr;-Produktion reguliert und die Entwicklung von CD4+-T-Helfer-(Th1)-Zellen unterstützt.

Die Antitumor-Aktivität von IL-12 wurde bei einer Anzahl von verschiedenen murinen Tumormodellen gezeigt, sowohl fest als auch metastasierend, mit systemischer Verabreichung von rekombinantem IL-12, Fibroblasten oder Tumorzellen, die gentechnisch hergestellt wurden, zur Sezernierung von IL-12, und viralen Vektoren, die IL-12 exprimieren. Die IL-12-Immuntherapie ist mit anderen Tumorzelllinien, wie CT26, C26, MCH-1-A1 und TS/A, weniger wirksam. Zitvogel et al., Eur. J. Immunol. 26: 1335–41 (1996). Es wurde gezeigt, dass die systemische Abgabe von rIL-12 bei verschiedenen Tiermodellen potente Antitumor-Auswirkungen besitzt. Eine verlängerte Exposition gegenüber IL-12 kann allerdings nachteilige Nebenwirkungen, wie diejenigen, die mit vielen Zytokinen festgestellt wurden, haben.

Der Transfer von immunmodulatorischen Genen direkt auf die Tumorzellen ist zweckmäßig, da die Gene innerhalb des Tumors an der Stelle ihrer Wirkung im Zusammenhang mit putativen Tumorantigenen exprimiert werden. Erfindungsgemäß werden Tumore darum in situ modifiziert, um Tumorzellen zu einer Quelle der Immunmodulatorproduktion zu machen.

Wie vorstehend erläutert, tötet die erfindungsgemäß ausgelöste Immunantwort Zellen des inokulierten Tumors und auch nicht-inokulierte Tumorzellen ab, einschließlich Zellen von beabstandeten nicht-inokulierten Tumoren. Diese Wirkung macht dieses Verfahren besonders zur Behandlung von Patienten geeignet, die multiple metastasierende Tumore eines gegebenen Zelltyps aufweisen. Es stellt auch eine Verbesserung bei der Behandlung von lokalen, nicht-metastasierenden Tumoren bereit, da das Verfahren Tumorzellen abtötet, auf die das verabreichte Virus nicht direkt zielt.

Jeder Typ von Tumor kann erfindungsgemäß behandelt werden, einschließlich nicht-metastasierender Tumore, Tumore mit metastasierendem Potenzial und Tumore, die bereits eine Fähigkeit zur Metastasierung zeigen. Beispiele von Tumorzelltypen, die erfindungsgemäß behandelt werden können, umfassen Astrozytom-, Oligodendrogliom-, Meningiom-, Neurofibrom-, Glioblastom-, Ependymom-, Schwannom-, Neurofibrosarkom- und Medullobastom-Zelltypen. Die Erfindung ist auch bei der Behandlung von Melanomzellen, Pankreaskrebszellen, Prostatakarzinomzellen, Kopf- und Nacken-Krebszellen, Brustkrebszellen, Lungenkrebszellen, Darmkrebszellen, Lymphomzellen, Hepatomzellen, Eierstockkrebszellen, Nierenkrebszellen, Neuroblastomen, Plattenepithelzellenkarzinomen, Sarkomen und Mesotheliom- und Epidermoid-Karzinomzellen geeignet.

Die Ausführungsformen der Erfindung werden weiterhin durch Beispiele erläutert, die die Aspekte der Erfindung im Einzelnen zeigen. Diese Beispiele erläutern spezielle Aspekte der Erfindung und schränken ihren Umfang nicht ein.

BEISPIELE Beispiel 1. Antitumor-Wirksamkeit von G207 in der CT26-Zelllinie

Die Antitumor-Wirksamkeit von G207 wurde in einem bilateralen entwickelten subkutanen Tumormodell mit CT26-Zellen, wie nachstehend beschrieben, bewertet.

Zelllinie

Die murine kolorektale Karzinom-CT26-Zelllinie wurde als syngeneisches Tumormodell zum Studium der Immuntherapie breit eingesetzt. Fearon et al., Cancer Res. 35: 2975–80 (1988); Wang, et al., J. Immunol. 154: 4685–92 (1995); Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9730–35 (1996). CT26 ist ein transplantierbarer Darmepitheltumor, der durch intrarektale Injektionen von N-Nitroso-N-methylurethan in weibliche BALB/c-Mäuse (H-2d) ausgelöst wird. Corbett et al., Cancer Res. 35: 2434–39 (1975).

Bei normalen Mäusen ist CT26 wenig immunogenisch: 103–104 Zellen können einen letalen Tumor herbeiführen und lösen keine nachweisbaren tumorspezifischen CTL aus. Fearon et al., supra; Wang et al., supra. AH1, ein nicht mutiertes Nonamer, das sich von dem Hüllprotein (gp70) eines endogenen ekotropischen murinen Leukämie-Provirus (MuLV), env-1, ableitet, wurde als immundominantes MHC-Klasse-I-eingeschränktes Antigen für CT26 identifiziert. Huang et al., supra. Der adoptive Transfer von Peptid-spezifischen CTL-Linien war in der Lage, entwickelte subkutane CT26-Tumore zu heilen, was die Korrelation zwischen Induktion von tumorspezifischen CTL und einer Antitumor-Wirkung zeigt.

Das Herpes-simplex-Virus wächst in vielen Rattenzellen nicht, und abgeschwächte Viren, wie G207, wachsen auch in vielen Maustumoren nicht gut. Dies steht im Gegensatz zu ihrem ausgezeichneten Wachstum in den meisten menschlichen Tumorlinien. Allerdings erfordern Studien in menschlichen Tumorlinien die Verwendung von athymischen Mäusen. CT26 wurde nach mehreren Jahren, in denen versucht wurde, ein gutes syngeneisches System zum Studium der Immuneffekte von abgeschwächten konditional replizierten Herpes-Vektoren, wie G207, zu finden, als Modell-Zelllinie gewählt.

Infektion von CT26-Zellen

Tumorzellen (1 × 105) wurden subkutan in die bilateralen Flanken von weiblichen BALB/c-Mäusen (National Cancer Institute (Rockville, MD)) injiziert. Als subkutane Tumore tastbar wuchsen (ungefähr 5 mm Durchmesser), wurden die Mäuse unilateral in den rechten Seitentumor entweder mit G207-Virus in 50 &mgr;l Viruspuffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5) und modifiziertem Eagle-Medium (MEM) (1:1) oder mit 50 &mgr;l mock-infiziertem Extrakt („Mock"), hergestellt aus mock-infizierten Zellen, unter Anwendung der gleichen Verfahrensweisen, wie diejenigen, die für das Virus-Inokulum eingesetzt wurden, inokuliert. Eine zweite Injektion der gleichen Zusammensetzung wurde 7 Tage später in einigen Experimenten verabreicht. Die Tumorgröße wurde durch eine äußere Mikrometerschraube gemessen. Sämtliche tierische Prozeduren waren von dem Georgetown University Animal Care and Use Committee genehmigt.

Wie in Figur gezeigt, ergab die Inokulation mit G207 eine Reduktion im Tumorwachstum sowohl der inokulierten Tumore (RT) als auch ihrer nicht-inokulierten kontralateralen Gegenstücke (LT) im Vergleich zu den mock-inokulierten Kontrollen (p < 0,005 (Rt) und p < 0,001 (Lt) am Tag 21 nach der Infektion; ungepaarter t-Test. Zum Zeitpunkt der zweiten Inokulation, 7 Tage nach der ersten Inokulation, wurde die lacZ-Expression aus G207 durch X-gal-Histochemie in dem inokulierten Tumor, jedoch nicht in dem nicht-inokulierten Tumor nachgewiesen.

Zwei intratumorale Inokulationen mit einer niedrigeren Dosis von G207 (7 × 103 Plaque-bildende Einheiten (pfu)) lösten eine signifikante Wachstumshemmung der bilateralen Tumore im Vergleich zu den Kontrollen aus (p < 0,01 (Rt) und p < 0,05 (Lt) am Tag 21 nach der Infektion; ungepaarter t-Test), jedoch zu einem geringeren Ausmaß als die höhere Dosis (siehe 1C).

Eine einzige unilaterale intratumorale Inokulation mit 5 × 107 pfu von G207 verursachte eine starke Reduktion im bilateralen Tumorwachstum (1A), vergleichbar mit der doppelten Inokulation mit 7 × 105 pfu (1C).

Die Antitumor-Wirkung auf den nicht-inokulierten kontralateralen Tumor, die von der intratumoralen Inokulation von G207 abhängt, als intradermale Inokulation von G207 in die rechten Flanken von Mäusen mit entwickelten unilateralen Tumoren in den linken Flanken besaß keine Auswirkung auf das Tumorwachstum (siehe 1B).

Rolle von T-Zellen bei der Immunantwort

Zur Evaluierung der potentiellen Rolle von T-Zellen bei der erfindungsgemäßen Herpes-simplex-induzierten Hemmung des Tumorwachstums wurde die Antitumor-Wirksamkeit der intratumoralen G207-Inokulation in athymischen Mäusen getestet. Es bestand keine Wirkung der intratumoralen Inokulation von 7 × 105 pfu G207. Höhere Dosen an G207-Inokulationen (5 × 107 pfu) verursachten eine leichte Wachstumshemmung von Virus-inokulierten Tumoren im Vergleich zu mock-inokulierten Tumoren (p = 0,08 am Tag 10), jedoch wurde keine Wirkung auf die nicht-inokulierten kontralateralen Tumore festgestellt. Diese fehlende Wirkung auf die kontralateralen Tumore in athymischen Mäusen zeigt für die ausgelöste Immunantwort eine T-Zellen-Komponente.

Tumorspezifische CTL-Antwort

Zur Bestimmung, ob das Herpes-simplex-Virus eine tumorspezifische CTL-Antwort auslöst, wurden Effektorzellen in vitro aus Splenozyten erzeugt, die 12 Tage nach der ersten Virus-(G207)-Inokulation erhalten und in einem 51Cr-Freisetzungstest getestet wurden.

Einzelzell-Suspensionen von Splenozyten (3 × 106) aus einzelnen Mäusen, die mit G207 oder mit einer Mock-Probe behandelt wurden, wurden mit 1 × 106 Mitomycin-C-behandelten CT26-Zellen (100 &mgr;g/ml Mitomycin C für 1 h) kultiviert. Effektorzellen wurden nach 6 Tagen der in vitro Kultivierung geerntet und in den angegebenen Verhältnissen mit Zielzellen vermischt. Die Zielzellen wurden 60 min mit 50 &mgr;Ci von Na51CrO4 (51Cr) inkubiert. Vierstündige 51Cr-Freisetzungstests wurden wie bei Kojima et al., Immunity 1: 357–64 (1994) beschrieben, durchgeführt. Die prozentspezifische Lyse wurde aus Dreifachproben wie folgt berechnet: [(cpm experimentell – cpm spontan)/(cpm maximum – cpm spontan)] × 100.

A20 ist eine B-Zellen-Lymphom-Zelllinie (Ig+, Ia+, H-2d), die sich aus einem spontanen Retikulum-Zellneoplasma in BALB/c-Mäusen ableitet. Kim et al., J. Immunol. 122: 549–54 (1979). Sie ist in der Lage, Proteinantigen gegenüber MHC-eingschränkten Antigen-reaktiven T-Lymphozyten zu präsentieren. Glimcher, et al., J. Exp. Med. 155: 445–59 (1982).

Mäuse, die intratumoral mit G207 behandelt wurden, erzeugten eine hochspezifische CTL-Antwort gegen CT26-Zellen, allerdings nicht gegen A20-Lymphomzellen (auch H-2d). Eine nicht-spezifische CTL-Antwort wurde bei Mäusen nachgewiesen, die intradermal mit G207 oder intratumoral mit Mock-Extrakt behandelt wurden. Es lag eine schwache, nicht-spezifische CTL-Antwort (gegen A20 und CT26) vor, die in mock-inokulierten Mäusen ausgelöst wurde.

Die Fähigkeit von CTL, die in Mäusen erzeugt wurde, die intratumoral mit dem Herpes-simplex-Virus inokuliert wurden, zur Erkennung des CT26-immundominanten MHC-Klasse-I-eingeschränkten antigenischen Peptids AH1 wurde ebenfalls bewertet. AH1, das Nonamer SPSYVYHQF, ist das immundominante Peptid aus CT26, das von dem MHC-Klasse-I-Ld-Molekül präsentiert wird. Das Ld-bindende AH1-Peptid leitet sich von gp70 ab, eines von zwei env-Genprodukten der endogenen MuLV. Huang et al., supra, zeigten, dass CT26-Zellen das MuLV-env-Genprodukt exprimieren, während es für das normale Gewebe von BALB/c-Mäusen nicht der Fall war, und dass das virale Antigen gp70 als potentielles Tumor-Rejektions-Antigen für das Immunsystem dienen kann. Das AH1-Peptid wurde von Peptide Technologies (Washington, D.C.) mit einer Reinheit von > 99% synthetisiert, wie durch HPLC- und Aminosäureanalyse bestimmt.

H-2Ld-eingeschränktes P815AB.35-43, LPYLGWLVF, ist das immundominante Peptid, das aus murinen Mastozytom-P815-Zellen stammt. Van den Eynde et al., J. Exp. Med. 173: 1373–84 (1991).

Effektorzellen aus intratumoralen G207-inokulierten Mäusen zeigten eine spezielle Lyse von CT26-Zellen und von A20-Zellen, die mit dem Ld-eingeschränkten Peptid AH1 gepulst wurden, jedoch nicht von A20-Zellen, die mit dem Ld-eingeschränkten Peptid P815AB gepulst wurden. Die in vitro CTL-Aktivität war durch die Verarmung an CD8+-Zellen, jedoch nicht durch die Verarmung an CD4+-Zellen vollständig aufgehoben.

Die intradermale Inokulation mit G207-Virus oder die intratumorale Inokulation mit Mock-Extrakt verstärkte die Aktivierung von spezifischen T-Zellen gegen CT26-Tumore nicht. Im Gegensatz dazu löste das in vivo Priming gegen Tumore, die endogene Antigene exprimieren, durch intratumorale Inokulation von G207 eine antigenische Peptid-spezifische CTL-Reaktion aus. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Inokulation von Tumoren mit einem Herpes-simplex-Virus die potentiellen Mechanismen der Toleranz gegenüber der endogenen Antigen-Expression beheben kann. Deas Fehlen einer Antitumor-Antwort gegen nicht-inokulierte Tumore in athymischen Mäusen und der Verlust an CTL-Aktivität durch Verarmung an CD8+-Zellen in vitro legt eine bedeutende Rolle der T-Zellen-vermittelten MHC-Klasse-I-eingeschränkten Erkennung durch CTL nahe.

Beispiel 2. Antitumor-Wirksamkeit von G207 im M3-Maus-Melanomzellen

M3-Maus-Melanomzellen (3 × 105) wurden bilateral in die Flanken von DBA/2-Mäusen inokuliert. Wenn die Tumore maximal 5 mm im Durchmesser betrugen, wurden in den Tumor der rechten Flanke einmal entweder 5 × 107 pfu G207 oder eine gleichwertige Menge einer Mock-Verozellen-Präparation (als negative Kontrolle) inokuliert.

Die Inokulation mit G207 hemmte das Wachstum des inokulierten Tumors (p < 0,0005) und hemmte auch das Wachstum des nicht-inokulierten Tumors (p < 0,02) signifikant. 2.

Beispiel 3. Antitumor-Wirksamkeit von G207 in Maus-N18-Neuroblastomzellen Bilaterale subkutane Tumore

Maus-N18-Neuroblastomzellen wurden subkutan bilateral in syngeneische A/J-Mäuse implantiert. Acht Tage nach der Tumorimplantation wurden 107 pfu G207 oder Mock-Proben in den linken Tumor injiziert. In sechs von acht Tieren ergab die Inokulation mit G207 das Verschwinden der Tumore auf beiden Seiten. 3.

Subkutane und intrazerebrale Tumore

N18-Neuroblastomzellen wurden subkutan bilateral in die linke Flanke von A/J-Mäusen implantiert. Drei Tage später wurden N18-Neuroblastomzellen intrazerebral in den rechten frontalen Lobus der Mäuse implantiert. An den Tagen 10 und 13 wurde in die subkutanen Tumore nur G207 (11 Mäuse) oder Mock-Probe (11 Mäuse) injiziert. Innerhalb von 35 Tagen der zerebralen Implantation starben sämtliche mit Mock-Proben behandelten Mäuse an intrazerebralen Tumoren oder wiesen sie auf. Vier von elf Mäusen, die mit G207 behandelt wurden, wiesen keine intrazerebralen Tumore auf, und eine G207-behandelte Maus war eine Langzeit-Überlebende. Die G207-Behandlung hemmte das Wachstum von distanten intrazerebralen Tumoren und erhöhte das Überleben von Tumor-tragenden Tieren (p < 0,05 gemäß Wilcox-Test).

Reprovokation mit N18

10 A/J-Mäuse ohne vorherige Exposition gegenüber N18-Zellen (naive Gruppe), 30 A/J-Mäuse, die spontan vor den subkutanen Injektionen von N18-Zellen abgestoßen hatten (Abstoßungsgruppe), und zwölf A/J-Mäuse, die zuvor N18-subkutane Tumore aufwiesen, die durch intratumorale Injektion von G207 geheilt wurden (geheilte Gruppe), wurden subkutan mit N18-Zellen injiziert. Keines der Tiere aus der geheilten Gruppe zeigte ein Anzeichen von Tumorwachstum, wohingegen eine große Anzahl von Tieren der naiven und der Abstoßungsgruppe signifikantes Tumorwachstum zeigt.

Beispiel 4. Antitumor-Wirksamkeit von tsK

Maus-CT26-Darmkarzinomzellen wurden subkutan bilateral in syngeneische BALB/c-Mäuse implantiert. 105 pfu tsK, eine temperaturempfindliche Herpes-simplex-Virus-Mutante in ICP4 oder Mock-Probe, wurden in den rechten Tumor injiziert, und eine zweite Inokulation mit der gleichen Zusammensetzung wurde sieben Tage später verabreicht (Tag 7). Die Inokulation mit tsK ergab in beiden Tumoren eine nennenswerte Hemmung des Tumorwachstums (p < 0,05 am Tag 21). 4.

Beispiel 5. Antitumor-Wirksamkeit eines defekten Vektors, der IL-12 und Helfervirus-G207 enthält

Die murine kolorektale Karzinomzelllinie CT26 wurde zur Bewertung der Antitumor-Wirksamkeit eines defekten Vektors verwendet, der IL-12 und G207 als Helfervirus enthielt.

Erzeugung von defekten Vektoren

Zwei Amplicon-Plasmide ähnlicher Größe, pHCIL12-tk und pHCL-tk, wurden konstruiert, die die beiden Untereinheiten von murinem IL-12 (p40 und p35) bzw. lacZ unter der Kontrolle des CMVIE-Promotors codierten (siehe 5A und 5B). Da IL-12 als Heterodimer funktionell ist, wurden beide Untereinheiten aus einem einzigen defekten Vektor als bicistronische Botschaft mittels einer internen Ribosomeneintrittsstelle (IRES) exprimiert.

Das Doppelkassetten-Amplicon-Plasmid (pHCL-tk) wurde durch Insertion des HSV-1-Thymidinkinase-(TK)-Gens und des stumpfendigen BamH1-Fragments aus pHSV-106 (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) in die stumpfendige Spe-I-Schnittstelle von pHLC konstruiert (5A).

Die codierende Region von p40, das BamH1-Fragment von BL-pSV40, cDNA für murinen IL-12-p35 und eine IRES aus dem Pferdeenzephalomyokarditisvirus (EMCV) aus DFG-mIL-12 (IRES-p35) und das BamH1-Fragment aus DFG-mIL12 wurden in LITMUS 28 (New England Biolabs, MA) an der BgIII/BamH1-Schnittstelle unter Erzeugung von p40-IRES-35 subkloniert. Das IL-12, das das Doppelkassetten-Amplicon-Plasmid pHCIL12-tk codierte, wurde durch Insertion der p40-IRES-p35-Kassette, das SnaB1/AflII-Fragment, in die stumpfendige SalI-Schnittstelle von pSR-ori und anschließende Insertion des HSV-TK-stumpfendigen BamH1-Fragments in die stumpfendige SphI-Schnittstelle unter Herstellung von pHCIL12-tk konstruiert. 5B.

G207, enthaltend Deletionen in beiden Kopien des &ggr;34.5-Gens, und eine E. coli-lac-Z-Insertion, die das ICP6-Gen inaktiviert, wurden als Helfervirus zur Erzeugung von defekten Vektor-(dv)-Vorräten verwendet. Verozellen wurden mit gereinigter Amplicon-Plasmid-DNA (pHCIL12-tk und pHCL-tk) und G207-Virus-DNA unter Verwendung von lipofectAMINETM (Life Technologies, Inc., Rockville, MD), wie vom Hersteller beschrieben, co-transfiziert und sodann bei 34,5°C kultiviert, bis sie die vollständige zytopathische Wirkung zeigten. Das Virus wurde anschließend geerntet und in einer 1:4-Verdünnung in Verozellen eingeschleust, bis die Hemmung der Helfervirus-Replikation festgestellt wurde. Der IL-12-enthaltende defekte Vektor wird dvIL12/G207 genannt, und der lacZ-enthaltende defekte Vektor wird dvlacZ/G207 genannt.

Titration von defekten Vektormaterialien

Defekte Vektormaterialien wurden nach Gefrier-Tau/LTltrabeschallungs-Regimen und Entfernung von Zellabfall durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (2000 × g 10 min bei 4°C) titriert. Der G207-Helfervirus-Titer wurde als Anzahl von pfus nach Plaquetest auf Verozellen bei 34,5°C ausgedrückt. Für die dvIL12/G207 wurde die IL-12-Expression bestimmt, und die Passage mit dem höchsten Niveau (Passage 4), mit einem G207-Helfervirustiter von 5 × 107 pfu/ml, wurde verwendet. Der Titer von dvlacZ/G207, bestimmt durch die Zählung von X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-&bgr;-D-galactopyranosid)-Histochemie positiven Einzelzellen (defekte Partikeleinheiten, dpu) nach Bildung von Plaques durch G207, betrug 5 × 106 dpu/ml und 5 × 107 pfu/ml für das Helfervirus.

Zellkultur

Nierenzellen des afrikanischen grünen Affen (Vero) wurden in DMEM, enthaltend 10% Kälberserum (CS), kultiviert. MC-38-Maus-Darm-Adenokarzinom, Harding-Passey-Maus-Melanom, MDA-MB-435-Humanes-Brust-Adenokarzinom und CT26-Zellen wurden in DMEM gezüchtet, enthaltend 10% wärmeinaktiviertes FCS (Hyclone, Logan, UT) und Penicillin-Streptomycin (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO). A20, eine B-Zellen-Lymphomzelllinie (Ig+, Ia+, H-2d), die sich von einem spontanen Retikulum-Zellneoplasmus in BALB/c-Mäusen (American Type Culture Collection, Rockville, MD, ATCC TIB 208) ableitet, wurde in RPMI 1640, enthaltend 10% wärmeinaktiviertes FCS, 50 &mgr;M 2-ME, 2mM Glutamin, 20 mM Hepes-Puffer und Penicillin-Streptomycin, gezüchtet.

Nachweis von IL-12

Die Expression und Sekretion von IL-12 wurde durch ELISA-Test nach Infektion von Tumorzellen in Kultur bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 1 pfu pro Zelle bestimmt.

24 Stunden nach der Infektion wurden Aliquote des infizierten Zellüberstands entfernt, in einem Trockeneis/Ethanol-Bad schnell eingefroren und zum Nachweis von IL-12 bei –80°C gelagert. Tumore und Blut wurden aus den mit defektem Vektor behandelten Mäusen gesammelt und in einem Trockeneis/Ethanol-Bad schnell eingefroren. Gefrorenes Gewebe wurde in eiskaltem PBS, enthaltend 500 &mgr;M PMSF, 0,5 &mgr;g/ml Leupeptin und 0,7 &mgr;g/ml Pepstatin, homogenisiert. Das Homogenat wurde anschließend zweimal 10 Sekunden lang ultrabeschallt und durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge 5 min bei 4°C geklärt. Die immunreaktiven IL-12-Spiegel wurden durch Sandwich-ELISA unter Verwendung von Ab-Paaren und rIL-12 bestimmt. Die rIL-12-Standards wurden in dem gleichen Medium oder in Puffer wie die Proben (d. h. Maus-Serum für die Serumproben) verdünnt.

Kurz gesagt, wurden 96-Well-Platten, die mit einem Anti-Maus-IL-12-mAb (9A5) überzogen waren, über Nacht bei Raumtemperatur mit den Testproben inkubiert. Nach den Waschungen wurden die Platten mit Peroxidase-markiertem Anti-Maus-IL-12-p40-Ab (5C3) 2 h inkubiert und anschließend entwickelt. Die Extinktion wurde bei 450 nm gemessen.

Die Infektion von CT26-(murines Darmkarzinom), Harding-Passey-(murines Melanom), MCA38-(murines Darmadenokarzinom) und MDA-MB-435-(menschliches Brustadenokarzinom) Zellen mit dvIL12/G207 ergab die Sekretion von bis zu 1,5 ng murinen IL-12/105 Tumorzellen in 24 Stunden. 6. Kein IL-12 wurde in den Überständen von nicht-infizierten Tumorzellkulturen oder denjenigen, die mit dvlacZ/G207 infiziert wurden, nachgewiesen. Die Spiegel der IL-12-Synthese und -Sekretion erreichten 1 Tag nach dvIL12/G207-Infektion von CT26-Zellen das Maximum und nahmen auf nicht nachweisbare Niveaus 3 Tage nach Infektion, wahrscheinlich aufgrund von Zelltod, ab.

Subkutanes Tumormodell

BALB/c- und BALB/c-(nu/nu)-Mäuse wurden vom National Cancer Institue oder Charles River (Wilmington, MA) erhalten. Sämtliche Tierversuche waren vom Georgetown University Animal Care and Use Committee genehmigt.

CT26-Tumorzellen (1 × 105) wurden subkutan (s. c.) in die bilateralen Flanken von Mäusen injiziert. Wenn s. c. Tumore tastbar wuchsen (etwa 5 mm in maximalem Durchmesser) wurden den Mäusen unilateral in den rechten Seitentumor entweder 50 &mgr;l defekter HSV-Vektor (7 × 105 pfu Helfervirus) in Viruspuffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,5) oder 50 &mgr;l Viruspuffer injiziert, gefolgt von einer zweiten Injektion der gleichen Zusammensetzung 7 Tage später. Wo angegeben, wurde anstelle von Viruspuffer Mock-Extrakt verwendet. DvlacZ/G207 statt Helfervirus G207 allein wurde als Kontrolle für die dvIL12/G207-Inokulation verwendet, so dass Unterschiede in den viralen Faktoren (d. h. Partikel:pfu-Verhältnis), die in den defekten Vektormaterialien vorhanden waren, vs. G207-Materialien herangezogen wurden. Sowohl G207 als auch dvlacZ enthalten E-coli-lacZ, und darum wurden keine zusätzlichen Fremdantigene durch den defekten Kontrollvektor exprimiert.

Die Tumorgröße wurde durch eine Mikrometerschraube von außen gemessen, und das Tumorvolumen wurde berechnet (V = h × w × d). Wenn Tiere moribund erschienen oder der Durchmesser ihrer s. c. Tumore 18 mm erreichte, wurden sie getötet, und dies wurde als Todesdatum für die Überlebensstudien dokumentiert. Die statistischen Unterschiede wurden unter Verwendung von StatView 4.5 (Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA) berechnet, wobei das mittlere Tumorvolumen durch den ungepaarten t-Test bewertet wurde, das Überleben mittels ANOVA (Fisher's Post-Hoc-Vergleiche) und Unterschiede im Überleben durch den Log-Rang-(Mantel-Cox)-Test bewertet wurden.

Die Inokulation mit dvIL12/G207 rief eine sehr prominente Antitumor-Wirkung hervor, wobei sowohl die inokulierten Tumore sowie ihre nicht inokulierten kontralateralen Gegenstücke eine signifikante Reduktion im Tumorwachstum zeigten. 7. Zwei von sechs der mit dvIL12/G207 inokulierten Tumore entwickelten sich zu einer nicht nachweisbaren Größe. Die Inokulation mit dvlacZ/G207 ergab ebenfalls eine signifikante Reduktion der Tumorgröße sowohl der inokulierten als auch nicht-inokulierten Tumore, verglichen mit Kontrollen, jedoch zu einem viel geringeren Ausmaß als mit dvIL12/G207. 7.

Auch das Überleben der Mäuse wurde beobachtet, wobei eine Tötung erfolgte, wenn einer der bilateralen Tumore im Durchmesser größer als 18 mm wurde. Das Überleben der mit defektem Vektor-behandelten Tiere spiegelt darum das Wachstum der nicht-inokulierten Tumore wider und war wesentlich länger als bei Kontrolltieren. Mäuse, die unilateral mit dvIL12/G207 behandelt wurden, überlebten länger als die mit dvlacZ/G207-behandelten Mäuse (8). IL-12 wurde in den dvIL12/G207 angeimpften Tumoren ein und fünf Tage nach Inokulation (ungefähr 50–100 pg/Tumor) nachgewiesen, wobei kein IL-12 im Serum nachgewiesen wurde.

Rolle der T-Zellen bei der Immunantwort

Zur Bewertung der möglichen Rolle von T-Zellen bei der durch defekten HSV-Vektor-induzierten Antitumor-Antwort wurden bilaterale CT26 s. c. Tumore in athymischen BALB/c-(nu/nu)-Mäusen entwickelt. Wie bei dem immunkompetenten Maus-Modell, das vorstehend besprochen wurde, wurde eine unilaterale intratumorale Inokulation von dvIL12/G207, dvlacZ/G207 oder Mock-Extrakt in den Tumoren auf der rechten Seite durchgeführt, wenn sie tastbar (ungefähr 5 mm im maximalen Durchmesser) waren, und eine zweite Inokulation mit der gleichen Zusammensetzung wurde 7 Tage später verabreicht.

Obwohl eine leichte Verzögerung im Wachstum bei den Tumoren auf der rechten Seite bestand, denen dvIL12/G207 injiziert wurde, wurde keine signifikante Tumorwachstumshemmung weder in den inokulierten noch in den kontralateralen nicht-inokulierten Tumoren festgestellt. CT26-Tumore wuchsen etwas schneller in den athymischen Mäusen als in den immunkompetenten Mäusen.

Tumor-spezifische CTL-Antwort

Um zu testen, ob die Hemmung des Tumorwachstums mit erhöhter CTL-Aktivität verbunden war, wurde die Fähigkeit der intratumoralen Inokulation mit defekten HSV-Vektoren zur Auslösung von CT26-spezifischer CTL-Aktivität in vitro unter Verwendung eines 51Cr-Freisetzungstests untersucht.

BALB/c-Mäuse wurden mit dvIL12/G207 oder dvlacZ/G207 intratumoral inokuliert, wenn die s. c. Tumore ungefähr 5 mm im maximalen Durchmesser erreichten, und eine zweite Inokulation mit der gleichen Zusammensetzung wurde sieben Tage später verabreicht. Einzelzell-Suspensionen von Splenozyten wurden in RPMI-1640-Medium mit 10 inaktiviertem FCS, 50 &mgr;M 2-ME, 2 mM Glutamin, 20 mM Hepes und Penicillin-Streptomycin in 24-Well-Platten bei einer Konzentration von 3 × 106 Zellen/ml kultiviert.

Zusätzlich wurden dem Medium entweder 1 × 106 inaktivierte CT26-Zellen oder 1 &mgr;g/ml Peptid AH1 zugesetzt. Zur Inaktivierung wurden die CT26-Tumorzellen 1 h in Kulturmedium inkubiert, das 100 &mgr;g/ml Mitomycin C enthielt, und sodann zweimal gewaschen. Die Effektorzellen wurden nach 6 Tagen der in vitro Kultur geerntet.

Vierstündige 51Cr-Freisetzungstests wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, wurden die Zellen mit 50 &mgr;Ci Na51CrO4 (51Cr) 60 min inkubiert. A20-Zellen wurden mit 1 &mgr;g/ml der Ld-eingeschränkten Peptide AH1 oder P815AB 1 h vor dem Markieren gepulst. Die Zielzellen wurden anschließend mit den Effektorzellen 4 h bei den angegebenen E/T-Verhältnissen vermischt. Die Menge der 51Cr-Freisetzung wurde durch &ggr;-Zählung bestimmt, und die prozentuale spezifische Lyse wurde aus Dreifachproben wie folgt berechnet: [(cpm experimentell – cpm spontan)/(cpm maximal – cpm spontan)] × 100.

Effektorzellen aus dvIL12/G207-behandelten Mäusen wurden mit Mitomycin-C-behandelten CT26-Zellen restimuliert, die spezifische Lyse von CT26-Zielzellen und A20-Zellen, gepulst mit dem Peptid AH1, zeigten. Es wurde keine offensichtliche Lyse von ungepulsten A20-Zellen oder von A20-Zellen festgestellt, die mit Ld-eingeschränktem Peptid P815AB gepulst wurden. Effektorzellen, die mit dem Peptid AH1, aus Mäusen, die mit dvIL12/G207 oder dvlacZ/G207 behandelt wurden, restimuliert wurden, zeigten eine spezifische Lyse von A20-Zielzellen, die mit dem Peptid AH1 gepulst wurden, und von CT-26-Zellen, jedoch nicht von ungepulsten A20-Zellen. Das CTL-Aktivitätsniveau, das durch dvIL12/G207 erzeugt wurde, war wesentlich größer als dasjenige, das durch dvlacZ/G207 erzeugt wurde. Effektorzellen aus dvIL12/G207-inokulierten nicht restimulierten Tieren waren zur spezifischen Lyse von CT26-, jedoch nicht von A20-Zellen in der Lage.

Die Auswirkung der intratumoralen IL-12-Expression auf die Akkumulation von bestimmten T-Lymphozyten-Subtypen oder die IFN-&ggr;-Produktion wurden ebenfalls bestimmt. Splenozyten wurden fünf Tage nach der zweiten Inokulation von dvIL12/G207 oder dvlacZ/G207 isoliert und auf die IFN-&ggr;-Produktion durch ELISA und Milz-T-Lymphozytensubsets durch FACS-Analyse getestet. Kurz gesagt, wurden Einzelzellsuspensionen von Splenozyten gewaschen und in RPMI-1640-Medium resuspendiert, das 10% inaktiviertes FCS enthielt. Die Zellen (3 × 106/ml) wurden in 24-Well-Platten 24 h kultiviert. Die Überstände wurden gesammelt und durch Sandwich-ELISA unter Verendung von Anti-IFN-&ggr;Ab-Paaren, erhalten von Endogen (Woburn, MA), getestet.

Ähnliche Prozentwerte von Helfer-T-Zellen (CD4) und von zytotoxischen T-Zellen (CD8a) wurden in dvIL12/G207- und dvlacZ/G207-behandelten Mäusen festgestellt. Splenozyten aus Mäusen, die mit dvIL12/G207 behandelt wurden, erzeugten wesentlich größere Mengen an IFN-&ggr; als diejenigen, die mit dvlacZ/G207 behandelt wurden, wie nachstehend gezeigt.

Beispiel 6. Antitumor-Wirksamkeit eines Vektors, der tsK und IL-12 enthält

Defekte Vektoren, die IL-12 und tsK oder lacZ und tsK enthalten, wurden hergestellt. Defekte Vektorplasmide pHCIL12-tk und pHCL-tk wurden, wie vorstehend beschrieben, hergestellt. Defekte Vektoren wurden durch Co-Transfektion von Verozellen mit Helfervirus-tsK-DNA und pHCIL12-tk oder pHCL-tk erzeugt. Die transfizierten Zellen wurden bei 31,5°C (eine Replikations-permissive Temperatur für tsK) inkubiert, bis die gesamte zytopathische Wirkung festgestellt wurde. Anschließend wurden die Zellen wie vorstehend beschrieben auf G207-Helfervirus passiert. Siehe auch Kaplitt et al., Mol. Cell. Neurosci. 2: 320–30 (1991). Der defekte Vektor, der IL-12 enthält, wird dvIL12/tsK genannt, und der defekte Vektor, der lacZ enthält, wird dvlacZ/tsK genannt.

CT26-Maus-Darmkarzinomzellen wurden subkutan bilateral in syngeneische BALB/c-Mäuse, wie vorstehend beschrieben, implantiert. Der rechte Tumor wurde entweder mit dvlacZ/tsK, dvIL12/tsK oder einer Mock-Probe inokuliert, und eine zweite Inokulation mit der gleichen Zusammensetzung wurde sieben Tage später verabreicht. Die Inokulation mit dvlacZ/tsK ergab eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums in beiden Tumoren (p < 0,01 am Tag 22). Die Inokulation mit dvIL12/tsK ergab eine größere Hemmung des Tumorwachstums in beiden Tumoren im Vergleich zu dem dvlacZ/tsK-inokulierten Tumor (p < 0,001). 9.

Das Überleben der inokulierten Mäuse wurde ebenfalls beobachtet. Die Mäuse wurden, wenn sie moribund wurden oder wenn ihre Tumore einen Durchmesser von mehr als 18 mm erreichten, getötet. Wie in 10 gezeigt, überlebten Mäuse, die mit dvlacZ inokuliert wurden, wesentlich länger als Mäuse, die mit einer Mock-Probe inokuliert wurden (p < 0,01), und Mäuse, die mit dvIL12/tsK inokuliert wurden, überlebten wesentlich länger als Mäuse, die mit dvlacZ/tsK oder einer Mock-Probe inokuliert wurden (p < 0,01).

Beispiel 7. Antitumor-Wirksamkeit eines Vektors, der tsK und GMCSF enthält

Harding-Passey-Melanomzellen wurden subkutan in die bilateralen Flanken von C57BL/6-Mäusen implantiert. Wenn die Tumore etwa 5 mm im maximalen Durchmesser (Tag 0) erreichten, wurden in die Tumore der rechten Flanke der defekte Vektor dvlacZ/tsk (erzeugt aus dem Amplicon-Plasmid pHCL-tk, welches E-coli-lacZ exprimiert) oder dvGMCSF/tsk (erzeugt aus dem Amplicon-Plasmid pHCGMCSF-tk, dessen Struktur die gleiche wie pHCIL12-tk ist, mit der Ausnahme, dass es Maus-GM-CSF-cDNA anstelle von IL-12 DNA enthält; die Expression von GM-CSF wurde durch ELISA nachgewiesen) und Helfer-tsK-Virus oder Viruspuffer injiziert. Mäuse, die mit dvGMCSF/tsK behandelt wurden, zeigten ein erhöhtes Überleben gegenüber Mäusen, die mit dvlacZ/tsk oder Puffer behandelt wurden, und zeigten in beiden bilateralen Tumoren ein vermindertes Tumorwachstum.

Es ist selbstverständlich, dass die Beschreibung, die speziellen Beispiele und Messwerte, obgleich beispielhafte Ausführungsformen vorgelegt wurden, zur Erläuterung angegeben sind und nicht die vorliegende Erfindung einschränken sollen. Verschiedene Änderungen und Modifikationen im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der Diskussion der Offenbarung und der hier enthaltenen Messwerte, klar und werden somit als Teil der Erfindung.


Anspruch[de]
Verwendung einer Zusammensetzung umfassend

ein Herpes Simplex Virus (HSV), das in sich teilenden Zellen repliziert und eine attenuierte Replikation in sich nicht teilenden Zellen zeigt, und das eine oder mehrere exprimierbare Nukleotidsequenzen umfasst, die eines oder mehrere Zytokine oder mindestens einen anderen Immunmodulator kodieren und

ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel für das Virus

zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Vorbeugen einer Metastase eines Tumors eines bestimmten Zelltyps durch Auslösen einer systemischen Antitumor-Immunantwort in einem Patienten, der multiple metastatische Tumore eines bestimmten Zelltyps aufweist oder das Risiko hat, solche zu entwickeln,

wobei das Medikament zur Inokulierung des Tumors in einem Patienten geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung eine Immunantwort induziert, die für den Tumorzelltyp spezifisch ist, und die Zellen des inokulierten Tumors und eines nicht inokulierten Tumors tötet. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das HSV nicht in der Lage ist, sowohl ein funktionelles &ggr;34.5-Genprodukt als auch eine Ribonukleotid-Reduktase zu exprimieren. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Virus ein HSV-Typ-1-Virus (HSV1) ist. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das HSV von der Multigen-Mutante G207 abstammt. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das HSV von der Mutante G92A abstammt. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das HSV ein HSV-Typ-2-Virus (HSV2) ist. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das HSV konditional replikationskompetent ist. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das HSV replikationsdefekt ist. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das HSV eine temperatursensitive Mutante ist. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Virus von der ICP4-Mutante tsK abstammt. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Virus von einem Vaccinstamm ist. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Tumorzellen von einem Typ sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Astrocytom, Oligodendrogliom, Meningiom, Neurofibrom, Glioblastom, Ependymom, Schwannom, Neurofibrosarcom und Medulloblastom. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Tumorzellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Melanomzellen, pankreatischen Tumorzellen, Prostatakarzinomzellen, Kopf-Hals-Tumorzellen, Brustkrebszellen, Lungenkrebszellen, Dickdarmkrebszellen, Lymphomzellen, Eierstock-Krebszellen, Nierenkrebszellen, Neuroblastome, Plattenepithelkarzinome, Medulloblastomen, Hepatomzellen und Mesotheliomen und epidermoiden Karzinomzellen. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Cytokin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, G-CSF, GM-CSF, IFN-&agr;, IFN-&ggr;, TNF-&agr;, vorzugsweise IL-12 oder GM-CSF. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Immunmodulator ausgewählt ist aus Genen kodierend Chemokine oder co-stimulatorische Moleküle, vorzugsweise B7. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Patient multiple metastatische Tumore aufweist.






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