PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE60215268T2 30.08.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001285969
Titel Verfahren zur Herstellung von Sterol- und Stanolestern mittels enzymatischer Transesterifikation in lösungsmittel- und wasserfreien Medien
Anmelder Härting, Thomas Francis, Santiago, CL
Erfinder Diaz, Miguel Angel Fuenzalida, Santiago 443 3500, CL;
Basterrechea, Martinez Irene, Santiago 443 3500, CL;
Rojas, Markovits Alejandro, Santiago 443 3500, CL;
Schersl, Markovits Endre, Santiago 443 3500, CL
Vertreter Meissner, Bolte & Partner GbR, 81679 München
DE-Aktenzeichen 60215268
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 08.08.2002
EP-Aktenzeichen 022555692
EP-Offenlegungsdatum 26.02.2003
EP date of grant 11.10.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 30.08.2007
IPC-Hauptklasse C12P 33/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12P 7/64(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umesterung von Sterolen oder Stanolen in Lösungsmittel-freiem Medium und ein Verfahren zur Herstellung von Steryl- oder Stanylestern durch enzymatische Umesterung von Sterolen in Lösungsmittel-freiem Medium.

Steryl- und Stanylester sind nützliche cholesterinsenkende Mittel und sind als solche derzeit als Ingredienzien für Functional Food stark gefragt. (Food Technology, 2001, 55, 1 S. 59–67).

Steryl- und Stanylester können durch organische Synthese unter Verwendung verschiedener Katalysatoren hergestellt werden, wie es im US-Patent Nr. 6 184 397 offenbart ist. Die vielen Nachteile einer organischen Synthese werden im US-Patent Nr. 5 219 733 diskutiert, das ein Verfahren zur enzymatischen Veresterung oder Umesterung von Sterolen mit Fettsäuren oder Fettsäureestern in wässrigem Medium bzw. wässrigen Medien, das/die mit Wasser gesättigtes organisches Lösungsmittel enthält/enthalten, offenbart.

Dennoch leidet das offenbarte Verfahren auch an vielen Nachteilen. Das Vorliegen von freiem Wasser im Reaktionsgemisch kann eine Hydrolyse gegenüber einer Synthese begünstigen, wie es aus den Figuren, die in den Beispielen gezeigt sind, zu erkennen ist, und zusätzlich gibt es Lipasen, die in mit Wasser gesättigten organischen Lösungsmitteln keine Aktivität aufweisen. (Yokozeki et al., European J. Appl. Microbiol.Biotechnol., 1982, 14, 1-5).

Andererseits kann die Verwendung von organischen Lösungsmitteln mit der Erzeugung von Functional Food-Ingredienzien nicht kompatibel sein.

Die Erfindung hierin offenbart ein neues und hoch-effizientes Veresterungsverfahren nicht nur für Sterole sondern auch für Stanole in Medium ohne freies Wasser oder organisches Lösungsmittel, was die veresterten Produkte besonders für Verwendungen in Functional Food geeignet macht.

Weber N et al., "Fatty acid steryl, stanyl, and steroid ester by esterificfation and transesterification in vacuo using Candida rugosa lipase as catalyst", Journal of agricultural and food chemistry, US Bd. 49, Nr.1, Januar 2001 (2001-01), Seiten 67-71, ISSN: 0021-8561, offenbart eine enzymatische Herstellung von Carbonsäureestern, insbesondere Fettsäureestern, von Sterolen, Stanolen und Steroiden in hoher Ausbeute durch Veresterung und Umesterung von Fettsäuren und anderen Carbonsäureestern.

Shimada Yuji et al., "Facile purification of tocopherols from soybean oil deoderizer distillate in high yield using lipade", Journal of the American oil chemist's society, American oil chemist's society campaign, US Bd. 77, Nr. 10, Oktober 2000 (2000-10), Seiten 1009-1013, ISSN: 0003-021X, offenbart eine enzymatische Veresterung von Sterolen bei der Tocopherolreinigung.

Dementsprechend richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Sterol- oder Stanolestern durch enzymatische Umesterung in Lösungsmittel- und Wasser-freiem Medium, wie es in Anspruch 1 ausgeführt ist. Bevorzugte Merkmale werden in den Unteransprüchen 2 bis 11, einschließlich, beschrieben.

In der vorliegenden Erfindung wurde beobachtet, dass bestimmte mikrobielle Lipasen Umesterungswirkung auf Sterole und Stanole oder auf Gemische dieser Verbindungen in einem Reaktionssystem in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels und freiem Wasser aufweisen.

Das Reaktionssystem wird gebildet, wenn die Lipase mit einem Reaktantengemisch, umfassend Sterole, Stanole und eine oder mehrere Komponenten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fettsäuren, die mit kurzkettigen aliphatischen Alkoholen verestert sind, in Kontakt gebracht wird.

Lipase bedeutet in der vorliegenden Erfindung eine Formulierung, die Umesterungsaktivität in Abwesenheit von freiem Wasser oder organischen Lösungsmitteln exprimiert, und sie kann eine oder mehrere Verbindungen, die aus einer Fermentationsbrühe eines Mikroorganismus stammen, oder eine oder mehrere Verbindungen, die aus einem zellulären Extrakt eines Mikroorganismus stammen, umfassen. In diesen Fällen wird die Formulierung freie Lipase genannt. Alternativ kann die Formulierung einen inerten Träger, der eine oder mehrere Verbindungen, die aus einer Fermentationsbrühe eines Mikroorganismus stammen, immobilisiert, oder einen inerten Träger, der eine oder mehrere Verbindungen, die von einem zellulären Extrakt eines Mikroorganismus stammen, immobilisiert, umfassen. In den letztgenannten Fällen wird die Formulierung immobilisierte Lipase genannt. Verbindungen, die aus einer Fermentationsbrühe stammen, oder Verbindungen, die aus einem zellulären Extrakt von Bakterien der Gattung Pseudomonas wie Pseudomonas stutzeri oder Pseudomonas (Burkholderia) cepacia stammen, sind zur Herstellung von Lipasen, entweder freier oder immobilisierter, geeignet.

Eine lipolytische Einheit ist die Menge an Formulierung, die ein Mikromol Fettsäure pro Minute bei 37°C aus Olivenöl, das in Gegenwart von Polyvinylalkohol emulgiert wurde, freisetzt. Das Verfahren zur Bestimmung der lipolytischen Aktivität, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist im US-Patent Nr. 5 219 733 beschrieben und stellt eine Standardtechnik zur Messung der lipolytischen Aktivität dar. Es wurde beobachtet, dass es eine Korrelation zwischen hydrolytischer Aktivität und Umesterungsaktivität der Lipasen gibt, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.

Die Reaktion kann entweder in Gegenwart einer stöchiometrischen Menge oder eines stöchiometrischen Überschusses an Estern der Fettsäureester durchgeführt werden.

Eine Umesterungsreaktion im Reaktionsgemisch wird vorzugsweise in Rührreaktoren bei Drücken unter Atmosphärendruck, vorzugsweise unter 300 mbar und bei Temperaturen im Bereich von 30 und 90°C durchgeführt.

Fettsäuren, deren Ester zur Umesterung von Sterolen oder Stanolen nützlich sind, können von einem Speiseöl, z.B. Rapssamenöl, Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl, Sonnenblumenöl, Palmöl, Fischöl, stammen und können auch Fettsäuren mit 2 bis 14 Kohlenstoffatomen pro Molekül umfassen. Diese Fettsäuren können mit einem kurzkettigen aliphatischen Alkohol, z.B. Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol, in Gegenwart von Schwefelsäure als Katalysator verestert werden und als Umesterungsmittel verwendet werden.

Sterole oder Stanole, die aus dem Rückstand der Entschleimungsbehandlung von Speiseölen, z.B. Sojabohnenöl, Sonnenblumenöl, Maiskeimöl, Palmöl, Rapssamenöl stammen, oder die sogenannten Holzalkohole, die Gemische von Sterolen und Stanolen sind, die aus Schwarzlaugen stammen, aus Kraft-Zellulosepulpenherstellungsverfahren, Talgöl stammen, oder dem Rückstand einer Talgöldestillation, bekannt als Talgölpech, stammen, sind für das offenbarte Umesterungsverfahren geeignet.

Um die Reaktion abzuschließen, wird die Lipase entweder durch Absetzenlassen, Filtrieren, Zentrifugieren oder durch eine beliebige Technik vom Reaktionsgemisch abgetrennt. Das resultierende umgesetzte Gemisch umfasst Steryl- oder Stanylester von Fettsäuren. Wenn ein stöchiometrischer Überschuß an Fettsäureestern in der Umesterungsreaktion verwendet wird, wird das umgesetzte Gemisch auch den nicht umgesetzten Überschuß dieser Ester umfassen. Wenn es gewünscht wird, kann dieser Überschuß an Estern aus dem Reaktionsgemisch durch Destillation bei reduziertem Druck entfernt werden, wie es in Beispiel 7 beschrieben ist.

Nach dem was offenbart wurde, umfasst das Verfahren zur Herstellung von Steryl- oder Stanylestern die folgenden Schritte:

  • a) Bilden eines Reaktionsgemisches, indem eine Lipase mit einem Reaktantengemisch in Kontakt gebracht wird, wobei das Reaktantengemisch Styrole oder Stanole und einen oder mehrere Ester, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Estern einer Fettsäure mit einem kurzkettigen aliphatischen Alkohol, umfasst;
  • b) Abtrennen der Lipase aus dem Reaktionsgemisch unter Bildung eines umgesetzten Gemisches und
  • c) Abtrennen von Steryl- oder Stanylestern aus dem umgesetzten Gemisch.

Ein Verfahren für die Umesterung von Sterolen oder Stanolen umfasst die Bildung eines Reaktionsgemisches durch In-Kontakt-Bringen einer Lipase mit einem Reaktantengemisch, wobei das Reaktantengemisch Sterole oder Stanole und einen oder mehrere Ester, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Estern einer Fettsäure mit einem kurzkettigen aliphatischen Alkohol, umfasst.

Die folgenden Beispiele erläutern Wege zur Durchführung der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1. Herstellung von Ethylester von Fettsäuren von Sonnenblumenöl

10 l Ethanol technischer Qualität, 313 g konzentrierte Schwefelsäure und 10,3 g handelsübliche Sonnenblumenöl-Fettsäuren wurden unter leichtem Stickstoffstrom in einen 40 l-Stainless Steel-Rührreaktor eingegeben, der mit Heizvorrichtung, einer Spirale, einem Einfülltrichter, einer Kolonne, einem Kühler, einem Dean-Stark-Separator, Bodenventil, Stickstoffinjektor und Vakuumanschluß zur Destillation bei reduziertem Druck ausgestattet war. Der Stickstofffluß wurde unterbrochen und das Gemisch wurde für 10 Stunden bei 77°C mit periodischer Überwachung der Säure refluxiert. Als die Säurezahl 6,4 erreichte, wurde Ethanol abdestilliert, bis 90% der Anfangsmenge an Ethanol gewonnen worden waren. Das Gemisch wurde auf 60°C abgekühlt und mit 7 kg Hexan verdünnt. Die verbleibende Azidität wurde mit 8 kg einer wässrigen 10%igen Lösung von Natriumcarbonat technischer Qualität neutralisiert. Die wässrige Phase wurde eliminiert und die organische Phase wurde dreimal mit 1 kg eines Wasser:Ethanol-Gemisches (1:1) bis pH 6,8 gewaschen. Die neutrale organische Phase wurde bei 95°C und 25 mbar von Lösungsmittel befreit. Schließlich wurden 9,64 kg Ethylester von Fettsäuren von Sonnenblumenöl erhalten.

Beispiel 2. Umesterung eines Gemisches von Sterolen und Stanolen

Ein Reaktionsgemisch der in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung (Anfangszusammensetzung zur Zeit = 0) wurde gebildet, indem 1000 ml Ethylester von Fettsäuren von Sonnenblumenöl, 180 g eines Gemisches aus Sterolen und Stanolen (Holzalkohole) und 10 g Lipase von Pseudomonas stutzeri (MEITO SANGYO CO., LTD., Lipase-TL) mit einer lipolytischen Aktivität von 20000 Einheiten pro Gramm vermischt wurden und in einen 2000 ml-Schott-Duran-Reaktionskolben mit rundem Boden und Planschliff mit einem Planschliffdeckel, ausgestattet mit 4 Standardhälsen, eingefüllt wurde. Der Reaktor wurde teilweise in ein Wasserbad mit 60°C eingetaucht. Ein Reaktorauslaß wurde an eine Vakuumpumpe (TRIVAC B D 16B) angeschlossen, die während der Reaktion einen Druck von 2 mbar im Reaktor aufrecht hielt. Ein Rühren erfolgte mittels Magnetrührer. Das Rühren wurde jede Stunde gestoppt, um die Entnahme einer Probe zu ermöglichen, die Probe wurde mit 10000 g für 15 min zentrifugiert, um Lipase zu entfernen, und der Sterol- und Stanolgehalt der zentrifugierten Probe wurde gemessen.

Eine Analyse von freien Stanolen und Sterolen wurde unter Verwendung eines Hewlett-Packard HP 6890-Serie 2-Chromatographen durchgeführt, der mit einer HP-5-Kapillarsäule mit einer Länge von 30 m, einem Durchmesser von 0,32 mm und einem Film von 0,25 mm ausgestattet war. Die Ofentemperatur war 300°C, die Injektor- und Detektor-Temperatur war 320°C, der Heliumträgerfluß war 0,92 ml/min mit 60:1-Aufsplittung und einem 15 minütigen Programm. Die Details der Analyse sind in der chilenischen Patentanmeldung Nr. 85/98 offenbart.

Tabelle 1 zeigt die Veränderung der Zusammensetzung des umgesetzten Gemisches zu verschiedenen Reaktionszeiten.

Tabelle 1. Veränderung der Zusammensetzung des umgesetzten Gemisches zu verschiedenen Reaktionszeiten gemäß Beispiel 2 Zeit (h)

1 zeigt die Umwandlungskinetik der Umesterung von Holzalkoholen in die entsprechenden Fettester. Die Umwandlung von Holzalkoholen in Fettester (XAlkohole) wird durch den folgenden Ausdruck errechnet: XAlkohole = (C0Alkohole – CAlkohole)/C0Alkohole worin C0Alkohole die Konzentration an Sterolen und Stanolen im Reaktantengemisch ist; CAlkohole die Konzentration an Sterolen und Stanolen im umgesetzten Gemisch ist.

Beispiel 3. Umesterung von Holzalkoholen

Ein Reaktionsgemisch, dessen Zusammensetzung in Tabelle 2 gezeigt ist, wurde hergestellt, indem 100 ml Ethylester von Fettsäuren von Talgöl, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, in dem Reaktor von Beispiel mit 10 g Holzalkohol und 0,5 g Lipase von Pseudomonas (Burkholderia) capacia (MEITO SANGYO CO., LTD., Lipase-SL) mit einer lipolytischen Aktivität von 36000 Einheiten pro Gramm vermischt wurden. Die Reaktionstemperatur war 70°C und der Druck war 0,8 mbar. Die Extraktion von Proben und eine Analyse wurden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Tabelle 2 zeigt die Veränderung der Zusammensetzung des umgesetzten Gemisches mit der Zeit und 2 zeigt die Veränderung zu verschiedenen Reaktionszeiten der Umwandlung in dem umgesetzten Gemisch von Holzalkoholen zu Steryl- und Stanylestern.

Tabelle 2. Veränderung der Zusammensetzung des umgesetzten Gemisches zu verschiedenen Reaktionszeiten nach Beispiel 2 Zeit (h)

Beispiel 4. Immobilisierung von Lipase in Celite

Lipase von Pseudomonas stutzeri PL-836 (MEITO SANGYO CO., LTD., Lipase-TL) mit einer lipolytischen Aktivität von 45000 Einheiten pro Gramm wurde durch Adsorption an Celite und auch durch Einschließen des adsorbierten Enzyms in einem polymeren Harz entsprechend dem Verfahren von Yokokezi et al. (European J. Appl. Microbiol. Biotechnol, 1982, 14, 1-5) immobilisiert, was zu einem Katalysator mit einer lipolytischen Aktivität von 25000 bzw. 32000 Einheiten pro Gramm immobilisierter Lipase führte.

Beispiel 5–6. Umesterung mit immobilisierter Lipase

15 g Sterole und 15 g Stanole wurden getrennt umgeestert, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, und zwar mit 0,5 g Lipase von Pseudomonas stutzeri PL-836 (MEITO SANGYO CO., LTD., Lipase-TL), die durch Adsorption an Cellite immobilisiert worden war, mit 100 ml Ethylester von Fettsäuren von Sonnenblumenöl. Tabelle 3 zeigt Reaktionsbedingungen und Resultate der entsprechenden Umwandlungen, die nach 6-stündiger Reaktion erreicht waren. Die Analyse der Probe wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.

Tabelle 3. Resultate der Beispiele 5 und 6
worin:

Gew.-% der Gewichtsprozentanteil an Sterolen oder Stanolen im Reaktantengemisch ist,

T, Reaktionstemperatur (°C),

P, Druck im Reaktor (mbar).

Beispiel 7. Abtrennung von nicht umgesetzten Ethylestern von Fettsäuren von Sonnenblumenöl

Ein Reaktionsgemisch, das entsprechend Beispiel 3 hergestellt worden war, wurde filtriert, wobei 978,5 g Lipase-freies umgesetztes Gemisch erhalten wurden.

Das umgesetzte Gemisch wurde bei 10 mbar in einer UIC KDL 4-Kurzweg-Destillationskolonne bei Temperaturen der erhitzten Oberfläche und des inneren Kühlers von 170 bzw. 30°C destilliert. 622,7 g Destillat wurden am inneren Kühler gesammelt, das nicht umgesetzte Ethylester von Fettsäuren von Sonnenblumenöl enthielt, und 352,8 g Rückstand wurden am Boden der erhitzten Oberfläche gesammelt, der 16 Gew.-% Holzalkohole umfasste.


Anspruch[de]
Verfahren zur Umesterung eines Gemisches aus Stanolen und Sterolen, umfassend Umsetzen des Gemisches mit einem Ester oder mehreren Estern einer Fettsäure in Gegenwart einer mikrobiellen Lipase in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittel und zugesetztem Wasser unter Bildung eines Reaktionsgemisches, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch aus Sterolen und Stanolen im Wesentlichen aus Campesterol, Campestanol, Sitosterol und Sitostanol besteht, und außerdem dadurch gekennzeichnet, dass die Lipase in dem Reaktionsgemisch aus Pseudomonas stutzeri erhalten wurde. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einer Temperatur von 30°C bis 90°C und einem Druck von unter Atmosphärendruck durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Druck weniger als 300 mbar ist. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, das das Verhältnis der Masse an Lipase in dem Reaktionsgemisch zu der Masse an Stanolen und Sterolen in dem Gemisch aus Stanolen und Sterolen weniger als 0,05 ist. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Fettsäureester oder die Fettsäureester in größerer Molmenge vorliegt/vorliegen als die Stanole und Sterole. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einer Temperatur von 30°C bis 90°C und bei einem Druck von unter Atmosphärendruck durchgeführt wird. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fettsäureester oder die Fettsäureester Methyl- oder Ethylester von Fettsäuren sind. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipase nach einem Zeitraum der Reaktionszeit von nicht weniger als 1 Stunde aus dem Reaktionsgemisch entfernt wird, um ein umgesetztes Gemisch zu bilden. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das umgesetzte Gemisch als eine Komponente in fetthaltigen Nahrungsmitteln verwendet wird. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das umgesetzte Gemisch bei einem Druck von 10 mbar destilliert wird, um ein Destillat und einen schweren Rückstand zu bilden. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der schwere Rückstand als Komponente in fetthaltigen Nahrungsmitteln eingesetzt wird.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com