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Dokumentenidentifikation DE102006008321A1 30.08.2007
Titel Mittel zur Behandlung von Infektionen mit Influenzaviren
Anmelder ViroLogik GmbH, 91052 Erlangen, DE
Vertreter Wehlan & Wehlan, Patentanwälte, 10367 Berlin
DE-Anmeldedatum 17.02.2006
DE-Aktenzeichen 102006008321
Offenlegungstag 30.08.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 30.08.2007
IPC-Hauptklasse A61K 45/00(2006.01)A, F, I, 20060217, B, H, DE
IPC-Nebenklasse A61P 31/16(2006.01)A, L, I, 20060217, B, H, DE   
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Virus-Infektionen, insbesondere von Infektionen mit grippalen Infekten auslösenden Influenza-Viren. Gegenstand der Erfindung sind Mittel, die als Wirkstoffe Inhibitoren des Ubiquitin-Proteasom-Systems, insbesondere Proteasominhibitoren, enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die systemische als auch die topische, bevorzugt die aerogene Verabreichung von Proteasominhibitoren. Die erfindungsgemäß eingesetzte Wirksubstanz eines Proteasominhibitors kann mit mindestens einer weiteren antiviral wirksamen Substanz zur Prophylaxe und/oder Therapie von Influenzavirus-Infektionen eingesetzt werden.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Virus-Infektionen, insbesondere von Infektionen mit grippalen Infekten auslösenden Influenza Viren. Gegenstand der Erfindung sind Mittel, die als Wirkstoffe Inhibitoren des Ubiquitin-Proteasom-Systems, insbesondere Proteasom-Inhibitoren, enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die systemische als auch die topische, bevorzugt die aerogene Verabreichung von Proteasominhibitoren. Die erfindungsgemäße eingesetzte Wirksubstanz eines Proteasominhibitors kann mit mindestens einer weiteren antiviral wirksamen Substanz zur Prophylaxe und/oder Therapie von Influenzavirus-Infektionen eingesetzt werden.

1. Charakteristik des bekannten Standes 1.1. Die Influenzavirus-Infektion in Tier und Mensch

Infektionen mit Influenza Viren, den Erregern der Virusgrippe, stellen eine bedeutende Gesundheitsbedrohung für Mensch und Tier dar und fordern Jahr für Jahr nicht nur eine Vielzahl an Todesopfern, sondern sind auch gesamtwirtschaftlich, etwa durch krankheitsbedingte Arbeitsunfähigkeit ein immenser Kostenfaktor. Neben den jährlich auftretenden Epidemien hat die Influenza jedoch noch eine weitaus bedrohlichere Dimension, da es in der Vergangenheit immer wieder zu weltweiten Ausbrüchen, sogenannten Pandemien gekommen ist, die viele Millionen Todesopfer gefordert haben. Das seit einigen Jahren beobachtete Auftreten hochpathogener Vogelgrippeviren vom Subtyp H5N1 verdeutlicht unmittelbar die Gefahr einer neuen Pandemie in naher Zukunft, gegen die derzeit keine wirksamen Impfstoffe vorhanden sind.

Influenza Viren gehören zu der Familie der Orthomyxoviren und besitzen ein segmentierete Genom negativ-strängiger Orientierung, welches für mindestens 11 virale Protein kodiert. (Lamb und Krug, in Fields, Virology, Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1353-1395, 1996). Aufgrund molekularer und serologischer Charakteristika der Nukleoproteine (NP) und der Matrixproteine (M) werden Influenza Viren den Typen A, B und C zugeordnet. Viren des Types A besitzen das größte pathogene Potential für Menschen und einige Tierarten (Webster et al., Microbiol Rev, 56, 152-79, 1992).

Ein Influenza A Viruspartikel besteht aus 9 strukturellen Proteinen und einer Lipidhülle, die von der Wirtszelle stammt. Die viralen RNA Segmente 1 bis 3 kodieren für die Komponenten des RNA-abhängigen RNA Polymerasekomplexes (RDRP), PB1, PB2 und PA, verbunden mit dem Ribonukleoproteinkomplex katalysieren diese Komponenten Transkription und Amplifikation des viralen Genoms. Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) sind virale Oberflächenglykoproteine, die von den vRNA Segmenten 4 und 6 gebildet werden. Gegenwärtig sind 16 verschiedene HA- und 9 verschiedene NA-Subtypen bekannt, aufgrund derer Influenza A Viren in unterschiedliche Kategorien gegliedert werden.

Viren mit den HA-Typen H1, H2 und H3 und NA-Typen N1 und N2 können in Menschen epidemisch wirken (Lamb und Krug, in Fields, Virology, Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 1353-1395, 1996). Segment 5 kodiert das Nukleoprotein (NP), die Hauptkomponente des Ribonukleoproteinkomplexes. Die beiden kleinsten vRNA Segmente kodieren für jeweils zwei Proteine. Das vRNA Segment 7 kodiert das Matrixprotein M1 und das M2 Protein. Das M1 Protein assoziiert mit der Innenseite der Lipiddoppelmembran und kleidet die Virushülle von innen aus, M2 ist eine dritte Transmembrankomponente, die als pH-abhängiger Ionenkanal fungiert. Die Sequenz von Segment 8 trägt die Informationen für das Kernexportprotein NS/NEP und das einzige Nichtstrukturprotein, NS 1. Vor kurzem wurde ein elftes Influenza A Virusprotein identifiziert (Chen et al., 2001). Es handelt sich um das PB1-F2 Protein, das von einem offenen, um ein Nukleotid verschobenen Leserahmen des PB1 Gensegmentes gebildet wird.

PB1-F2 ist ein mitochondriales Protein, das in der Lage ist, die Induktion des kontrollierten Zelltods, der Apoptose, zu verstärken.

Das Problem der Bekämpfung von RNA Viren ist die durch eine hohe Fehlerrate der viralen Polymerasen verursachte Wandlungsfähigkeit der Viren, die sowohl die Herstellung geeigneter Impfstoffe als auch das Entwickeln von antiviralen Substanzen sehr schwierig macht.

Es hat sich gezeigt, daß die Anwendung von antiviralen Substanzen, die direkt gegen Funktionen des Virus gerichtet sind, mutationsbedingt sehr schnell zur Selektion resistenter Varianten führt. Ein Beispiel hierfür ist das anti-Influenza Agenz Amantadin und dessen Derivate, welche gegen ein Transmembranprotein des Virus gerichtet sind und bereits binnen weniger Passagen zur Bildung resistenter Varianten führen.

Auch die neuen Therapeutika für Influenzainfektionen, die das Influenza-virale Oberflächenprotein Neuraminidase hemmen und unter dem Handelsnamen RELANZA bzw. TAMIFLU von Glaxo Wellcome bzw. Roche in Deutschland vertrieben werden, haben bereits resistente Varianten in Patienten erzeugt [Gubareva et al J Infect Dis 178, 1257-1262, 1998]. Auch bei den derzeit im Menschen gefundenen H5N1 Vogelgrippeviren sind schon Resistenzen gegen TAMIFLU aufgetreten (Qui et al. Nature 437,1108, 2005). Die Hoffnungen, die in diese Therapeutika gelegt wurden, konnten auch aus diesem Grunde nicht erfüllt werden.

Aufgrund ihrer meist kleinen Genome und damit begrenzter Kodierungskapazität für replikationsnotwendige Funktionen sind alle Viren in starkem Maße auf Funktionen ihrer Wirtszellen angewiesen. Durch Einflussnahme auf solche zelluläre Funktionen, die für die virale Replikation notwendig sind, ist es möglich, die Virusreplikation in der infizierten Zelle negativ zu beeinträchtigen (Ludwig et al., Trends Mol. Med. 9, 46-51, 2003). Hierbei besteht für das Virus nicht die Möglichkeit, durch Anpassung die fehlende zelluläre Funktion zu ersetzen. Ein Entweichen vor dem Selektionsdruck durch Mutation ist hier nicht möglich. Dies konnte am Beispiel des Influenza A Virus nicht nur mit relativ unspezifischen Hemmstoffen gegen zelluläre Kinasen und Methyltransferasen gezeigt werden (Scholtissek und Muller, Arch Virol 119, 111-118, 1991) sondern auch mit Kinase-Inhibitoren, die selektiv einen vom Virus benötigen Signalweg angreifen (Ludwig et al., FEBS Lett 561, 37-43, 2004).

1.2. Funktion des Ubiquitin/Proteasom-Systems (UPS)

Proteasomen stellen die hauptsächliche proteolytische Komponente im Zellkern und Zytosol aller eukaryotischen Zellen dar. Es sind multikatalytische Enzymkomplexe, die ca. 1 % der Gesamt-Zellproteine ausmachen. Proteasomen üben eine vitale Rolle in vielfältigen Funktionen des Zellmetabolismus aus. Die hauptsächliche Funktion ist die Proteolyse von missgefalteten, nicht-funktionellen Proteinen. Eine weitere Funktion hat der proteasomale Abbau von zellulären oder viralen Proteinen für die T-Zell-vermittelte Immunantwort durch die Generierung von Peptid-Liganden für Major Histocompatibilitäts Klasse-I-Moleküle (für Review siehe Rock und Goldberg, 1999). Proteasom-Targets werden in der Regel durch die Anheftung von oligomeren Formen von Ubiquitin (Ub) für den Abbau markiert. Ub ist ein hochkonserviertes, 76 Aminosäuren langes Protein, das kovalent an Targetproteine gekoppelt wird. Die Ubiquitinylierung selbst ist reversibel, und Ub-Moleküle können durch eine Vielzahl von Ub-Hydrolasen von dem Targetmolekül wieder entfernt werden. Die Verbindung zwischen der Ubiquitinylierung von Target-Proteinen und der proteasomalen Proteolyse wird allgemein als Ubiquitin/Proteasom-System (UPS) bezeichnet (für Review siehe Rock und Goldberg, 1999; Hershko und Ciechanover, 1998).

Das 26S Proteasom ist ein 2.5 MDa großer Multienzym-Komplex, der aus ca. 31 Untereinheiten besteht. Die proteolytische Aktivität des Proteasom-Komplexes wird durch eine zylinderförmige, 700 kDa große und aus vier übereinander liegenden Ringen bestehende Core-Struktur, dem 20S Proteasom, realisiert. Das 20S Proteasom bildet einen aus 14 nicht identischen Proteinen bestehenden komplizierten Multienzymkomplex, der in zwei &agr;- und zwei &bgr;-Ringen in einer &agr;&bgr;&bgr;&agr;-Reihenfolge angeordnet ist. Die Substratspezifität des 20S Proteasom umfasst drei wesentliche Aktivitäten: Trypsin-, Chymotrypsin- und Postglutamyl-Peptid hydrolysierende-(PGPH) oder auch Kaspase-ähnliche Aktivitäten, die in den &bgr;-Untereinheiten Z, Y und Z lokalisiert sind. Das 20S Proteasom degradiert in vitro denaturierte Proteine unabhängig von deren Poly-Ubiquitinylierung. Dagegen werden in vivo enzymatische Aktivitäten des 20S Proteasoms durch Anlagerung der 19S regulatorischen Untereinheiten reguliert, welche zusammen das aktive 26S Proteasom Partikel bilden. Die 19S regulatorischen Untereinheiten sind bei der Erkennung von poly-ubiquitinylierten Proteinen sowie bei der Entfaltung von Targetproteinen beteiligt. Die Aktivität des 26S Proteasom ist ATP-abhängig und degradiert fast ausschließlich nur poly-ubiquitinylierte Proteine (für Review siehe Hershko und Ciechanover, 1998).

1.3. Proteasom-Inhibitoren

Verschiedene Substanzklassen sind als Proteasom-Inhibitoren bekannt. Es sind zum einen chemisch modifizierte Peptidaldehyde, wie der Tripeptidaldehyd N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal (zLLL; auch als MG132 bezeichnet) sowie das wirksamere Borsäure-Derivat MG232. Ähnlich zu zLLL wurde eine weitere Klasse von modifizierten Peptiden, die Peptid-Vinyl-Sulfone, als Proteasom-Inhibitoren beschrieben (für Review siehe Elliott und Ross, 2001). Natürlich vorkommende Substanzen sind Lactacystin (LC) (Fenteany et al., 1995), das aus Streptomyceten, sowie Epoxomycin, das aus Aktinomyzeten gewonnen wird (Meng et al., 1999 a, b). LC ist ein hoch spezifischer, irreversibel wirkender Proteasom-Inhibitor, welcher hauptsächlich die Chymotrypsin und die Trypsin-ähnlichen Aktivitäten des 26S Proteasom-Partikels blockiert (Fenteany et al., 1995). LC hat keine Peptid-Grundstruktur, sondern besteht aus einem &ggr;-Lactam-Ring, einem Cystein und einer Hydroxy-butyl-Gruppe. LC selbst inhibiert nicht das Proteasom. Vielmehr wird in wässriger Lösung der N-Acetyl-Cystein-Rest hydrolysiert. Das Resultat ist die Bildung eines Clastolactacystein &bgr;-Lactons, das in der Lage ist, Zellmembranen zu penetrieren. Nach Zellaufnahme kommt es zum nukleophilen Angriff des &bgr;-Lacton-Rings und anschließender Transesterifizierung der Threonin-1-Hydroxyl-Gruppe der &bgr;-Untereinheit (Fenteany et al., 1995).

Hinsichtlich Spezifität und Wirksamkeit ist Epoxomycin der bislang wirksamste aller bekannten natürlichen Proteasom-Inhibitoren (Meng et al., 1999; a, b). Eine weitere und sehr potente Klasse an synthetischen Proteasom-Inhibitoren sind Borsäure-Peptid-Derivate, insbesondere die Verbindung Pyranozyl-Phenyl-Leuzinyl-Borsäure mit dem Namen "PS-341". PS-341 ist unter physiologischen Bedingungen sehr stabil und nach intravenöser Applikation bioverfügbar (Adams und Stein, 1996; Adams et al., 1999, US 1,448,012TW01).

1.4. Klinische Applikation von Proteasom-Inhibitoren

Die Hemmung der Proteasom-Aktivität als hauptsächliche zelluläre Protease kann zu Veränderungen in der Regulation des Zellzyklus, der Transkription, der gesamten zellulären Proteolyse sowie der MHC-I Antigenprozessierung führen (für Review siehe Ciechanover et al., 2000). Demzufolge ist eine dauerhafte Inhibierung aller enzymatischen Aktivitäten des Proteasoms mit dem Leben einer Zelle und damit des Gesamtorganismus nicht vereinbar. Bestimmte, reversibel wirkende Proteasom-Inhibitoren können jedoch selektiv einzelne proteolytische Aktivitäten des 26S Proteasoms inhibieren, ohne dabei andere zelluläre Proteasen zu beeinflussen. Erste klinische Studien mit Proteasom-Inhibitoren (Adams et al., 1999) verdeutlichen, dass diese Substanzklasse ein enormes Potential als Pharmaka mit einer vielfältigen Anwendungsbasis hat (für Review siehe Elliot und Ross, 2001). Die Bedeutung von Proteasom-Inhibitoren als neues therapeutisches Prinzip hat in den vergangenen Jahren zunehmende Aufmerksamkeit erfahren, insbesondere bei der Behandlung von Krebs und entzündlichen Erkrankungen (für Review siehe Elliot und Ross, 2001). Die Firma "Millennium Inc." (Cambridge, MA, USA) entwickelte Proteasom-Inhibitoren für entzündungshemmende, immunmodulatorische und antineoplastische Therapien, insbesondere Borsäure-Derivate von Di-Peptiden und dabei insbesondere die Verbindung PS-341 (Adams et al., 1999).

Der Einsatz von Proteasom-Inhibitoren mit dem Ziel, virale Infektionen zu blockieren, wurde bereits beschrieben. Insbesondere wurde von Schubert et al. (2000 a, b) gezeigt, dass Proteasom-Inhibitoren die Assemblierung, Freisetzung und proteolytische Reifung von HIV-1 und HIV-2 blockieren. Dieser Effekt beruht auf einer spezifischen Blockade der proteolytischen Prozessierung der Gag-Polyproteine durch die HIV-Protease, ohne dass Proteasom-Inhibitoren die enzymatische Aktivität der viralen Protease selbst beeinflussen. Weitere Zusammenhänge mit dem UPS wurden für Budding von Rous Sarcoma Virus, RSV (Patnaik et al., 2000); Simian Immunodeficiency Virus, SIV (Strack et al., 2000), und Ebola-Virus (Harty et al., 2000) berichtet. Im letzteren Fall (Harty et al., 2000) wurde gezeigt, dass eine zelluläre Ubiquitin-Ligase mit Ebola-Matrixprotein in Wechselwirkung tritt.

1.5. Proteasom-Inhibitoren in der Patentliteratur

Proteasom-Inhibitoren und deren medizinische Verwendung sind Gegenstand zahlreicher Patente bzw. Patentanmeldungen. Im US-Patent 5,780,454 A (Adams et al.) werden Boronsäure- und -Esterverbindungen, deren Synthese und Verwendungen als Proteasom-Inhibitoren beschrieben. Als Mechanismus der Proteasom-Inhibierung wird die Inhibierung von NF-.kappa.B in einer Zelle angegeben.

Die internationale Patentanmeldung WO 98/10779 hat die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren zur Behandlung von Parasiten-Infektionen zum Gegenstand.

In der Druckschrift WO 99/15183 werden Proteasom-Inhibitoren zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten eingesetzt. Dabei geht es auch um die Rolle des UPS bei der NF&kgr;B-vermittelten Aktivierung des HIV-1 LTR-Promoters und um Transkriptionsprozesse im Zellkern, die aber für eine Replikation von HIV nicht essentiell sind. Es wird nicht gezeigt, dass Proteasom-Inhibitoren die Replikation von HIV blockieren können. Der NF&kgr;B-Pathway ist dazu sicher nicht geeignet.

Weitere medizinische Anwendungen sind die Behandlung fibriotischer Erkrankungen (US 2005/222043 A), die Verhinderung einer Transplantatabstoßung und eines septischen Schocks (EP 0967976 A), die Behandlung von Blutgefäßverengungen (WO02/060341 A) oder die Behandlung einer Endothel-Fehlfunktion (WO2004/012732 A).

Auch wird die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren bei einer kardiologischen Indikation erwähnt (DE 100 40 742 A).

Der Einsatz von Proteasom-Inhibitoren zur Behandlung viraler Infektionen ist Gegenstand der Patentanmeldung EP 1430903 A1 = US2004/0106539A1. Die Verwendung von Proteasom-Inhibitoren als Mittel zur Hemmung der Freisetzung, der Reifung und der Replikation von Retroviren wird beschrieben. Am Beispiel der Humanen Immundefizienzviren (HIV) wird gezeigt, dass Proteasom-Inhibitoren sowohl die Prozessierung der Gag-Proteine als auch die Freisetzung von Viruspartikeln sowie die Infektiosität der freigesetzten Viruspartikel und damit die Virusreplikation blockieren. Anwendungsgebiete sind die anti-retrovirale Therapie und Vorbeugung bei Infektionen mit Immundefizienz verursachenden Lentiviren bei Tieren und Menschen, insbesondere AIDS oder HIV-induzierte Demenz, auch in Kombination mit anderen anti-retroviralen Medikamenten.

In der Patentanmeldung EP 1326632 A1 werden Mittel zur Behandlung, Therapie und Hemmung von Hepatitis-Virusinfektionen und der damit im Zusammenhang stehenden Hepatopathogenese und Erkrankungen genannt. Die zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Hepatitisviren eingesetzten Mittel in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten als wirksame Komponente Substanzklassen, denen gemeinsam ist, dass sie das 26S Proteasom in Zellen inhibieren. Dazu gehören vor allem Proteasom-Inhibitoren, welche die Aktivitäten des Ubiquitin/Proteasom-Pathway beeinflussen, insbesondere die enzymatischen Aktivitäten des 26S und des 20S Proteasom-Komplexes. Die Anwendung der Erfindung liegt in der anti-viralen Therapie von Hepatitis-Infektionen, speziell in der Verhinderung der Etablierung sowie der Aufrechterhaltung einer akuten und chronischen HBV- und HCV-Infektion und damit assoziierter Leberkarzinome.

Auch werden Proteasom-Inhibitoren zur Behandlung, Therapie und Hemmung von Flaviviridae-Virusinfektionen (WO2003/084551 A1) eingesetzt. Die zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Flaviviridae eingesetzten Mittel in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten als wirksame Komponente Substanzklassen, denen gemeinsam ist, dass sie das 26S Proteasom in Zellen inhibieren.

Auch zur Behandlung von Virus-Infektionen, insbesondere von Infektionen mit SARS (severe acute respiratory syndrome) auslösenden Corona-Viren, wurden Proteasom-Inhibitoren vorgeschlagen (DE 103 61 945 A1).

Influenza-Viren wurden im Zusammenhang mit Proteasom-Inhibitoren noch nicht genannt.

Eine Bedeutung des Ubiquitin-Proteasome-Pathways für die Replikation von Influenzaviren oder gar eine Verwendung von Proteasom-Inhibitoren für die Prophylaxe und/oder die Behandlung von Infektionen mit Influenzaviren wurde bislang nicht gezeigt.

Zusammengefasst kann festgestellt werden, dass bei allen bisherigen Verwendungen von Proteasom-Inhibitoren deren Wirkung auf Influenzaviren und erst recht nicht deren therapeutischer Einsatz für die Behandlung einer Influenzavirus-Infektion beschrieben wurde. Ebenfalls wurde bislang nicht die Wirkung von Proteasom-Inhibitoren für die Behandlung einer Influenzavirus-Infektion erörtert. Weiterhin wurde bisher nicht getestet, ob Proteasom-Inhibitoren die Assemblierung und die Freisetzung von Influenzaviren blockieren. Ebenso wurde bislang keinerlei Zusammenhang zwischen Influenzavirus-Infektionen und dem UPS berichtet. Insofern ist ebenfalls sowohl die Verwendung von Inhibitoren zellulärerer Ubiquitin-Ligasen als auch von Ubiquitin-Hydrolasen vollkommen neuartig.

2. Das Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Mittel zur Verfügung zu stellen, die zur Behandlung von Infektionen mit Influenza-Viren geeignet sind, dabei insbesondere solche Substanzen, die eine antivirale Wirkung auf Influenzavirus-Infektionen in Tier und Menschen ausüben. Die Aufgabe wurde – gemäß den Merkmalen der Patentansprüche – durch den Einsatz von Inhibitoren des UPS gelöst. Insbesondere finden dabei sowohl Proteasom-Inhibitoren als auch Inhibitoren von Ubiquitin-Ligasen oder Ubiquitin-Hydrolasen Anwendung.

Es sind erfindungsgemäß Mittel zur Behandlung von Influenzavirus-Infektionen entwickelt worden, die als wirksame Komponenten sowohl Proteasom-Inhibitoren als auch Inhibitoren von Ubiquitin-Ligasen oder Ubiquitin-Hydrolasen in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten. Die erfindungsgemäßen neuartigen Mittel eignen sich zur Prophylaxe und/oder Therapie von Infektionen mit Influenza-Viren, insbesondere dem Influenza A Virus.

Das Wesen der Erfindung geht auch aus den Patentansprüchen hervor.

Weiterhin können die erfindungsgemäß verwendeten Mittel für die Prophylaxe und/oder der Behandlung, Therapie und Hemmung einer Infektion mit Orthomyxo-Viren verwendet werden. Es wird gezeigt, dass die Anwendungen dieser Mittel zur Hemmung der Infektionsausbreitung und damit der Krankheitsentwicklung in vivo, im Tiermodell führt. Diese Mittel können daher die Etablierung einer Infektion mit Influenzaviren im Tier und Menschen verhindern beziehungsweise eine bereits etablierte Infektion heilen.

Die Aufgabe wurde mit Hilfe von pharmazeutischen Zubereitungen gelöst, die zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Influenzaviren, insbesondere von IAV, geeignet sind.

Diese Zubereitungen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente mindestens einen Proteasom-Inhibitor enthalten. Weiterhin können diese Medikamente andere Komponenten des UPS enthalten. Dies betrifft Ubiquitin-Ligasen und/oder Ubiquitin-Hydrolasen, also Enzyme, welche die Ubiquitinylierung von Proteinen regulieren. Diese Aufgabe wurde also durch eine Kombination von Proteasom-Inhibitoren einerseits und durch Ubiquitin-Ligasen und/oder Ubiquitin-Hydrolasen andererseits gelöst. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden ebenfalls reine Proteasom-Inhibitoren eingesetzt, die sich durch eine hohe Membran-Permeabilität sowie eine hohe Spezifität für das 26S Proteasom der Wirtszelle auszeichnen.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung können speziell in IAV-infizierten Zellen anti-virale Wirkungen ausgelöst werden. Diese betreffen zum einen die Induktion der Apoptose in den Influenzavirus-infizierten Zellen und damit das bevorzugte Absterben von infizierten Zellen im Organismus. Gleichzeitig werden durch Inhibierung der Assemblierung und Reifung von Influenzaviren die Freisetzung und die Produktion von infektiösen Viruspartikeln gestört. In der Gesamtsumme dieser Wirkung kann eine therapeutische Wirkung durch Blockade der Virusreplikation und die Entfernung virusproduzierender Zellen im Organismus bewirkt werden.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sollen klassische Proteasom-Inhibitoren für die Bekämpfung von Infektionen mit Influenzaviren eingesetzt werden. Hierfür sollen vor allem Inhibitoren eingesetzt werden, die ausschließlich nur mit der katalytisch aktiven Hydroxyl-Threonin-Gruppe der Beta-Untereinheit des 26S Proteasoms interagieren und daher spezifisch nur das Proteasom blockieren. Ein weiterer wesentlicher Bestandteil und überraschender Effekt dieser Entwicklung ist die Beobachtung, dass die Blockade des UPS bevorzugt das Absterben (die Apoptose) Influenzavirus-infizierten Zellen induziert.

Die Aufgaben der Erfindung wurden durch den Einsatz von mindestens einem Proteasom-Inhibitor und/oder mindestens einem Inhibitor von Ubiquitin-Ligasen oder Ubiquitin-Hydrolasen gelöst. Es sind erfindungsgemäß Mittel zur Behandlung von Virus-Infektionen entwickelt worden, die als eine wirksame Komponente Inhibitoren des UPS in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten, so zur Hemmung von Influenzaviren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt, welche die Aktivitäten des UPS hemmen, regulieren oder anderweitig beeinflussen.

Es ist auch möglich, dass als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die speziell die enzymatischen Aktivitäten des kompletten 26S Proteasom-Komplexes und der freien, nicht mit regulatorischen Untereinheiten assemblierten 20S katalytisch aktiven Proteasom-Struktur beeinflussen. Diese Inhibitoren können entweder eine oder mehrere oder alle drei hauptsächlichen proteolytischen Aktivitäten des Proteasoms (die Trypsin-, die Chymotrypsin- und die Postglutamyl-Peptid hydrolysierenden Aktivitäten) innerhalb des 265- oder auch des 20S-Proteasom-Komplexes hemmen.

Eine Variante der Erfindung besteht darin, als Proteasom-Inhibitoren Substanzen einzusetzen, die von Zellen höherer Eukaryonten aufgenommen werden und nach Zellaufnahme mit der katalytischen beta-Untereinheit des 26S-Proteasoms in Wechselwirkung treten und dabei alle oder einzelne der proteolytischen Aktivitäten des Proteasom-Komplexes irreversibel oder reversibel blockieren.

Als eine weitere Form der Erfindung kommen Mittel zum Einsatz, welche die Aktivitäten der Ubiquitin-konjugierenden wie auch der Ubiquitin-hydrolysierenden Enzyme hemmen. Dazu gehören auch zelluläre Faktoren, die mit Ubiquitin – als Mono- oder auch als Poly-Ubiquitin – in Wechselwirkung treten. Poly-Ubiquitinylierung gilt allgemein als ein Erkennungssignal für die Proteolyse durch das 26S-Proteasom, und die Beeinflussung des Ubiquitinylierungs-Pathway kann ebenfalls die Aktivität des Proteasoms regulieren.

Erfindungsgemäß werden als Proteasom-Inhibitoren auch Substanzen eingesetzt, die in verschiedenen Formen in vivo oral in verkapselter Form mit oder ohne Zellspezifitättragende Veränderungen, intravenös, intramuskulär, subkutan, durch Inhalation in Aerosol-Form, oder anderweitig verabreicht werden, aufgrund der Anwendung eines bestimmten Applikations- und Dosis-Regimes eine geringe Zytotoxizität und/oder hohe Selektivität für bestimmte Zellen und Organe aufweisen, keine oder unbedeutende Nebenwirkungen auslösen, eine relativ hohe metabolische Halbwertszeit und eine relativ geringe Clearence-Rate im Organismus aufweisen.

Als Proteasom-Inhibitoren werden des weiteren Substanzen eingesetzt, die in natürlicher Form aus Mikroorganismen oder anderen natürlichen Quellen isoliert werden, durch chemische Modifikationen aus natürlichen Substanzen hervorgehen oder totalsynthetisch hergestellt werden oder durch gentherapeutische Verfahren in vivo synthetisiert oder durch gentechnische Verfahren in vitro oder in Mikroorganismen hergestellt werden.

Dazu gehören

  • a) natürlich vorkommende Proteasom-Inhibitoren:

    – Epoxomicin (Epoxomycin) und Eponemycin,

    – Aclacinomycin A (auch bezeichnet als Aclarubicin),

    – Lactacystin und dessen chemisch modifizierte Varianten, insbesondere die Zellmembranpenetrierende Variante "Clastolactacystein beta-Lacton",
  • b) synthetisch hergestellte:

    – modifizierte Peptidaldehyde wie zum Beispiel N-carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal (auch bezeichnet als MG132 oder zLLL), dessen Borsäure-Derivat MG232; N-carbobenzoxy-Leu-Leu-Nva-H (bezeichnet als MG115); N-Acetyl-L-Leuzinyl-L-Leuzinyl-L-Norleuzinal (bezeichnet als LLnL); N-carbobenzoxy-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H (auch bezeichnet als PSI);

    – Peptide, die C-terminal Epoxyketone (auch bezeichnet als Epoxomicin/Epoxomycin oder Eponemycin), Vinyl-sulphone (zum Beispiel Carbobenzoxy-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucinvinyl-sulfon oder 4-Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylactetyl-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucinvinyl-sulfon, auch bezeichnet als NLVS), Glyoxal- oder Borsäure-Reste (zum Beispiel Pyrazyl-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutyl)B(OH)2), auch bezeichnet als "PS-431" oder Benzoyl(Bz)-Phe-boroLeu, Phenacetyl-Leu-Leu-boroLeu, Cbz-Phe-boroLeu); Pinacol-Ester – zum Beispiel Benzyloxycarbonyl (Cbz)-Leu-Leu-boroLeu-Pinacol-Ester – tragen;

    – und

    – als besonders geeignete Verbindungen werden Peptide und Peptid-Derivate eingesetzt, die C-terminal Epoxyketon-Strukturen tragen; hierzu zählen beispielsweise Epoxomicin (Molekülformel: C28H86N4O7) und Eponemycin (Molekülformel: C20H36N2O5);

    – bestimmte Dipeptidyl-Borsäure-Derivate, insbesondere die Verbindung PS-296 (8-Quinolylsulfonyl-CONH-(CH-Naphthyl)-CONH(-CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-303 (NH2(CH-Naphtyl)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-321 (Morpholin-CONH-(CH-Naphthyl)-CONH-(CH-Phenylalanin)-B(OH)2); die Verbindung PS-334 (CH3-NH-(CH-Naphthyl-CONH-(CH-Isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-325 (2-Quinol-CONH-(CH-homo-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2); die Verbindung PS-352 (Phenyalanin-CH2-CH2-CONH-(CH-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)1-B(OH)2); die Verbindung PS-383 (Pyridyl-CONH-(CHpF-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2. Hierzu zählen alle Verbindungen, die bereits in Adams et al. (1999) beschrieben wurden. Als besonders geeignete Verbindungen haben sich, neben Epoxomicin und Eponemycin, Peptidyl-Borsäurederivate erwiesen. Diese Proteasom-Inhibitoren sind sehr potent, sehr spezifisch für das Proteasom, blockieren keine anderen zellulären Proteasen und haben daher so gut wie keine Nebenwirkungen.

Mit den Proteasom-Inhibitoren werden erfindungsgemäß Mittel zur Verfügung gestellt, die überraschenderweise

  • – durch die Blockierung der Replikation von Influenzaviren die Produktion von infektiösen Nachkommen-Viren beeinträchtigen und damit die Ausbreitung eine Influenzavirus-Infektion im Organismus verhindern;
  • – die Freisetzung von infektiösen Influenza-Viren aus infizierten Zellen blockieren;
  • – die Ausbreitung einer akuten Influenzavires-Infektion begrenzen;
  • – die Virämie sowohl bei einer Neuinfektion als auch bei wiederkehrenden RE-Infektionen mit Influenzaviren unterdrücken und den Erfolg einer Viruseliminierung durch das eigene Immunsystem und/oder durch bekannte Mittel mit ähnlicher oder anderer Wirkung erhöhen.

Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Die Erfindung liegt auch in einem kombinierten Einsatz von bekannten und neuen Elementen – Proteasom-Inhibitoren und Ub-Ligasen einerseits sowie Ub-Hydrolasen andererseits.

Erfindungsgemäß finden die Proteasom-Inhibitoren Verwendung

  • – bei der Behandlung von grippalen Infekten und verwandten Erkrankungen von Mensch und Tier, die durch Influenzaviren und verwandte Negativstrang-RNA Viren verursacht werden,
  • – als Mittel zur Beeinflussung, Hemmung oder Regulierung des Ubiquitin/Proteasom-Pathway
  • – als Mittel zur Beeinflussung der enzymatischen Aktivitäten des kompletten 26S Proteasom-Komplexes und der freien, nicht mit regulatorischen Untereinheiten assemblierten 20S katalytisch aktiven Proteasom-Struktur
  • – zur Induktion der Apoptose von Influenzavirus-infizierten Zellen
  • – zur Induktion der Apoptose speziell in Influenzavirus-infizierten Zellen.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Inhibitoren des UPS finden ferner Verwendung

  • – zur Verhinderung des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus von bereits infizierten Personen;
  • – zur Prophylaxe der Etablierung einer systemischen Influenza-Infektion unmittelbar nach Kontakt mit infektiösen biologischen Proben, infizierten Personen oder deren näherer Umgebung.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Inhibitoren des UPS können sowohl systemisch als auch topisch, vorzugsweise die aerogen verabreicht werden. Die erfindungsgemäße eingesetzte Wirksubstanz eines Proteasominhibitors kann mit mindestens einer weiteren antiviral wirksamen Substanz zur Prophylaxe und/oder Therapie von Influenzavirus-Infektionen eingesetzt werden.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1:

Ein pharmakologischer Inhibitor des Proteasoms interferiert mit der Influenza Virus aktivierten Induktion NF-kappaB abhängiger proapoptotischer Gene und inhibitiert effizient die Influenza Virus Vermehrung in vitro und in vivo.

Es ist bekannt, dass Influenza Viren die Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-kappaB benötigen, um sich effizient zu vermehren. Der zugrundeliegende Mechanismus umfasst u.a. die NF-kappaB induzierte Hochregulation proapototischer Faktoren wie des Rezeptors Fas/CD95 oder der Apoptose-induzierenden Liganden FasL/CD95L und TRAIL (Wurzer et al. J Biol Chem. 279, 30931-7, 2004). Die klassische Virus-induzierte Aktivierung von NF-kappaB erfordert zwingend den proteasomalen Abbau des Inhibitors von NF-kappaB, IkappaB. Um zu untersuchen ob Proteasomen Inhibitoren über diesen Mechanismus eine negative Wirkung auf die Vermehrung von Influenza Viren haben wurde die humane Lungenepithelzellinie A549 infiziert mit dem hoch-pathogenen aviären Influenza A Virus A/FPV/Bratislava/79 (Multiplizität der Infektion = 1) in der an oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen des Proteasomen Inhibitors MG132 (1, 5, 10&mgr;M). Im Falle der Anwesenheit des Inhibitors wurden die Zellen 30 Minuten vor Infektion mit der Substanz vorinkubiert. 24h nach Infektion wurden die Zellüberstände auf den Gehalt an infektiösen Nachkommenviren in Plaque Assays untersucht. Im Ergebnis zeigt sich in Anwesenheit von MG132 eine Konzentrationsabhängige bis zu 10-fache Reduktion der Virustiter.

Um zu untersuchen ob die Reduktion der Virustiter mit einer verminderten Expression der proapoptotischen Liganden TRAIL und FasL/CD95L einhergeht, wurde die A549 Lungenepithelzellline wie beschrieben mit dem aviären Influenza A Virus A/FPV/Bratislava/79 (Multiplizität der Infektion = 1) in der an oder Abwesenheit des Proteasomen Inhibitors MG132 (10&mgr;M) infiziert. Etwa 24h nach Infektion wurden die Zellen fixiert mit 4% Paraformaldehyd und mit spezifischen Antikörpern gegen TRAIL and FasL/CD95L inkubiert. Nach Kopplung der Antikörper mit einem Fluoreszenzfarbstoff wurden die Zellen einer Durchflusszytometrischen Analyse (FACS) unterzogen um die Expression der proapoptotischen Faktoren zu messen. Im Ergebnis zeigen die FACS Profile eine deutlich verringerte virus-induzierte Expression von FasL und TRAIL in Anwesenheit von MG132.

Um die antivirale Aktivität von MG132 in einem in vivo Infektionsmodell in der Maus zu prüfen wurden C57B1/6 Mäuse (10 Wochen alt, Eigenzucht BFAV Tübingen) mit 104 infektiösen Einheiten des mausadaptierten hoch-pathogenen aviären Influenza A Virus A/FPV/Bratislava/79 intranasal infiziert und unbehandelt belassen (n = 14) bzw. in einem Isolierkäfig für 5 Tage täglich mit 2ml eines vernebelten Aerosols von 1mM MG132 behandelt (n = 8). Die Behandlung erfolgte einmal täglich, angefangen 1h vor der Infektion am Tag 1. Die Mäuse wurden täglich gewogen und die Überlebensrate wurde bestimmt.

Im Ergebnis zeigte sich eine insgesamt signifikant erhöhte Überlebensrate der infizierten und MG132 behandelten Mäuse im vergleich zu den unbehandelten Kontrolltieren.

Beispiel 2: Inhibition der Replikation von IAV in Zellkultur durch Proteasom-Inhibitoren Beispiel 3: Inhibition der Freisetzung von infektiösen Nachkommenviren aus IAV infizierten Zellen durch Proteasom-Inhibitoren Beispiel 3: Material und Methoden Legende zu den Figuren

1: A549 Zellen wurden mit FPV (MOI = 1) in der Gegenwart von MG132 (10&mgr;M) infiziert. 24h p.i. wurden die überstände gesammelt und der Titer mittels Plaque assay bestimmt.

2: A549 mit FPV (MOI = 1) infiziert und mit MG132 (10&mgr;M) im Medium inkubiert. 24h p.i. wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd fixiert und die anti-TRAIL und anti-CD95L gefärbt.

3: Überlebenskurve von FPV infizierten Mäusen. C57B1/6 Mäuse wurden FPV infiziert, (104 pfu, intranasal), wurden mit MG132 (n = 8) (solid line) behandelt durch Käfiginhalation, oder erhielten keine Behandlung (n = 14) (dotted line). Für die Käfig-Behandlung wurden die Tiere mit Aerosol von 2ml einee 1mM MG132 (Sigma) für 5 Tage behandelt. Die Behandlung wurde täglich durchgeführt, und begann eine Stunde vpr der initialen Infektion. for 5 days. Treatment. Zur Kontrolle wurde das Gewicht der Tiere täglich bestimmt.

Abkürzungsverzeichnis

DNA
desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
kDa
Kilodalton (Maß für Molekulargewicht)
Ki
inhibitorische Konstante
LC
Lactacystin
MDa
Mega Dalton
MHC
Major Histocompatibility Complex
MTT
NLVS
Proteasom-Inhibitor z-Leuzinyl-Leuzinyl-Leuzinyl-vinylsulfon (NLVS)
PGPH
Postglutamyl-Peptid hydrolysierende
PI
Proteasom-Inhibitor
PCR
polymerase chain reaction
RPMI
RNA
Ribonucleinsäure (ribonucleic acid)
RSV
Rous Sarcoma Virus
RT
reverse Transkriptase
Ub
Ubiquitin
UPS
Ubiquitin/Proteasom-System
Vero-Zellen
humane permanente transformierte Zellen der Linie VERO
Vpr
HIV-1 Protein Vpr
zLLL
Tripeptidaldehyd N-carbobenzoxyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal

Literatur

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Anspruch[de]
Mittel zur Behandlung von Infektionen mit Orthomyxoviridae, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente mindestens einen Proteasom-Inhibitor und 1 oder mindestens einen Inhibitor des Ubiquitin-Proteasom-Pathways (UPS) in pharmazeutischen Zubereitungen enthalten. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie als UPS-Inhibitoren Inhibitoren des Proteasoms und/oder von Ubiquitin-Ligasen und/oder Ubiquitin-Hydrolasen enthalten. Verwendung der Mittel nach Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung von Infektionen mit Influenzaviren. Verwendung nach Anspruch 3 zur

4.1. Behandlung von Virus-Infektionen

4.2. Beeinflussung, Hemmung, Regulierung oder Blockierung des Ubiquitin/Proteasom-Pathway in der Zielzelle

4.3. Verhinderung der Ausbreitung von Virusinfektionen im Organismus

4.4. Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Influenzaviren

4.5. Induktion der Apoptose von Influenzavirus-infizierten Zellen.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzung, Reifung und Replikation von Influenzaviren gehemmt werden. Verwendung nach Anspruch 3 bis 5 zur Bekämpfung/Behandlung von Grippe und verwandten Erkrankungen, speziell pandemische und endemische Influenza-Ausbrüche bei Mensch und Tier. Verwendung nach Anspruch 6 in Kombination mit anderen, bereits bekannte anti-viralen Medikamenten, wie zum Beispiel Ripavarin, Interleukinen, Nukleosid-Analoga, Protease-Inhibitoren, Hemmern von viralen Kinasen, Hemmern von Membranfusionen und des Viruseintritts, speziell von Hemmern von Kompnenten von Influenzaviren, wie zum Beispiel der Nueraminidase oder des M2 Ionenkanalporteins von IAV. Verwendung nach Anspruch 6 und 7 zur Verhinderung des Krankheitsausbruches und zur Reduzierung der Infektionsausbreitung im Organismus von akut in Influenzaviren infizierten Menschen und Tieren. Verwendung nach Anspruch 6 bis 8 zur Blockierung des Ubiquitin/Proteasom-Pathway in bestimmten Targetzellen, wobei die Targetzellen von Inlfuenzaviren befallene Wirtszellen sind. Verwendung nach Anspruch 6 bis 9 zur Beeinflussung von Zielzellen in ihren zellulären Mechanismen: Zellteilung, Zellzyklus, Zelldifferenzierung, Zelltod (Apoptose), Zellaktivierung, Signaltransduktion oder Antigenprozessierung, speziell NF-KB Aktivierung. Verwendung nach Anspruch 3 zur Herstellung von Mitteln zur Hemmung der Freisetzung, Reifung und Replikation von Influenzaviren, dadurch gekennzeichnet, dass sie als wirksame Komponente mindestens einen Proteasom-Inhibitor und/oder mindestens einen Inhibitor von Ubiquitin-Ligasen und/oder Ubiquitin-Hydrolasen in einer pharmazeutischen Zubereitung enthalten. Verwendung nach Anspruch 11 zur Behandlung von grippalen Infekten, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die als Proteasom-Inhibitoren von Zellen höherer Eukaryoten aufgenommen werden und nach Zellaufnahme mit den katalytischen Untereinheiten des Proteasoms in Wechselwirkung treten und dabei alle oder einzelne der proteolytischen Aktivitäten des Proteasoms – die Trypsin-, die Chymotrypsin- und die Postglutamyl-Peptid hydrolysierenden Aktivitäten – innerhalb des 26S oder auch des 20S Proteasom-Komplexes irreversibel oder reversibel blockieren. Verwendung nach Anspruch 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutischen Zubereitungen neben Proteasom-Inhibitoren auch andere Mittel enthalten, die das zelluläre Ubiquitin-System beeinflussen, regulieren oder hemmen, wie die Aktivitäten

13.1. der Ubiquitin-konjugierenden Enzyme und/oder

13.2. der Ubiquitin-hydrolysierenden Enzyme

13.3. von zellulären Faktoren, die mit Ubiquitin in Wechselwirkung treten

13.4. von zellulären Faktoren, die mit Ubiquitin als

13.4.1. Mono-Ubiquitin oder als

13.4.2. Poly-Ubiquitin

in Wechselwirkung treten.
Verwendung nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die in verschiedenen Formen in vivo oral in verkapselter Form mit oder ohne Zellspezifität-tragende Veränderungen, intravenös, intramuskulär, subkutan, durch Inhalation in Aerosol-Form, oder anderweitig verabreicht werden, aufgrund der Anwendung eines bestimmtes Applikations- und/oder Dosis-Regimes eine geringe Zytotoxizität aufweisen, keine oder unbedeutende Nebenwirkungen auslösen, eine relative hohe metabolische Halbwertszeit und eine relative geringe Clearence-Rate im Organismus aufweisen. Verwendung nach Anspruch 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die

a) in natürlicher Form aus Mikroorganismen oder anderen natürlichen Quellen isoliert werden oder

b) durch chemische Modifikationen aus natürlichen Substanzen hervorgehen

c) total-synthetisch hergestellt werden

d) durch gentherapeutische Verfahren in vivo synthetisiert werden

e) durch gentechnische Verfahren in vitro oder

f) in Mikroorganismen hergestellt werden.
Verwendung nach Anspruch 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Proteasom-Inhibitoren Substanzen eingesetzt werden, die folgenden Substanzklassen angehören:

a) natürlich vorkommende Proteasom-Inhibitoren:

– Peptid-Derivate, welche C-terminal Epoxyketon-Strukturen enthalten

– &bgr;-Lacton-Derivate

– Aclacinomycin A (auch bezeichnet als Aclarubicin),

– Lactacystin und dessen chemische modifizierte Varianten, wie der Zellmembranpenetrierenden Variante "Clastolactacystein ⎕-Lacton"

b) synthetisch hergestellte Proteasom-Inhibitoren:

– modifizierte Peptidaldehyde wie N-carbobenzoxy-L-leucinyl-L-leucinyl-L-leucinal (auch bezeichnet als MG132 oder zLLL), dessen Borsäure-Derivat MG232; N-Carbobenzoxy-Leu-Leu-Nva-H (bezeichnet als MG115; N-Acetyl-L-Leuzinyl-L-Leuzinyl-L-Norleuzinal (bezeichnet als LLnL), N-Carbobenzoxy-Ile-Glu(OBut)-Ala-Carbobenzoxy-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H (auch bezeichnet als PSI);

c) Peptide, welche C-terminal eine &agr;,&bgr;-Epoxyketon-Struktur tragen, ferner Vinyl-sulfone wie

c1) Carbobenzoxy-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucin-vinyl-sulfon oder

c2) 4-Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylactetyl-L-Leucinyl-L-Leucinyl-L-Leucinvinyl-sulfon (NLVS)

d) Glyoxal- oder Borsäure-Reste wie

d1) Pyrazyl-CONH(CHPhe)CONH(CHisobutyl)B(OH)2) sowie

d2) Dipeptidyl-Borsäure-Derivate

oder

e) Pinacol-Ester- wie Benzyloxycarbonyl(Cbz)-Leu-Leu-boroLeu-Pinacol-Ester.
Verwendung nach Anspruch 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass als besonders geeignete Proteasom-Inhibitoren die Epoxyketone

17.1. Epoxomicin (Epoxomycin, Molekülformel: C28H86N4O7) und/oder

17.2. Eponemycin (Eponemicin, Molekülformel: C20H36N2O5)

eingesetzt werden.
Verwendung nach Anspruch 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass als besonders geeignete Proteasom-Inhibitoren aus der PS-Serie die Verbindungen

18.1. PS-519 als &bgr;-Lacton- sowie als Lactacystin-Derivat die Verbindung 1R-[1S, 4R, 5S]]-1-(1-Hydroxy-2-methylpropyl)-4-propyl-6-oxa-2-azabicyclo[3.2.0]heptane-3,7-dione – Molekülformel C12H19NO4

18.2. PS-303 (NH2(CH-Naphthyl)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2) und/oder

18.3. PS-321 als (Morpholin-CONH-(CH-Napthyl)-CONH-(CH-Phenylalanin)-B(OH)2); – und/oder

18.4. PS-334 (CH3-NH-(CH-Naphthyl-CONH-(CH-Isobutyl)-B(OH)2) und/oder

18.5. die Verbindung PS-325 (2-Quinol-CONH-(CH-homo-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2) und/oder

18.6. PS-352 (Phenyalanin-CH2-CH2-CONH-(CH-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)1-B(OH)2) und/oder

18.7. PS-383 (Pyridyl-CONH-(CHpF-Phenylalanin)-CONH-(CH-isobutyl)-B(OH)2) eingesetzt werden.
Verwendung nach Anspruch 11 als Mittel zur Beeinflussung der enzymatischen Aktivitäten des kompletten 26S Proteasom-Komplexes und der freien, nicht mit regulatorischen Untereinheiten assemblierten 20S katalytisch aktiven Proteasom-Struktur. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 19 für eine systemische als auch die topische, bevorzugt die aerogene Verabreichung von UPS-Inhibitoren.






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