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Dokumentenidentifikation DE102005018641B4 06.09.2007
Titel Verwendung von Verbindungen zur Prophylaxe und / oder Behandlung von Tumoren
Anmelder Bio Mac- Privatinstitut für medizinische und zahnmedizinische Forschung,Entwicklung und Diagnostik GmbH, 04103 Leipzig, DE
Erfinder Birkenmeier, Gerd, 04103 Leipzig, DE;
Birkenmeier, Monika, 04103 Leipzig, DE;
Huse, Klaus, 04416 Markkleeberg, DE
Vertreter Kailuweit & Uhlemann, Patentanwälte, 01187 Dresden
DE-Anmeldedatum 15.04.2005
DE-Aktenzeichen 102005018641
Offenlegungstag 19.10.2006
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 06.09.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.09.2007
IPC-Hauptklasse A61K 31/22(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
IPC-Nebenklasse A61P 35/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), insbesondere Ethylpyruvat oder Butylpyruvat, zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Tumoren in der Human- und/oder Veterinärmedizin.

Krebs ist eine Erkrankung, bei der Zellen, deren Ursprung in den unterschiedlichsten Organen (z.B. Leber, Hirn, Prostata, Blut, Niere) liegen kann, durch endogene Prozesse (Fehler in verschiedenen Prozessen während der Zellteilung) oder exogene Faktoren (u.a. chemische Mutagene, Strahlung) so verändert werden, dass sie sich Wachstumskontrollen entziehen können und sogar aus dem ursprünglichen Gewebe herausgelöst werden und sich nach Verteilung über den Blutstrom oder das lymphatische System in anderen Organen ansiedeln und dort eindringen (Metastasen). Im Ursprungsorgan wie auch dem sekundär besiedelten Organ können sie sich endlos vermehren und bösartige Tumoren bilden, die zum Tode des Betroffenen führen können.

Die Vielfalt ihrer Herkunft und die Vielfalt ihrer Entstehung macht die entstandenen Tumorzellen jeweils einzigartig. Es gibt Tumoren, die von Wachstumsfaktoren (z.B. TGFbeta, Leptin) oder Hormonen (z.B. männliche oder weibliche Sexualhormone) abhängig sind oder ihre Stimuli selbst produzieren. In vielen Fällen sind die wachstumsfördernden Faktoren sogar unbekannt. Demzufolge ist eine einheitliche Therapie der verschiedenen Krebsformen bisher nicht möglich, obwohl dies wünschenswert ist, um Tumoren bei Menschen und Tieren erfolgreich zu behandeln.

Krebszellen benötigen beträchtliche Energiemengen, um ihre Zellteilung ablaufen lassen zu können. Dies muss bei vielen Tumoren darüber hinaus bei verringerter Sauerstoffversorgung erfolgen, denn Tumore sind meist schlecht mit Gefäßen durchdrungen und solide Tumore weisen stets große, schlecht durchblutete Bereiche auf, die hypoxisch sind.

Ein generelles Merkmal von Tumoren ist im Einklang mit den hypoxischen Bedingungen eine hohe Glykolyserate, die sogar in besser gefäßversorgten Bereichen als „aerobe Glykolyse" abläuft. Diese Eigenschaft von Krebszellen, auch „fehlender Pasteureffekt" genannt, ist bereits vor mehr als siebzig Jahren von Warburg beschrieben worden und hat sich seither vielseitig bestätigt. Strittig ist lediglich, ob die erhöhte Glykolyserate als Ursache oder Folge einer Transformation in der Tumorgenese anzusehen ist (Garber K., 2004).

Aus der Hemmung der Glykolyse erhoffte man daher die Ableitung einer "universellen" Therapie einer Vielzahl von Krebsarten.

So beschreibt US 2004/0167079 A1 Verfahren zur Behandlung von Krebs durch den Einsatz von 2-Desoxy-Glucose (2-DG), einem Inhibitor der Glykolyse.

US 2003/0181393 A1 offenbart die Glykolyseinhibitoren 2-Desoxyglucose, Oxamat und Iod-Acetat. Iod-Acetat inhibiert dabei die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase und Oxamat die Laktat-Dehydrogenase.

Der hauptsächliche Mangel der Strategie der Glykolysehemmung liegt jedoch darin, dass die Glykolyse in fast allen Zellen zur Energiegewinnung benutzt wird, so dass auch gesunde Zellen durch die Hemmung der Glykolyse beeinflusst werden. Besonders der Einfluss auf das Gehirn ist dramatisch, da das Gehirn als obligater Glucoseverbraucher stark von der Glykolyse abhängig ist.

Ein neuerer Ansatz für eine therapeutische Intervention mit dem Ziel, die veränderte und erhöhte Glykolyse als Tumorzell-spezifisches Target zu beeinflussen, liegt daher nicht mehr in der Hemmung der Glykolyse, sondern in der Hemmung der Glyoxalasen (Creighton et al, 2003; Hamilton und Batist, 2004).

Die beiden Glyoxalasen I und II sind für den Abbau des bei der Glykolyse anfallenden Nebenprodukts Methylglyoxal verantwortlich. Methylglyoxal ist zytotoxisch (z.B. über die Bildung von Addukten mit zellulären Proteinen und Nukleinsäuren), und Krebszellen besitzen im allgemeinen sehr hohe Konzentrationen von Glyoxalasen, um mit dem durch die erhöhte Glykolyse vermehrt anfallenden Methylglyoxal umgehen zu können. Unter der Wirkung der Glyoxalasen werden 2-Oxo-Aldehyde wie Methylglyoxal über das Intermediat S-D-Laktoyl-Glutathion in die korrespondierenden 2-Hydroxysäuren wie D-Laktat umgewandelt.

Wird durch Glyoxalase-Hemmer der Abbau von Methylglyoxal verhindert, wird in den Zellen, die durch eine erhöhte Glykolyse vermehrt Methylglyoxal bilden wie beispielsweise Tumorzellen, das Zellgift jedoch angehäuft. Dies führt zur Apoptose der Zellen.

Auf der Basis des Substrats der Glyoxalase I, dem Halbthioacetal aus Methylglyoxal und Gluthathion, wurden bereits peptidische Glyoxalase-Inhibitoren synthetisiert (Johansson et al, 2000; Thornalley et al, 1996; Kalsi et al, 2000; Sharkey et al, 2000).

US 4 898 870 beschreibt Pyrrolochinolinchinon Verbindungen in Verbindung mit der Inhibition der Glyoxalase I. WO 99/35128 A1 beschreibt ebenfalls Verbindungen zur Inhibition von Glyoxalase I. WO2004/101506 A1 beschreibt eine weitere Klasse nicht-peptidischer Glyoxalase I Inhibitoren.

Die bisher bekannten Glyoxalaseinhibitoren weisen allerdings eine relativ hohe oder sehr hohe Toxizität auf und werden im Stoffwechsel zu Verbindungen metabolisiert, die wiederum vielfältige pharmakologische Effekte haben und teils starke Nebenwirkungen entwickeln.

Die bisher bekannten Glyoxalaseinhibitoren hemmen ausserdem jeweils entweder nur Glyoxalase I oder nur Glyoxalase II. Gegenüber Hemmstoffen, die nur gegen ein einziges Proteintarget gerichtet sind, wird jedoch sehr rasch eine Resistenz entwickelt, indem in dem entsprechenden Protein z.B. Mutationen auftreten, die den Hemmstoff wirkungslos werden lassen.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ungiftige und nicht-mutagene Verbindungen zur Hemmung der zellulären Methylglyoxaldetoxifikation, insbesondere zur Hemmung der Glyoxalasen I und II anzugeben, die die Zellproliferation hemmen und somit zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden können.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1,

wobei R1 einen verzweigten oder unverzweigten Alkyl-, Alkenyl-, Alkenyl- oder Cycloalkyl-Rest vorzugsweise mit einer Kettenlänge von C1 bis C8 bedeutet und wobei R2 H- oder einen verzweigten oder unverzweigten Alkyl-, Alkenyl- oder Alkenyl-Rest vorzugsweise mit einer Kettenlänge von C1 bis C8 bedeutet.

Die Ansprüche 2 bis 11 stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar.

Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) handelt es sich beispielsweise um Methylpyruvat, Ethylpyruvat, Butylpyruvat, Isobutylpyruvat, Ethyl-2-oxo-butyrat.

Besonders bevorzugt sind die Verbindungen Ethylpyruvat, Butylpyruvat, Isobutylpyruvat und Ethyl-2-oxo-butyrat.

Überraschend wurde gefunden, dass Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wie z.B. Ethylpyruvat in der Lage sind, sowohl die Glyoxalase I als auch die Glyoxalase II zu hemmen. Die Hemmung von Glyoxalasen durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) verhindert erfindungsgemäß die zelluläre Entgiftung von Methylglyoxal und führt über verschiedene Mechanismen zur Hemmung der Zellproliferation und zum Zelltod.

Vorteilhaft werden durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mehrere Enzyme- im vorliegenden Fall die Glyoxalasen I und II – inhibiert, was die Wahrscheinlichkeit einer Resistenzausbildung innerhalb des therapeutischen Zeitraums drastisch verringert.

Vorteilhaft werden durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) solche Zellen gehemmt, die eine deutlich erhöhte Glykolyserate aufweisen, während der Stoffwechsel in Zellen mit normaler Glykolyserate nicht oder nur gering beeinträchtigt wird.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei den Zellen, deren Proliferation gehemmt wird, vor allem um Krebszellen von Mensch und Tier. Der Abbau von Glucose über die Glykolyse und die Bildung von Glyoxalverbindungen sind ubiquitäre Stoffwechselwege, die phylogenetisch stark konserviert sind (Heymans und Singh, 2003; Clugston et al, 1997). Zellen, die bei Verfügbarkeit von Glucose nur über die Glykolyse ihren Energieverbrauch decken, sind beispielsweise Hefezellen. Diese stellen andere energieliefernde Prozesse durch Glucose ab und verwenden die Glykolyse (Katabolitrepression). Es ist daher nicht verwunderlich, dass auch Hefezellen durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in ihrem Wachstum gehemmt werden können.

Die Toxizität von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und deren Derivaten ist zudem nur äußerst gering (Clary et al, 1998). Nach der Verseifung durch Esterasen werden sie im Stoffwechsel in ebenfalls nicht oder nur gering toxische Alkohole und auch im normalen Zellstoffwechsel gebildete Carbonsäuren (z.B. Pyruvat und Laktat) metabolisiert. Das erklärt auch die geringe oder fehlende Öcotoxizität dieser Verbindungen (Bowmer et al, 1998) in Tests mit Selenastrum capricornutum, Daphnia magna, Pimephales promelas und Brachydanio rerio. Ebenso fehlt diesen Verbindungen ein mutagenes Potential in normalen Zellen, wie in einem etablierten Testsystem nachgewiesen wurde (Andersen und Jensen, 1984).

Die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zur Hemmung der Glyoxalasen war bislang nicht bekannt.

In mehreren Patenten (US 5580902 A, US 4234599, US 4105783) wurden Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wie Ethylpyruvat als Mittel beschrieben, die Beschaffenheit der Haut zu verbessern und Falten zu glätten.

Ethylpyruvat ist zur Verbesserung kataraktischer Zustände eingesetzt worden (Devamanoharan et al, 1999). Hierbei wurde ein Absenken von Dulcitol und glykatierter Proteine durch Ethylpvruvat gefunden, die auf die Wirkung von Pyruvat zurückzuführen ist, welches durch Hydrolyse aus Ethylpyruvat entsteht. Der Vorteil der Verwendung von Ethylpyruvat ist in seiner leichteren Membrangängigkeit zu suchen.

Weiterhin wurde beschrieben, dass durch die Verwendung von von Ethylpyruvat entzündliche Zustände und Sepsis verbessert werden können. In der Patentanmeldung US 2004/0110833 A1 wird Ethylpyruvat eingesetzt, um Zytokin-vermittelte Erkrankungen zu beeinflussen. Dies ist auf die Aufhebung der Wirkung von NF&kgr;B zurückzuführen (Han et al, 2005; Yang et al, 2004; Fink et al, 2004; Miyaji et al, 2003; Ulloa et al, 2002). Allerdings liegen zu diesem Befund auch gegensätzliche Beobachtungen vor (Mulier et al, 2005). In keinem Fall kann dieser Mechanismus jedoch herangezogen werden, um die Hemmung des Wachstums von Zellen zu erklären, da auch Hefezellen in ihrem Wachstum durch Ethylpyruvat gehemmt werden, die weder über NF&kgr;B, noch über Zytokine noch über andere inflammatorische Proteine verfügen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Proteinaddukte von Methylglyoxal, die nach Hemmung der Glyoxalasen in ihrer Konzentration erhöht werden, die Ausschüttung von TNF-&agr; und die Aktivierung von NF-&kgr;B sogar erhöhen (Fan et al., 2003). Insbesondere kann dieser Mechanismus nicht zur Erklärung der proliferationshemmenden Wirkung von Ethylpyruvat herangezogen werden, da sich die Wirkung von Ethylpyruvat auf Zytokine auch nachweisen lasst, wenn die Zellen nicht proliferieren.

Die proliferationshemmende Wirkung von Ethylpyruvat, vermittelt über die Hemmung der Glyoxalasen, ist umso überraschender, da Ethylpyruvat aufgrund seiner beschriebenen Wirkung als „scavenger" (Fänger) von reaktiven Sauerstoffradikalen eher eine wachstumsfördernde Wirkung haben sollte (Varma et al, 1998). Dies ist tatsächlich auch für normale humane T-Lymhozyten beschrieben worden (Dong et al, 2005). In dieser Arbeit wurde außerdem beschrieben, dass die Bildung des Zytokins Interleukin-2 in diesen Zellen gesteigert wurde. Dies ist ein wichtiger Hinweis darauf, dass Nicht-Tumorzellen durch Ethylpyruvat nicht nur nicht geschädigt werden, sondern dass sogar ein positiver Effekt auf die Zell-vermittelte Immunabwehr ausgeübt wird. Dies hat einen synergistischen Einfluss bei einer Krebstherapie im Sinne der vorliegenden Erfindung. Krebszellen werden durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) geschädigt und in ihrem Wachstum gehemmt, gleichzeitig erfolgt eine Stärkung des Immunsystems, insbesondere der zellulären Abwehr durch die Wirkung auf Zytokine, die Steigerung der Proliferation von T-Lymphozyten und durch die Entfernung von Sauerstoffradikalen.

Auch aus der bekannten Wirkung von Methylpyruvat war die Beeinflussung der Glyoxalasen nicht vorhersagbar. Methylpyruvat ist seit Jahren als insulinotrope Verbindung intensiv untersucht worden (Dufer et al, 2002; Valverde et al, 2001; Lembert et al, 2001). Diese Wirkung wird über die Beinflussung von Kaliumkanälen und mitochondriale Effekte vermittelt.

Ein weiteres Beispiel für den überraschenden Befund, dass Verbindungen der allgemeinen Formel (I) die Proliferation von Krebszellen hemmen, wird aus den Angaben in der Patentanmeldung JP 8208422 A deutlich. Normale humane Zellen, zum Beispiel Keratinozyten, werden nach JP 8208422 A durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in ihrer Proliferation sogar angeregt, was zur Verbesserung des Erscheinungsbildes der Haut Anwendung findet.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden bevorzugt als Nahrungsmittelzusatz eingesetzt.

Beispiele von Tumoren, die durch die Erfindung behandelt werden können, sind Karzinome (Brust, Lunge, Blase, Schilddrüse; Prostata, Darm, Rektum, Pankreas, Magen, Leber, Uterus, Eierstock), Lymphome (Non-Hodgkin-Lymphom, Hodgkin-Lymphom, Myelom), Leukämie (akute und chronische lymphoblatische Leukämie, akute und chronische myeloblastische Leukämie), Hirntumore (Astrozytom, Gliom, Medulloblastom, Glioblastom, Oligodendrogliom, Neuroblastom), Sarkome (Fibrosarkom, Liposarkom, Angiosarkom, Mesotheliom, Chrondrosarkom, Osteosarkom) und Melanom.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können nach allgemein bekannten Methoden verabreicht werden – einschließlich, aber nicht begrenzt auf oral, intravenös, subcutan, intramuskulär, intradermal, intraperitoneal, rektal, intranasal, epidural, percutan, transdermal, als Aerosol, über Minipumpen, als Mundspülung, als Gel, als Pflaster, mittels Microbubbles und/oder mittels pulmonärer Applikation (z.B. durch Inhalation) sowie intratumoral vorzugsweise unter Sichtung der Applikation durch stereotaktische Verfahren oder Ultraschall.

Ester sind naturgemäß nur begrenzt stabil, dadurch besteht die Notwendigkeit, bei einer systemischen Applikation höhere Dosen der Verbindungen zu verwenden. Letzteres lässt sich umgehen, indem eine lokale Applikation erfolgt.

Um einen therapeutischen Effekt zu erreichen, werden die erfindungsgemäßen Verbindungen im allgemeinen für mehrere Tage oder Wochen in der jeweiligen therapeutisch effektiven Dosis appliziert. Die Applikation erfolgt dabei beispielsweise systemisch, z.B. durch wiederholte orale oder parenterale Applikation, oder auch lokal, z.B. während stereotaktischer Operationen, bei denen das Medikament an den gewünschten Ort gebracht wird, durch lokal gesetzte Sonden in Verbindung mit Pumpen oder bei oberflächlich liegenden Tumoren durch Cremes oder durch Verfahren, bei denen das Medikament in einem inerten Vehikel systemisch in den Körper gebracht wird und erst am gewünschten Ort durch entsprechende Manipulationen freigesetzt wird. Ein solches Beispiel stellen u.a. Gasbläschen (sog. Microbubbles dar, wie sie in Bekeredjian et al (2005) und Bekeredjian et al (2003) beschrieben werden.

Für eine systemische Verabreichung kann die therapeutisch effektive Dosis aus in vitro Exprimenten bestimmt werden. Zum Beispiele kann in Tiermodellen eine Dosis formuliert werden, die der IC50 in Zellkulturexperimenten entspricht. Nach bekannter Art kann aus Tierexperimenten so die optimale Dosis für den Menschen abgeleitet werden. Die Menge des zu verabreichenden Mittels ist natürlicherweise von der zu behandelnden Person, seinem Körpergewicht, seiner genetischen und körperlichen Konstitution, dem Stadium der Erkrankung, der Applikationsroute und anderen individualspezifischen Parametern abhängig. Dosierungsmenge und Verabreichungsintervall sollten sich nach den individuellen Plasmakonzentrationen des Mittels richten, die einen therapeutischen Effekt gewährleisten.

Die Therapie wird zweckmäßigerweise in Verbindung mit Positronen-Emissions-Tomographie (PET) unter Verwendung von z.B. 2-[18F]Fluor-2-Desoxyglucose oder ähnlichen den Glucoseeinstrom verfolgenden diagnostischen Verfahren durchgeführt. Mit Hilfe dieses therapeutischen Verfahrens lassen sich Tumoren mit hoher Glykolyserate anzeigen (Gatenby und Gillies., 2004), nur begrenzt durch die Auflösung der PET. Jeder Tumor, der mittels PET identifizierbar und lokalisierbar ist, ist daher durch das erfindungsgemäße Verfahren therapierbar.

Die aufgeführten Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können auch in Kombination mit mindestens einem pharmazeutischen Wirkstoff eingesetzt werden, z.B. eine Kombination von Ethylpyruvat mit bekannten Chemotherapeutika im Rahmen einer Standard-Chemotherapie, die allgemein für zum Beispiel Karzinome und Sarkome existieren. Einige repräsentative Beispiele sind für Brustkrebs und Leukämie die Verwendung von Cyclophosphamid und Doxorubicin, für Eierstockkrebs Taxolund, für Sarkome 5-Fluorouracil oder Cisplatin.

Eine bevorzugte Kombination besteht aus Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und einem Glykolysehemmstoff, wobei der Glykolysehemmstoff unterhalb der Triosephosphatisomerase-Reaktion in die Glykolyse eingreift. Der Sinn einer solchen Kombination besteht darin, die Konzentration der Triosephosphate, aus denen Methylglyoxal parametabolisch oder parakatalytisch entsteht, zu erhöhen und damit die Effektivität der Therapie zu verbessern.

Besonders bevorzugt ist dabei die Kombination von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), insbesondere Ethylpyruvat, und dem Laktatdehydrogenaseinhibitor Oxamat. Ebenfalls besonders bevorzugt ist die Kombination aus Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mit dem Glycerinaldehyd-phosphat-dehydrogenase-Hemmer Jodacetat.

Glyoxalase I ist bei vielen Tumoren hochreguliert. Allgemein wird angenommen, dass ansteigende Konzentrationen der Glyoxalase I mit dem malignen Phänotyp von Tumoren korrelieren. Die erhöhte Konzentration von Glyoxalase I in Tumorgewebe im Vergleich zu Normalgewebe soll die Resistenz von Tumorzellen gegenüber Chemotherapeutika wie Mitomycin C und anderen Anti-Krebsmittels erhöhen (Ranganathan et al, 1995; Ayoub et al, 1993). Eine Hemmung der Glyoxalase I-Reaktion durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und insbesondere durch Ethylpyruvate und verwandte Substanzen ist daher in Kombination mit einer Chemotherapie bei der Krebsbehandlung von Vorteil.

Die beschriebene Wirkung des Ethylpyruvat als „scavenger" (Fänger) von reaktiven Sauerstoffradikalen stellt zudem eine wünschenswerte Nebenwirkung für Zellen, die nicht über eine hohe Glykolyserate verfügen (Nichtkrebszellen), dar, da solche Zellen zusätzlich geschützt werden. Bei einer Kombinationstherapie mit einem Chemotherapeutikum ist dies ein zusätzlicher Vorteil, da dann auch normale Zellen einem Stress unterworfen sind, der durch Verbindungen der allgemeinen Formel (I) abgeschwächt wird.

Wichtig in diesem Zusammenhang ist, dass die Wirkung von Resistenzen gegenüber Chemotheraputika durch Hemmstoffe von Glyoxalase I aufgehoben werden kann (Kamiya 2005). Damit kann eine ursprünglich erfolgreiche Therapie, die nach aufgetretener Tumorresistenz eigentlich abgesetzt werden muss, bei gleichzeitiger Gabe von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weitergeführt oder neu angesetzt werden.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können auch zur Behandlung von Krebs in Kombination mit einem das Tumorwachstum stimulierenden Agens verwendet werden. Eine solche Provokation einer schnelleren Tumorzellproliferation erhöht die Glykolyserate des Tumors und damit seine Anfälligkeit gegenüber Verbindungen der allgemeinen Formel (I). Solche stimulierenden Agenzien sind beispielsweise Wachstumsfaktoren (EGF, PDGF, FGF, TGF, IGF, IL, CSF, EPO, NGF, INF, HGF, VEGF, HGF, BMP, Leptin) und Hormone (Insulin, Östrogene, Androgene, Schilddrüsenhormone, Nebennierenrindenhormone, Hypothalamische Hormone, Hypophysenhormone), Nicotin und andere. Die Zusammensetzung lässt sich vorteilhaft in Kombination mit den jeweils von den verschiedenen Tumoren benötigten Stimulanzien (Wachstumsfaktoren, Hormone, etc.) anwenden. Damit ist eine Therapie mit Verbindungen der allgemeinen Formel (I) individualisierbar auf die jeweiligen Tumorcharakteristika eines betroffenen Patienten.

Wenn ein Tumor operativ entfernt wurde, können beispielsweise aus dem explantierten Tumorgewebe Krebszellen in Kultur genommen werden und daraufhin geprüft werden, welche Agenzien (Hormone, Zytokine wie TGF&bgr;, Medikamente und andere Chemikalien) die Krebszellen stimulieren können. Das kann z.B. auch in Kombination mit molekulargenetischen Verfahren, bei denen die Expression von Rezeptoren bestimmt wird, erfolgen. Die so identifizierten Proliferationsfaktoren werden dann zur Therapie gemeinsam mit Verbindungen der allgemeinen Formel (I), z.B. Ethylpyruvat, eingesetzt.

Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in Kombination mit bekannten oder neuen genetischen Verfahren wie siRNA und Antisensenukleotiden zur gezielten Hemmung von Enzymen oder Proteinen zur Erhöhung der Empfindlichkeit von Tumoren (Nesterova und Cho-Chung, 2004).

Anhand der folgenden Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert.

Die SI-Einheit "mol" wird hierbei durch "M" ausgedrückt. DEL steht für D-Ethyllaktat, LEL für L-Ethyllaktat.

Dabei zeigen

1: Effekt von Ethylpyruvat (EP) auf die Vitalität von primären humanen Fibroblasten

2: Hemmung der enzymatischen Reaktion der Glyoxalase I aus Hefe durch EP

3: Hemmung der enzymatischen Reaktion der Glyoxalase I aus menschlichen Erythrozyten durch EP

4: Hemmung der enzymatischen Reaktion der Glyoxalase II aus menschlichen Erythrozyten durch EP

5: Hemmung des Wachstums von Hefezellen durch EP

6: Hemmung des Wachstums von menschlichen Leukämiezellen durch EP

7: Hemmung des Wachstums von menschlichen Hirntumorzellen durch EP

Ausführungsbeispiel 1

Eine identische Zahl(104 Zellen pro Kavität) von primären humanen Hautfibroblasten wurden in 24-well Platten (Greiner, Nr. 662160) ausgesät und in DMEM (Gibco, Nr. 41966-092) in Anwesenheit von 10% Kälberserum (Biochrom, S0113/5), 2 mM L-Glutamin (Gibco, Nr.25030-024), Penicillin/Streptomycin (100 Einheiten Penicillin/ml; 100 &mgr;g Streptomycin/ml)(Gibco, Nr. 15140/122), 5mg% Ascorbinsäure (Serva, Nr. 14030.02) bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die Herstellung von primären humanen Fibroblasten erfolgte nach einer Vorschrift von Birkenmeier et al (1998). Nach Erreichen einer 50% Konfluenz wurde das Medium durch frisches serumfreies Medium ersetzt. Anschließend wurden folgende Zusätze zu den Zellen gegeben Ansatz 1 (Serumfreies Medium-Volumenäquivalent, Blank); Ansatz 2 (1 mM DEL oder 1 mM LEL oder 1 mM EP); Ansatz 3 (5 mM DEL oder 5 mM LEL oder 5 mM EP), Ansatz 4 (10 mM DEL oder 10 mM LEL oder 10 mM EP), Ansatz 5 (20 mM DEL oder 20 mM LEL oder 20 mM EP), Ansatz 6 (50 mM DEL oder 50 mM LEL oder 50 mM EP). Die Kultivierung wurde bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden fortgesetzt. Anschließend wurden die Überstände entfernt und 100 &mgr;l einer 50% Thymolblaulösung in die Kavitäten pipettiert. Nach dem Waschen mit Medium wurden die ungefärbten und gefärbten Zellen unter dem Lichtmikroskop mit Koordinatensystem ausgezählt. Blau-gefärbte Zelle wurden als avital, ungefärbte Zellen als vital angesprochen. Der prozentuale Anteil der ungefärbten Zellen an der Gesamtzellzahl entspricht der Vitalität der Zellen.

Das Experiment (1) zeigt, dass DEL, LEL und EP über den untersuchten Konzentrationsbereich nicht toxisch sind und die Vitalität von primären humanen Fibroblasten nicht signifikant beeinflussen. DEL und LEL stellen Vergleichsbeispiele dar.

Ausführungsbeispiel 2

Die Bestimmung der Glyoxalase I (E.C.4.4.1.5, Laktoyl-Glutathionlyase Sigma, G-4252) erfolgte nach einer Vorschrift von McLellan and Thornalley (1989). Das Prinzip beruht auf der Messung der initialen Geschwindigkeit der Bildung von S-D-Laktoylglutathion aus Methylglyoxal (Sigma, MO252, 40%) und reduziertem L-Glutathion (Aldrich, G4251, >99%). Die Bildung des Produktes wird unter Verwendung des Exktinktionskoeffizienten von &egr; = 2.86 mM–1 cm–1 bei 240 nm verfolgt. Die Bestimmung wurde in 50 mM Natriumphopshatpuffer pH 7.0 durchgeführt. Dazu wurden 2 mM Methylglyoxal und 2 mM reduziertes Glutathion zur Bildung des Hemithioazetals für 2 Minuten bei 30°C inkubiert.

Anschließend wurden zu dem Messansatz von 1 ml 20 &mgr;l einer 1:1000 Verdünnung der Glyoxalase I zum Starten der Reaktion hinzu pipettiert.

Die Glyoxalaseaktivität (IE) entspricht der Menge an Enzym, die 1 &mgr;mol des S-D-Laktoylglutathion/min bildet. Der Einfluß von Ethylpyruvat auf die Enzymaktivität wurde durch Zugabe von ansteigenden Konzentrationen von EP (Sigma; Nr. E4,780-8; Lot S18972-513) zum Messansatz untersucht.

Die Experimente (2) zeigen, dass EP die Reaktion der Glyoxalase I aus Hefe konzentrationsabhängig hemmt.

Ausführungsbeispiel 3

Die Bestimmung der Erythrozyten-Glyoxalase I (E.C.4.4.1.5) erfolgte nach einer Vorschrift von McLellan and Thornalley (1989). Das Prinzip beruht auf der Messung der initialen Geschwindigkeit der Bildung von S-D-Laktoylglutathion aus Methylglyoxal (Sigma, MO252, 40%) und reduziertem L-Glutathion (Aldrich, G4251, >99%). Die Bildung des Produktes wird unter Verwendung des Exktinktionskoeffizienten von &egr; = 2.86 mM–1 cm–1 bei 240 nm verfolgt. Die Bestimmung wurde in 50 mM Natrium-phopshatpuffer pH 7.0 durchgeführt. Dazu wurden 2 mM Methylglyoxal und 2 mM reduziertes Glutathion zur Bildung des Hemithioazetals für 2 Minuten bei 30°C inkubiert. Anschließend wurden zu dem Messansatz von 1 ml geeignete Mengen (5-100 &mgr;l) eines Erythrozytenlysates zum Starten der Reaktion hinzu pipettiert. Die Herstellung des Erythrozytenlysates folgte einer Vorschrift von Mannervik et al (1982).

Die Glyoxalaseaktivität (IE) entspricht der Menge an Enzym, die 1 &mgr;mol des S-D-Laktoylglutathion/min bildet. Der Einfluß des Ethylpyruvates auf die Enzymaktivität wurde durch Zugabe von ansteigenden Konzentrationen an EP (Sigma; Nr. E4,780-8; Lot S18972-513)(0-50 mM) zum Messansatz untersucht.

Das Experiment (3) zeigt, dass EP die Reaktion der Glyoxalase I aus menschlichen Erythrozyten konzentrationsabhängig hemmt.

Ausführungsbeispiel 4

Die Bestimmung der Erythrozyten-Glyoxalase II (E.C. 3.1.2.6., Hydroxyacylglutathionhydrolase) erfolgte nach einer Vorschrift von McLellan and Thornalley (1989). Das Prinzip beruht auf der Messung der initialen Hydrolye von S-D-Laktoylglutathion (L7140, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) in Anwesenheit von geringen Mengen eines Zellextraktes. Die Hydrolyse wird anhand der Abnahme der Extinktion bei 240nm (&egr; = –3.1 mM–1 cm–1) verfolgt. Die Glyoxalase II Aktivität (IE) entspricht der Menge an Enzym, die 1 &mgr;mol des S-D-Laktoylglutathion/min hydrolysiert. Die Bestimmung wurde in 100 mM Tris-HCl-Puffer pH 7.4 durchgeführt. Dazu wurden 0.4 mM S-D-Laktoylglutathion zu 1 ml Meßansatz gegeben und die Reaktion wurde durch Zugabe von geeigneten Mengen (5-100 &mgr;l) eines Erythrozytenhämolysates zum Starten der Reaktion hinzu pipettiert. Die Herstellung des Erythrozytenlysates folgte einer Vorschrift von Mannervik et al (1982).

Der Einfluß des Ethylpyruvat auf die Enzymaktivität wurde durch Zugabe von ansteigenden Konzentrationen an EP (Sigma; Nr. E4,780-8; Lot S18972-513) (0-20 mM) zum Messansatz untersucht.

Das Experiment (4) zeigt, dass EP die Reaktion der Glyoxalase II konzentrationsabhängig hemmt.

Ausführungsbeispiel 5

Eine Kolonie des Stammes HD65-5a (Saccharomyces cereviciae) wurde in 5 ml YPD-Medium [(2% Glucose (Fluka), 1% Yeast Extract (BD, Sparks), 2% Peptone (BD, Sparks)] in 20 ml Glasröhrchen angeimpft und über Nacht bei 30°C unter Drehen inkubiert. Bei einer O.D. von 12.9 (580 nm) wurde durch Verdünnen mit Nährmedium eine Anfangsdichte von O.D. 0.19 eingestellt. Der Ansatz wurde zu 10 ml aliquotiert (in 20 ml Glasröhrchen), mit ansteigenden Konzentrationen von Ethylpyruvat versetzt und bei 30°C unter kontinuierlichem Drehen (200 U/min) inkubiert. Nach festgelegten Zeiten wurden je 1 ml-Proben entnommen und die O.D. bei 600 nm vermessen.

Das Experiment (5) zeigt, dass EP das Wachstum der Hefezellen konzentrationsabhängig hemmt.

Ausführungsbeispiel 6

Humane akute monozytische Leukämiezellen (THP-1; DSMZ No ACC 16) wurden in RPMI-1640 Medium (Gibco Nr. 21875-034) in Anwesenheit von 10% Kälberserum (Biochrom, S0113/5), Penicillin/Streptomycin (100 Einheiten Penicillin/ml; 100 &mgr;g Streptomycin/ml) (Gibco, Nr. 15140/122), 20 mM Hepes (Gibco, Nr. 15630-056) 2mM L-Glutamin (Gibco; Nr. 25030-024) bei 37°C und 5% CO2 24 kultiviert. Je 10000 Zellen wurden in die Kavitäten von 96-Well Kulturplatten (Greiner; Nr. 655180) pipettiert und mit Ethylpyruvat bis zum Erreichen der angegebenen Konzentrationen gemischt. Anschließend wurden die Zellen 24 Stunden weiter kultiviert. Danach wurden zu jeder Kavität 20 &mgr;l WST-1 Reagenz (Roche Nr.1644807) zugegeben und nach 3 Stunden wurde die Absorption bei 450/620 nm gemessen. Die Färbung ist entsprechend den Angaben des Herstellers proportional der Zellzahl.

Bei allen mit einem Stern markierten Konzentrationen sind signifikante Zellzahlunterschiede im Vergleich zu unbehandelten Zellen zu beobachten (p<0.05).

Das Experiment (6) zeigt, dass die Proliferation von Leukämiezellen durch Ethylpyruvat gehemmt wird.

Ausführungsbeispiel 7

10000 humane Astrozytomzellen (1321N1; ECACC No: 86030102) wurden in DMEM Gibco, Nr. 41966-092) in Anwesenheit von 10% Kälberserum (Biochrom, S0113/5), 2 mM L-Glutamin (Gibco, Nr.25030-024), Penicillin/Streptomycin (100 Einheiten Penicillin/ml; 100 &mgr;g Streptomycin/ml)(Gibco, Nr. 15140/122) bei 37°C, 5% CO2 in 96-Well Platten (Greiner, Nr. 657160) kultiviert. Nach Zugabe von ansteigenden Konzentrationen an Ethylpyruvat wurden die Tumorzellen 24 Stunden weiter inkubiert. Danach wurden zu jeder Kavität 20 &mgr;l WST-1 Reagenz (Roche Nr.1644807) zugegeben und nach 3 Stunden wurde die Absorption bei 450/620 nm gemessen. Die Färbung ist proportional der Zellzahl.

Bei allen mit einem Stern markierten Konzentrationen sind signifikante Zellzahlunterschiede im Vergleich zu unbehandelten Zellen zu beobachten (p<0.05).

Das Experiment (7) zeigt, dass die Proliferation von humanen Hirntumorzellen signifikant durch EP gehemmt wird.

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Abkürzungsverzeichnis

  • BMP
    Bone Morphogenic Protein
    BP
    Butylpyruvat
    CSF
    Colony Stimulation Factor
    DMEM
    Dulbecco's modified Eagle Medium
    DMSO
    Dimethylsulfoxid
    DSMZ
    Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
    ECACC
    European Collection of Cell Cultures
    E.C.
    Enzyme commission
    EDTA
    Ethylendiamintetraacetat
    EGF
    Epidermal Growth Factor
    EP
    Ethylpyruvat
    EPO
    Erythropoietin
    FGF
    Fibroblast Growth Factor
    FKS
    Fetales Kälberserum
    HGF
    Hepatocyte Growth Factor
    IC-50
    Inhibitorkonzentration mit 50%igem maximalen Effekt
    IE
    Internationale Einheit
    IGF
    Insulin-like Growth Factor
    IL
    Interleukine
    MCT
    Monocarboxylattransporter
    NF&kgr;B
    Nuklear Faktor Kappa B
    NGF
    Nerve Growth Factor
    INF
    Interferon
    PBS
    Phosphat buffered salt
    PDGF
    Platelet-Derived Growth Factor
    PET
    Positronen-Emissions-Tomographie
    RPMI
    Rosswell Park Memorial Institute
    SF
    Serum-frei
    TGF&bgr;
    Transforming Growth Factor Beta
    YPD
    Yeast Peptone Dextrose Medium


Anspruch[de]
Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Tumoren,

wobei R1 einen verzweigten oder unverzweigten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Cycloalkyl-Rest bedeutet und

wobei R2 H- oder einen verzweigten oder unverzweigten Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyl-Rest bedeutet.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R1 ein bis acht C-Atome enthält und dass R2 H ist oder ein bis acht C-Atome enthält. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) Methylpyruvat oder Ethylpyruvat oder Butylpyruvat oder Isobutylpyruvat oder Ethyl-2-oxobutyrat sind. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zur Behandlung von Karzinomen der Brust, der Lunge, der Blase, der Schilddrüse, der Prostata, des Darms, des Rektums, des Pankreas, des Magens, der Leber, des Uterus oder der Eierstöcke, zur Behandlung von Lymphomen wie Non-Hodgkin-Lymphom, Hodgkin-Lymphom oder Myelom, zur Behandlung einer Leukämie wie akute und chronische lymphoblastische Leukämie oder akute und chronische myeloblastische Leukämie, zu Behandlung von Hirntumoren wie Astrozytom, Gliom, Medulloblastom, Glioblastom, Oligodendrogliom oder Neuroblastom, zur Behandlung von Sarkomen wie Fibrosarkom, Liposarkom, Angiosarkom, Mesotheliom, Chrondrosarkom oder Osteosarkom oder zur Behandlung von Melanomen eingesetzt werden. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen der allgemeinen Formel (I) als Nahrungsmittelzusatz eingesetzt werden. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oral, intravenös, subcutan, intramuskulär, intradermal, intraperitoneal, rektal, intranasal, epidural, percutan, transdermal, als Aerosol, über Minipumpen, als Mundspülung, als Gel, als Pflaster, mittels Microbubbles und/oder mittels pulmonärer Applikation und/oder intratumoral verabreicht werden. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kombination aus Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und mindestens einer weiteren pharmazeutisch wirksamen Verbindung eingesetzt wird. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als weitere pharmazeutisch wirksame Verbindung Chemotherapeutika, Glykolysehemmstoffe oder tumorstimulierende Agenzien eingesetzt werden. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Chemotherapeutika Cyclophosphamid, Doxorubicin, Taxol, 5-Fluoruracil oder Cisplatin eingesetzt werden. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Glykolysehemmstoffe Oxamat oder Jodacetat eingesetzt werden. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als tumorstimulierende Agenzien Wachstumsfaktoren wie EGF, PDGF, FGF, TGF, IGF, IL, CSF, EPO, NGF, INF, HGF, VEGF, HGF, BMP oder Leptin, Hormone wie Insulin, Östrogene, Androgene, Schilddrüsenhormone, Nebennierenrindenhormone, Hypothalamische Hormone oder Hypophysenhormone oder Nicotin eingesetzt werden.






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