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Dokumentenidentifikation DE60216292T2 30.08.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001423131
Titel CALCIUMTRIFLUORACETAT MIT ZYTOTOXISCHER WIRKUNG
Anmelder Bionest Ltd., Dublin, IE
Erfinder BARTORELLI, Alberto, CH-3963 Crans sur Sierre, CH
Vertreter Gille Hrabal Struck Neidlein Prop Roos, 40593 Düsseldorf
DE-Aktenzeichen 60216292
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 01.07.2002
EP-Aktenzeichen 027646074
WO-Anmeldetag 01.07.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/EP02/07222
WO-Veröffentlichungsnummer 2003006031
WO-Veröffentlichungsdatum 23.01.2003
EP-Offenlegungsdatum 02.06.2004
EP date of grant 22.11.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 30.08.2007
IPC-Hauptklasse A61K 33/16(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 33/06(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61P 35/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Calciumtrifluoracetat zur Herstellung von Medikamenten mit cytotoxischer und antitumoraler Aktivität.

Calciumsalze, insbesondere Calciumgluconat, wurden für eine gewisse Zeit in der Humanmedizin zur Behandlung von Osteoporose und allen Zuständen, in welchen ein Anstieg in den Blutcalciumgehalt angezeigt ist, verwendet. Die Verwendung von Calciumsalzen zur Behandlung von tumoralen und hyperproliferativen Fehlfunktionen wurde bis zum heutigen Tag nicht beschrieben; allerdings wurden vor Chemotherapie schützende Wirkungen für einige Calciumsalze postuliert, insbesondere für Calciumglucarat (siehe z.B. Webb T. et al., Biochem. Pharmacol., Vol. 47 (9), 1994, 1655–1660).

Es wurde nun herausgefunden, dass Calciumtrifluoracetat eine überraschende cytotoxische Aktivität aufweist, welche für Tumorzellen selektiv ist. Diese Aktivität wurde an Zelllinienkulturen von humanen Tumoren und Tumoren von Mäusen verschiedener Herkunft (Dickdarm, Lunge, Bauchspeicheldrüse, Brust, Prostata, Leber, Magen und Eierstöcken), wie HT 29-, Kato-, C-26-, H G C 27- und PA-1 -Zellen, gezeigt.

Calciumtrifluoracetat, welches ausgehend von Trifluoressigsäure und Calciumoxid oder -hydroxid unter Verwendung von herkömmlichen Methoden hergestellt wird, und in jeder Vertiefung (ungefähr 10000 Zellen) zu einer wässrigen Lösung in Mengen, welche zwischen 0,001 und 1,5 mg liegen, zugegeben wurde, bewirkt den Tod von 90 bis 95% oder mehr der Tumorzellen. Unter den identischen Bedingungen sind normale menschliche Zelllinien annährend unempfindlich oder zumindest deutlich weniger empfindlich gegenüber der cytotoxischen Wirkung, welche Calciumtrifluoracetat zugewiesen wird. Gleiche Wirkungen wurden mit anderen Calciumsalzen von pharmazeutisch verträglichen Säuren wie Acetat, Nitrat, Chlorid und dergleichen gleichwohl in einem geringeren Ausmaß erhalten. Dennoch scheint Trifluoracetat im Hinblick auf seine positiven toxikologischen Eigenschaften bevorzugt zu sein.

Für die Verwendung in der Behandlung von Tumoren wird Calciumtrifluoracetat vorzugsweise parenteral, z.B. über den intramuskulären, intravenösen oder subkutanen Weg, mit Dosierungen, welche zwischen 0,1 und 10 mg/kg/Tag liegen, verabreicht. Zu diesem Zweck wird das Calciumsalz geeigneterweise in der Form von sterilen Suspensionen oder Lösungen, gegebenenfalls mit Hilfe von konventionellen Vehikeln oder Lösemitteln, formuliert. Darüber hinaus sind auch andere Verabreichungswege möglich, wie der orale Weg oder die topische Infusion am Mutationsort der Tumorläsion. Calciumtrifluoracetat kann in Kombination mit anderen antitumoral wirkenden Arzneimitteln, welche eine komplementäre, synergistische oder anders artige verwendbare Aktivität zeigen, verwendet werden.

Die Ergebnisse von Experimenten, welche mit Calciumtrifluoracetat durchgeführt wurden, sind unten beschrieben.

Toxizität In Maus und Ratte

Calciumtrifluoracetat, welches mit einer akuten Dosis von 200 mg/kg Balb/c-Mäusen über den intraperitonalen Weg verabreicht wurde, führt zu keinen bemerkenswerten toxischen Wirkungen.

Eine subchronische Behandlung mit einer Dosis von 100 mg/kg ebenfalls über den intraperitonalen Weg für 4 Wochen führte zu keinen pathologischen Wirkungen. Eine ähnliche Behandlung über den subkutanen Weg für 4 Wochen wurde bei der Dosis von 10 mg/kg ebenfalls toleriert.

In Sprague-Dawley-Ratten wurden keine toxischen Wirkungen nach einer akuten oder subakuten Verabreichung von 200 mg/kg von Calciumtrifluoracetat über den intravenösen Weg beobachtet.

In vitro-Cytotoxizität

Die Cytotoxizität von Calciumtrifluoracetat wurde an 13 Zelllinien von bösartigen humanen Tumoren und 4 Linien von gutartigen Tumoren bestimmt.

20 &mgr;l an Ca(CF3COO)2-Lösungen bei Konzentrationen von 100, 50, 37,5, 25, 15, 12,5, 10 und 6,25 mg/ml wurden zu Platten mit 96 Vertiefungen gegeben, welche jeweils 10000 Zellen/Vertiefung in 100 &mgr;l eines Kulturmediums enthielten.

Sie wurden über Nacht bei 37°C stehen gelassen, wonach 40 &mgr;l an MTT (Dimethylthiazol-0,2 g/100 ml PBS) zugegeben und für 4 Stunden bei 37°C stehen gelassen wurde.

Nach der Aspiration werden 100 &mgr;l an SDS zugegeben und es wird bei 37°C für 1 Stunde stehen gelassen. Die Platte wird bei 540 nm und 690 nm analysiert.

Die Toxizität der Probe wird als das Verhältnis zwischen dem Absorptionswert in der Vertiefung mit den behandelten Zellen und dem Absorptionswert in der Vertiefung mit den Kontrollzellen bestimmt.

Der MTT-Test ist ein quantitatives kolorimetrisches Verfahren, welches ausschließlich lebende Zellen misst, da die mitochondrischen Enzyme von lebenden Zellen in der Lage sind, MIT-Tetrazoliumsalze in unlösliches Formazan zu überführen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1 Biologische Aktivität von Ca(CF3COO)2 in vitro
  • Normaler Typ: bösartige Zelllinien
  • Fett/kursiver Ty: gutartige Zelllinien

Ergebnisse

Bösartige menschliche Zelllinien von verschiedenen histologischen Arten und Herkünften zeigen, dass die cytotoxische Antwort auf Calciumtrifluoracetat zwischen den verschiedenen Linien variiert, jedoch abhängig von der Dosis immer eine hohe Zelltodrate erreicht: 8/14 erreichten 100% Mortalität und 6/14 erreichten Werte zwischen 80% und 90%.

Diese Ergebnisse wurden nach 24 Stunden Inkubation erhalten. Weitere Überprüfungen wurden hinsichtlich des möglichen schnellen Turnovers des Salzes aufgrund dessen sehr geringen Molekulargewichtes nach 6 Stunden durchgeführt.

Die gesammelten Daten zeigen, dass die antitumorale Wirkung in einem kurzen Zeitraum bei niedrigen Konzentrationen stattfindet, Wenn die Konzentration erhöht wird, entwickelt sich eine nicht spezifische Toxizität des Salzes, was dessen geringe Toxizität gegenüber normalen Zellen bei hohen Dosen erklärt.

Experimentelle Tumore von Mäusen

Mäusen von Typ Balb/c wurden mit 25000 Zellen/Maus von C26 (Dickdarm-Adenokarzinom einer Maus) geimpft.

Vier Tage nach der Impfung wurden die Tiere subkutan mit 5 mg/kg an Calciumtrifluoracetat behandelt, Die Kontrollgruppe erhielt nur eine Salzlösung. Die Behandlung wurde jeden Tag durchgeführt. Der Tumordurchmesser wurde mit einer Schieblehrenanzeige gemessen. An dem 20. Tag nach der Impfung wurden die Tiere getötet und die Tumore entfernt und gewogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Das mittlere Gewicht und die mittlere Größe der Tumore in der Kontrollmaus waren viermal größer als diejenigen der behandelten Gruppe. Die Daten, welche sich auf den Ausbruch der Tumore beziehen, waren ebenso signifikant; 100% für die Kontrollen im Verhältnis zu 40% für die behandelte Maus.

Behandlung von spontan auftretenden Hundetumoren

Experimente, welche an spontan auftretenden Tumoren in Haustieren, insbesondere Hunden, durchgeführt, werden, werden als verlässliches Modell für Voraussagen der Aktivität in Menschen betrachtet (D.M. Vail et al., Spontaneously occurring tumors in companion animals as models for drug development. Anticancer drug development giude: preclinical screening, clinical trials and approval; herausgegeben von B. Teicher Humana Press Inc., Totowa, NJ). Tumore in Tieren sind gegenüber menschlichen Tumoren im Hinblick auf Größe, Zellkinetik und Verhalten ähnlicher als Tumore von Nagetieren.

Sechs Hunde, welche unter Brusttumoren leiden, und ein Hund mit einem bösartigen Lymphon wurden behandelt. Die Behandlung wurde intravenös mit einer Dosierung, welche zwischen 100 und 10 mg/kg/Tag an Calciumtrifluoracetat variierte, durchgeführt. Trotz einiger Schwankungen unter den Tieren, abhängig von dem Auftreten von Nebenwirkungen, insbesondere Erbrechen, wurde die höchste Dosis (100 mg/kg) anfänglich für ein bis drei Tage, gefolgt von der niedrigsten Dosis (10 mg/kg) für einige Tage verabreicht. Die höchste Dosis wurde dann erneut, jedoch nur zweimal jede Woche verabreicht. Einige Tiere wurden immer mit der höchsten Dosis behandelt, jedoch mit einer niedrigeren Häufigkeit (9 bis 10 Verarbeichungen in ungefähr 20 Tagen).

Obwohl die Ergebnisse von vorläufiger Natur sind und nur mit einer beschränkten Anzahl an Tieren erhalten wurden, zeigen sie die bemerkenswerte antitumorale Wirksamkeit von Calciumtrifluoracetat. So zeigen die Experimente:

  • 1. Eine Reduktion der Haupttumormasse von 20% bis über 50%, bezogen auf dessen Anfangsvolumen, Diese Reduktion war nach den ersten Verabreichungen evident und erreichte am Ende des Behandlungszyklus ein Maximum (im allgemeinen 3 Wochen),
  • 2. Das reduzierte Volumen wurde im allgemeinen von anderen Phänomenen begleitet, welche die Tumormasse bedingen, wie kollikative Nekrosis, Kontaktverlust mit dem umgebenden Gewebe (Adhäsion) und schließlich die Verkapselung oder Zusammenbruch der Wände mit dem Auslaufen von nikrotischem Material nach außen.
  • 3. Zum Stillstand gebrachte Entwicklung von Metastasen und in einigen Fällen Nekrosis und deren Verschwinden (Resorption oder Verkalkung).
  • 4. Ca(CF3COO)2 zeigte sich als absolut sicher, selbst bei täglichen intravenösen Dosen von 100 mg/kg; die einzige Nebenwirkung, welche bei zwei Tieren beobachtet wurde, war ein unmittelbares Erbrechen nach der Verabreichung des Arzneimittels und ein geringfügiger Anstieg der Temperatur (1°C nicht übersteigend).

Die Toxizitätstests, welche unter besonderer Vorsicht durch Beobachten der Leber und Nierenfunktionsparameter und Koagulationszeiten durchgeführt wurden, zeigten keine pathologischen Modifikationen dieser Parameter in den behandelten Tieren.

Klinische Versuche

Calciumtrifluoracetat wurde subkutan mit Dosen, welche zwischen 10 und 200 mg pro Tag variieren, fünf Patienten im Alter von 56 bis 63 verabreicht, welche unter Brustkrebs (ein Fall), Darmkrebs (drei Fälle) und Gebärmutterkrebs (ein Fall) im fortgeschrittenen Stadium der Krankheiten und unter diffusen Metastasen litten, verabreicht. Mit der Ausnahme von einem Fall eines Dickdarmkrebses, welcher zu dem Tod des Patienten aufgrund einem hochgradig fortgeschrittenen Stadium der Krankheit führte (alle Fälle wurden auf der Basis eines Härtefallprotokolls für offensichtliche ethische Gründe durchgeführt), war die therapeutische Wirkung überraschend, sowohl hinsichtlich objektiver Bewertungen (ungefähr 10 bis 40% Reduktion der Tumormasse, Reduktion oder Verschwinden von Asciten und Metastasen bildenden Knoten und Reduktion von Tumormarkern wie CA19.9 und alpha-Fetoprotein) als auch subjektiver Bewertungen (verbesserte Gemütsverfassung, Reduktion und Verschwinden von Schmerzen und Rückkehr zum Arbeiten und sozialen Leben). Selbst in dem Fall des Patienten, welcher starb, wurde eine Reduktion in der Tumormasse beobachtet, der Patient starb allerdings aufgrund neoplastischen Kräfteverlustes und kardiorespiratorischen Komplikationen.


Anspruch[de]
Verwendung von Calciumtrifluoracetat für die Herstellung zytotoxischer Medikamente zur Behandlung von Tumoren. Pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend Calciumtrifluoracetat als aktiven Bestandteil, gemischt mit geeigneten Trägern.






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