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Dokumentenidentifikation DE60215729T2 30.08.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001285968
Titel Selektive Transesterifikation von Stanole in Mischungen die Sterole und Stanole enthalten
Anmelder Härting, Thomas Francis, Las Condes, Santiago, CL
Erfinder Diaz, Miguel Angel Fuenzalida, Santiago 443 3500, CL;
Basterrechea, Martinez Irene, Santiago 443 3500, CL;
Rojas, Markovits Alejandro, Santiago 443 3500, CL;
Schersl, Markovits Endre, Santiago 443 3500, CL
Vertreter Meissner, Bolte & Partner GbR, 81679 München
DE-Aktenzeichen 60215729
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 08.08.2002
EP-Aktenzeichen 022555460
EP-Offenlegungsdatum 26.02.2003
EP date of grant 02.11.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 30.08.2007
IPC-Hauptklasse C12P 33/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12P 7/64(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur selektiven Umesterung von Stanolen in Gemischen, die Sterole und Stanole umfassen, und auf ein Verfahren zur Abtrennung von Sterolen aus Gemischen, die Sterole und Stanole enthalten.

Steroide aus Pflanzen (Phytosteroide) oder Tieren (Zoosteroide) sind chemische Verbindungen, deren Moleküle einen Perhydrocyclopentanophenanthren-Kern aufweisen; und einige von ihnen haben auch eine Kohlenwasserstoffkette, die an den Kohlenstoff 17 dieses Kerns gebunden ist.

Unter den Steroiden gibt es Stereoidalkohole, die wenigstens eine an das C-3 des Kerns gebundene Hxydroxylgruppe aufweisen. In der vorliegenden Erfindung steht der Ausdruck "Sterol" für einen Steroidalkohol, der eine Doppelbindung am Kohlenstoff C-5 des Kerns umfasst. Entsprechend steht der Ausdruck "Stanol" für einen Steroidalkohol, dem eine Doppelbindung am Kohlenstoff C-5 des Kerns fehlt. Sterole und Stanole, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind, sind unter Sterolen und Stanolen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.

Signifikante Mengen an Steroidalkoholen können im Rückstand der Entschleimung von Speiseölen wie Sojabohnenöl, Sonnenblumenöl, Maiskeimöl, Palmöl, Rapssamenöl, oder in den so genannten Holzalkoholen, die von Schwarzlaugenseifen aus dem Kraft-Cellulose-Aufschlussverfahren oder aus Talgöl oder aus dem Rückstand der Talgöldestillation, bekannt als Talgölpech, hergeleitet sind, gefunden werden.

Die meisten Steroidalkohole aus Pflanzen oder Phytosterole, die auch Holzalkohole umfassen, enthalten üblicherweise sowohl Sterole als auch Stanole.

Verfahren für die Gewinnung und Reinigung von Phytosterolen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Tabelle I unten zeigt eine typische Zusammensetzung von Holzalkoholen aus Schwarzlaugenseifen.

Tabelle I. Typische Zusammensetzung von Holzalkoholen aus Schwarzlaugenseifen

Gemische von Steroidalkoholen enthalten gelegentlich außer freien Steroidalkoholen Steryl- oder Stanolester. Um das hierin offenbarte Trennverfahren in diesen Fällen zu verwenden, müssen die Gemische zuerst hydrolysiert werden, entweder durch enzymatische Hydrolyse oder alkalische Verseifung, und das resultierende, nicht verseifbare Material, das Sterole und Stanole umfasst, kann, sobald es aus dem hydrolisierten oder verseiften Gemisch gewonnen wurde, dem Fraktionierungsverfahren der vorliegenden Erfindung unterworfen werden. Das hierin offenbarte Verfahren kann mit Gemischen aus Steroidalkoholen entweder pflanzlichen oder tierischen Ursprungs eingesetzt werden, und kann auch mit einem beliebigen nicht verseifbaren Gemisch, das Sterole und Stanole umfasst, verwendet werden.

Sowohl Sterole als auch Stanole haben bedeutende kommerzielle Anwendungen. Sterole, hauptsächlich beta-Sitosterol, kann durch Fermentation in nützliche Zwischenprodukte für die Synthese von Steroidwirkstoffen transformiert werden. Stanole sind für eine mikrobielle Umwandlung weniger geeignet, daher kann es ratsam sein, sie aus dem Gemisch von Steroidalkoholen vor einer Fermentation zu entfernen.

Andererseits sind Stanole, die mit organischen Säuren, im Allgemeinen Fettsäuren, verestert sind, oder Stanylester von Fettsäuren, wirksame Blutcholesterin senkende Mittel und sind als solche als Functional Food-Ingredienzien für Nahrungsmittelprodukte sehr gefragt.

Daher könnte es zweckmäßig sein, Sterole von Stanolen in Gemischen, die Steroidalkohole umfassen, abzutrennen, um reine Sterole für die pharmazeutische Industrie und Stanylester oder Stanole für die Functional Food-Industrie zu erhalten. Allerdings sind keine Verfahren zur Abtrennung von Sterolen von Stanolen bekannt. Daher muss die pharmazeutische Industrie zu Steroidalkoholgemischen greifen, deren Fermentation, wie oben erläutert wurde, weniger effizient ist als die von reinen Sterolen, und die Functional Food-Industrie muss zum Erhalt von Stanolen oder Stanolestern auf die Transformation des gesamten Gemisches von Steroidalkoholen zu Steroidestern greifen. Ein derartiges Verfahren ist im US-Patent Nr. 5 502 045 offenbart. Das offenbarte Verfahren besteht in der katalytischen Hydrierung des Gemisches von Steroidalkoholen, um Sterole in Stanole zu reduzieren, gefolgt von der chemischen Umesterung des Gemisches unter Verwendung von Methylestern von Fettsäuren in Gegenwart des Katalysators Natriumethylat. Unter seinen Nachteilen eliminiert eine Hydrierung das wertvolle beta-Sitosterol, und außerdem führt das Verfahren zur Bildung eines asymmetrischen Kohlenstoffzentrums in C-5, so dass enantiomere Gemische mit nicht-natürlichen Konfigurations-Isomeren und unbekannten metabolischen Wirkungen erzeugt werden könnten.

Es ist daher zweckmäßig, Sterole und Stanole aus Gemischen von Steroidalkoholen abzutrennen, um Qualitätssterole zur Fermentation oder zu anderen Verwendungen und natürliche Stanole und Stanolester als Functional Food-Ingredienzien zu erhalten.

Allerdings haben beta-Sitostanol und beta-Sitosterol, deren Strukturen unten gezeigt sind, praktisch identische physikalische und chemische Eigenschaften, was eine wirksame Technik, um sie zu trennen, fast undenkbar macht. Diese Tatsache spiegelt sich in dem völligen Fehlen einer Referenz bezüglich dieses Gegenstands im Fachgebiet wieder.

Weber et al. (2001) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(1), Seiten 67-71, offenbaren die Verwendung von Candida rugosa-Lipase, um Stanole und Sterole umzuestern. Es wird bewiesen, dass es Unterschiede in der Effizienz des enzymatischen Verfahrens gibt, und zwar abhängig von dem Substrat (Stanol oder Sterol) und der verwendeten Quelle der Estergruppe.

In der vorliegenden Erfindung wurde beobachtet, dass bestimmte mikrobielle Lipasen, die nachfolgend als selektive Lipasen bezeichnet werden, überraschenderweise und unerwartet eine selektive Umesterungswirkung bei Stanolen in einem Reaktionsgemisch zeigen, wenn ein Reaktionsgemisch, das Sterole, Stanole und eine oder mehrere Komponenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus organischen Säuren, die mit kurzkettigen aliphatischen Alkoholen verestert sind, umfasst, mit derartigen selektiven Lipasen in Kontakt gebracht wird, wodurch ein Reaktionsgemisch gebildet wird.

Bei Abtrennung der selektiven Lipase aus dem Reaktionsgemisch wird ein umgesetztes Gemisch erhalten. Bei den gegebenen überraschenden Charakteristika der selektiven Lipase wird in dem umgesetzten Gemisch die Umwandlung, wie sie oben definiert ist, von Stanolen in Stanylester höher als die Umwandlung von Sterolen in Sterylester.

Die Umwandlung von Stanolen in Stanylester (XStanol) in einem umgesetzten Gemisch wird mittels des folgenden Ausdrucks errechnet: Xstanole = (C0stanole – Cstanole)//C0stanole worin:

C0stanole
die Konzentration von Stanolen im Reaktantengemisch ist,
Cstanole
die Konzentration von Stanolen im umgesetzten Gemisch ist.

In ähnlicher Weise wird die Umwandlung von Sterolen in Sterylester (Xsterole) mit Hilfe des folgenden Ausdrucks errechnet: Xsterole = (C0sterole – Csterole)/C0sterole worin:

C0sterole
die Konzentration an Sterolen im Reaktantengemisch ist,
Csterole
die Konzentration von Sterolen im umgesetzten Gemisch ist.

Konzentrationen können in einer beliebigen Einheit, vorzugsweise als Gewichtsprozent, angegeben werden. Selektive Lipase ist eine beliebige Formulierung, die selektive Lipaseaktivität ausdrückt, und kann eine oder mehrere Verbindungen umfassen, die aus einer Fermentationsbrühe eines Mikroorganismus stammen, oder eine oder mehrere Verbindungen umfassen, die aus einem zellulären Extrakt eines Mikroorganismus stammen. In diesen Fällen wird die Formulierung als freie selektive Lipasepräparation bezeichnet. Alternativ kann die Formulierung einen inerten Feststoff umfassen, der eine oder mehrere Verbindungen, die aus einer Fermentationsbrühe eines Mikroorganismus stammen, immobilisiert, oder einen inerten Feststoff umfassen, der eine oder mehrere Verbindungen, die aus einem zellulären Extrakt eines Mikroorganismus stammen, immobilisiert. In diesen Fällen wird die Formulierung immobilisierte selektive Lipasepräparation genannt. Verbindungen, die aus einer Fermentationsbrühe von Bakterien der Gattung Alcaligenes, zum Beispiel Alcaligenes sp., stammen, oder Verbindungen, die aus einem zellulären Extrakt von Bakterien der Gattung Alcaligenes, zum Beispiel Alcaligenes sp., stammen, sind zur Herstellung selektiver Lipase, entweder von freier oder immobilisierter, geeignet.

Eine lipolytische Einheit ist die Menge an Formulierung, die 1 Mikromol Fettsäure pro Minute bei 37°C aus Olivenöl, das in Gegenwart von Polyvinylalkohol emulgiert wurde, freisetzt. Das Verfahren zur Bestimmung der lipolytischen Aktivität, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist im US-Patent Nr. 5 219 733 beschrieben, das eine Standardtechnik zur Messung lipolytischer Aktivität darstellt. Es wurde beobachtet, dass es eine Korrelation zwischen hydrolytischer und Umesterungs-Aktivität der selektiven LIpasen der vorliegenden Erfindung gibt.

Die Reaktion kann entweder in Gegenwart einer stöchiometrischen Menge oder eines stöchiometrischen Überschusses an Estern von organischen Säuren durchgeführt werden.

Im ersten Fall umfasst das umgesetzte Gemisch Steroidalkohole und Ester von Steroidalkoholen.

Im zweiten Fall umfasst das umgesetzte Gemisch zusätzlich Ester von organischen Säuren.

In beiden Fällen kann das umgesetzte Gemisch ohne weitere Verarbeitung als Nahrungsmittel-Ingredienzien, wenn es gewünscht wird, eingesetzt werden.

In den meisten Fällen kann es jedoch wünschenswert sein, das Gemisch zu fraktionieren, wodurch nicht-veresterte Sterole von der veresterten Fraktion des Gemisches abgetrennt werden.

Es gibt verschiedene Verfahren zur Abtrennung dieser Fraktionen aus dem umgesetzten Reaktionsgemisch, die verwendet werden können, wenn das umgesetzte Reaktionsgemisch Ester von organischen Säuren umfasst oder wenn es diese nicht umfasst. Das umgesetzte Gemisch kann durch Destillation bei niedrigem Druck entweder in einer Kurzwege-Destillationskolonne mit einem inneren Kühler oder in einem Dünnfilmverdampfer mit Fraktionierkolonne und äußerem Kühler durch Destillation bei niedrigem Druck in verschiedene Fraktionen getrennt oder aufgelöst werden, wie es in den Beispiele unten beschrieben wird. Einige der Verfahren, die für die Gewinnung von Sterolen aus umgesetzten Gemischen nützlich sind, umfassen:

Verfahren 1

Das umgesetzte Gemisch wird einem Destillationssystem zugeführt, um ein Destillat, das Ester von organischen Säuren umfasst, und einen Rückstand, der Sterole und Ester von Steroidalkoholen umfasst, zu produzieren.

Der Rückstand (oder ein Teil davon) wird erneut destilliert, um ein Destillat zu produzieren, das Sterole umfasst.

Verfahren 2

Das umgesetzte Gemisch wird einem Destillationssystem zugeführt, um ein Destillat, das Ester von organischen Säuren und Sterole umfasst, und einen Rückstand, der Ester von Steroidalkoholen umfasst, zu produzieren. Das Destillat (oder ein Teil davon) wird erneut destilliert, um ein Destillat und einen Rückstand, der Sterole umfasst, zu produzieren.

Verfahren 3

Das umgesetzte Gemisch wird einem Destillationssystem zugeführt, um ein Destillat und einen Rückstand, der Sterole und Ester von Steroidalkoholen umfasst, zu produzieren. Der Rückstand wird kristallisiert, wie es in der chilenischen Patentanmeldung Nr. 2026/99 offenbart ist, wodurch eine kristallisierte Fraktion erhalten wird, die Sterole umfasst.

Verfahren 4

Das umgesetzte Gemisch wird kristallisiert, wie es in der chilenischen Patentanmeldung Nr. 2026/99 offenbart ist, wobei eine kristallisierte Fraktion erhalten wird, die Sterole umfasst.

Kurzwege-Destillationskolonnen oder Molekular-Destillationskolonnen mit inneren Kühlern, Dünnfilmverdampfer mit Fraktionierkolonne und äußerem Kühler oder Kombinationen dieser Destillationssysteme werden als zur Durchführung der oben beschriebenen Destillierverfahren geeignet angesehen. Arbeitsdrücke der Kolonnen liegen im Bereich von 0,01 bis 50 mbar; die Temperatur der Verdampfungsoberflächen liegt im Bereich von 120 bis 400°C und die Temperatur der kondensierenden Oberflächen liegt im Bereich von 20 bis 200°C.

Gemische eines Kohlenwasserstoffs, eines kurzkettigen aliphatischen Alkohols und Wasser sind geeignete Lösungsmittel zum Kristallisieren des umgesetzten Gemisches in den Verfahren 3 und 4.

Ester von Steroidalkoholen, die nach einem der Verfahren 1, 2, 3 oder 4 erhalten worden waren, können als Cholesterin senkende Nahrungsmittel-Ingredienzien eingesetzt werden. Um allerdings den Gehalt an Stanylestern der Ester von Steroidalkoholen, die nach einem der Verfahren 1, 2, 3 oder 4 erhalten worden waren, zu erhöhen, können diese Ester außerdem mit Natrium- oder Kaliumhydroxid in einer alkoholischen oder wässrigen Lösung verseift werden, um ein verseiftes Gemisch zu ergeben, das freie Steroidalkohole und Fettsäureseifen und Wasser oder Alkohol enthält, oder diese Ester von Steroidalkoholen können enzymatisch mit einer geeigneten Lipase hydrolysiert werden, wodurch Steroidalkohole und Fettsäuren produziert werden. Komponenten des verseiften Gemisches können getrennt werden, um Fraktionen zu produzieren, die Fettsäureseifen und freie Steroidalkohole enthalten. Sobald die Steroidalkohole von den verseiften oder hydrolysierten Gemischen abgetrennt sind, können sie selektiv unter Bildung eines umgesetzten Gemisches umgeestert werden, welches dann, wenn es gewünscht wird, durch eines der Verfahren 1, 2, 3 oder 4 wiederum fraktioniert werden kann.

Eine Umesterung von Steroidalkoholen, gefolgt von einer Trennung von Estern von Steroidalkoholen, Hydrolyse oder Verseifung dieser Ester und Abtrennung von Steroidalkoholen aus dem verseiften oder hydrolysierten Gemisch, außerdem Umesterung der abgetrennten Steroidalkohole kann so oft wie nötig wiederholt werden, um Sterol-freie Stanolester oder Stanole zu erhalten.

Zur Erhöhung des Gehalts an Sterolen der Steroidalkohole, die aus dem umgesetzten Gemisch erhalten wurden, können die genannten Alkohole, sobald sie nach einem der Verfahren 1, 2, 3 oder 4 aus dem umgesetzten Gemisch abgetrennt sind, selektiv umgeestert und wie oben beschrieben verarbeitet werden, um Steroidalkohole mit einem höheren Gehalt an Sterolen zu produzieren. Das vollständige Verfahren kann so viele Male, wie es nötig ist, um Stanol-freie Steroidalkohole zu erhalten, wiederholt werden.

Die Umesterungsreaktion in dem Umsetzungsgemisch wird vorzugsweise in Rührreaktoren bei verringerten Drücken, vorzugsweise bei weniger als 300 mbar, und bei Temperaturen im Bereich von 30 bis 90°C in Gegenwart einer geeigneten Menge an selektiver Lipase, entweder frei oder immobilisiert, durchgeführt.

Organische Säuren, deren Ester in der Umesterungsreaktion eingesetzt werden können, umfassen Fettsäuren, die von Speiseölen, zum Beispiel Rapsöl, Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl, Sonnenblumenöl, Palmöl, Fischölen, stammen, oder können eine oder mehrere Fettsäuren mit 2 bis 14 Kohlenstoffatomen pro Molekül enthalten. Diese Fettsäuren können mit einem kurzkettigen aliphatischen Alkohol, zum Beispiel Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol, in Gegenwart von Schwefelsäure als Katalysator, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, verestert werden.

Wenn es gewünscht wird, die Umesterungsreaktion im Reaktionsgemisch zu beenden, wird die selektive Lipase vom Reaktionsgemisch durch Filtrieren oder Zentrifugieren oder durch andere geeignete Trenntechniken abgetrennt, wodurch das umgesetzte Gemisch erhalten wird.

Nachdem was offenbart wurde, umfasst ein Verfahren zur Abtrennung einer Fraktion, die Sterole umfasst, aus einem Gemisch, das Sterole und Stanole umfasst, die folgenden Schritte:

  • a) Bilden eines Reaktionsgemisches durch In-Kontakt-Bringen einer selektiven Lipase mit einem Reaktantengemisch, das Sterole und Stanole und einen Ester, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Estern von organischen Säuren mit einem kurzkettigen aliphatischen Alkohol, umfasst;
  • b) Bilden eines umgesetzten Gemisches durch Abtrennen der selektiven Lipase aus dem Reaktionsgemisch, und
  • c) Abtrennen einer Fraktion, die Sterole umfasst, aus dem umgesetzten Gemisch.

Ein Verfahren zur selektiven Umesterung von Stanolen in Gemischen, die Sterole und Stanole umfassen, umfasst die Bildung eines Reaktionsgemisches durch In-Kontakt-Bringen einer selektiven Lipase mit einem Reaktantengemisch, das Sterole und Stanole und einen Ester, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Estern einer organischen Säure mit einem kurzkettigen aliphatischen Alkohol, umfasst.

Die folgenden Beispiele erläutern Wege zur Durchführung der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1. Herstellung von Ethylester von Sonnenblumenöl-Fettsäuren

15,6 l Ethanol technischer Qualität, 313 g konzentrierte Schwefelsäure und 10,3 kg handelsüblicher Sonnenblumenöl-Fettsäuren wurden unter leichtem Stickstoffstrom in einen 40 l Reaktor aus rostfreiem Stahl mit Rührer eingefüllt, der mit Erhitzungsvorrichtung, Kühlungsspirale, Einfülltrichter, Säule, Kühler, Dean-Stark-Separator, Bodenventil, Stickstoffinjektor und Vakuumanschluss zur Destillation mit reduziertem Druck ausgestattet war. Der Stickstoffstrom wurde unterbrochen und das Gemisch wurde 10 Stunden bei 77°C unter Rückfluss erhitzt, wobei die Säurezahl periodisch überwacht wurde. Als die Säurezahl 6,4 erreichte, wurde Ethanol abdestilliert, bis 90 % der Anfangsmenge an Ethanol wiedergewonnen war. Das Gemisch wurde auf 60°C abgekühlt und mit 7 kg Hexan verdünnt. Restliche Säure wurde mit 8 kg einer wässrigen Lösung von Natriumcarbonat technischer Qualität mit 10 % neutralisiert. Die wässrige Phase wurde eliminiert und die organische Phase wurde 3-mal mit 1 kg eines Wasser:Ethanol-Gemisches (1:1) bis pH 6,8 gewaschen. Die neutrale organische Phase wurde bei 95°C und 25 mbar von Lösungsmittel befreit. Schließlich wurden 10,6 kg Ethylester von Fettsäuren von Sonnenblumenöl erhalten.

Beispiel 2. Umesterung von Holzsterolen mit immobilisierter selektiver Lipase

Ein Reaktionsgemisch, dessen Anfangszusammensetzung in Tabelle 2 unten zu sehen ist, wurde gebildet, indem 1000 ml Ethylester von Fettsäuren aus Sonnenblumenöl, 180 g Holzalkohol und 10 g immobilisierte Lipase von Alcaligenes sp. (MEITO SANGYO Co., Ltd., Lipase-QLC) mit einer lipolytischen Aktivität von 20 000 Einheiten pro Gramm in einem 2000 SCHOTT-DURAN-Reaktionskolben mit rundem Boden und Planschliffverbindung eingefüllt wurde, wobei ein Planschliffdeckel mit 4 Standardhälsen angeordnet war. Der Reaktor wurde teilweise in ein Wasserbad mit 60°C eingetaucht. Der Reaktorauslass wurde an eine Vakuumpumpe (TRIVAC B D 16B) angeschlossen, die den Druck von 2 mbar während der Reaktion im Reaktor aufrecht hielt. Ein Rühren erfolgte mit Hilfe eines Magnetrührers. Das Rühren wurde jede Stunde gestoppt, was das Absetzen der immobilisierten Lipase ermöglichte, und das Vakuum wurde unterbrochen, um eine Probe zur Analyse zu entnehmen. Der gesamte Vorgang dauerte weniger als 1 Minute.

Die Analyse von freien Stanolen und Sterolen wurde unter Verwendung eines Hewlett-Packard HP 6890-Serie 2-Chromatographen durchgeführt, der mit einer HP-5-Kapillarsäule mit 30 m Länge, 0,32 mm Durchmesser und 0,25 mm Film ausgestattet war. Die Ofentemperatur war 300°C, die Injektor- und Detektortemperatur war 320°C. der Heliumträgerfluss war 0,92 ml/min mit einer 60:1-Aufspaltung und einem 15 Minuten-Programm. Die Details der Analyse sind in der chilenischen Patentanmeldung Nr. 85/98 offenbart.

Tabelle 2 zeigt die Veränderung von relativer und absoluter Gewichtskonzentration an freien Stanolen und Sterolen mit der Reaktionszeit von Beispiel 2.

Tabelle 2. Veränderung der Konzentration (relative und absolute) von Stanolen und Sterolen mit der Zeit nach Beispiel 2

1 zeigt die Veränderung des Massenverhältnisses von Sterolen zu Stanolen im Lauf der Zeit während der Reaktion von Beispiel 2.

2 zeigt die Veränderung der Umwandlung von Sterolen und Stanolen in Ester mit der Zeit während der Reaktion von Beispiel 2.

Während der Reaktion erhöhte sich das Massenverhältnis von Sterolen zu Stanolen um mehr als das Zwölffache. Eine Umwandlung von Stanolen war nahezu 100 %, während die Umwandlung von Sterolen kaum 20 % war; diese Tatsache beweist eine überraschende und unerwartete Selektivität der Lipase für die Umesterung von Stanolen, wodurch ein praktisch Stanol-freies Gemisch von Sterolen erhalten werden kann. Es kann auch beobachtet werden, dass Campesterol, dessen Anfangskonzentration niedriger als die Hälfte der Anfangskonzentration von Stanolen war, während der Reaktion praktisch intakt bleibt, was die überraschende Selektivität der verwendeten Lipase bestätigt.

Beispiel 3. Umesterung von Holzsterolen mit freier Lipase

Ein Reaktionsgemisch der in Tabelle 3 unten gezeigten Zusammensetzung wurde gebildet, indem 854 g Ester von Fettsäuren von Sonnenblumenöl, 141 g Holzsterole und 16 g freie selektive Lipase von Alcaligenes sp. (MEITO SANGYO Co., Ltd., Lipase-QL) mit einer Aktivität von 30 000 Einheiten pro Gramm in den Reaktor von Beispiel 2 gefüllt wurden. Temperatur und Druck im Reaktor waren 60°C bzw. 2 mbar. In Intervallen wurden Proben entnommen, bei 60°C und 10 000 U/min für 15 Minuten zentrifugiert, um die in der Probe dispergierte Lipase abzutrennen. Resultate sind in Tabelle 3 gezeigt. Wie durch Vergleich der Daten der Tabelle 2 und Tabelle 3 beobachtet werden kann, gibt es keine signifikanten Unterschiede in der Umwandlung zwischen immobilisierter und freier Lipase.

Tabelle 2. Veränderung der Konzentration (relative und absolute) von Stanolen und Sterolen mit der Zeit nach Beispiel 3

Beispiel 4. Enzymatische Umesterung von Sterolen mit Ethylacetat

Es wurde ein reaktives Gemisch gebildet, indem 300 g Ethylacetat (Mallinckrodt AR 4992) mit 0,01 % Feuchtigkeit, 100,3 g Holzalkohole und 6 g immobilisierte selektive Lipase Alcaligenes sp. (MEITO SANGYO Co., Ltd., Lipase-QLC) in einen 2 l Reaktionskolben mit rundem Boden und Planschliff mit einem Planschliffdeckel gefüllt wurden, der mit 5 Standardhälsen, einem zylindrischen Messtropftrichter mit Druckausgleichrohr und einem Dean-Stark-Destillationskopf, der mit einem Kühler und einem Glaskolben zur Aufnahme von Destillaten verbunden war, ausgestattet war.

Der Reaktor wurde teilweise in ein thermostatisiertes Bad mit 60°C eingetaucht. Rühren erfolgte mit einem Magnetrührer. Der Druck im Reaktor war 200 mbar. Frisches Ethylacetat wurde aus dem Tropftrichter mit der Geschwindigkeit der Destillatgewinnung zugeführt. Nach 4-stündiger Reaktion wurde das umgesetzte Gemisch gewonnen und filtriert. Das filtrierte umgesetzte Gemisch wurde von Lösungsmittel befreit und es wurden 101,1 g Rückstand gewonnen. Der Rückstand wurde unter Verwendung von Gaschromatographie analysiert. Die Umwandlung der Sterole war 3,1 % und die der Stanole war 45,9 %.

Beispiel 5. Fraktionierung eines umgesetzten Gemisches

950 g des umgesetzten Gemisches, das wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt worden war, wurden mit einer Rate von 1,7 g/min in eine UIC KDL-4-Kurzwege-Destillationskolonne geführt. Die Temperatur der verdampfenden Oberfläche war 180°C. Die Temperatur des inneren Kühlers war 30°C und der Druck in der Kolonne war 10 mbar. Eine Destillatfraktion, die von Sterolen und Stanolen frei war, die Ethylester von Sonnenblumenfettsäuren in einer Menge von 773 g umfasste, wurde aus der Säule mit dem inneren Kühler gesammelt und eine getrennte Restfraktion von 171 g wurde am Boden der Kolonne gesammelt.

165 g des Rückstands wurden mit 1,5 g/min zu der UIC KDL-4-Kurzwege-Kolonne geführt, welche als Dünnfilmverdampfer (ohne inneren Kühler) verwendet wurde, und wobei das Destillat oder der Dampfauslass der Kolonne mit einer Fraktionierungskolonne mit gepacktem Bett (8 mm Poropak-stainless steel-Berl-Sattelkörper-Packung) mit Überkopfkondensator verbunden war. Die Verdampfungsoberfläche der Dünnfilmkolonne wurde bei 250°C gehalten und die Temperatur des äußeren Kühlers war 150°C. Der Arbeitsdruck war 0,1 mbar. 155 g einer Destillatfraktion, die 96 % der gesamten Steroidalkohole umfasste, und 50-mal so viel Sterole wie Stanole enthielt, wurde am Überkopfkühler gesammelt und 7 g einer Restfraktion am Boden der KDL-4-Kolonne, die weniger als 1 % freie Steroidalkohole enthielt, wurden gesammelt.

Beispiel 6. Fraktionierung eines umgesetzten Gemisches

920 g umgesetztes Gemisch, das wie in Beispiel 3 beschrieben produziert worden war, wurden mit einer Rate von 1,5 g/min zu der UIC KDL-4-Kurzwege-Destilationskolonne geführt. Die Verdampfungsoberfläche wurde bei einer Temperatur von 180°C gehalten und der Innenkühler wurde bei einer Temperatur von 30°C gehalten. Der Druck in der Kolonne war 10 mbar. Eine Destillatfraktion, die frei von Sterolen und Stanolen war, die Ethylester von Sonnenblumenfettsäuren in einer Menge von 771 g enthielt, wurde aus der Kolonne am inneren Kühler gesammelt und eine getrennte 145 g-Restfraktion wurde am Boden der Kolonne gesammelt.

140 g des Rückstands, 400 g Hexan, 20 g Ethanol und 20 g Wasser wurden in einen 1 l-Glaskolben gefüllt und bis zur Auflösung unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen der Lösung auf 5°C und Stehen lassen, um die Bildung von Kristallen zu ermöglichen, Filtrieren und Trocknen wurden 130 g Kristalle, die 86 % Steroid-Ikohole umfassten, die 25-mal so viel Sterole wie Stanole enthielten, gewonnen.

Beispiel 7. Verseifung des Rückstands eines Dünnfilmverdampfers

5 g des Rückstands des Dünnfilmverdampfers, der in Beispiel 5 erhalten worden war, und 20 ml einer alkoholischen 8 %igen Natriumhydroxidlösung wurden in einen 100 ml Erlenmeyer-Glaskolben gefüllt. Das Gemisch wurde für 1 Stunde unter Rückfluss erhitzt. Dann wurden 20 ml destilliertes Wasser zugesetzt und das Gemisch wurde 4-mal mit 50 ml-Portionen Hexan extrahiert.

Die Hexanphase wurde bis zum neutralen pH mit 10 ml-Portionen eines Gemisches aus Wasser:Ethanol (1:1) gewaschen und wurde in einem Rotationsverdampfer von Lösungsmittel befreit. 2,5 g eines von Lösungsmittel befreiten Rückstands, der 97 % Steroidalkohole umfasste (58 % Stanole, 42 % Sterole), wurden erhalten.

Beispiel 8. Wiederveresterung

30 ml Methylester von Fettsäuren von Rapsöl (Härting S.A.), 5000 g Holzalkohole, deren relative Zusammensetzung in Tabelle 4 gezeigt ist, und 250 g immobilisierte Lipase von Alkaligenes sp. (MEITAO SANGYO Co., Ltd., Lipase-QLC) mit einer lipolytischen Aktivität von 20 000 Einheiten pro Gramm wurden in einen 40 l-stainless steel-Rührreaktor gefüllt, der mit einer elektrischen Heizung, einer Kühlspirale, einem Einfülltrichter, einer Säule, einem Kühler, einem Dean-Stark-Separator, einem Bodenventil, einem Stickstoffinjektor und einem Vakuumanschluss zur Destillation unter reduziertem Druck ausgestattet war.

Das Gemisch wurde unter konstanter Bewegung mit 300 U/min bei reduziertem Druck von 20 mbar für 10 Stunden auf 60°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung eines 50 Mikrometer-Polyesterbeutels filtriert und es wurden 31,75 kg eines umgesetzten Gemisches gewonnen. Das filtrierte Enzym wurde mit Hexan gewaschen und getrocknet.

Das umgesetzte Gemisch wurde mit einer Rate von 12 g/min zu der UIC KDL-4-Kurzwege-Destillationskolonne geführt. In diesem Fall wurde die Kolonne als Dünnfilmverdampfer verwendet und die Destillate von der verdampfenden Oberfläche der Kolonne wurden zu einer äußeren Kolonne mit gepacktem Bett (8 mm Poropak-stainless steel-Berl-Sattelkörper) mit Überkopfkühler geführt. Die Temperatur der Verdampfungsoberfläche war 200°C und die Temperatur des Kühlers über der gepackten Kolonne war 30°C. Der Druck in der KDL-4-Kolonne war 5 mbar. 23,15 kg einer Destillatfraktion wurden am Überkopfkühler und 7,40 kg einer Restfraktion wurden am Boden der KDL-4-Kolonne gewonnen.

Der Rückstand wurde wieder zu der Dünnfilm-Verdampferanordnung, wie sie oben beschrieben wurde, geführt. Die Temperatur der Verdampfungsoberfläche wurde bei 250°C gehalten und die Temperatur des Überkopfkühlers war 150°C. Der Arbeitsdruck war 0,1 mbar. Es wurden 5,23 kg einer Destillatfraktion am Überkopfkühler und 2,07 kg einer Restfraktion am Boden der KDL-4-Kolonne gesammelt. Eine chromatographische Analyse der Restfraktion detektierte keine Sterole oder Stanole.

2,0 kg des Rückstands wurden in den 40 l-stainless steel-Rührreaktor gefüllt und 3 l einer ethanolischen Lösung von Natriumhydroxid mit 8 % wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde für 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt und auf 25°C abgekühlt, indem 3 l Wasser zugesetzt wurden; das resultierende Gemisch wurde 4-mal mit 10 l-Portionen Hexan extrahiert. Die Hexanphase wurde zu neutralem pH gewaschen und dann teilweise in demselben Reaktor von Lösungsmittel befreit. Das Hexankonzentrat wurde schließlich in einem Rotationsverdampfer bei reduziertem Druck von Lösungsmittel befreit. 1070 g eines von Lösungsmittel befreiten Rückstands (Rückstand 3, Tabelle 4), dessen Zusammensetzung in Tabelle 4 gezeigt ist, wurden gesammelt.

4,00 kg Destillat aus der ersten Destillation, 800 g des von Lösungsmittel befreiten Rückstands und 40 g der immobilisierten Lipase, die im vorliegenden Beispiel gewonnen worden war, wurden in einen 6 l-SCHOTT-DURAN-Reaktor gefüllt. Der Reaktor wurde teilweise in ein thermostatiertes Bad mit 60°C eingetaucht.

Das Gemisch wurde bei reduziertem Druck von 20 mbar für 2 Stunden unter Bewegung gehalten, dann durch einen 50 Mikrometer-Polyesterbeutel filtriert. 4,75 kg des umgesetzten Gemisches wurden gewonnen. Das filtrierte Enzym wurde mit Hexan gewaschen und getrocknet.

2,00 kg des umgesetzten Gemisches wurden mit einer Rate von 2 g/min zu der UID KDL-4-Kurzwege-Kolonne geführt, wobei die Verdampfungsoberfläche bei einer Temperatur von 180°C gehalten wurde und der innere Kühler bei einer Temperatur von 30°C gehalten wurde. Der Druck der Kolonne war 10 mbar. 1541 g einer Destillatfraktion und 432 g eines Rückstands wurden aus der Kolonne gewonnen.

420 g des Rückstands wurden mit einer Rate von 1,5 g/min zu der Fallfilmverdampferanordnung, wie sie oben beschrieben wurde, geführt. Die Temperatur der Verdampfungsoberfläche wurde bei 250°C gehalten und die Temperatur des Überkopfkühlers war 150°C. Der Druck war 0,1 mbar. 294 g Destillatfraktion wurden am Kühler und 109 g einer Restfraktion wurden am Boden der Kolonne gesammelt.

100 g des zuletzt genannten Rückstands wurden mit einer Rate von 1,5 g/min zu der UIC KDL-4-Kurzwege-Destillationskolonne geführt, wobei die Verdampfungsoberfläche bei der Temperatur von 250°C gehalten wurde und die Kühlertemperatur bei 100°C gehalten wurde. Der Druck in der Kolonne war 0,1 mbar. 96 g der fünften Destillatfraktion am inneren Kühler und 3 g einer Rückstandsfraktion (Rückstand 7 in Tabelle 4) wurden am Boden der Kolonne gesammelt.

2 g der zuletzt genannten Destillatfraktion wurden wie in Beispiel 7 beschrieben verseift. 1 g von Lösungsmittel befreiter Hexanextrakt, dessen Zusammensetzung wie in Tabelle 4 gezeigt ist, wurde gesammelt.

Tabelle 4. Gehalt an Steroidalkohol nach Beispiel 8


Anspruch[de]
Verfahren zur Umesterung eines Gemisches aus Stanolen und Sterolen, umfassend Umsetzen des Gemisches mit einem Ester oder mehreren Estern einer organischen Säure mit einem kurzkettigen aliphatischen Alkohol in Gegenwart einer mikrobiellen Lipase unter Bildung eines Reaktionsgemisches, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipase von Alcaligenes sp. stammt, und außerdem dadurch gekennzeichnet, dass in dem umgesetzten Gemisch die Umwandlung von Stanolen in Stanylester stärker ist als die Umwandlung von Sterolen in Sterylester. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Carbonsäureester oder die Carbonsäureester in einer größeren molaren Menge als die Stanole und Sterole vorliegen. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einer Temperatur von zwischen 30°C und 90°C und bei einem Druck unter Atmosphärendruck durchgeführt wird. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der organische Säureester oder die organischen Säureester mit einem kurzkettigen aliphatischen Alkohol Methyl- oder Ethylester von Fettsäuren sind. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewinnung einer Fraktion, die Stanyl- oder Sterylester umfasst, aus dem umgesetzten Gemisch einen oder mehrere Destillationsschritte bei reduziertem Druck oder einen oder mehrere Destillations- und Kristallisationsschritte umfasst. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktion als Komponente in Fettnahrungsmitteln verwendet wird.






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