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Dokumentenidentifikation DE69837094T2 30.08.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001009413
Titel VERWENDUNG VON IMMUNERREGENDEN OLIGONUKLEOTIDEN ZUR VORBEUGUNG ODER BEHANDLUNG VON ASTHMA
Anmelder The Regents of the University of California, Oakland, Calif., US
Erfinder RAZ, Eyal, Del Mar, CA 92014, US
Vertreter LEINWEBER & ZIMMERMANN, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69837094
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 04.09.1998
EP-Aktenzeichen 989458773
WO-Anmeldetag 04.09.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/US98/18382
WO-Veröffentlichungsnummer 1999011275
WO-Veröffentlichungsdatum 11.03.1999
EP-Offenlegungsdatum 21.06.2000
EP date of grant 14.02.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 30.08.2007
IPC-Hauptklasse A61K 31/70(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 39/385(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61P 11/06(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung wurde unter Unterstützung der US-Regierung in Form des Grant Al37305 gemacht, der von den National Institutes of Health verliehen wird. Die US-Regierung hält bestimmte Rechte an dieser Erfindung.

FACHGEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft Verfahren und Oligonucleotidzusammensetzungen zur Verwendung zur Reduktion oder Suppression von granulozytenvermittelten Entzündungen in einem Wirtsgewebe und in der Modulation der Immunreaktion eines Wirts auf ein Antigen.

GESCHICHTE DES VERWANDTEN FACHGEBIETS

Bei Wirbeltieren wird die Endothelzelladhäsion durch Granulozyten (Eosinophile, Basophile, Neutrophile und Mastzellen) von der Freisetzung von Entzündungsmediatoren, wie z.B. Leukotrienen, dem wesentlichen basischen Protein und Histamin, gefolgt. Bei empfindlichen Personen kann die resultierende Entzündung betroffenes Wirtsgewebe schädigen.

Das häufigste pathologische entzündliche Leiden ist Asthma, das durch markierte Eosinophileninfiltrierung in Atemwege gekennzeichnet ist, gefolgt von durch Entzündung induzierten Gewebsschäden. Andere pathologische entzündliche Leiden, die mit Granulozyteninfiltrierung in betroffenes Gewebe verbunden sind, umfassen Polyposis nasi, Rhinitis allergica, Heuschnupfen, Neurodermitis atopica, eosinophile Fasziitis, idiopathisches hypereosinophiles Syndrom und kutane Basophilenhypersensibilität sowie Entzündung und Fibrose, die aus erhöhter Produktion von granulozytenstimulierenden Zytokinen, wie z.B. Interleukin-(IL-)5 und bestimmten Interferonen, resultieren.

Eine routinemäßige Behandlung solcher Leiden ist typischerweise auf die Hemmung der Aktivität von Entzündungsmediatoren ausgerichtet, die nach Granulozytenadhäsion an Endothele freigesetzt werden (z.B. durch Verabreichung einer Corticoidzusammensetzung in betroffene Gewebe). Wo die Identität eines entzündungsinduzierenden Antigens bekannt ist, kann durch Immunisierung ein gewisser Immunschutz gegen weitere Antigenprovokation bereitgestellt werden. Obwohl kanonische Immunisierung zur Stimulation von Produktion neutralisierender Antikörper wirksam ist, stimuliert sie jedoch nicht wirksam langfristige Zellimmunität. Außerdem stimuliert die Antigenimmunisierung Wirtsproduktion von IL-4 und IL-5. IL-5 löst Granulozytenadhäsion an Endothele aus, während IL-4 Immunglobulinwechsel zum IgE-Isotyp mit dem Risiko einer Anaphylaxie induziert.

WO 98/18810, veröffentlicht am 7. Mai 1998, betrifft immunstimulierende Nucleinsäuremoleküle, die ein nicht-methyliertes CpG-Dinucleotid und deren Verwendung enthalten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft Mittel zur raschen Suppression von antigenstimulierter Entzündung bei einem Säugetierwirt durch Suppression von Granulozyteninfiltrierung in ein Wirtsgewebe. Die Erfindung betrifft auch immunisierungsfreie Mittel zur Bereitstellung von Schutz für einen antigensensibilisierten Säugetierwirt gegen nachfolgende Provokation ohne das Risiko von Anaphylaxie. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines immunstimulierenden Oligonucleotids (ISS-ODN) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Asthma bei einem Säugetier bereit ohne gleichzeitige Verabreichung eines immunisierenden Antigens, worin das Säugetier auf ein asthmastimulierendes Antigen empfindlich ist und worin das ISS-ODN die Sequenz 5'-Cytosin-Guanin-3' umfasst, worin ISS-ODN intranasal über Inhalation oder Insufflation an Respirationsgewebe verabreicht wird.

Überraschenderweise haben ISS-ODN zusätzlich zu ihren immunstimulierenden Eigenschaften entzündungshemmende Eigenschaften. ISS-ODN sind daher zur Behandlung und Prävention von Entzündungen zweckdienlich, die mit antigenstimulierter Granulozyteninfiltrierung von Gewebe verbunden sind, wie es z.B. in den Atemwegen von Asthmatikern während eines Asthmaanfalls eintritt. Die Verabreichung von ISS-ODN gemäß der Erfindung supprimiert vorteilhaft antigenstimulierte Granulozyteninfiltrierung in Wirtsgewebe, sogar bevor das ISS-ODN die Wirtsimmunreaktion auf das Antigen beeinflusst. Daher betrifft die Erfindung ein antigenunabhängiges Verfahren zur Reduktion von antigenstimulierter Entzündung durch Suppression von Zelladhäsion, wodurch die Freisetzung von Entzündungsmediatoren vermieden wird, die durch Granulozytenbindung von Endothelzellen stimuliert werden.

Ein Beispiel für die Kontrolle von Asthma ist jenes, bei dem ISS-ODN intranasal in das Lungengewebe abgegeben werden. Bei Asthmatikern tritt die Eosinophileninfiltrierung von Lungengewebe hauptsächlich in der späten Phase einer allergischen Reaktion auf ein Atemallergen auf. Kanonische Immuntherapie kann die Wirtsimmunreaktion auf das Allergen modulieren und letztendlich die Flut von Eosinophilen in die Atemwege des Wirts aufhalten. Jedoch unterdrückt die Praxis der Erfindung die Eosinophileninfiltrierung der Atemwege des Wirts schon bevor das Wirtsimmunsystem auf das Atemallergen reagiert, wodurch eine Form von Schutz gegen Atemwegsverengung und Respirationsgewebsschaden bereitgestellt wird, die einen akuten Asthmaanfall charakterisieren.

Hierin ist ebenfalls ein Mittel zur Verschiebung einer vorliegenden Wirtszellimmunreaktion auf ein Antigen weg von einem Th2-Phänotyp und in einen Th1-Phänotyp beschrieben. Zu diesem Zweck werden ISS-ODN über beliebige Verabreichungswege verabreicht, durch welche antigensensibilisierte Wirtsgewebe mit dem ISS-ODN kontaktiert werden. ISS-ODN, die in dieser Weise verabreicht werden, verstärken humorale (Antikörper-) und zellulare (Th1-Typ-)Immunreaktionen dieses Wirts. Anders als kanonische Immuntherapie wird die Immunität mithilfe dieses Verfahrens der Erfindung stimuliert, sogar wenn kein zusätzliches Antigen in den Wirt eingeführt wird. Daher vermeidet die Verwendung des Verfahrens zur Verstärkung der Immunreaktion eines Wirts auf nachfolgende Provokation durch ein sensibilisierendes Antigen ohne Immunisierung das Risiko immunisierungsinduzierter Anaphylaxie, unterdrückt die IgE-Produktion als Reaktion auf Antigenprovokation und eliminiert die Notwendigkeit, das sensibilisierende Antigen zur Verwendung zur Immunisierung zu identifizieren. Eine besonders vorteilhafte Verwendung dafür ist die Behandlung von lokalisierten allergischen Reaktionen in Targetgeweben, wo Allergene in den Körper eintreten, wie z.B. in die Haut und Schleimhaut.

Suppression des Th2-Phänotyps wie hierin beschrieben ist auch ein nützlicher Zusatz zu kanonischer Immuntherapie, um antigenstimulierte IL-4- und IL-5-Produktion zu reduzieren. Daher kann ISS-ODN an einen Wirt verabreicht werden, um den Th2-Phänotyp, der mit herkömmlicher Antigenimmunisierung verbunden ist, zu unterdrücken (z.B. zur Impfung oder Allergieimmuntherapie).

Die Verschiebung zu einem hierin beschriebenen Th1-Phänotyp wird von erhöhter Sekretion von IFN-&agr;, -&bgr; und -&ggr; sowie IL-12 und IL-18 begleitet. Jedes dieser Zytokine verstärkt die Immunreaktionen des Wirts gegen intrazelluläre Pathogene, wie z.B. Viren.

Im Th1-Phänotyp wird Angiogenese ebenfalls verstärkt (scheinbar durch Stimulation durch IL-12).

Pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen von ISS-ODN sind zur Verwendung in der Umsetzung der Verfahren der Erfindung bereitgestellt. Die ISS-ODN der Erfindung umfassen DNA- oder RNA-Oligonucleotide, die mit CpG-Dinucleotiden angereichert sind, einschließlich jenen, die aus der Primärstruktur 5'-Purin-Purin-[C]-[G]-Pyrimidin-Pyrimidin-3' bestehen.

Wo es für den gewählten Verlauf der Therapie geeignet ist, können die ISS-ODN mit anderen entzündungshemmenden oder immuntherapeutischen Mitteln verabreicht werden. Daher ist eine besonders nützliche Zusammensetzung zur Verwendung in der Umsetzung des Verfahrens der Erfindung eines, in welchem ein entzündungshemmendes Mittel (z.B. ein Glucocorticoid) oder ein immuntherapeutisches Mittel (z.B. ein Antigen, Cytokin oder Adjuvans) mit einem ISS-ODN gemischt und daran konjugiert wird.

Das ISS-ODN kann auch in Form eines Sets bereitgestellt werden, das ISS-ODN und beliebige weitere Arzneimittel umfasst, sowie in Form einer Vorrichtung zur Verabreichung des ISS-ODNs an ein Wirtsgewebe und Reagenzien zur Bestimmung der biologischen Wirkung des ISS-ODNs auf den behandelten Wirt.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 ist eine graphische Darstellung, welche die Aspekte des Säugetierimmunsystems zusammenfasst.

2 ist ein Diagramm von Daten, die eine Verschiebung von einem Th2- in einen Th1-Phänotyp (wie durch die IgG2A-Produktion gemessen) bei Mäusen bestätigen, die 3 Tage vor Antigenprovokation mit einem ISS-ODN behandelt werden.

3a und 3b sind Diagramme von Daten, welche die Induktion eines Th2-Phänotyps (wie durch die IgG1-Produktion gemessen) bei Mäusen, die mit einem mutierten, inaktiven ISS-ODN 3 Tage vor Antigenprovokation behandelt werden, bestätigen.

4 ist ein Diagramm von Daten, die Th1-assoziierte Suppression von antigenspezifischem IgE bei antigen-sensibilisierten, mit ISS-ODN (pCMV-LacZ, einem Plasmid, das zwei Kopien von DY1018-ISS-ODN enthält) behandelten Mäusen im Vergleich zu antigensensibilisierten (Kontroll-)Mäusen bestätigt.

5 ist ein Diagramm von Daten, welche die Suppression von IL-4-Sekretion durch ISS-ODN im Vergleich zu einer Kontrolle bestätigen.

6 ist ein Diagramm von Daten, welche die Suppression von IL-5-Sekretion durch ISS-ODN im Vergleich zu einer Kontrolle bestätigen.

7 ist ein Diagramm von Daten, welche die Suppression von IL-10-Sekretion durch ISS-ODN im Vergleich zu einer Kontrolle bestätigen.

8 ist ein Diagramm von Daten, welche die Stimulation von INF-&ggr;-Sekretion durch ISS-ODN im Vergleich zu einer Kontrolle bestätigen.

9 ist ein Diagramm von Daten, welche eine ISS-ODN-vermittelte Verschiebung zu einem Th1-Phäntoyp bei Tieren zeigen (wie durch IFN&ggr;-Spiegel angegeben), die vor Antigenprovokation (mit Sternchen gekennzeichnete Balken) oder nach Antigenprovokation mit ISS-ODN behandelt wurden.

10 ist ein Diagramm von Daten, welche einen ISS-ODN-vermittelten Anstieg der Immunreaktionsfähigkeit (wie durch Anstiege in CD4+-Lymphozytenproliferation angegeben) bei Säugetieren zeigen, die vor Antigenprovokation (mit Sternchen gekennzeichnete Balken) oder nach Antigenprovokation behandelt wurden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG A. Entzündungshemmende und immuntherapeutische Verfahren der Erfindung 1. Therapeutische Wirkungen der Verfahren der Erfindung

Durch Verabreichung von ISS-ODN an einen antigensensibilisierten Wirt, z.B. ein Säugetier, dessen Immunsystem geprimt worden ist, um auf eine Provokation mithilfe eines sensibilisierenden Antigens zu reagieren, kann das ISS-ODN in der Behandlung von Entzündung und zur Steigerung der Immunreaktionsfähigkeit des Wirts mit einem Th1-Phänotyp gegen ein sensibilisierendes Antigen verwendet werden. Zum Zwecke der Offenbarung bezieht sich „sensibilisierendes Antigen" auf ein exogenes, immunogenes Protein, Peptid, Glykoprotein, Lipid oder Polysaccharid. Als Beispiel ist eine graphische Darstellung als 1 beigefügt, die Aspekte von Säugetierantigenimmunität zusammenfasst.

Die entzündungshemmende Wirkung von ISS-ODN ist zur Suppression des Auftretens von und zur Reduktion akuter granulozytenvermittelter Entzündung in einem antigensensibilisierten Wirt zweckdienlich. Insbesondere supprimiert die Behandlung eines antigensensibilisierten (geprimten) Wirts vor nachfolgender Antigenprovokation antigenstimulierte Infiltrierung von Wirtsgewebe durch Granulozyten (speziell Eosinophile und Basophile). Auf ähnliche Art und Weise reduziert die Behandlung eines antigensensibilisierten Wirts bei oder nach Antigenprovokation antigenstimulierte Infiltrierung von Wirtsgewebe durch Granulozyten. Die entzündungshemmende Wirkung von ISS-ODN, das gemäß der Erfindung verabreicht wird, ist vorteilhaft schnell und zeigt Wirkung sogar kurz bevor zu erwarten ist, dass das ISS-ODN Einfluss auf die Immunreaktionsfähigkeit des Wirts auf das sensibilisierende Antigen hat. Die Erfindung verleiht daher dem Wirt einen fast unmittelbaren Schutz gegen Gewebsschaden aus granulozytenvermittelter Entzündung.

Zum Beispiel zeigten, wie durch die Daten in Beispiel II dargestellt ist, antigen-sensibilisierte Tiermodelle von allergischem Asthma, die mit ISS-ODN ohne gleichzeitiger Antigenprovokation behandelt wurden, 90% Reduktion von Eosinophileninfiltrierung in Respirationsgewebe im Vergleich zu Kontrolltieren und Tieren, die nur mit einer inaktiven ISS-ODN-Mutante behandelt wurden. Signifikanterweise wurde innerhalb von nur 24 Stunden nach Verabreichung von ISS-ODN bei zuvor exponierten Mäusen eine Reduktion der Eosinophileninfiltration oder bei geprimten, nicht exponierten Mäusen eine Suppression der Eosinophileninfiltration erhalten. Die Wirkung des ISS-ODNs auf Eosinophileninfiltration ist daher unabhängig von der sich später entwickelnden Wirtsimmunreaktion auf das sensibilisierende Antigen. Da sie antigenunabhängig sind, können die ISS-ODN als Entzündungssuppressoren vor Antigenprovokation oder in jenem Zeitraum, in welchem das Risiko einer Antigenprovokation gegenwärtig ist (z.B. in der Allergiesaison), verwendet werden. Signifikanterweise kann ISS-ODN, wie in den Beispielen IV und VI dargestellt, gemäß der Erfindung verwendet werden, um Entzündung oder eine Immunreaktion auf nachfolgende Antigenprovokation in einem antigengeprimten Wirt zu vermeiden sowie um Entzündungen oder andere antigenstimulierte Immunreaktionen nach Antigenprovokation zu reduzieren.

Obwohl die Erfindung nicht auf einen beliebigen Wirkmechanismus beschränkt ist, ist es wahrscheinlich, dass die entzündungshemmende Aktivität von ISS-ODN zumindest teilweise eine Folge von IL-5-Suppression ist. Jedoch wird Suppression von Granulozytenakkumulierung in Wirtsgewebe schneller erreicht (innerhalb von 24 Stunden) als eine Immunaktivierung von cytokinsekretierenden Lymphozyten erwartet werden würde. Es ist deshalb auch möglich, dass ISS-ODN, die gemäß der Erfindung verabreicht werden, physikalisch mit der Granulozytenadhäsion ans Endothel interferieren, vielleicht indem sie VCAM-1-Endothelrezeptoren, ihren Eosinophilenliganden (VLA-4) blockieren oder Granulozyten lysieren. Egal welcher Mechanismus, die ISS-ODN-Suppression von Granulozytenakkumulierung gemäß der Erfindung scheint unabhängig von der ISS-ODN-Stimulierung des Wirtsimmunsystems zu sein.

Die immuntherapeutische Wirkung von ISS-ODN produziert eine impfstoffähnliche Immunreaktion auf Provokation durch ein sensibilisierendes Antigen ohne gleichzeitige Exposition des Wirts gegenüber dem Antigen. Die erreichte Immunstimulation ist mit der Immunstimulation vergleichbar, die bei Impfung eines Wirts mit einem sensibilisierenden Antigen auftritt. Daher stellt ISS-ODN Mittel zur Immunisierung eines Wirts gegen ein sensibilisierendes Antigen ohne beabsichtigte Antigenprovokation bereit.

Die durch ISS-ODN stimulierte Immunreaktion unterscheidet sich vorteilhafterweise von einer Immunisierungsreaktion darin, dass letztere sich in einem Th2-Phänotyp entwickelt, während erstere sich in einem Th1-Phänotyp entwickelt. In dieser Hinsicht ist es hilfreich, daran zu erinnern, dass CD4+-Lymphozyten im Allgemeinen in eine von zwei verschiedenen Untermengen fallen, d.h. die Th1- und Th2-Zellen. Th1-Zellen sekretieren prinzipiell IL-2, IFN-&ggr; und TNF&bgr; (die letzten beiden vermitteln Makrophagenaktivierung und Hypersensibilität verzögerter Art), während Th2-Zellen prinzipiell IL-4 (das die Produktion von IgE-Antikörpern stimuliert), IL-5 (das Granuloyzteninfiltrierung von Gewebe stimuliert), IL-6 und IL-10 sekretieren. Diese CD4+-Untermengen üben einen negativen Einfluss aufeinander aus, d.h. die Sekretion von Th1-Lymphokinen hemmt die Sekretion von Th2-Lymphokinen und vice versa.

Faktoren, von denen angenommen wird, dass sie die Th1-Aktivierung begünstigen, ähneln jenen, die durch Vireninfektion induziert werden, und umfassen intrazelluläre Pathogene, Exposition gegenüber IFN-&bgr;, IFN-&agr;, IFN&ggr;, IL-12 und IL-18 und Exposition gegenüber geringen Antigendosen. Immunreaktionen vom Th1-Typ herrschen auch bei Autoimmunerkrankung vor. Faktoren, von denen angenommen wird, dass sie die Th2-Aktivierung begünstigen, umfassen Exposition gegenüber IL-4 und IL-10, APC-Aktivität auf einen Teil der B-Lymphozyten und hohe Antigendosen. Aktive Th1-(IFN&ggr;-)Zellen verstärken Zellimmunität und sind daher von besonderem Wert für intrazelluläre Infektionen, während aktive Th2-Zellen die Antikörperproduktion verstärken und deshalb als Reaktion auf extrazelluläre Infektionen von Wert sind (mit dem Risiko anaphylaktischer Ereignisse, die mit IL-4-stimulierter Induktion von IgE-Antikörperproduktion verbunden sind). Daher hat die Fähigkeit, Wirtsimmunreaktionen vom Th1- auf das Th2-Repertoire und vice versa zu verschieben, besondere klinische Bedeutung für die Kontrolle von Wirtsimmunität gegen Antigenprovokation (z.B. bei Infektionskrankheiten und allergischen Leiden).

Zu diesem Zweck verschieben ISS-ODN die Wirtsimmunreaktion auf ein sensibilisierendes Antigen in Richtung eines Th1-Phänotyps (Beispiel IV). In der Folge werden antigenstimulierte/Th2-assoziierte IL-4-, IL-5- und IL-10-Sekretion (Beispiel VI), IL-5-stimulierte Granulozyteninfiltrierung von antigensensibilisiertem Gewebe (Beispiele II und III) und IL-4-stimulierte Produktion von IgE (Beispiel V) supprimiert, wodurch das Risiko einer anhaltenden allergischen Entzündung reduziert und das Risiko antigen-induzierter Anaphylaxie minimiert wird.

Obwohl die Erfindung nicht auf einen beliebigen Wirkmechanismus beschränkt ist, ist es denkbar, dass ISS-ODN die Aufnahme von exogenem Antigen durch antigenpräsentierende Zellen zur Präsentation über Wirts-MHC-Klasse-1- verarbeitende Wege erleichtern. Egal welcher Wirkungsmechanismus, die Verwendung von ISS-ODN zur Verstärkung der Wirtsimmunreaktionsfähigkeit auf ein sensibilisierendes Antigen und die Verschiebung der Immunreaktion in Richtung Th1-Phänotyp vermeidet das Risiko einer durch Immunisierung induzierten Anaphylaxie, unterdrückt die IgE-Produktion in Reaktion auf ein sensibilisierendes Antigen und eliminiert das Bedürfnis, das sensibilisierende Antigen zur Verwendung bei Immunisierung zu identifizieren.

Unter Verweis auf die Erfindung werden ISS-ODN-vermittelte „Reduktion von Entzündung" (bei einem geprimten antigenexponiertem Wirt), „Prävention von Entzündung" (bei einem geprimten Wirt vor Antigenprovokation) und „Verstärkung der Immunreaktionsfähigkeit bei einem Th1-Phänotyp" bei einem mit ISS-ODN behandelten Wirt durch ein beliebiges der folgenden Ereignisse belegt:

  • (1) Reduktion von Spiegeln von IL-4, die vor und nach Antigenprovokation gemessen werden, oder Detektion geringerer (oder sogar fehlender) Spiegel von IL-4 bei einem behandelten Wirt im Vergleich zur antigengeprimten oder geprimten und exponierten Kontrolle.
  • (2) Anstieg der Spiegel von IL-12, IL-18 und/oder IFN (&agr;, &bgr; oder &ggr;) vor und nach Antigenprovokation; oder Detektion höherer Spiegel von IL-12, IL-18 und/oder IFN (&agr;, &bgr; oder &ggr;) bei einem mit ISS-ODN behandelten Wirt im Vergleich zu einer antigengeprimten oder geprimten und exponierten Kontrolle;
  • (3) IgG2a-Antikörperproduktion bei einem behandelten Wirt oder
  • (4) Reduktion der Spiegel von antigenspezifischem IgE gemessen vor und nach Antigenprovokation oder Detektion geringerer (oder sogar fehlender) Spiegel von antigenspezifischem IgE bei einem mit ISS-ODN behandelten Wirt im Vergleich zu einer antigengeprimten oder geprimten und exponierten Kontrolle.

Auch insbesondere in Hinblick auf die Reduktion und Prävention von Entzündung ist ein besonders bedeutungsvolles Indiz für die Wirksamkeit des Verfahrens der Erfindung bei einem behandelten Wirt folgendes:

  • (5) eine Reduktion der Granulozytenzahlen (z.B. von Eosinophilen oder Basophilen, abhängig davon, welcher Zelltyp bei der Erkrankung, von welcher der Wirt betroffen ist, am meisten involviert ist) in einem Entzündungsinfiltrat eines betroffenen Wirtsgewebes wie in einem antigenexponierten Wirt vor und nach ISS-ODN-Verabreichung gemessen wird oder Detektion niedrigerer (oder sogar fehlender) Spiegel von Eosinophilen- oder Basophilenzahlen bei einem behandelten Wirt im Vergleich zu einer antigengeprimten oder geprimten und exponierten Kontrolle.

Beispielhafte Verfahren zur Bestimmung solcher Werte sind in den Beispielen weiter beschrieben.

2. Verfahren und Wege zur Verabreichung von ISS-ODN an einen Wirt

Die ISS-ODN der Erfindung werden einem Wirt intranasal über Inhalation oder Insufflation in das Respirationsgewebe verabreicht. Jedoch verstehen Fachleute, dass Verfahren und lokalisierte Wege, welche die ISS-ODN in antigen-sensibilisiertes Gewebe lenken, in den meisten Fällen gegenüber systemischen Verabreichungswegen bevorzugt sind, sowohl aufgrund der unmittelbaren therapeutischen Wirkung als auch aufgrund der Vermeidung von In-vivo-Oligonucleotidabbau.

Der Eintrittspunkt für viele exogene Antigene in einen Wirt ist die Haut oder Schleimhaut. Fachleute im klinischen Bereich sind mit Mitteln zur Arzneimittelverabreichung in Haut und Schleimhaut vertraut oder können diese einfach in Erfahrung bringen. Zur genauen Erläuterung sind jedoch exemplarische Verfahren und Arzneimittelverabreichungswege, die in der Erfindung zweckdienlich sind, nachstehend kurz diskutiert.

Intranasale Verabreichungswege sind besonders zur Behandlung von Respirationsentzündung, insbesondere Entzündung, die durch Antigene vermittelt wird, die aus den Nasengängen in die Trachea oder die Bronchiolen übertragen werden, zweckdienlich. Solche Mittel umfassen die Inhalation von Aerosolsuspensionen oder die Insufflation von Polynucleotidzusammensetzungen der Erfindung. Zerstäubervorrichtungen, die zur Verabreichung von Polynucleotidzusammensetzungen in die Nasenschleimhaut, Trachea und Bronchiolen geeignet sind, sind fachbekannt und werden deshalb hierin nicht im Detail beschreiben. Für eine allgemeine Erläuterung hinsichtlich intranasaler Arzneimittelverabreichung können Fachleute Chien, Novel Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Kapitel 5 (1992), konsultieren.

3. Dosierungsparameter für ISS-ODN

Ein besonderer Vorteil der ISS-ODNs der Erfindung ist deren Fähigkeit, sogar in relativ kleinen Dosierungen entzündungshemmende und immuntherapeutische Aktivität auszuüben. Obwohl die verwendete Dosis abhängig von den klinischen Zielen, die zu erreichen sind, variiert, ist ein geeigneter Dosisbereich ein Bereich, der bis zu etwa 1-1000 &mgr;g ISS-ODN/ml Träger in einer Einzeldosierung bereitstellt. In Bezug auf die Lehre, die diese Offenbarung bereitstellt, sind Fachleute im klinischen Fach mit geeigneten Parametern zur Verabreichung von ISS-ODN gemäß der Erfindung vertraut oder können sich einfach damit vertraut machen.

Diesbezüglich sollte angemerkt werden, dass die entzündungshemmende und immuntherapeutische Aktivität von ISS-ODN in der Erfindung im Wesentlichen dosisabhängig ist. Deshalb wird jede Einzeldosis in der Konzentration verdoppelt, um die ISS-ODN-Wirkung um eine Größenordnung von zwei zu erhöhen. Klinisch kann es ratenswert sein, das ISS-ODN in einer geringen Dosis zu verabreichen (etwa 1 &mgr;g/ml bis etwa 50 &mgr;g/ml) und dann die Dosis wie erforderlich zu erhöhen, um das gewünschte therapeutische Ziel zu erreichen. Alternativ dazu kann eine Targetdosierung von ISS-ODN von etwa 1-10 &mgr;M in einer Probe von Wirtsblut, das innerhalb der ersten 24-48 Stunden nach Verabreichung von ISS-ODN abgenommen wird, in Betracht gezogen werden. Basierend auf gegenwärtigen Studien wird angenommen, dass ISS-ODN in diesen Dosierungsspiegeln wenig oder keine Toxizität haben.

B. Entzündungshemmende ISS-ODN-Zusammensetzungen 1. ISS-ODN-Struktur

Funktionsgemäß verstärken ISS-ODN die zellulären und humoralen Immunreaktionen bei einem Wirt, insbesondere die Lymphozytenproliferation und Freisetzung von Cytokinen (einschließlich IFN) durch Wirtsmonozyten und natürliche Killer-(NK-)Zellen. Immunstimulation durch synthetische ISS-ODN in vivo tritt durch das Kontaktieren von Wirtslymphozyten z.B. mit ISS-ODN-Oligonucleotiden, ISS-ODN-Oligonucleotid-Konjugaten und ISS-enthaltenden rekombinanten Expressionsvektoren auf (Daten über die Aktivität von ISS-ODN-Konjugaten und ISS-ODN-Vektoren sind in den ebenfalls anhängigen, gemeinsam abgetretenen US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 60/028.118 und 08/593.554 dargelegt; Daten, die hierin durch Verweis aufgenommen sind, um die immunstimulierende ISS-ODN-Aktivität in vivo zu zeigen). Daher sind synthetische Analoga dieser ISS-ODN therapeutisch nützlich, um die Wirtsimmunreaktion nicht nur auf Mikrobenantigene, sondern auch auf Tumorantigene, Allergene und andere Substanzen zu modulieren, während native Mikroben-ISS-ODN das Wirtsimmunsystem stimulieren, um auf Infektion zu reagieren.

Strukturell sind ISS-ODN nicht-kodierende Oligonucleotide 6-Mer oder länger, die zumindest ein nicht-methyliertes CpG-Motiv umfassen können. Die relative Position jeder CpG-Sequenz in ISS-ODN mit immunstimulierender Aktivität in bestimmten Säugetierspezies (z.B. Nagetieren) ist 5'-CG-3' (d.h. C liegt an der 5'-Position im Vergleich zu G an der 3'-Position). Viele bekannte ISS-ODN flankieren das CpG-Motiv mit zumindest zwei Purinnucleotiden (z.B. GA oder AA) und zumindest zwei Pyrimidinnucleotiden (5'-Purin-Purin-[C]-G]-Pyrimidin-Pyrimidin-3'). Es wird davon ausgegangen, dass CpG-Motiv-enthaltende ISS-ODN die B-Lymphozytenproliferation stimulieren (siehe z.B. Krieg et al., Nature 374, 546-549 (1995)).

Die Kernhexamerstruktur der vorangegangenen ISS-ODN kann stromauf und/oder stromab durch eine beliebige Zahl oder Zusammensetzung von Nucleotiden oder Nucleosiden flankiert sein. Jedoch sind ISS-ODN zumindest 6-Mer und vorzugsweise zwischen 6- und 200-Mer, um die Aufnahme von ISS-ODN in Target-Gewebe zu verstärken. Fachleute sind mit den berichteten Nucleotidsequenzen bekannter ISS-ODN vertraut oder können diese einfach identifizieren. Zum einfachen Bezug in dieser Hinsicht sind die folgenden Quellen besonders hilfreich:

  • Yamamoto et al., Microbiol. Immunol. 36, 983 (1992)
  • Ballas et al., J. Immunol. 157, 1840 (1996)
  • Klinman et al., J. Immunol. 158, 3635 (1997)
  • Sato et al., Science 273, 352 (1996)

Alle diese Artikel sind hierin zum Zwecke der Veranschaulichung des Wissensstands auf dem Gebiet der Nucleotidzusammensetzung von ISS-ODN durch Verweis aufgenommen.

Insbesondere umfassen ISS-ODN, die in der Erfindung nützlich sind, jene mit den folgenden hexameren Nucleotidsequenzen:

  • 1. ISS-ODN mit „CpG"-Dinucleotiden und
  • 2. Inosin- und/oder Uracilsubstitutionen für Nucleotide in den vorangegangenen hexameren Sequenzen zur Verwendung als RNA-ISS-ODN.

Zum Beispiel umfassen DNA-basierte ISS-ODN, die für die Erfindung nützlich sind, jene mit den folgenden hexameren Nucleotidsequenzen:

AACGTT, AGCGTC, GACGTT, GGCGTT, AACGTC, AGCGTC, GACGTC, GGCGTC, AACGCC, AGCGCC, GACGCC, GGCGCC, AGCGCT, GACGCT, GGCGCT, TTCGAA, GGCGTT bzw. AACGCC (Seq.-ID Nr. 1-18).

ISS-ODN können einzelsträngige oder doppelsträngige DNA, einzel- oder doppelsträngige RNA und/oder Oligonucleoside sein. Die ISS-ODN können, müssen aber nicht Palindromregionen umfassen. Wenn gegenwärtig kann ein Palindrom sich nur bis zu einem CpG-Motiv erstrecken, wenn es im Kern der hexameren Sequenz gegenwärtig ist, oder es kann mehr der hexameren Sequenz sowie flankierende Nucleotidsequenzen umfassen.

Die Nucleotidbasen der ISS-ODN, die das CpG-Motiv des Kernhexamers flankieren und/oder die flankierenden Nucleotidsequenzen darstellen, können beliebige bekannte natürlich vorkommende Basen oder synthetische nicht-natürliche Basen sein (z.B. TCAG oder bei RNA UACGI). Oligonucleoside können in die Innenregion und/oder Termini der ISS-ODN unter Einsatz herkömmlicher Verfahren zur Verwendung als Anheftungspunkte für andere Verbindungen (z.B. Peptide) dienen. Die Basen, Zuckergruppierungen, Phosphatgruppen und Termini von ISS-ODN können auch auf jede beliebige Art und Weise, die Fachleuten bekannt ist, modifiziert werden, um ein ISS-ODN herzustellen, das zusätzlich zur beschriebenen Aktivität von ISS-ODN über gewünschte Eigenschaften verfügt. Zum Beispiel können Zuckergruppierungen in jeder beliebigen sterischen Konfiguration an Nucleotidbasen von ISS-ODN gebunden werden.

Zusätzlich dazu können Rückgratphosphatgruppenmodifikationen (z.B. Methylphosphonat-, Thiophosphat-, Phosphoramidat- und Dithiophosphatinternucleotidbindungen) den ISS-ODN Antimikrobenaktivität verleihen und deren Stabilität in vivo verstärken, wodurch sie für therapeutische Anwendungen besonders nützlich gemacht werden. Eine besonders nützliche Phosphatgruppenmodifikation ist die Überführung in Thiophosphat- und Dithiophosphatformen der ISS-ODN-Oligonucleotide. Zusätzlich zu ihren potenziellen antimikrobiellen Eigenschaften sind Thiophosphate und Dithiophosphate resistenter gegenüber In-vivo-Abbau als ihre nicht-modifizierten Oligonucleotidgegenstücke, wodurch ISS-ODN der Erfindung für den Wirt zugänglicher gemacht wird.

2. Synthese von und Screening auf ISS-ODN

ISS-ODN kann unter Einsatz von fachbekannten Verfahren und Nucleinsäuresyntheseausrüstung synthetisiert werden. Für einen diesbezüglichen Verweis siehe z.B. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Kapitel 2 und 4 (1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., New York (1982), US-Patent Nr. 4.458.066 und US-Patent Nr. 4.650.675. Diese Verweise werden hierin durch Verweis für den alleinigen Zweck der Demonstration von Fachwissen über die Produktion synthetischer Oligonucleotide aufgenommen. Da ISS-ODN nicht-kodierend ist, gibt es kein Problem bezüglich der Aufrechterhaltung eines offenen Leserasters während Synthese.

ISS-ODN kann in einen Verabreichungsvektor, wie z.B. ein Plasmid, Cosmid, Virus oder Retrovirus, aufgenommen werden, die hingegen für therapeutisch günstige Polypeptide kodieren können, wie z.B. Cytokine, Hormone und Antigene. Aufnahme von ISS-ODN in einen solchen Vektor beeinflusst deren Aktivität nicht negativ.

Alternativ dazu kann ISS-ODN aus Mikrobenspezies isoliert werden (insbesonders aus Mycobakterien) unter Einsatz fachbekannter Verfahren, wie z.B. Nucleinsäurehybridisierung. Vorzugsweise werden solche isolierten ISS-ODN auf einen im Wesentlichen reinen Zustand gereinigt, d.h. so, dass sie frei von enodgenen Kontaminanten, wie z.B. Lipopolysacchariden, sind. ISS-ODN, die als Teil eines größeren Polynucleotids isoliert werden, können unter Verwendung fachbekannter Verfahren, wie z.B. Endonucleaseverdau, auf die gewünschte Länge reduziert werden. Fachleute sind mit Verfahren, die zur Isolation, Reinigung und zum Verdau von Polynucleotiden geeignet sind, vertraut oder können sich diese einfach aneignen, um ISS-ODN zur potenziellen Verwendung in der Erfindung zu erhalten.

Durch Evaluierung, ob das ISS-ODN Cytokinsekretion und IgG-Antikörperisotypproduktion wie in Abschnitt A.I. oben beschrieben beeinflusst, kann eine Bestätigung erhalten werden, dass ein besonderes Oligonucleotid die Eigenschaften eines ISS-ODN aufweist, das für die Erfindung nützlich ist. Details von In-vitro-Verfahren, die für eine solche Evaluierung nützlich sind, sind in den Beispielen angeführt; Fachleuten sind andere Verfahren zur Messung der Cytokinsekretion und Antikörperproduktion gemäß den hierin angeführten Parametern bekannt oder leicht zugänglich.

Die Verfahren zur Herstellung von Phosphatgruppenmodifikationen auf Oligonucleotiden sind fachbekannt und erfordern keine detaillierte Erklärung. Zur Erläuterung eines solchen nützlichen Verfahrens wird ein Zwischenprodukt-Phosphattriester für das Targetoligonucleotidprodukt hergestellt und mit wässrigem Iod oder mit anderen Mitteln, wie z.B. wasserfreien Aminen, zum natürlich vorkommenden Phosphattriester oxidiert. Die resultierenden Oligonucleotidphosphoramidate können mit Schwefel behandelt werden, um Thiophosphate zu ergeben. Dasselbe allgemeine Verfahren (mit der Ausnahme des Schritts der Schwefelbehandlung) kann angewendet werden, um aus Methylphosphonaten Methylphosphoamidite zu ergeben. Für weitere Details betreffend Phosphatgruppenmodifikationsverfahren können Fachleute US-Patent Nr. 4.425.732, 4.458.066, 5.218.103 und 5.453.496 sowie Tetrahedron Lett. 21, 4149 (1995), 7, 5575 (1986), 25, 1437 (1984), und Journal Am. Chem. Soc. 93, 6657 (1987), konsultieren, deren Offenbarungen den Standard-Wissensgrad im Fachgebiet über die Herstellung dieser Verbindungen veranschaulichen.

Ein kolloidales Dispersionssystem kann zur gerichteten Verabreichung von ISS-ODN an ein entzündetes Gewebe verwendet werden. Kolloidale Dispersionsystems umfassen Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrokügelchen, Perlen und lipidbasierte Systeme, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, Mizellengemische und Liposomen. Das bevorzugte kolloidale System für diese Erfindung ist ein Liposom.

Liposomen sind künstliche Membranvesikel, die als In-vitro- und In-vivo Verabreichungsvehikel nützlich sind. Es ist gezeigt worden, dass große einschichtige Vesikel (LUV), die 0,2-4,0 &mgr;m groß sind, einen wesentlichen Prozentsatz eines wässrigen Puffers einkapseln, der große Markomoleküle enthält. RNA, DNA und intakte Virionen können innerhalb des wässrigen Inneren eingekapselt werden und in einer biologisch aktiven Form an Zellen verabreicht werden (Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6, 77 (1981)). Zusätzlich zu Säugetierzellen sind Liposomen zur Verabreichung von Polynucleotiden in Pflanzen-, Hefe- und Bakterienzellen verwendet worden. Damit ein Liposom ein wirksames Gentransfervehikel ist, sollten folgende Eigenschaften gegenwärtig sein: (1) Einkapselung der Gene, welche für die Antisense-Polynucleotide mit hoher Wirksamkeit kodieren, während sie deren biologische Aktivität nicht beeinträchtigen; (2) bevorzugte und wesentliche Bindung an eine Targetzelle im Vergleich zu Nicht-Targetzellen; (3) Verabreichung der wässrigen Gehalte des Vesikels an ein Targetzellzytoplasma mit hoher Wirksamkeit und (4) akkurate und wirksame Expression von genetischer Information (Mannino et al., Biotechniques 6, 682 (1988)).

Die Zusammensetzung des Liposoms ist üblicherweise eine Kombination aus Phospholipiden, insbesondere aus Phospholipiden mit einer hohen Phasenübergangstemperatur, üblicherweise in Kombination mit Steroiden, insbesondere Cholesterin. Es können ebenfalls andere Phospholipide oder andere Lipide verwendet werden. Die physikalischen Eigenschaften von Liposomen hängen vom pH, der Ionenstärke und der Gegenwart zweiwertiger Kationen ab.

Beispiele für Lipide, die in der Liposomenproduktion nützlich sind, umfassen Phosphatidylverbindungen, wie z.B. Phosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Sphingolipide, Cerebroside und Glanglioside. Besonders nützlich sind Diacylphosphatidylglycerine, wo die Lipidgruppierung 14-18 Kohlenstoffatome enthält, insbesondere 16-18 Kohlenstoffatome, und gesättigt ist. Veranschaulichende Phospholipide umfassen Eiphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylcholin.

Das Targeting von Liposomen kann basierend auf anatomischen und mechanistischen Faktoren klassifiziert werden. Eine anatomische Klassifizierung basiert auf dem Selektivitätsgrad, z.B. organspezifisch, zellspezifisch und organellenspezifisch. Mechanistisches Targeting kann basierend darauf, ob es passiv oder aktiv ist, unterschieden werden. Passives Targeting verwendet die natürliche Tendenz von Liposomen zur Verteilung auf Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) in Organen, die Sinuskapillaren enthalten. Aktives Targeting umfasst andererseits die Änderung des Liposoms durch Bindung des Liposoms an einen spezifischen Liganden, wie z.B. einen monoklonalen Antikörper, Zucker, Glykolipid, oder Protein, oder durch Änderung der Zusammensetzung oder Größe des Liposoms, um Targeting an Organe und Zelltypen zu erreichen, die nicht natürlich auftretende Stellen von Lokalisierung sind.

Die Oberfläche des gerichteten Verabreichungssystems kann auf verschiedene Weisen modifiziert werden. Im Fall eines liposomalen gerichteten Verabreichungssystems können Lipidgruppen in die Lipiddoppelschicht des Liposoms aufgenommen werden, um den Targeting-Liganden in stabiler Verbindung mit der liposomalen Doppelschicht zu halten. Verschiedene bekannte verbindende Gruppen können zur Verbindung der Lipidketten mit dem Targeting-Liganden verwendet werden (siehe z.B. Yanagawa et al., Nuc. Acids. Symp. Ser. 19, 189 (1988); Grabarek et al., Anal. Biochem. 185, 131 (1990); Staros et al., Anal. Biochem. 156, 220 (1986), und Boujrad et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5728 (1993), deren Offenbarungen hierin nur deshalb durch Verweis aufgenommen sind, um den Standardwissensstand im Fachgebiet über die Konjugation von Oligonucleotiden an Lipide zu veranschaulichen). Gerichtete Verabreichung von ISS-ODN kann auch durch Konjugation von ISS-ODN an die Oberfläche viraler und nicht-viraler rekombinanter Expressionsvektoren, an ein Antigen oder einen anderen Liganden, an einen monoklonalen Antikörper oder an ein beliebiges Molekül, das die gewünschte Bindungsspezifität hat, erreicht werden.

Beispiele für andere nützliche Konjugatpartner umfassen beliebige immunogene Antigene (einschließlich Allergene, lebende und abgeschwächte Virenpartikel und Tumorantigene), Targeting-Peptide (wie z.B. Rezeptorliganden, Antikörper und Antikörperfragmente, Hormone und Enzyme), nicht-peptidische Antigene (über Peptidbindung gebunden, wie z.B. Lipide, Polysaccharide, Glykoproteine, Ganglioside und dergleichen) und Cytokine (einschließlich Interleukine, Interferone, Erythropoietin, Tumornekrosefaktor und koloniestimulierende Faktoren). Solche Konjugatpartner können gemäß herkömmlichen Verfahren (z.B. Peptidsynthese) hergestellt werden, und viele sind im Handel erhältlich.

Fachleute sind auch mit Verfahren vertraut, die zur Herstellung von Oligonucleotid-Peptidkonjugaten nützlich sind, oder können diese einfach bestimmen. Konjugation kann an einem der Termini von ISS-ODN oder an einer geeignet modifizierten Base an einer inneren Stelle (z.B. ein Cytosin oder Uracil) erreicht werden. Als Verweis sind Verfahren zur Konjugation von Oligonucleotiden an Proteine und an Oligosaccharidgruppierungen von Ig bekannt (siehe z.B. O'Shannessy et al., J. Applied Biochem. 7, 347 (1985), dessen Offenbarung den Standardwissensstand im Fachgebiet betreffend Oligonucleotidkonjugation veranschaulicht). Ein anderer nützlicher Verweis ist Kessler: „Nonradioactive Labeling Methods for Nucleic Acids", in Kricka (Hrsg.), Nonisotopic DNA Probe Techniques, Acad. Press (1992).

Kurz gesagt umfassen Beispiele für geeignete Konjugationsverfahren: Konjugation durch 3'-Anheftung über Festträgerchemie (siehe z.B. Haralambidis et al., Nuc. Acids Res. 18, 493 (1990), und Haralambidis et al., Nuc. Acids. Res. 18, 501 (1990) [Festträgersynthese des Peptidpartners]; Zuckermann et al., Nuc. Acids. Res. 15, 5305 (1987), Corey et al., Science 238, 1401 (1987), und Nelson et al., Nuc. Acids Res. 17, 1781 (1989) [Feststrägersynthese des Oligonucleotidpartners]). Amino-Aminogruppenbindungen können wie in Benoit et al., Neuromethods 6, 43 (1987), beschrieben durchgeführt werden, während Thiol-Carboxylgruppenbindungen wie in Sinah et al., Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press (1991), beschrieben durchgeführt werden können. In letzteren Verfahren wird der Oligonucleotidpartner auf einen festen Träger synthetisiert, und eine bindende Gruppe, die eine geschützte Amin-, Thiol- oder Carboxylgruppe gegenüber von einem Phosphoramidit umfasst, ist kovalent an das 5'-Hydroxyl gebunden (siehe z.B. US-Patent Nr. 4.849.513; 5.015.733; 5.118.800 und 5.118.802).

Bindung des Oligonucleotidpartners an ein Peptid kann auch über Einführung eines Linkerarms (z.B. einer Amin- oder Carboxylgruppe) an eine modifizierte Cytosin- oder Uracilbase erreicht werden (siehe z.B. Ruth, 4th Annual Congress for Recombinant DNA Research auf 123). Affinitätsbindungen (z.B. Biotin-Streptavidin) können ebenfalls verwendet werden (siehe z.B. Roget et al., Nuc. Acids Res. 17, 7643 (1989)).

Es sind ebenfalls Verfahren zur Bindung von Oligonucleotiden an Lipide bekannt und umfassen die Synthese von Oligophospholipidkonjugaten (siehe z.B. Yanagawa et al., Nuc. Acids Symp. Ser. 19, 189 (1988)), Synthese von Oligo-Fettsäurekonjugaten (siehe z.B. Grabarek et al., Anal. Biochem. 185, 131 (1990)) und Oligo-Sterolkonjugaten (siehe z.B. Boujrad et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 5728 (1993)).

Jeder der vorangegangenen Verweise veranschaulicht den Wissensstand im Fachgebiet hinsichtlich Oligonucleotidkonjugationsverfahren.

Co-Verabreichung eines Peptidarzneimittels mit einem ISS-ODN gemäß der Erfindung kann auch durch Einführung von ISS-ODN in cis oder in trans in einen rekombinanten Expressionsvektor (Plasmid, Cosmid, Virus oder Retrovirus) erreicht werden, der für ein beliebiges therapeutisch günstiges Protein kodiert, das mithilfe eines rekombinanten Expressionsvektors verabreicht werden kann. Wenn die Inkorporation eines ISS-ODNs in einen Expressionsvektor zur Verwendung zur Umsetzung der Erfindung erwünscht ist, kann eine solche Inkorporation unter Einsatz herkömmlicher Verfahren erreicht werden, die keine detaillierte Erklärung für Fachleute erfordern. Für eine Erläuterung können Fachleute jedoch Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, siehe oben, konsultieren.

Kurz gesagt verwendet die Herstellung rekombinanter Expressionsvektoren (einschließlich jener, die nicht für ein beliebiges Protein kodieren und als Träger für ISS-ODN verwendet werden) Standardligationsverfahren. Zur Analyse, um korrekte Sequenzen in hergestellten Vektoren nachzuweisen, können die Ligationsgemische verwendet werden, um eine Wirtszelle und erfolgreiche Transformanten zu transformieren, die, wo es angebracht ist, durch Antibiotikaresistenz ausgewählt werden. Vektoren aus Transformanten werden hergestellt, mittels Restriktion analysiert und/oder zum Beispiel mithilfe des Verfahrens von Messing et al. (Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981)), des Verfahrens von Maxam et al. (Methods in Enzymology 65, 499 (1980)) oder anderer geeigneter fachbekannter Verfahren sequenziert. Größentrennung gespaltener Fragmente wird unter Einsatz herkömmlicher Gelelektrophorese wie zum Beispiel von Maniatis et al., Molecular Cloning, 133-134 (1982), beschrieben durchgeführt.

Wirtszellen können mit Expressionsvektoren transformiert und in herkömmlichen Nährstoffmedien gezüchtet werden, die modifiziert werden, sodass sie für die Induktion von Promotoren, die Auswahl von Transformanten oder Amplifikation von Genen geeignet sind. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die zuvor bei der Wirtszelle verwendet wurden, die für die Expression ausgewählt wurde, und sind dem Fachmann bekannt.

Wenn ein rekombinanter Expressionsvektor als Träger für das ISS-ODN der Erfindung verwendet wird, sind Plasmide und Cosmide aufgrund des Fehlens von Pathogenität besonders bevorzugt. Jedoch unterliegen Plasmide und Cosmide rascherem In-vivo-Abbau als Viren und verabreichen daher nicht eine adäquate Dosis von ISS-ODN, um immunstimulierende ISS-ODN-Aktivität wesentlich zu hemmen, die durch einen systemisch verabreichten Gentherapievektor verliehen wird. Von den Virenvektoralternativen besitzen adeno-assoziierte Viren den Vorteil geringer Pathogenität. Die relativ geringe Fähigkeit von adeno-assoziierten Viren zur Insertion fremder Gene stellt in diesem Kontext aufgrund der relativ kleinen Größe, in welcher ISS-ODN der Erfindung synthetisiert werden kann, kein Problem dar.

Andere Virenvektoren, die in der Erfindung verwendet werden können, umfassen Adenovirus, adeno-assoziiertes Virus, Herpes-Virus, Vakzinia- oder ein RNA-Virus, wie z.B. ein Retrovirus. Retrovirale Vektoren sind bevorzugte Derivate eines murinen, aviären oder menschlichen HIV-Retrovirus. Beispiele für retrovirale Vektoren, in welche ein einziges Fremdgen insertiert werden kann, umfassen unter anderem: murines Moloney-Leukämievirus (MoMuLV), murines Harvey-Sarkomvirus (HaMuSV), murines Brusttumorvirus (MuMTV) und Rous-Sarkomvirus (RSV). Eine Reihe zusätzlicher retroviraler Vektoren kann mehrere Gene aufnehmen. All diese Vektoren können ein Gen für einen selektierbaren Marker transferieren oder aufnehmen, sodass transduzierte Zellen identifiziert und erzeugt werden können.

Da rekombinante Retroviren schadhaft sind, erfordern sie Unterstützung, um infektiöse Vektorpartikel zu produzieren. Diese Unterstützung kann z.B. durch die Verwendung von Helferzelllinien bereitgestellt werden, die Plasmide enthalten, die für alle strukturellen Gene des Retrovirus unter der Kontrolle regulierender Sequenzen innerhalb des LTRs kodieren. Diesen Plasmiden fehlt eine Nucleotidsequenz, die den Packmechanismus ermöglicht, um ein RNA-Transkript für Enkapsidierung zu erkennen. Helferzelllinien, die über Deletionen des Packsignals verfügen, umfassen unter anderem zum Beispiel &PSgr;2, PA317 und PA12. Die Zelllinien produzieren leere Virionen, da kein Genom verpackt ist. Wenn ein retroviraler Vektor in solche Helferzellen eingeführt wird, in welchen das Packsignal intakt ist, die strukturellen Gene jedoch durch Gene von Interesse ersetzt sind, kann der Vektor verpackt werden und Vektorvirion produziert werden.

Durch Insertion einer oder mehrerer Sequenzen von Interesse in den Virenvektor gemeinsam mit einem anderen Gen, welches für den Liganden für einen Rezeptor auf einer spezifischen Targetzelle kodiert, kann zum Beispiel der Vektor targetspezifisch gemacht werden. Retrovirale Vektoren können targetspezifisch gemacht werden, indem zum Beispiel ein Polynucleotid, das für einen Zucker, ein Glykolipid oder ein Protein kodiert, insertiert wird. Fachleute kennen spezifische Polynucleotidsequenzen, oder können sich ohne übermäßiges Experimentieren mit ihnen vertraut machen, die in das retrovirale Genom eingeführt werden können, um eine targetspezifische Verabreichung des retroviralen Vektors, der ISS-ODN enthält, zu ermöglichen.

C. Pharmazeutische Zusammensetzungen von ISS-ODN

Wenn ISS-ODN ohne Verwendung eines Vektors oder eines anderen Verabreichungssystems verabreicht werden sollen, werden sie in einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung hergestellt. Pharmazeutisch annehmbare Träger, die für die Verwendung mit den ISS-ODN der Erfindung bevorzugt sind, können sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen umfassen. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle, wie z.B. Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie z.B. Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich salzhältige und gepufferte Medien. Parenterale Vehikel umfassen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, laktierte Ringer-Lösung oder fette Öle. Intravenöse Vehikel umfassen Fluid- und Nährstoffnachfülllösungen, Elektrolytnachfülllösungen (wie z.B. jene basierend auf Ringer-Dextrose) und dergleichen. Es können ebenfalls Konservierungsmittel und andere Zusatzstoffe ebenfalls gegenwärtig sein, wie z.B. antimikrobielle Mittel, Antioxidanzien, Chelatbildner und Inertgase und dergleichen. Eine Zusammensetzung von ISS-ODN kann ebenfalls unter Einsatz fachbekannter Mittel für nachfolgende Rekonstitution und Verwendung gemäß der Erfindung. gefriergetrocknet werden.

Absorptionspromotoren, Detergenzien und chemische Reizmittel (z.B. keritinolytische Mittel) können die Transmission einer ISS-ODN-Zusammensetzung in ein Targetgewebe verstärken. Für einen Verweis auf allgemeine Prinzipien betreffend Absorptionspromotoren und Detergenzien, die erfolgreich in der Schleimhautverabreichung von organischen und peptidbasierten Arzneimitteln verwendet worden sind, siehe Chien, Novel Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Kapitel 4 (1992).

Beispiele für geeignete nasale Absorptionspromotoren sind insbesondere in Chien, siehe oben, Kapitel 5, Tabelle 2 und 3, angeführt, mildere Mittel sind bevorzugt. Geeignete Mittel zur Verwendung im Verfahren dieser Erfindung für Schleimhaut-/nasale Verabreichung sind ebenfalls in Chang et al., Nasal Drug Delivery, „Treatise on Controlled Drug Delivery", Marcel Dekker, Kapitel 9 und Tabelle 3-4B (1992), beschrieben. Geeignete Mittel, von denen bekannt ist, dass sie die Absorption von Arzneimitteln durch die Haut verstärken, sind in Sloan, Use of Solubility Parameters from Regular Solution Theory to Describe Partitioning-Driven Processes, Kapitel 5, „Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery", Marcel Dekker, Kapitel 5 (1992), und an anderen Stellen im Text beschrieben.

All diese Verweise veranschaulichen den Wissensstand und das Können im Fach betreffend Arzneimittelverabreichungsverfahren.

D. Sets zur Verwendung in der Umsetzung der Verfahren der Erfindung

Die Erfindung stellt Sets zur Verwendung in den oben beschriebenen Verfahren bereit. Solche Sets können beliebige oder alle der folgenden Elemente umfassen: ISS-ODN (konjugiert oder nicht-konjugiert); einen pharmazeutisch annehmbaren Träger (kann mit dem ISS-ODN vorgemischt werden) oder eine Suspensionsbasis für die Wiederherstellung von gefriergetrocknetem ISS-ODN; weitere Arzneimittel; eine sterile Phiole für jedes ISS-ODN und ein weiteres Arzneimittel; oder eine einzelne Phiole für Gemische davon; Vorrichtungen) zur Verwendung in der Verabreichung von ISS-ODN an einen Wirt; Testreagenzien zur Detektion von Indizien dafür, dass die gesuchten entzündungshemmenden und/oder immunstimulierenden Wirkungen bei behandelten Tieren erreicht worden sind und eine geeignete Testvorrichtung.

Beispiele, welche die praktische Umsetzung der Erfindung veranschaulichen, sind nachstehend angeführt. Die Beispiele dienen nur dem Zwecke des Verweises und sollen die Erfindung nicht einschränken, die durch die Ansprüche im Anhang definiert ist. Alle in den Beispielen verwendeten Abkürzungen und Termini haben, wenn nicht anders angegeben, ihre erwartete und übliche Bedeutung.

BEISPIEL I MURINES MODELL FÜR DIE ATEMWEGSHYPERREAKTIVITÄT VON ALLERGISCHEM ASTHMA

Mäuse verschiedener Stämme, die gegenüber einem sensibilisierenden Antigen exponiert wurden, stellen ein Modell für die Atemwegshyperreaktivität bei allergischem Asthma dar. Geeignete murine Stämme für die Verwendung zur Modellierung der Erkrankung umfassen Balb/b-Mäuse (die genetisch in Richtung des Th2-Phänotyps beeinflusst sind und verstärkte Konzentrationen von IL-4 und IL-5 als Reaktion auf Antigenprovokation gegenüber CD4+-Lymphozyten produzieren), C57BL/G-Mäuse (denen IL-5 fehlt, für eine detaillierte Studie von IL-5-induziertem Gewebsschaden bei Asthma) und W/Wv-Mäusen (denen Mastzellen fehlen, für eine detaillierte Studie von Mastzellenaktivierung bei Asthma).

Krankheitsmodellierende Mäuse werden auf herkömmliche Weise durch intraperitoneale oder subkutane Injektion eines sensibilisierenden Modellantigens, Ovalbumin („OVA"), in Träger (z.B. sterile Salzlösung oder ein Träger mit Adjuvans, wie z.B. Alaun), gefolgt von einer Antigenprovokation mit aerosolisiertem Antigen hergestellt. Beispielsweise können Mäuse mit 0,25 &mgr;g OVA durch subkutane Injektion (mit oder ohne Adjuvans) wöchentlich 4-6 Wochen lang immunisiert werden und dann mit 2 oder 3 wöchentlichen Aerosolisierungen von OVA bei einer Konzentration von 50 mg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) provoziert werden, die in 20-Minuten-Intervallen oder in einer Konzentration von 10 mg/ml 0,9% Kochsalzlösung täglich über einen Zeitraum von etwa einer Woche (in drei 30-Minuten-Intervallen täglich) verabreicht wird. Zerstäubervorrichtungen zur Verwendung in der Aerosolisierung sind von Aerotech II, CIS-US, Bedford, Massachusetts, zu beziehen, mit einer Nasenkammer, die für murine Nasengänge angepasst wird (z.B. eine reine Nasenkammer von Intox Products, Albuquerque, New Mexico). Wenn die Vorrichtungen mit Druckluft mit einer Geschwindigkeit von 10 Litern/min angetrieben werden, produzieren die beschriebenen Vorrichtungen Aerosolteilchen mit einem durchschnittlichen aerodynamischen Durchmesser von 1,4 &mgr;m.

Kontrollmäuse sind bevorzugt Wurfgeschwister, die ohne vorherige Immunisierung einem Protein-Antigen ausgesetzt sind. Für weitere Details bezüglich dieses Tiermodells können sich Fachleute an Foster et al., J. Exp. Med., 195-201 (1995), und Corry et al. J. Exp. Med., 109-117 (1996), wenden.

BEISPIEL II REDUKTION VON EOSINOPHILENAKKUMULIERUNG IN LUNGENGEWEBE IN EINEM MURINEN ASTHMAMODELL DURCH VERABREICHUNG VON ISS-ODN

BALB/c-Mäuse, 6-10 Wochen alt, wurden als Modelle für allergisches Asthma wie in Beispiel I beschrieben hergestellt (subkutane Injektion von OVA, gefolgt von Antigenprovokation bei einer Konzentration von 50 mg OVA/ml PBS). Vor jeder Inhalation mit OVA gemäß diesem Schema wurden Gruppen von 8 Mäusen jeweils wie in der nachstehenden Tabelle beschrieben behandelt. Kontrollmäuse wurden einem Antigen ausgesetzt, aber nicht behandelt, und naive Mäuse wurden nicht einem Antigen ausgesetzt. Alle ISS-Dosen waren 100 &mgr;g pro Verabreichung. Dexamethason-Dosen (ein herkömmliches steroides entzündungshemmendes Mittel, das zur Behandlung von Asthma verwendet wird) betrugen 5 mg/kg/Maus. Priming-Dosen von Antigen waren 25 &mgr;g OVA, das an Alaun in 0,2 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) adsorbiert war. Provokationsdosen von Antigen waren 10 ml von 50 mg OVA/ml PBS. IN=intranasal; IP=intraperitoneal; SC=subkutan und N/A=nicht zutreffend.

DY1018 hat folgende Nucleotidsequenz:

5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' (Seq.-ID Nr. 19) mit einem Thiophosphatrückgrat,

und DY1019 hat folgende Nucleotidsequenz:

5'-TGACTGTGAAGGTTGGAGATGA-3' (Seq.-ID Nr. 20) mit einem Thiophosphatrückgrat.

An Tag 32 wurde jeder Maus über einen Schwanzschnitt (etwa 50 &mgr;l Volumen) in eine 0,1 mM Lösung aus PBS und EDTA Blut abgenommen. Rote Blutzellen in Lösung wurden mit 150 mM NH4Cl und 10 mM KHCO3 in dH2O lysiert und dann gefärbt (Wright-Giesma-Färbung). Bei jeder Maus wurde nach deren Tötung durch Kanalisierung der Trachea und Spülung mit 800 Mikrolitern PBS eine Lungenspülung erhalten, dann wurde das Produkt der Spülung gefärbt. Knochenmarksproben jeder Maus wurden durch Spülung des extrahierten Femurmarks mit PBS erhalten. Histologische Proben von Lungen- und Tracheagewebe wurden vom rechten unteren Lappen der Lunge und Trachea erhalten. Die Proben wurden eingefroren, auf eine Breite von 5 &mgr;m geschnitten und mit DAB-Peroxidase gefärbt.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle als Prozent Eosinophile im Vergleich zur Gesamtzahl von Leukozyten (entzündliches Infiltrat) in jeder Probe ausgedrückt, mit Ausnahme der „Lungen"-Ergebnisse, welche die Zahl von Eosinophilen pro mikroskopisches Feld repräsentieren (für jede Probe wurden 5 zufällig ausgewählte Felder evaluiert). Zusammengefasst hatten die Kontrollmäuse einen Durchschnitt von 67% Eosinophilen in den Lungen-/Tracheagewebsproben, während Mäuse, die das mutierte ISS-ODN (M-ISS-ODN, DY1019) erhielten, 52% und 88 (± 12%) durchschnittliche Akkumulation von Eosinophilen in Lungengewebe nach IP- bzw. IN-Verabreichung aufwiesen. Die höheren Werte für die Mäuse, die mit M-ISS-ODN nach Antigenprovokation behandelt wurden, sind am wahrscheinlichsten auf die immunhemmenden Eigenschaften von DY1019 zurückzuführen (siehe die gleichzeitig anhängige, gemeinsam gehaltene US-Patentanmeldung mit dem Namen „Inhibitors of DNA Immunostimulatory Sequence Activity", Eyal Raz, Erfinder, eingereicht am 6. Juni 1997 (Serien-Nummer 60/048.793)). Mausgruppen 7 und 8 stellen daher ein Modell für einen teilweise immun-inkompetenten Wirt mit allergischem Asthma bereit.

In verblüffendem Gegensatz dazu wiesen die Mäuse, die mit dem DY1018-ISS-ODN vorbehandelt wurden, das ihnen intranasal verabreicht wurde, weniger als etwa 10% Eosinophilenakkumulation in der Lunge und Trachea auf, wenn sie nach Antigenprovokation behandelt wurden, und nur etwa 19% Eosinophilenakkumulation, wenn sie vor Antigenprovokation behandelt wurden. Diese Werte stellen eine bis zu 80%ige Reduktion der Eosinophilenakkumulation im Vergleich zu den Kontrollmäusen und eine mehr als 90%ige Reduktion im Vergleich zu Mäusen, die mit M-ISS-ODN (IN) behandelt wurden, dar.

Den mit ISS-ODN IP behandelten Mäusen erging es noch besser, mit einer 6% Eosinophilenakkumulation in der Lunge und Trachea bei Behandlung vor und nach Antigenprovokation. Dieser Wert stellt eine 86%ige Reduktion der Eosinophilenakkumulation im Vergleich zu den Kontrollmäusen dar und eine 91%ige Reduktion im Vergleich zu Mäusen, die mit M-ISS-ODN (IP) behandelt wurden.

Diese Daten zeigen, dass die mit IL-5 stimulierte Eosinophilenakkumulation im Lungengewebe, welche die späte Phase von allergischem Asthma charakterisiert, durch die therapeutischen ISS-ODN-Verfahren der Erfindung gehemmt wird.

BEISPIEL III ANTIGENUNABHÄNGIGE REDUKTION VON EOSINOPHILENAKKUMULATION IM LUNGENGEWEBE

Zur Beurteilung, ob die Eosinophilensuppression, die durch die Daten in Beispiel II dargestellt ist, von der Immunstimulation durch ISS-ODN abhängt, wurden Mäuse unter Einsatz eines herkömmlichen Th2-stimulierenden Adjuvans (Alaun) auf OVA sensibilisiert, mit ISS-ODN oder einer Kontrolle behandelt und auf Eosinophilensuppression gemessen, bevor ISS-ODN-Stimulation des Mausimmunsystems erwartet wurde.

Spezieller wurden Gruppen von vier Mäusen mit 25 &mgr;g OVA in 1 mg Alaun durch subkutane Injektion an den Tagen 1, 7, 14 und 21 immunisiert. Es ist bekannt, dass dieses Immunisierungsprotokoll bei Mäusen eine Reaktion vom Th2-Typ auf das Antigen stimuliert. An Tag 27 erhielt eine Gruppe von Tieren wie in Beispiel I beschrieben durch intraperitoneale Verabreichung 100 &mgr;g von DY1018-ISS-ODN. Eine Kontrollgruppe erhielt das mutierte DY1019-M-ISS-ODN, das in Beispiel I beschrieben ist, auf demselben Weg.

An Tag 28 erhielten die Tiere in jeder Gruppe 10 mg OVA/ml phosphatgepufferter Salzlösung durch Inhalation über einen Zeitraum von 30 Minuten. An Tag 30 erhielten einige der Tiere in jeder Gruppe eine zweite Injektion von ISS-ODN oder M-ISS-ODN, und die Tiere, die zuvor an Tag 27 nicht behandelt worden waren, wurden mit ISS-ODN oder M-ISS-ODN behandelt. Die Inhalationsprovokation mit OVA wurde an Tag 31 wiederholt, und die Tiere wurden zur Eosinophilenzählung innerhalb von 24 Stunden getötet.

Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in der nachstehenden Tabelle angeführt. Tiere, die zwei Behandlungen mit ISS-ODN an den Tagen 27 und 30 erhielten, zeigten nur 5,8% Eosinophile in der Broncheoalveolärfluid-(BALF-)Spülung an Tag 32, obwohl Immunstimulation durch das ISS-ODN so kurz nach der Behandlung minimal ist. Sogar nach nur einer Behandlung mit ISS-ODN (an Tag 30) war die Eosinophilenakkumulation in dem BALF der behandelten Tiere auf 10,3% beschränkt. Hingegen zeigten die Kontrolltiere, die zweimal mit M-ISS-ODN behandelt wurden, 42,3% Eosinophile in extrahiertem BALF.

Diese Daten zeigen, dass die praktische Umsetzung der Erfindung allergische Entzündungen bei Tieren hemmen kann und dass die Hemmung schon einen Tag nach der Behandlung auftreten kann.

BEISPIEL IV SELEKTIVE INDUKTION VON Th1-REAKTION BEI EINEM WIRT NACH VERABREICHUNG EINES ISS-ODN-ENTHALTENDEN PLASMIDS

Bei Mäusen sind IgG-2A-Antikörper serologische Marker für eine Immunreaktion vom Th1-Typ, während IgG-1-Antikörper eine Immunreaktion vom Th2-Typ angeben. Th2-Reaktionen umfassen die allergieassoziierte IgE-Antikörperklasse; lösliche Proteinantigene tendieren dazu, relativ starke Th2-Reaktionen zu stimulieren. Hingegen werden Th1-Reaktionen durch Antigenbindung an Makrophagen und dendritische Zellen induziert.

Zur Bestimmung, welche Reaktion von Mäusen produziert wird, wenn überhaupt eine Reaktion produziert wird, die ISS-ODN gemäß der Erfindung erhielten, wurden Gruppen von Balb/c-Mäusen mit 10 &mgr;g &bgr;-Galactosidaseprotein immunisiert (an Avidin konjugiert, Sigma, St. Louis, Missouri), um einen allergischen Modellphänotyp zu produzieren, und wurden wie folgt behandelt:

In 2-Wochen-Intervallen wurde beliebiges IgG-2a und IgG-1 an &bgr;-Galactosidase, das im Serum jeder Maus vorhanden war, durch enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (unter Einsatz von Antikörpern, die für die IgG-1- und IgG-2A-Unterklassen spezifisch sind) auf Mikrotiter-Platten gemessen, die mit dem Enzym beschichtet waren.

Wie in 2 dargestellt produzierten nur jene Mäuse, die das ISS-ODN erhielten, hohe Titer von IgG-2A-Antikörpern, die über einen Zeitraum von 12 Wochen anstiegen. Wie in 3 dargestellt induzierte die Immunisierung von Mäusen mit dem Antigen selbst oder mit dem mutierten ISS-ODN die Produktion von relativ hohen Titern von IgG1-Antikörpern. Die Daten, die in den Figuren dargestellt sind, umfassen Durchschnitte der Werte, die von jeder Gruppe von Mäusen erhalten wurden.

Diese Daten zeigen, dass eine selektive Th1-Reaktion durch Verabreichung eines ISS-ODNs gemäß der Erfindung an einen antigen-exponierten Wirt induziert ist. Weiters zeigen die Daten, dass ISS-ODN-Verabreichung gemäß der Erfindung das Immunsystem bei Antigenprovokation in Richtung Th1-Phänotyp beeinflusst, sogar wenn die ISS-ODN vor Antigenprovokation verabreicht werden (in diesem Fall 72 Stunden vor Provokation).

BEISPIEL V SUPPRESSION VON IgE-ANTIKÖRPER-REAKTION AUF ANTIGEN DURCH IMMUNISIERUNG MIT POLYNUCLEOTIDEN, DIE FÜR EIN ANTIGEN KODIEREN

Zur Veranschaulichung der IgE-Suppression, die bevorzugt durch Stimulation einer Zellimmunreaktion vom Th1-Typ gegenüber einer Zellimmunreaktion vom Th2-Typ erreicht wird, wurden fünf bis acht Wochen alte Balb/c-Mäuse mit einem von zwei rekombinanten Expressionsvektoren immunisiert: ISS-ODN, das pCMV-Lac-Z enthält (das zwei Kopien von Nucleotidsequenzen enthält, die dem DY1018-ISS-ODN ähnlich sind), oder ein Kontrollplasmid, pCMV-BL. Eine dritte Gruppe der Mäuse erhielt Antigeninjektionen (&bgr;-Galactosidase). Plasmid-DNA wurde gereinigt, und sein Endotoxingehalt wurde mittels Extraktion mit TRITON X-114 (Sigma, St. Louis, Missouri) auf 0,5-5 ng/1 mg DNA reduziert. Vor Inokulation wurde pDNA in Ethanol präzipitiert, mit 70% Ethanol gewaschen und in pyrogenfreier normaler Kochsalzlösung gelöst.

Immunisierung wurde durch intradermale Injektion von Plasmid-DNA, die auf separate Zinken einer MONO-VACC®-Vorrichtung mit mehreren Zinken (CONNAUGHT Lab.Inc., Swiftwater, Pennsylvania) geladen wurde, durchgeführt. Kurz gesagt wurden die Zinkenvorrichtungen nach umfassender Waschung in DDW und Einweichen über Nacht in 0,5% SDS (sulfatierte Dodecylsalzlösung) hergestellt, wieder in DDW gewaschen, über Nacht in 0,1 N NaOH eingeweicht, wieder in DDW gewaschen und bei 37°C 8 Stunden lang getrocknet. Sechs &mgr;l von Plasmid-DNA, die in normaler Kochsalzlösung gelöst waren, wurden auf die Zinken der Zinkenvorrichtung kurz vor jeder nachstehend beschriebenen Inokulation pipettiert. Die Gesamtmenge der pro Inokulation auf die Vorrichtung geladenen pDNA betrug jeweils 25 &mgr;g pCMV-Lac-Z und pCMV-BL. Zum Zwecke der Schätzung der tatsächlichen Dosen wurde angenommen, dass weniger als 10% der pDNA-Lösung, die auf die Zinkenvorrichtung geladen wurde, tatsächlich bei Injektion der Zinken in das intradermale Gewebe eingeführt wurden.

Jeder Maus wurden dreimal 2 Inokulationen jedes Plasmids in einem 1-Wochen-Intervall intradermal in die Schwanzbasis injiziert. Eine andere Gruppe von Mäusen erhielt eine einzige intradermale Injektion von 10 g &bgr;-Galactosidaseprotein (gelöst in 50 &mgr;l normaler Kochsalzlösung) in die Schwanzbasis anstelle von pDNA.

Zur Induktion einer IgE-Antikörperreaktion auf nachfolgende Provokation mit sensibilisierendem Antigen wurden jeder Gruppe von Mäusen 14 Wochen nach der anfänglichen Immunisierung einmal intraperitoneal 0,1 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) injiziert, die 1 &mgr;g von Antigen (&bgr;-Galactosidase, Calbiochem, San Diego, Kalifornien) und 3 mg Alaun-Aluminiumhydroxid als Adjuvans (Pierce Chemical, Rockford, Illinois) enthielt. Das gesamte IgE wurde in Sera der Mäuse 4-mal über die darauf folgenden 4 aufeinander folgenden Wochen getestet.

IgE wurde unter Einsatz eines Festphasenradioimmuntests (RAST) in einer 96-Well-Polyvinyiplatte detektiert (eine Radioisotopmodifikation des ELISA-Verfahrens, das in Coligan, „Current Protocols in Immunology", Kapitel 7.12.4, Band 1, Wiley & Sons (1994), beschrieben ist), mit der Ausnahme, dass gereinigte polyklonale Ziegenantikörper, die für Maus-∊-Ketten spezifisch sind, anstelle von Antikörpern verwendet wurden, die für menschliches Fab spezifisch waren. Zur Detektion von Anti-Lac-Z-IgE wurden die Platten mit &bgr;-Galactosidase (10 g/ml) beschichtet. Die geringste IgE-Konzentration, die mithilfe des verwendeten Tests messbar war, betrug 0,4 ng IgE/ml.

Bei der spezifischen Messung der Anti-Antigen-Reaktion jeder Gruppe von Mäusen, wie in 4 dargestellt, waren die Anti-Lac-Z-IgE-Spiegel bei den Mäusen, denen ISS-ODN-enthaltendes Plasmid injiziert wurde, sowohl vor als auch nach dem Boosten durchwegs niedrig (durchschnittlich etwa 250 CPM bei RAST), während Mäuse, denen das Protein injiziert wurde, hohe Spiegel von Anti-Lac-Z entwickelten, insbesondere nach der ersten Antigen-Booster-Injektion, wenn Anti-Lac-Z-Spiegel bei Mäusen auf einen Durchschnitt von etwa 3000 CPM anstiegen. Übereinstimmend mit dem Erwerb von Toleranz sanken die Anti-Lac-Z-IgE-Spiegel bei Mäusen, denen Protein injiziert wurde, im Verlauf der Zeit, nahmen aber bei den Kontrollmäusen, die keine beliebige Immunisierung auf &bgr;-Galactosidase erhalten hatten, weiter zu.

Diese Daten zeigen, dass Mäuse, denen das ISS-ODN-enthaltende Plasmid injiziert wurde, eine antigenspezifische Th1-Reaktion auf das Plasmidexpressionsprodukt mit gleichzeitiger Suppression von IgE-Produktion entwickelten, während die Toleranz bei Mäusen, denen das Protein injiziert wurde, nur nach Entwicklung von wesentlich höheren Spiegeln von antigenspezifischen IgE-Antikörpern erreicht wurde.

BEISPIEL VI IL-4, IL-5, IL-10 und INF&ggr;-SPIEGEL UND CD4+-LYMPHOZYTENPROLIFERATION BEI MÄUSEN NACH VERABREICHUNG VON ISS-ODN

BALB/C-Mäusen wurden intravenös 100 &mgr;g DY1018, DY1019 oder eine zufällige Sequenzkontrolle (DY1043) injiziert, und die Mäuse wurden dann 24 Stunden später getötet. Aus jeder Maus wurden Splenozyten geerntet.

96-Well-Mikrotiter-Platten wurden mit Anti-CD3-Antikörper (Pharmingen, La Jolla, Kalifornien) bei einer Konzentration von 1 &mgr;g/ml Kochsalzlösung beschichtet. Der Anti-CD3-Antikörper stimuliert T-Zellen durch die Bereitstellung eines chemischen Signals, das die Wirkungen der Bindung an den T-Zellrezeptor-(TCR-)Komplex nachahmt. Die Platten wurden gewaschen, und zu jedem Well (4 × 105/Well) wurden in einem Medium von RPMI 1640 mit 10% fötalem Kalbserum Splenozyten hinzugefügt. An den Tagen 1, 2 und 3 wurden Überstände erhalten.

Die Th2-Cytokin-(IL-4-, IL-5- und IL-10-)Spiegel wurden unter Einsatz eines im Handel erhältlichen Sets in den Überständen getestet; Th1-Cytokin-(INF&ggr;-)Spiegel wurden mit einem murinen Anti-INF&ggr;-Antikörpertest gemessen (siehe z.B. Coligan, „Current Protocols in Immunology", Kapitel 6.9.5, Band 1, Wiley & Sons (1994)). Bei Mäusen mit einem Th2-Phänotyp waren relativ hohe Spiegel von IL-4 und IL-10 mit niedrigen Spiegeln von INF-&ggr; zu erwarten, während relativ niedrige Spiegel von IL-4 und IL-10 mit hohen Spiegeln von INF-&ggr; bei Mäusen mit einem Th1-Phänotyp zu erwarten waren. Relativ hohe Spiegel von INF-&ggr; charakterisieren ein pro-entzündliches Milieu, während für relativ niedrige Spiegel von IL-5 das Gegenteil zutrifft.

Wie in 5 und 6 dargestellt waren die Spiegel von Anti-CD3-stimulierter IL4- und IL-10-Sekretion bei mit DY1018 behandelten Mäusen wesentlich geringer als bei den Kontrollmäusen. Bei den mit DY1019-Mäusen waren die Spiegel mittelmäßig. Spiegel von pro-entzündlichem IL-5 wurden bei mit DY1018 behandelten Mäusen auf ein vergleichbares Ausmaß reduziert (7).

Spiegel von T-Zellproliferation als Reaktion auf Antigenprovokation wurden bei mit DY1018 (ISS-ODN) behandelten Mäusen im Vergleich zu mit DY1019 (mutiertem ISS-ODN) behandelten Mäusen und Kontrollmäusen stark reduziert. Diese Suppression der T-Zellproliferation war bei Verabreichung von IL-2 reversibel, was angab, dass die Suppression auf Th2-Anergie bei den mit ISS-ODN behandelten Mäusen zurückzuführen war.

Spiegel von Th1-stimulierter IFN-&ggr;-Sekretion wurden bei den mit DY1018 behandelten Mäusen stark erhöht, aber bei den mit DY1019 behandelten Mäusen (im Vergleich zur Kontrolle) wesentlich reduziert, was die Stimulation eines Milieus vom Th2-Typs bei letzteren Mäusen (8) anzeigt. Weitere Daten, die diese Ergebnisse zeigen, sind in der nachstehenden Tabelle angeführt. „b/f" bezieht sich in der Tabelle auf „vor", „1.", „2." und „jeder" bezieht sich auf die Verabreichung der Verbindung vor der 1. oder 2. Antigenprovokation.

Bedeutenderweise verschiebt die Behandlung von Mäusen vor Antigenprovokation die Immunreaktion auf Antigenprovokation noch wirkungsvoller auf einen Th1-Phänotyp als nach der Provokation. Wie in den 9 und 10 dargestellt entwickelten antigengeprimte (aber nicht provozierte) Tiere, denen ISS-ODN DY1019 72 Stunden vor Antigenprovokation (mit &bgr;-Galactosidase) injiziert wurde, eine robustere Immunreaktion vom Th1-Typ auf das Antigen als ihre Wurfgeschwister, die nach Provokation behandelt wurden, oder Wurfgeschwister, die vor der Provokation mit einem mutierten, inaktiven Oligonucleotid (DY1019) behandelt wurden, wie durch die erhöhte IFN&ggr;-Sekretion (9) und CD4+-Lymphozytenproliferation (10) gemessen wird.

Weiters supprimieren ISS-ODN, die gemäß der Erfindung verabreicht werden, Th2-Cytokinfreisetzung aus Th2-sensibilisierten Mauszellen (Splenozyten, die aus OVA-geprimten Mäusen geerntet werden, dann 72 Stunden lang mit 100 &mgr;g/ml OVA in vitro inkubiert wurden). Die ISS-ODN-Behandlung fand entweder 1 (–1) oder 3 (–3) Tage vor der Tötung der Tiere statt. Diese Daten sind nachstehend angeführt:

SEQUENZPROTOKOLL

  • Seq.-ID Nr. 1 bis 18 stellen repräsentative hexamere Nucleotidsequenzen von ISS-ODN dar.
  • Seq.-ID Nr. 19 ist die vollständige Nucleotidsequenz von ISS-ODN DY1018.
  • Seq.-ID Nr. 20 ist die vollständige Nucleotidsequenz einer inaktiven ISS-ODN-Mutante, DY 1019.

SEQUENZPROTOKOLL


Anspruch[de]
Verwendung eines immunstimulierenden Oligonucleotids (ISS-ODN) bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Asthma bei Säugetieren, ohne gleichzeitige Verabreichung eines immunisierenden Antigens, worin das Säugetier auf asthmastimulierendes Antigen sensibilisiert ist und worin das ISS-ODN die Sequenz 5'-Cytosin-Guanin-3' umfasst, worin ISS-ODN ins Respirationsgewebe intranasal, über Inhalation oder über Insufflation verabreicht wird. Verwendung nach Anspruch 1, worin das ISS-ODN über einen Zerstäuber, der das ISS-ODN in die Nasenschleimhaut, die Trachea oder die Bronchiolen abgibt, oder intranasal in das Lungengewebe verabreicht wird. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin ISS-ODN eine hexamere Nucleotidsequenz umfasst, die aus 5'-Purin-Purin-C-G-Pyrimidin-Pyrimidin-3' besteht. Verwendung nach Anspruch 3, worin die hexamere Nucleotidsequenz aus AACGTT besteht. Verwendung nach Anspruch 3, worin die hexamere Nucleotidsequenz aus der aus AACGCC, AACGTC, AGCGCC, AGCGCT, AGCGTC, GACGCC, GACGCT, GACGTC; GACGTT, GGCGCC, GGCGCT, GGCGTC und GGCGTT bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin ISS-ODN zumindest 6 Nucleotide lang ist. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin ISS-ODN Seq.-ID Nr. 19 umfasst. Verwendung nach Anspruch 1 der 2, worin ISS-ODN in einem ISS-enthaltenden rekombinanten Expressionsvektor vorliegt. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin ISS-ODN zwischen 6 und 200 Nucleotide lang ist. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Säugetier ein Mensch ist. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin ISS-ODN an ein Peptid gebunden ist, worin das Peptid nicht das Antigen ist, gegen das das Säugetier sensibilisiert ist, und worin das Peptid aus einer Targetinggruppierung und einem Cytokin ausgewählt ist. Verwendung nach Anspruch 11, worin das Peptid eine Targetinggruppierung ist. Verwendung nach Anspruch 11, worin das Peptid ein Cytokin ist. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin ISS-ODN an einen Antikörper gebunden ist. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, weiters umfassend die Verabreichung eines immuntherapeutischen Mittels. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, weiters umfassend die Verabreichung eines entzündungshemmenden Mittels. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin die Akkumulation von Eosinophilen im Lungengewebe reduziert wird. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin die Entzündung durch asthmastimulierendes Antigen reduziert wird.






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