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Dokumentenidentifikation DE60031374T2 30.08.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001155119
Titel VIRUSIMPFSTOFF CHARAKTERISIERT DURCH EINE BHV-1-GENDELETION
Anmelder Kansas State University Research Foundation, Manhattan, Kan., US
Erfinder CHOWDHURY, I., Shafiqul, Manhattan, KS 66502, US
Vertreter Uexküll & Stolberg, 22607 Hamburg
DE-Aktenzeichen 60031374
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 18.01.2000
EP-Aktenzeichen 009043852
WO-Anmeldetag 18.01.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/US00/01085
WO-Veröffentlichungsnummer 2000044884
WO-Veröffentlichungsdatum 03.08.2000
EP-Offenlegungsdatum 21.11.2001
EP date of grant 18.10.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 30.08.2007
IPC-Hauptklasse A61K 39/265(2006.01)A, F, I, 20060206, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12Q 1/70(2006.01)A, L, I, 20060206, B, H, EP   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG 1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich umfassend mit rekombinanten bovinen Herpesvirusvakzinen und entsprechenden Verfahren. Insbesondere beschäftigt sich die vorliegende Erfindung bevorzugt mit der Konstruktion eines infektiösen rekombinanten bovinen Herpesvirus Typ 1 (BHV-1), bei dem ein Teil der nativen für Glykoprotein E (gE) kodierenden Region entfernt ist und ein funktionelles &bgr;-Galaktosidase Gen (&bgr;-gal) dort in den gE-locus eingefügt ist. Die Deletion der nativen für gE kodierenden Region attenuiert das Virus und dient als ein genotypischer oder immunologischer Marker, welcher Infektion mit einem gE-deletierten rekombinanten Virus von Infektion mit einem Wildtyp-Virus unterscheidet. Zusätzlich stellt die Einfügung des &bgr;-gal Gens ein phänotypisches Verfahren des Testens auf die Anwesenheit einer Infektion mit gE-deletiertem rekombinanten Virus durch Expression von &bgr;-gal Aktivität in Wirtszellen zur Verfügung.

2. Beschreibung des Stands der Technik

Bovines Herpesvirus Typ 1 (BHV-1), welches auch als Infektiöses Bovines Rhinotracheitisvirus (IBRV) bekannt ist, ist mit einer Vielzahl klinischer Erkrankungen assoziiert, einschließlich Rhinotracheitis, Konjunktivitis, Genitalinfektionen und gelegentlich Fehlgeburt, Enteritis, Enzephalitis und generalisierte systemische Infektionen bei Rindern. Das Genom von BHV-1 besteht aus einem linearen dsDNA-Molekül von etwa 140 kb. Es ist aus einer einzigartigen langen (UL)-Region und einer einzigartigen kurzen (US)-Region zusammengesetzt, die von internen und terminalen umgekehrten Wiederholungssequenzen (inverted repeat sequences, jeweils IR und TR) flankiert sind. Das BHV-1-Genom kodiert für etwa 70 Proteine (Misra et al., Proteins Specified Bovine Herpesvirus 1 (Infectious Bovine Rhinotracheitis, 40 J. Virol. 367-378 (1981)). Wie bei mehreren anderen Tierherpesviren kodiert das BHV-1-Genom für das Glykoprotein (g) gE Gen. Die BHV-1 gE Gensequenz, welche für 575 Aminosäure (AS) -Reste kodiert, wurde für zwei verschiedene Stämme beschrieben (Leung-Taek, P. et al., Complete DNA Sequence and the Genetic Organization of the Short Unique Region (US) of the Bovine Herpesvirus Type 1 Strain (ST strain), 199 Virology 409-421 (1994); Rebordosa, X. et al., Maping, Cloning and Sequencing of a Glycoprotein – Encoding Gene From Bovine Herpesvirus Type 1 Homologous to the gE Gene From HSV-1, 149 Gene 203-209 (1994)). Die vorhergesagten gE Aminosäuren enthalten am N-Terminus (putative Signalsequenz) und nahe dem C-Terminus (Transmembran-Sequenz) Abschnitte hydrophober Aminosäuren, was typisch für integrale Membranproteine der Klasse I ist. Für BHV-1 gE und seine Homologen in anderen Herpesviren würde gezeigt, dass sie für in vitro-Replikation verzichtbar sind, Deletion der vollständige gE-kodierenden Sequenz des Pseudorabiesvirus (PRV) Genoms ist aber sowohl verantwortlich für die verringerte Virulenz der Lebendimpfstoff-Stämme Norden und Bartha (Prtrovskis, E.A. et al., Deletion in Vaccine Strains of Pseudorabies Virus and Their Effect on Synthesis of Glycoprotein gp 63, 60 J. Virol. 1166-1169 (1986), als auch die Veränderung der Neuroinvasivität (Card, J.P. et al., Pseudorabies Virus Envelope Glycoprotein gI Influences Both Neurotropism and Virulence During Infection of the Rat Visual System, 66 J. Virol. 3032-3041 (1992)). Damit ist die Expression des gE Gens für das volle pathogene Potential der Viren in Tieren notwendig, jedoch ist sie nicht für das Wachstum in Gewebekultur notwendig (Kritas et al., Invasion and Spread of Single Glycoprotein Deleted Mutants of Aujeszky's Disease Virus (ADV) in the Trigeminal Nervous Pathway of Pigs After Intranasal Inoculation, 50 Vet. Microbiol. 323-334 (1994); Kritas et al., Role of Envelope Glycoproteins gI, gp63 and gIII in the Invasion and Spread of Aujeszky's Disease Virus in the Olfactory Nervous Pathway of rus in the Olfactory Nervous Pathway of the Pig, 75 J. General Virol. 2319-2327 (1994)). US 5 789 177 und EP 0 668 356 offenbaren BHV-1 mit deletiertem gE Gen.

Vor kurzem wurden Mutanten von PRV und IBR mit deletiertem gE Gen in Bezug auf ihre Nützlichkeit als Impfstoffe mit differentiellen Markern interessant. Im Moment wird ein gE-deletierter Markerimpfstoff für die Ausrottung von IBR in Europa verwendet. Diesem gE-deletierten Impfstoffstamm in Europa fehlt jedoch ein &bgr;-gal Marker, welcher in situ histochemische Detektionsverfahren zur Detektion von &bgr;-gal Enzymaktivität und in situ histochemische Verfahren oder Immunoblot-Verfahren zur Detektion von &bgr;-gal Protein erlaubt. Die kodierende Region von &bgr;-gal dient auch als genotypischer Marker des rekombinanten Virus. Das Virus kann leicht durch Southern Blot Hybridisierung nachgewiesen werden, und auch PCR-Tests können die genetische Reinheit des Impfstoffvirus gegenüber dem Wildtyp bestimmen. Daher wird ein avirulenter gE-deletierter IBRV-Stamm benötigt, welcher einen geeigneten phänotypischen/histochemischen/genotypischen &bgr;-gal Marker enthält.

US 5 599 544 beschreibt BHV-I Mutanten mit Deletionen in den US2, gG und gE-Regionen. In einer gG Deletion würde ein &bgr;-Galaktosidase-Gen als Marker eingefügt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein attenuiertes rekombinantes bovines Herpesvirus Typ I Virus, welches ein bovines Herpesvirus Typ I umfasst, bei dem ein Teil einer nativen für Glykoprotein E kodierenden Region entfernt und mit einem genetischen Insert ersetzt ist, wobei der entfernte Teil etwa zwei Drittel der nativen für Glykoprotein E kodierenden Region umfasst, wobei das Insert die kodierende Region eines fremden &bgr;-Galaktosidase-Gens und humanen Cytomegalovirus Immediate Early Promotor umfasst, wobei das rekombinante Virus in einer Wirtszelle &bgr;-Galaktosidase exprimiert. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf einen Impfstoff, der bei der Induzierung von neutralisierenden Antikörpern gegen bovines Herpesvirus Typ I wirksam ist, welcher das rekombinante Virus umfasst, und auf ein Verfahren zur Identifizierung von Tieren, die mit dem rekombinanten Virus-Impfstoff infiziert sind, Schritte umfassend, bei denen man

  • a) eine Flüssigkeitsprobe von einem Tier analysiert;
  • (b) den rekombinanten Virus-Impfstoff in der Probe detektiert; und
  • (c) basierend auf dieser Detektion das Tier als infiziert identifiziert.

Weiterhin ist die Verwendung des rekombinanten bovinen Herpesvirus der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Impfstoffs zur Immunisierung von Rindern gegen bovinen Herpesvirus Typ I eingeschlossen.

Es wurde ein rekombinantes BHV-1 Virus (gE&Dgr;3.1IBR&bgr;) konstruiert, in dem offene Leserahmen (open reading frames, ORF's) von gE, welche einen Teil der für das gE Gen kodierenden Sequenzen umfassen, deletiert, und anstelle dessen ein chimäres Reporter/Marker-Gen eingefügt wurden. Das eingefügte &bgr;-Galaktosidase (&bgr;-gal) Gen spielt keine regulatorische Rolle bei der Replikation des Virus, dient aber als phänotypischer Marker für gE&Dgr;3.1IBR&bgr; Virus.

Um dieses rekombinante BHV-1 herzustellen, wurden die für das gE Gen kodierende Region von BHV-1 und die flankierenden, oberhalb und unterhalb befindlichen Sequenzen kloniert. Um eine Deletion in der für das gE Gen kodierenden Region herzustellen, wurde die obige, klonierte DNA mit geeigneten Enzymen verdaut, um die aminoterminalen zwei Drittel dieser Region freizusetzen, und mit dem &bgr;-gal Gen ligiert. Die erhaltene Plasmid-DNA wurde mit DNA aus Wildtyp IBR ganzer Länge, Virusstamm Cooper, in MDBK Zellen co-transfiziert. Rekombinante Viren, welche &bgr;-gal exprimierten (blaue Plaques) wurden aus den Plaques aufgereinigt und in Bezug auf genetischer Charakterisierung weiter durch Blot-Hybridisierung und in Bezug auf Reaktivität mit BHV-1 gE-Peptid-spezifischem polyklonalen Kaninchen-Antikörper durch Immunoblot getestet. Ein rekombinantes Virus, gE&Dgr;3.lIBR&bgr;, wurde in vitro in Bezug auf seine Wachstumseigenschaften und in vivo in Kälbern auf seine pathogenen Eigenschaften charakterisiert. Die Fähigkeit des rekombinanten Virus, in infizierten Kälbern BHV-1 neutralisierende Antikörper zu induzieren, wurde durch Plaque-Reduktionstests untersucht.

Die Regulation und Expression des chimären &bgr;-gal Gens sind auf zwei Arten für dieses rekombinante BHV-1 Virus wichtig. Der erste wichtige Aspekt des rekombinanten Virus ist, dass das &bgr;-gal Gen von einem starken humanen Cytomegalovirus Immediate Early (HCMV-IE) Promotor reguliert wird (nicht einer von BHV-1 abgeleiteten regulatorischen Sequenz). Der zweite wichtige Aspekt ist, dass das Gen sowohl in frühen als auch späten Phasen der Infektion als ein von BHV-1 kodiertes Gen exprimiert wird. Die in vitro- und in vivo-Eigenschaften dieses gE-deletierten rekombinanten Virus wurden durch Vergleich mit dem Eltern-IBRV-Stamm Cooper analysiert.

In Gewebekulturexperimenten wuchs gE&Dgr;3.1IBR&bgr;-Virus zu frühen Zeiten nach der Infektion bis zu einem geringeren Titer als der Wildtyp (Elternstamm Cooper), zu späten Zeiten nach der Infektion wuchs das rekombinante Virus aber bis zu fast gleichen Titern wie der Wildtypstamm. Das rekombinante Virus entwickelte normalerweise im Vergleich zu dem Eltern-Wildtypstamm Cooper signifikant kleinere Plaques. Dies könnte an dem Mangel von Ausbreitung des Virus von Zelle zu Zelle liegen, und stimmt mit den Ergebnissen für andere Herpesviren überein.

In Tierexperimenten gaben mit gE&Dgr;3.1IBR&bgr; infizierte Kälber während der Dauer der Virusabgabe im Vergleich zu mit dem E1-ternstamm Cooper infizierten Kälbern etwa 100-fach weniger Virus ab. Die Dauer dieser Virusabgabe war bei mit gE&Dgr;3.1IBR&bgr; infizierten Kälbern auch 2 Tage kürzer. Während die mit gE&Dgr;3.1IBR&bgr; Virus infizierten Kälber gesund blieben, zeigten die mit dem Elternstamm Cooper infizierten Kälber typische IBR-Symptome und -Läsionen. Ergebnisse der Serumneutralisierung wiesen darauf hin, dass sowohl in mit dem Wildtyp und dem gE-deletierten IBRV infizierten Kälbern vergleichbare BHV-1 neutralisierende Antikörper induziert wurden. Es wurde bereits berichtet, dass IBRV, in dem das Thymidinkinase (TK) Gen deletiert war, sowohl in vitro als auch in vivo mit einem signifikant geringeren Titer wuchs (Chowdhury, S.I., Construction and Characterization of an Attenuated Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) Recombinant Virus, 52 Vet. Microbiol. 13-23 (1996). Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass, obwohl das rekombinante gE&Dgr;3.1IBR&bgr;-Virus im Vergleich mit dem TK-deletierten IBR relativ gut wächst, das gE&Dgr;3.1IBR&bgr;-Virus für die Kälber nahezu avirulent war. Die von dem rekombinanten gE&Dgr;3.1IBR&bgr;-Virus aufgewiesenen attenuierten Eigenschaften glichen denen, die gezeigt wurden von: 1) Deletion von TK in BHV-1 wie gezeigt von Chowdhury, S.I., Construction and Characterization of an Attenuated Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) Recombinant Virus, 52 Vet. Microbiol. 13-23 (1996); 2) Deletion von gE in PRV, wie gezeigt von Kritas et al., Invasion and Spread of Single Glycoprotein Deleted Mutants of Aujeszky's Disease Virus (ADV) in the Trigeminal Nervous Pathway of Pigs After Intranasal Inoculation, 50 Vet. Microbiol. 323-334 (1994) und Kritas et al., Role of Envelope Glycoproteins gI, gp63 and gIII in the Invasion and Spread of Aujeszky's Disease Virus in the Olfactory Nervous Pathway of the Pig (75 J. General Virol. 2319-2327 (1994)), und 3) Europäischem gE-deletierten IBRV Vakzin-Isolat, wie gezeigt von Kaashoek et al., in, An Inactivated Vaccine Based on a Glycoprotein E-Negative Strain of Bovine Herpesvirus 1 Induces Prospective Immunity and Allows Serological Differentiation (13 Vaccine 342-346 (1995)) und Van Englenburg et al., in, A Glycoprotein E Deletion Mutant of Bovine Herpesvirus 1 Infects the Same Limited Number of Tissues in Calves as Wild-Type Virus, but for a Shorter Period (76 J. Gen. Virol. 2387-2392 (1994)).

Diese Untersuchung zeigte auch, dass die Deletion der gE-ORF-Sequenzen und das Einfügen eines funktionellen &bgr;-gal Gens an dem gE-locus des Virus das Virus stabil attenuiert hat. Eine praktische Anwendung dieses Virus ist seine Verwendung als sicherer Lebendimpfstoff, der gegen IBR gerichtet ist. Die Deletion des gE Gens wird als immunologischer Marker dienen, um die geimpften Tiere von den infizierten Tieren zu unterscheiden. Zusätzlich würde die Produktion von &bgr;-gal eine leichte Einschätzung der gE&Dgr;3.1IBR&bgr; Virus-Replikation in dem Nasenepithel geimpfter Tiere im Vergleich zu den jetzigen gE-deletierten Impfstoffstämmen in Europa erlauben, welchen dieser phänotypischer &bgr;-gal Marker fehlt, genauso wie er es gegenüber Infektion, die von Wildtyp IBR verursacht wird, unterscheiden würde.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 ist ein Flussdiagramm, welches die Konstruktion von gE-deletiertem BHV-1 Virus (gE&Dgr;3.1IBR&bgr;) und eines Insertions/Deletionsvektor-Plasmids, welches ein funktionelles &bgr;-gal Gen enthält, das die aminoterminalen zwei Drittel der gE-kodierenden Region ersetzt, skizziert;

2 ist eine Reproduktion der Southern Blot Hybridisierung für die beabsichtigte Deletion der für gE kodierenden Region und die Einfügung von &bgr;-gal Sequenzen an dem gE Lokus;

3 zeigt, dass das BHV-1 gE-Protein in dem Wildtyp-Elternstamm Cooper nachgewiesen wird, jedoch in dem gE-deletierten rekombinanten Virus (gE&Dgr;3.1IBR&bgr;) nicht nachgewiesen wird;

4 ist ein Graph, der das Ergebnis des Ein-Schritt Wachstumsexperiments zeigt, welches die Wachstumsrate des Gendeletierten IBR mit der Wachstumsrate des Wildtyp IBR in MDBK-Zellen vergleicht, wobei jeder Datenpunkt den Durchschnitt von Ergebnissen darstellt, die in jeder Gruppe von Kälbern erhalten wurden;

5 ist ein Graph, der die täglichen klinischen Werte von Kälbern, die mit gE-deletiertem IBR infiziert sind, mit den täglichen klinischen Werten von Kälbern vergleicht, die mit Wildtyp IBR infiziert sind, wobei jeder Datenpunkt den Durchschnitt von Ergebnissen darstellt, die in jeder Gruppe von Kälbern erhalten wurden;

6 ist ein Graph, der die täglichen rektalen Temperaturen von Kälbern, die mit gE-deletiertem IBR infiziert sind, mit den täglichen rektalen Temperaturen von Kälbern, die mit Wildtyp IBR infiziert sind, vergleicht, wobei jeder Datenpunkt den Durchschnitt von Ergebnissen darstellt, die in jeder Gruppe von Kälbern erhalten wurden; und

7 ist ein Graph, der die nasale Virusausscheidung von gE-deletiertem IBR mit der nasalen Virusausscheidung von Wildtyp IBR vergleicht, wobei jeder Datenpunkt den Durchschnitt von Ergebnissen darstellt, die in jeder Gruppe von Kälbern erhalten wurden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Die folgenden Beispiele beschreiben die Konstruktion eines infektiösen rekombinanten BHV-1, bei dem die native für gE-kodierende Region deletiert ist, was das Virus attenuiert, und bei dem ein funktionelles &bgr;-gal Gen in den gE-locus eingefügt ist, ein Verfahren unter Verwendung dieses rekombinanten BHV-1 als Impfstoff zur Immunisierung von Tieren gegen Erkrankungen, die von BHV-1 verursacht werden, und Verfahren zum Nachweis und sowohl zur genotypischen als auch phänotypischen Unterscheidung von Infektionen eines Tiers mit diesem rekombinanten Virus und dem Wildtypvirus. Diese Beispiele werden nur zur Veranschaulichung dargestellt, und nichts dabei sollte als Begrenzung des gesamten Rahmens der Erfindung gesehen werden.

Beispiel 1 Materialien und Methoden

In diesem Experiment wurde &bgr;-Galaktosidase exprimierendes rekombinantes IBRV mit deletiertem gE-Gen hergestellt und charakterisiert. Das hergestellte rekombinante Virus enthält ein chimäres Gen (4,5 kb lang), welches die für gE kodierende Region von BHV-1 ersetzt. Das chimäre Gen ist aus einem HCMV-IE-Promotor und seinen Enhancer-Sequenzen zusammengesetzt, verbunden mit für das &bgr;-gal Gen-kodierenden Sequenzen, welche mit SV40 Polyadenylierungsstellen verbunden sind. Bevorzugt sind die für &bgr;-gal kodierenden Sequenzen bakteriell, es wird jedoch angenommen, dass jegliche für ein &bgr;-gal Gen kodierenden Sequenzen funktionieren werden.

Um das rekombinante BHV-1 herzustellen und zu charakterisieren, wurde der Cooper (Colorado-1) Stamm von IBRV von der American Type Culture Collection erhalten. Viren wurden vermehrt und in Madin-Darby bovinen Nierenzellen unter Verwendung des Verfahrens von Chowdhury S.I., Molecular Basis of Antigenic Variation Between Glycoprotein C (gC) of Respiratory Bovine Herpesvirus 1 (BHV-1) and Neurovirulent BHV-5, 213 Virology 558-568 (1995) titriert. Die virale DNA wurde unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat und Protein K-Lyse, Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung, wie in Chowdhury et al., Equine Heresvirus Type 1 (EHV-1) Induced Abortions and Paralysis in a Lipizzaner Stud: A Contribution to the Classification of Equine Herpesviruses, 90 Arch. Virol. 273-288 (1986) beschrieben, isoliert.

Polyklonales BHV-1 gE-spezfisches anti-Peptid Kaninchen-Serum wurde basierend auf der vorhergesagten regionalen Hydropathizität und Antigenität synthetisiert. Das gE-Peptid, welches die Reste 378-398 enthielt, wie von Leung-Teak, P. et al., The Complete DNA Sequence and the Genetiv Organization of the Short Unique Region (US) of the Bovine Herpesvirus Type 1 Strain (ST strain), 199 Virology 409-421 (1994) beschrieben, wurde synthetisiert. Es wurde 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl (FMOC) Chemie, wie in Abdelmagid et al., Fine Mapping of Bovine Herpesvirus-1 (BHV-1) Glycoprotein D (gD) Neutralizing Epitop by Type-Specific Monoclonal Antibodies and Sequence Comparison With BHV gD, 206 Virology 242-253 (1995) beschrieben, verwendet, um die Synthese des gE-Peptids durchzuführen. Um die Konjugation mit Napfschnecken-Hämocyanin (Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH) zu erleichtern, wurde ein zusätzliches irrelevantes Cystein (C) (mit einem * markiert) an dem C-Terminus des Peptids hinzugefügt. Das 17-mer-Peptid [H]-TSDRLVRAVTDHTRPEC*-[OH] wurde mit KLH gekoppelt und Antiseren wurden, wie in Kyte, J., Doolittle, R. F., A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of Protein, 157 J. Mol. Biol. 105-132 (1982) beschrieben, hergestellt.

SDS-PAGE und Westernblot von Virus-infizierten und Kontroll-Zellproteinen wurden unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt, wie in Chowdhury S.I., Molecular Basis of Antigenic Variation Between Glycoprotein C (gC) of Respiratory Bovine Herpesvirus 1 (BHV-1) and Neurovirulent BHV-5, 213 Virology 558-568 (1995) und Laemli, U.K., Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4, 227 Nature (London) 680-685 (1970), beschrieben, durchgeführt.

Die Herstellung rekombinanter Plasmide wurde erreicht, indem die Plasmide pBHV1HK und pBHV1HF von Dr. W. Lawrence (U. Pennsylvania, Philadephia, USA), erhalten wurden. Die Plasmide enthielten jeweils die HindIII-K und HindIII-F Fragmente der BHV-1 DNA. Ein 4.4 kb XhoI/HindIII Unterfragment aus dem Plasmid pBHV1HK, welches das vollständige gD, gI und einen Teil, bevorzugt die aminoterminalen zwei Drittel der für gE kodierenden Region enthielt, wurde in die XhoI/HindIII-Schnittstellen des Plasmids pGEM7Z subkloniert (pBHV1gE5'). Als Nächstes wurde ein 1,15 kb HindIII/Bsu36I Fragment (durch Klenow-Verdau mit stumpfen Enden) aus pBHV1HF, welches das carboxyterminale Drittel der für gE kodierenden Region und die für den vollständigen US9 ORF kodierende Sequenz enthielt, in die HindIII/HincII Schnittstellen des Plasmids pBluescript KS subkloniert (pBHV1gE3'). Schließlich wurde, um die vollständige für das gE Gen kodierende Region mit ihren flankierenden Sequenzen zusammenzusetzen, das 4,4 kb HindIII/XbaI Vektor Schnittstellenfragment von pBHV1gE5', welches das HindIII/XhoI-Fragment enthielt, in die HindIII/XbaI-Schnittstellen des Plasmids pBHV1gE3' kloniert. Der erhaltene Klon wurde als pBHV1gE5'3' bezeichnet.

Um die für gE kodierende Region zu deletieren, wurde die pBHV1gE5'3'-DNA teilweise mit AsuII verdaut und darauffolgend vollständig wiederum mit HindIII verdaut. Das größere Fragment wurde aus einem Gel auf gereinigt und mit dem 4,5 kb PstI-Fragment (das mit T4-Polymerase mit stumpfen Enden versehen wurde) von pCMVß (erhalten von Clontech, Palo Alto, CA, USA) ligiert, welches die CMV Early Promotor-regulierten &bgr;-gal-Sequenzen enthält. Das erhaltene gE-Deletions/&bgr;-gal-Insertionsplasmid, pBHV1gE&Dgr;&bgr;, weist eine Deletion von 1 kb BHV-1 DNA-Sequenzen, welche die Gensequenzen enthalten, die für die ersten 372 Aminosäuren kodieren, und eine Insertion des &bgr;-gal Gens unter der Regulation des CMV-Promotors auf. Das &bgr;-gal Gen ist oberhalb von virusspezifischen 3,32 kb-Sequenzen (welche die vollständigen gD- und gI-Gensequenzen und die gE-Promotorsequenzen enthalten) und unterhalb von 1,15 kb-Sequenzen flankiert (welche das carboxyterminale Drittel der für gE kodierenden Region und die vollständigen US9 Gensequenzen enthalten), welche für die Rekombination mit der Virus-DNA notwendig sind.

Um gE-deletiertes rekombinantes IBR Virus herzustellen, wurden linearisierte pBHV1gE&Dgr;&bgr; (ATCC Zugangsnr. VR-2637) und Wildtyp IBRV ganzer Länge (Stamm Cooper) DNA durch Lipofektion in Madin-Darby bovine Nierenzellen (MDBK) co-transfiziert. Die korrekte Einfügung von &bgr;-gal in den gE-Lokus in dem IBRV ganzer Länge und die darauffolgende Deletion des Teils der in Wildtyp IBRV für gE kodierenden Region ist auf die homologe Rekombination der BHV-1-spezifischen flankierenden Sequenzen im Plasmid bei der Replikation von Virus-DNA zurückzuführen. Die Virusspezifische flankierende Sequenz wird in neu synthetisierte virale DNA eingefügt, was zu einer Deletion in der kodierenden Region führt, genau wie zu einem Einfügen in der gleichen Region. Rekombinante Viren, die &bgr;-gal exprimierten, wurden durch Reihenuntersuchungen auf blaue Plaques unter einem Bluo-Gal-Overlay dreimal aus Plaques aufgereinigt, wie in Chowdhery, S.I., Construction and Characterization of an Attenuated Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) Recombinant Virus, 52 Vet. Microbiol. 13-23 (1996) beschrieben. Mehrere rekombinante Isolate wurden weiter durch Blot-Hybridisierungen und Immunoblot mit polyklonalem anti-BHV-1 gE-spezifischen anti-Peptid Kaninchen-Serum charakterisiert. Die Blot-Hybridisierungsmethode von Chowdhery, S.I., Construction and Characterization of an Attenuated Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV-1) Recombinant Virus, 52 Vet. Microbiol. 13-23 (1996) wurde verwendet. Es wurde die Immunoblotmethode von Chowdhury, S.I., Molecular Basis of Antigenic Variation Between Glycoprotein C (gC) of Respiratory Bovine Herpesvirus 1 (BHV-1) and Neurovirulent BHV-5, 213 Virology 558-568 (1995) verwendet.

Ergebnisse

Eine Analyse von DNA aus zwei rekombinanten Viren, gE&Dgr;3.1IBR&bgr; (ATCC Zugangsnr. VR-2367) und gE&Dgr;3.5IBR&bgr;, durch Southern Blot-Hybridisierung in Bezug auf die beabsichtigte Deletion und die Insertion von &bgr;-gal-Sequenzen in den gE-Lokus ist in 2 gezeigt. Die Abwesenheit der Sequenzen des 1 kb Asu-II-HindIII-Fragments, welche für die ersten 372 Aminosäuren an dem aminoterminalen Ende des gE Gens kodieren, und die Anwesenheit von &bgr;-gal-Sequenzen in den Isolaten gE&Dgr;3.1IBR&bgr; und gE&Dgr;3.5IBR&bgr; zeigten, dass die beabsichtigte Rekombination in diesen Isolaten ortsspezifisch stattgefunden hat. In Übereinstimmung damit wurde das 92-95 kD BHV-1 gE-Protein in dem Wildtyp-Elternstamm Cooper mit polyklonalem BHV-1 gE-spezifischen anti-Peptid Kaninchen-Serum nachgewiesen, fehlte aber bei dem gE-deletierten rekombinanten Virus gE&Dgr;3.1IBR&bgr;. Dieses Ergebnis ist in 3 gezeigt, und dieses Isolat wurde für weitere Untersuchungen verwendet. Zusätzlich konnte gE&Dgr;3.1IBR&bgr; durch Co-Transfektion mit dem Plasmid, welches die flankierenden Sequenzen und ursprüngliche gE-Sequenzen aus einem Wildtyp IBRV enthielt, zurück zum Wildtyp umgewandelt werden. Dies kehrt im Wesentlichen den Co-Transfektionsprozess um, der verwendet wurde, um gE&Dgr;3.1IBR&bgr; herzustellen.

Die Kinetik der &bgr;-gal Expression in mit Virus infizierten MDBK-Zellen wurde histochemisch 3, 6, 12 und 24 Stunden nach der Infektion bestimmt. &bgr;-gal Aktivität wurde schon nach 3 Stunden und noch nach 24 Stunden nach der Infektion nachgewiesen. Dies zeigt, dass das von dem CMV-IE-Promotor regulierte &bgr;-Galaktosidase Gen des gE&Dgr;3.1IBR&bgr;-Virus sowohl zu frühen als auch späten Zeiten exprimiert wird. Weiterhin wird, obwohl das chimäre Gen von einem fremden humanen Herpesvirus HCMV-IE-Promotor reguliert wird und nicht-virale &bgr;-gal Sequenzen zusätzlich zu Enhancern enthält, die sowohl gegenüber &bgr;-gal als auch BHV-1 fremd sind, das Gen als authentisches BHV-1 Gen reguliert und exprimiert. Damit ist das &bgr;-gal dem BHV-1 fremd (im natürlichen Status von BHV-1 nicht vorhanden), und HCMV-IE und seine Enhancer-Sequenzen sind sowohl gegenüber BHV-1 als auch dem &bgr;-gal fremd, das sie regulieren/verstärken.

Deletion des gE-Gens wird als immunologischer Marker dienen, um die geimpften Tiere von den infizierten Tieren zu unterscheiden. Bei der von dem Impfstoffstamm induzierten Antikörper-Antwort würden gE-spezifische Antikörper fehlen, was von der durch die Wildtyp BHV-1-Infektion induzierten Antwort unterschieden werden kann, welche gE-spezifische Antikörper enthalten würde. Damit können infizierte Tiere in einer geimpften Herde identifiziert und gekeult werden. Dieser serologische Marker ist wichtig für die Eliminierung von BHV-1 aus der Herde.

Das Plasmid (pBHV1gE&Dgr;&bgr;), welches verwendet wurde, um das rekombinante Virus herzustellen, und das hergestellte rekombinante Virus gE&Dgr;3.1IBR&bgr;, wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt. Dem Plasmid (pBHV1gE&Dgr;&bgr;) wurde die ATCC Zugangsnr. 203607 zugeordnet und dem rekombinanten Virus (gE&Dgr;3.1IBR&bgr;) wurde ATCC Zugangsnr. VR-2637 zugeordnet.

Beispiel 2 Materialien und Methoden

In diesem Experiment wurde die Pathogenität von gE&Dgr;3.1IBR&bgr;-Virus in Kälbern bestimmt und diese Ergebnisse mit der Pathogenität des Elternstammes Cooper IBRV verglichen. Zehn 6 Monate alte Holstein-Kälber frei von IBRV und Bovinem Viralen Durchfallvirus (bovine viral diarrhoea virus) wurden zufällig in zwei Gruppen (A und B) von je 5 Kälbern aufgeteilt. Die zwei Gruppen wurden unter identischen Bedingungen in Isolierställen untergebracht. Vor dem Experiment waren alle Kälber gesund, und sie blieben bis zum Beginn des Experiments seronegativ.

Jedes Kalb in Gruppe A wurde intranasal mit dem rekombinanten gE-deletierten IBRV inokuliert. Jedes Kalb in Gruppe B wurde intranasal mit dem parenteralen Stamm IBRV Cooper inokuliert. Die Inokula enthielten 1 × 107 TCID50 des jeweiligen Virus pro Tier. Alle Inokulationen wurden durch Aerosol-Bildung unter Verwendung eines DEVILBIS Modell 50 Zerstäubers von Delvis Co., Somerset, Pennsylvania, mit 2 ml Inokulat pro Nasenloch in einem Zeitraum von 30 Sekunden bis zu 1 Minute durchgeführt.

14 Tage nach der Behandlung mit Virus (Inokulation) wurde täglich eine intensive klinische Beobachtung aller Kälber durchgeführt. Täglich wurden rektale Temperaturen aufgezeichnet. Besondere Beachtung wurde den folgenden Zuständen geschenkt: Verhalten (Depression), Appetit, Husten, Augen- und Nasenausscheidungen, Hyperämie oder Läsionen der Nasen- und Mund-Schleimhäute, Konjunktivitis und anormales Atmen. Jeder Zustand wurde individuell bewertet und tägliche klinische Werte für jedes Kalb genau wie durchschnittliche tägliche klinische Werte für jede Gruppe wurden berechnet, indem alle Werte für jeden Zustand addiert wurden. Die Bewertungsparameter waren wie folgt:

Nasenausscheidung: Normal = 0; Mittelschwer = 1; Ernsthaft Schwer = 2; Mild mikro-eitrig = 2; Mittelmikro-eitrig = 3 und Ernsthaft mikroeitrig = 4

Verhalten (Depression) Nicht Vorliegend = 0; Mild = 1; Mittel = 2; Ernst = 3

Hyperämie/Rötung der Nasenschleimhaut = 1

Geschwüre der Nasenschleimhaut = 2

Konjunktivitis = 2

Husten = 2

Atemnot = 2

Tägliche Rektale Temperatur 39,7 – 39,99°C = 1; 40,0 – 40,5°C = 2; 40,6 – 41,0°C = 3; über 41,0°C = 4

Ergebnisse

Kälber in Gruppe B, die mit dem Elternstamm von IBRV Cooper (Wildtyp IBRV) infiziert waren, zeigten typische Zeichen von Infektion: Depression, reduzierter Appetit, okulare und nasale Ausscheidungen, nasale Geschwüre/nasale Plaques und Husten. Diese klinischen Zeichen führten über mehrere Tage zu einem täglichen hohen klinischen Wert, wie in 5 gezeigt. Die mit dem rekombinanten gE&Dgr;3.1IBR&bgr;-Virus (Gruppe A) infizierten Kälber zeigten jedoch keine nachweisbaren klinischen Zeichen (auch in 5 gezeigt), und ihr Verhalten und Appetit blieb normal. 6 vergleicht die durchschnittliche rektale Temperatur der Kälber aus jeder Gruppe (A und B). Hohe rektale Temperaturen von 39,7 °C bis 40,5 °C wurden bei den mit dem E1-ternstamm Cooper infizierten Kälbern (Gruppe B) über mehrere Tage aufgezeichnet. Bei den mit gE&Dgr;3.1IBR&bgr; infizierten Kälbern (Gruppe A) wurden nie rektale Temperaturen größer als 38,9 °C aufgezeichnet.

Beispiel 3 Materialien und Methoden

In diesem Experiment wurde die Kinetik des Wachstums von gE&Dgr;3.1IBR&bgr;-Virus in MDBK-Zellen und dem Eltern-IBR-Stamm Cooper in MDBK-Zellen verglichen. Eine Serie von sich reproduzierenden Kulturen von MDBK-Zellen wurde getrennt entweder mit 5 Plaque-bildenden Einheiten (Plaque Forming Units, PFU) an rekombinantem gE&Dgr;3.1IBR&bgr; oder an Elternstamm Cooper pro Zelle infiziert. Infizierte Kulturen wurden nach aufeinanderfolgenden Zeiträumen nach der Infektion geerntet und Virusbestände wurden zur Verwendung in Virustitrations-Assays zubereitet.

Ergebnisse

Ergebnisse des einschrittigen Wachstumsexperiments sind in 4 gezeigt. Die Viruswachstumskurven zeigen, dass die Zeitverläufe für die Vermehrung der Viren zwischen gE&Dgr;3.1IBR&bgr; und dem Elternstamm Cooper ähnlich waren. Das rekombinante Virus führte jedoch kurz nach der Infektion zu geringeren Ergebnissen.

Beispiel 4 Materialien und Methoden

In diesem Experiment wurde Virus aus jedem Tier in den Gruppen A und B (aus Beispiel 3 oben) isoliert und quantifiziert. Ein einfacher Tupfer mit Baumwollspitze wurde in jedes Nasenloch eingeführt. Der Tupfer wurde dreimal gegen die Schleimhäute gedreht. Virus wurde aus den Tupfer 1 Stunde bei Raumtemperatur in 3 ml Probenmedium eluiert (MEM, welches 100 &mgr;g/ml Gentamycin, 3 % v/v FBC, 25 &mgr;g/ml Amphotericin B enthielt). Die Proben wurden durch Zentrifugation bei 1000 g für 5 Minuten geklärt und bei –70 °C gelagert. Virusisolation in MDBK-Zellen wurde unter Verwendung von 100 &mgr;l von 1 : 10 verdünnter Tupfersuspension durchgeführt. Virus-positive Proben wurden auf Mikrotiterplatten titriert. Serielle 10-fache Verdünnungen in Kulturmedium wurden durchgeführt und 50 &mgr;l jeder Verdünnung wurden zu jeder von 8 Vertiefungen hinzugefügt (in einer Platte mit 96 Vertiefungen), welche 1,5 × 105 MDBK-Zellen enthielten. Nach 5 Tagen bei 37 °C wurden die Platten mikroskopisch in Bezug auf zytopathischen Effekt (CPE) ausgelesen. Virustiter wurden nach dem Verfahren von Reed, L.J., und Muench, H., 27 Am. J. Hyg. 493 (1938) in TCID50 berechnet.

Ergebnisse

Die Menge von Virus, die aus den Nasentupfern isoliert wurde, zeigte, dass das gE&Dgr;3.1IBR&bgr;-Virus im Vergleich zu seinem Elternstamm Cooper in den Nasenepithelzellen weniger effizient wuchs. Die Ausscheidung von Virus in Nasensekretionen ist in 7 gezeigt. Diese Ausscheidung von Virus war bei gE&Dgr;3.1IBR&bgr;-Virus etwa 15- bis 550-fach geringer als bei dem Wildtyp BHV-1 (Elternstamm Cooper). Die Dauer der Virusabgabe war bei gE&Dgr;3.1IBR&bgr;-infizierten Kälbern auch 2 Tage kürzer als bei Kälbern, die mit dem Wildtypvirus infiziert waren.

Beispiel 5 Materialien und Methoden

In diesem Beispiel wurden die Titer von BHV-1 neutralisierenden Antikörpern in Serum bestimmt, das Kälbern aus den Gruppen A und B (aus den Beispielen 3 und 4 oben) abgenommen wurde. Blutproben wurden 13 Tage nach der Infektion von jedem Kalb sowohl aus Gruppe A als auch Gruppe B abgenommen. Titer der BHV-1 neutralisierenden Antikörper in dem Serum wurden durch das Plaque-Reduktionsverfahren unter Verwendung von Platten mit 12 Vertiefungen wie in Chowdhury, S.I., et al., Molecular Biological Characterization of Equine Herpesvirs 1 (EHV-1) Isolated From Ruminant Hosts, 11 Virus Res. 127-139 (1988) beschrieben, bestimmt.

Ergebnisse

Sowohl die Wildtyp (Elternstamm Cooper) als auch die gE-deletierten IBRV Viren (gE&Dgr;3.1IBR&bgr;) induzierten in Kälbern BHV-1 neutralisierende Antikörper. Seren von Kälbern, die mit dem Wildtyp infiziert waren, hatten jedoch unwesentlich höhere neutralisierende Titer (1 : 20 bis 1 : 35 mit einem durchschnittlichen Titer von 1 : 30), im Vergleich zu den gE-deletierten Antikörper-Titern (1 : 11 bis 1 : 30 mit einem durchschnittlichen Titer von 1 : 16).


Anspruch[de]
Attenuiertes rekombinantes Bovines Herpesvirus Typ I-Virus, umfassend ein Bovines Herpesvirus Typ I, bei dem ein Teil einer nativen für Glykoprotein E kodierenden Region enfernt und mit einem genetischen Insert ersetzt ist, wobei der entfernte Teil etwa zwei Drittel der nativen für Glykoprotein E kodierenden Region umfasst, wobei das Insert die kodierende Region eines fremden &bgr;-Galaktosidase-Gens unter der Regulation des humanen Cytomegalovirus Immediate Early Promotors umfasst, wobei das rekombinante Virus in einer Wirtszelle &bgr;-Galaktosidase exprimiert. Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Insert weiterhin Enhancer-Sequenzen des humanen Cytomegalovirus Immediate Early Promotors umfasst. Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus keine anderen Gen-Deletionen trägt. Virus nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Insert mit SV40 Polyadenylierungsstellen verbunden ist. Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das fremde &bgr;-Galaktosidase-Gen als authentisches, von bovinem Herpesvirus Typ I kodiertes Gen exprimiert wird. Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die deletierte native kodierende Region als genotypischer Marker dient. Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genetische Insert als phänotypischer Marker dient. Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die deletierte native kodierende Region als immunologischer Marker dient. Das Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die für &bgr;-Galaktosidase kodierenden Sequenzen in der Wirtszelle sowohl in frühen als auch in späten Stadien der Infektion exprimiert werden. Impfstoff, der bei der Induzierung von neutralisierenden Antikörpern gegen Bovinen Herpesvirus Typ I wirksam ist, umfassend das rekombinante Virus nach Anspruch 1. Impfstoff nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der deletierte Teil zwei Drittel der nativen für Glykoprotein E kodierenden Region umfasst. Impfstoff nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Insert weiterhin Enhancer-Sequenzen des humanen Cytomegalovirus Immediate Early Promotors umfasst. Impfstoff nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Insert mit SV40 Polyadenylierungsstellen verbunden ist. Impfstoff nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das &bgr;-Galaktosidase-Gen als authentisches, von Bovinem Herpesvirus Typ I kodiertes Gen exprimiert wird. Impfstoff nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die für &bgr;-Galaktosidase kodierenden Sequenzen in der Wirtszelle sowohl in frühen als auch in späten Stadien der Infektion exprimiert werden. Impfstoff nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die deletierte für natives Glykoprotein E kodierende Region als genotypischer Marker dient. Impfstoff nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die eingefügten für &bgr;-Galaktosidase kodierenden Sequenzen als phänotypische Marker dienen. Impfstoff nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die deletierte native kodierende Region als immunologischer Marker dient. Verfahren zur Identifizierung von Tieren, die mit dem rekombinanten Virus-Impfstoff nach Anspruch 10 infiziert sind, Schritte umfassend, bei denen man:

(a) eine Flüssigkeitsprobe von einem Tier analysiert;

(b) den rekombinanten Virus-Impfstoff in der Probe detektiert; und

(c) basierend auf dieser Detektion das Tier als infiziert identifiziert.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse in Schritt (a) ein Testen auf die Anwesenheit von &bgr;-Galaktosidase einschließt. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Nachweisen in Schritt (b) auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von &bgr;-Galaktosidase-Expression basiert. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse in Schritt (a) eine für Glykoprotein E spezifische Antikörperantwort einschließt. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion in Schritt (b) auf der Anwesenheit oder Abwesenheit einer für Glykoprotein E spezifischen Antikörperantwort basiert. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse in Schritt (a) in situ histochemische Verfahren zur Detektion von Enzymaktivität von &bgr;-Galaktosidase einschließt. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse in Schritt (a) in situ immunhistochemische Verfahren zur Detektion des &bgr;-Galaktosidase Proteins einschließt. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse in Schritt (a) Immunoblot zur Detektion des &bgr;-Galaktosidase Proteins einschließt. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse in Schritt (a) in situ histochemische Verfahren zur Detektion von Glykoprotein E einschließt. Rekombinantes Virus, dadurch gekennzeichnet, dass es ATCC-Zugangsnummer VR-2637 aufweist. Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass es ATCC-Zugangsnummer 203607 aufweist. Verwendung des rekombinanten Bovinen Herpesvirus nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Immunisierung von Rindern gegen Bovinen Herpesvirus Typ I.






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