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Dokumentenidentifikation DE69932728T2 06.09.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001107765
Titel 3-DEAZAADENOSIN ZUR VORBEUGUNG DER ATHEROSKLEROSE UND MIT TRANSPLANTAT ASSOZIIERTEN VASKULOPATHIE
Anmelder Kerckhoff-Klinik GmbH, 61231 Bad Nauheim, DE
Erfinder HABERBOSCH, Werner, D-35398 Giessen, DE
Vertreter Weickmann & Weickmann, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69932728
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 02.09.1999
EP-Aktenzeichen 999460991
WO-Anmeldetag 02.09.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/EP99/06462
WO-Veröffentlichungsnummer 2000013691
WO-Veröffentlichungsdatum 16.03.2000
EP-Offenlegungsdatum 20.06.2001
EP date of grant 09.08.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.09.2007
IPC-Hauptklasse A61K 31/70(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61P 9/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die Verwendung von 3-Deazaadenosin (c3Ado) zur Herstellung eines Medikaments gegen vaskuläre Erkrankungen oder Transplantatabstoßung, insbesondere Atherosklerose und Transplantatvaskulopathie.

Man nimmt an, dass die Adhäsion von Leukozyten an der Endothelzellschicht und ihre anschließende Migration in die Blutgefäßwand eine Schlüsselrolle während der Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen spielen. Monozyten/Makrophagen und Lymphozyten sind beispielsweise in sämtlichen Stadien der Entwicklung von atheriosklerotischer Plaque allgegenwärtig und propagieren den lokalen Entzündungsprozess. Außerdem reichern sich lipidbeladene Makrophagen in der Plaque an, was zu Instabilität und in Folge davon zu Bruch, Thrombose und akutem Gefäßverschluss führt (1-3).

Es ist weithin anerkannt, dass die Hemmung der Leukozytenadhäsion und Migration eine schützende Wirkung gegenüber der Entwicklung von Plaque besitzen kann (4-6). Zelluläre Adhäsion und Migration werden durch verschiedene Moleküle der Selektin-, Integrin- und Immunoglubolin-Superfamilie, wie beispielsweise die Adhäsionsmoleküle Vaskuläres Zelladhäsionsmolekül 1 (VCAM-1) und Interzelluläres Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1) vermittelt. Frühere Untersuchungen zeigten eine erhöhte Expression von VCAM-1 und ICAM-1 auf der Oberfläche von Endothelzellen und vaskulären Weichmuskelzellen menschlicher Plaque und in experimentellen Atherosklerosemodellen (7-13). Eine neuere Untersuchung an C57/BL6-Mäusen mit homozygoten Mutationen mit verschiedenen Adhäsionsmolekülen deutete darauf hin, dass endotheliale Adhäsionsmoleküle direkt an der Pathogenese von Atherosklerose beteiligt sind (14).

Die Adhäsion von Leukozyten an das vaskuläre Endothel ist auch ein früher Schritt der Transplantatabstoßung, der zu der Migration von inflammatorischen Zellen in darunter liegendes Gewebe führt. Endothelzellen tragen zu der Adhäsion bei, indem sie verschiedene induzierbare Zelloberflächenmoleküle exprimieren, die verschiedene inflammatorische Zellen binden. Zusammen mit MHC-Molekülen spielen die Adhäsionsmoleküle eine wichtige Rolle bei der T-Zell-Aktivierung. An der Adhäsion von inflammatorischen Zellen an aktivierte Endothelzellen sind wenigstens drei unterschiedliche Rezeptor/Ligand-Paare beteiligt: ICAM-1/LFA-1, VCAM-1/VLA-4 und E-Selektin/Sialyl-Lewis X und/oder verwandte Kohlenhydrate auf Leukozyten.

Gegenwärtige Modelle schlagen vor, dass Mitglieder der Selektin-Genfamilie (E-, P- und L-Selektin) die anfänglichen adhäsiven Wechselwirkungen einschließlich Leukozyten-Rolling vermitteln und dass für die anschließende feste Adhäsion und Diapedese eine aktivierungsabhängige Zusammenwirkung von Integrinen mit ihren Endothelliganden bzw. PECAM-1 erforderlich ist. Verschiedene frühere Untersuchungen zeigten, dass VCAM-1, ICAM-1, P-Selektin und LFA-1 auf Endothelzellen in Rattenherz-Allotransplantat-Atherosklerose stark exprimiert werden. Die Behandlung von Tieren mit Antikörpern gegen VCAM-1, VLA-4, ICAM-1 und LFA-1 induzierte Immunosuppression und hemmte Transplantatatherosklerose. Auch die Verabreichung von ICAM-1-Antisense-Oligonukleotiden führte zu einer Immunosuppression. Im Gegensatz dazu konnte in ICAM-defizienten Mäusen keine Verlängerung der Lebensdauer von Herzallotransplantaten nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass dieses Protein nicht allein für die Induktion von Abstoßung oder Transplantatvaskulopathie verantwortlich ist.

3-Deazaadenosin (c3Ado), ein strukturelles Analogon von Adenosin, ist ein antiinflammatorischer Wirkstoff, von dem gezeigt wurde, dass er Monozytenchemotaxis und Phagozytose hemmt (15-18). Außerdem liegen Daten vor, die zeigen, dass dieses Adenosin-Analogon die durch Tumornekrosefaktor &agr; induzierte Makrophagenadhäsion an Endothelzellen in vitro über eine selektive Hemmung der ICAM-1-Synthese verringert (19). Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind bislang noch nicht vollständig aufgeklärt worden. c3Ado hemmt die zelluläre Methylierung von Membranphospholipiden und unterdrückt die Adenosylhomocysteinhydrolase (20, 21). Es wurde jedoch vorgeschlagen, dass die biologischen Wirkungen von c3Ado von diesen Mechanismen abhängig sind (21-24).

EP 0 010 668 offenbart die Nützlichkeit von c3Ado zur Unterdrückung der Immunantwort und somit auch zur Vorbeugung der Abstoßung fremder Zellen wie beispielsweise Transplantaten einschließlich Organtransplantaten.

Aufgrund seiner anti-inflammatorischen Eigenschaften wurde c3Ado in einem klinischen Versuch an Patienten mit rheumatoider Arthritis getestet (19, 25) und dieser Wirkstoff wird an Menschen auf seine anti-virale (HIV) Aktivität in vitro untersucht werden (26). Der Wirkstoff ist nie in Tiermodellen zu vaskulären Erkrankungen getestet worden.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass c3Ado die Leukozytenadhäsion in vivo und die begleitende Bildung von atherosklerotischen Läsionen hemmt, indem die Expression von Endothelzelladhäsionsmolekülen wie beispielseweise VCAM-1 und ICAM-1 gehemmt wird, wie an weiblichen C57/BL6-Mäusen gezeigt wurde. Diese Tiere sind reproduzierbar anfällig für die Bildung von Fettläsionen, die den bei Menschen nachgewiesenen frühen atherosklerotischen Plaques stark ähneln (27-31).

Außerdem wurde gefunden, dass c3Ado die Transplantatabstoßung und Transplantatatherosklerose in transplantierten Herzen hemmt.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung 3-Deazaadenosin oder Analogen davon zur Herstellung eines Medikaments für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Transplantatvaskulopathie.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Stent, der mit 3-Deazaadenosin oder Analogen davon beschichtet ist.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können 3-Deazaadenosin und Analoge davon verwendet werden. Beispiele für solche Analoge sind Salze von 3-Deazaadenosin und Vorläufer von 3-Deazaadenosin, die im Körper unter physiologischen Bedingungen zu 3-Deazaadenosin abgebaut werden können, z.B. 3-Deazaadenosinphosphate. Weitere Beispiele für Analoge sind Deazanukleoside wie beispielsweise 3-Deazaadenosin-3'-monophosphorsäure, 3-Deazaadenosin-3'-5'-cyclophosphat und 3-Deazaadenosin-5'-diphosphorsäure und Salze bzw. Vorläufer davon.

3-Deazaadenosin und Analoge davon sind dazu in der Lage, das Auftreten von Atherosklerose zu verhindern oder zu verzögern. Sie verhindern das Auftreten der Bildung von Fettstreifen und allen anderen Stufen der Entwicklung von atherosklerotischer Plaque in der Intima von arteriellen Blutgefäßen, indem die Expression von Adhäsionsmolekülen in vaskulären Endothelzellen gehemmt wird. Dies führt zu einer Verringerung der Adhäsion und der begleitenden Infiltration von Monozyten in die Subendothelschicht. Daher ist die Hemmung der endothelialen Expression von VCAM-1 und ICAM-1 der Schlüsselmechanismus, durch welchen c3Ado Atherosklerose hemmt.

Über denselben Mechanismus hemmen c3Ado und Analoge die Transplantatatherosklerose in transplantierten Organen. Beispiele für transplantierte Organe sind Herzen, Nieren, Lebern, Lunge, etc. Die Verabreichung von 3-Deazaadenosin und Analogen davon führt zu einer verminderten Okklusion von Blutgefäßen, insbesondere von arteriellen Blutgefäßen in transplantierten Organen. Außerdem wird eine Verringerung der Abstoßung von transplantierten Organen, beispielsweise eine Verringerung der Abstoßung von transplantierten Herzen, erzielt.

Somit ist c3Ado zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Transplantatvaskulopathie geeignet.

Weitere bevorzugte Indikationen von 3-Deazaadenosin und Analogen davon sind die Vorbeugung der Abstoßung in der Xenotransplantation, die Vorbeugung der Restenose nach koronaren Eingriffen, insbesondere nach einer Stent-Implantation. Restenose in Stents (In-Stent-Restenose) kann vorgebeugt werden, indem der Stent, der verwendet werden soll, mit 3-Deazaadenosin beschichtet wird. Die Kombination einer kovalenten Bindung von 3-Deazaadenosin an Stents ist für die Vorbeugung von Restenose wirksam. Weitere bevorzugte Indikationen sind die Vorbeugung von Reperfusionsschäden, z.B. im Herz oder in der Lunge, Behandlung und Vorbeugung von infektiösen und inflammatorischen Koronarsyndromen, Vorbeugung und Behandlung von dilatativer Kardiomyopathie, Vorbeugung und Behandlung von viraler Myokarditis und Vorbeugung und Behandlung von Infektionen durch Parasiten wie beispielsweise Malaria tropica.

Eine weitere bevorzugte Indikation ist die Verwendung von 3-Deazaadenosin und Analogen davon zur Verringerung des Homocysteinwertes.

3-Deazaadenosin und Analoge davon können einzeln oder in Kombination mit anderen Medikamenten verwendet werden. Bei der Behandlung von vaskulären Erkrankungen ist z.B. eine Kombination mit Cholesterin-verringernden Mitteln denkbar. Für die Vorbeugung der Transplantatabstoßung können 3-Deazaadenosin und Analoge davon in Kombination mit immunosuppressiven Medikamenten, z.B. Cyclosporin, verwendet werden. 3-Deazaadenosin und Analoge davon können auch mit Azathioprin, Cortison, Rapamycin, Tacrolimus und anderen immunosuppressiven Wirkstoffen kombiniert werden.

Das Medikament kann auf beliebige Weise verabreicht werden, z.B. parenteral durch Injektion oder oral. Eine orale Verabreichung z.B. in Form von Tabletten, Kapseln, etc. ist bevorzugt.

Die verabreichte Dosis ist abhängig von der Art und Schwere der Erkrankung. Normalerweise liegt die Dosierung im Bereich von 0,1 bis 500 mg/kg Körpergewicht pro Tag, bevorzugt zwischen 1 und 200 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die Verabreichung kann über einen kurzen Zeitraum von 1 oder mehreren Tagen erfolgen. Eine Verabreichung erfolgt üblicherweise jedoch über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche. Die Dosis kann während des Verabreichungszeitraums, falls erforderlich, variiert werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren und Beispiele ausführlicher erläutert.

Figurenbeschreibung

1 Morphometrische Analyse von C57BL/J6-Aortasektionen. Balkengraphiken zeigen das durchschnittliche Verhältnis von Neointimafläche zu Mediafläche (NI/M) für Kontrollmäuse (n=9), Mäuse mit atherogener Diät (n=9) und Mäuse mit atherogener Diät und Behandlung mit 3-Deazaadenosin (c3Ado) (n=9). Der Durchschnittswert NI/M wurde aus 3 histologischen Sektionen pro Tier berechnet. Wie durch NI/M gemessen, war die Intima/Neointima-Dicke bei Mäusen, die mit c3Ado behandelt wurden, um 94% geringer im Vergleich zu Mäusen, die mit einer atherogenen Diät ohne c3Ado gefüttert wurden (p<0,001). Es gab keine Unterschiede bei NI/M zwischen Kontrollmäusen und Mäusen, die mit c3Ado behandelt wurden. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM.

2 Lichtmikroskopische Aufnahme des Querschnitts der Aortawand, entnommen von weiblichen C57BL/6J-Mäusen, die für 9 Wochen mit einer atherogenen Diät gefüttert wurden. Bemerke große lipidreiche Makrophagen-reiche Fettstreifen. Oil red O und Hemalaun; Originalvergrößerung × 100; Balken = 5 &mgr;m.

3(A-C) Entsprechende lichtmikroskopische Aufnahmen von Querschnitten der Aortawand (200 &mgr;m kranial zur Aortaklappe), entnommen von weiblichen C57BL/6J-Mäusen. (A) Gruppe 2, die für 9 Wochen mit der atherogenen Diät ernährt wurde, zeigte eine Proliferation der Aorta intima. Im Gegensatz dazu war bei Mäusen, die mit 3-Deazaadenosin behandelt wurden, keine Neointima vorhanden (B). (C) Kontrollen. Oil red O und Hemalaun. A-C: Originalvergrößerung × 40; Balken = 10 &mgr;m.

4(A-F) Querschnitte der aufsteigenden Aorta mit stark ICAM-1-positiven (A) und stark VCAM-1-positiven (B) Endothelzellen in Mäusen auf atherogener Diät. In Mäusen, die mit 3-Deazaadenosin behandelt wurden (C+D) sowie in Kontrollen (E+F), wurde in der Aorta keine endotheliale Expression von ICAM-1 und VCAM-1 nachgewiesen. Anfärben von ICAM-1 und VCAM-1 mit monoklonalen Ratte-Anti-Maus-Antikörpern unter Verwendung des APAAP-Verfahrens und Kontrastfärbung mit Hemalaun. A-F: Originalvergrößerung × 100; Balken = 5 &mgr;m.

5 Stark vergrößerte Ansicht der Aortawand mit einer atherosklerotischen Intimaläsion und CD11b-positiven Monozyten (Gruppe 2, atherogene Diät). CD11b-Färbung mit monoklonalen Ratte-Anti-Maus-Antikörpern unter Verwendung des APAAP-Verfahrens und Kontrastfärbung mit Hemalaun. Originalvergrößerung × 100; Balken = 5 &mgr;m.

Beispiel 1 Vorbeugung der Atherosklerose 1.1 Materialien und Methoden 1.1.1 Tiere, atherogene Diät und Konzeption des Experiments

Sechs bis acht Wochen alte weibliche C57BL/J6-Mäuse (Charles Rivers Wiga, Sulzfeld, Deutschland) mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g wurden zufällig in drei Gruppen eingeteilt:

  • Gruppe 1: Kontrolltiere (n=9), die bei einer normalen Mäuseernährung gehalten wurden (Altromin; Standardnahrung; Lage, Deutschland).
  • Gruppe 2: 9 Tiere, die eine atherogene Diät auf Basis von normalem Mäusefutter erhielten, das sich jedoch im Gesamtfettgehalt (10% gegenüber 5%), Proteingehalt (15,4% gegenüber 22%) und Cholesteringehalt (1% gegenüber 0%) unterschied. Die Gesamtenergie betrug 3790 gegenüber 3000 kcal/kg.
  • Gruppe 3: 9 Tiere, die eine atherogene Diät, wie oben beschrieben, und 3-Deazaadenosin (c3Ado) (Southern Research, Birmingham, AL, USA) erhielten, das mit einer Endkonzentration von 0,04 mg/g in das Futter eingemischt wurde, entsprechend einer täglichen oralen Dosis von 10 mg/kg c3Ado pro Tier.

Die durchschnittliche Nahrungsaufnahme jedes Tiers betrug 5,2 g pro Tag. Futter und Wasser wurden alle 2 Tage wieder aufgefüllt und die konsumierten Volumina wurden für jeden Käfig notiert. Die Mäuse wurden gemäß der Standardanforderungen der Tierpflege gehalten und sie wurden bei einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus mit autoklaviertem Wasser in einer Temperaturkontrollierten Umgebung gehalten. Alle Tiere blieben während des Versuchszeitraums gesund. Nach 9 Wochen wurden die Mäuse durch Inhalation von Trichlormethan getötet. Das Herz und die aufsteigende Aorta wurden entfernt und mit PBS DULBECCO'S (Life Technologies, Paisley, Schottland) gespült. Die untere Hälfte des Herzens wurde entlang einer Linie zwischen den Endstücken des Atriums transsektiert, um eine Grundlage für die junge aufsteigende Aorta zu erhalten. Diese Vorgehensweise ermöglichte eine genaue vertikale Einbettung der Aorta in Tissue-Tek (Miles, USA) für optimal ebene Querschnitte. Die Sektionen wurden in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –80 °C bis zur weiteren Untersuchung gelagert.

1.1.2 Quantifizierung von atherosklerotischen Läsionen und Neointima-Proliferation

Für die Bewertung der Bildung von Aortaläsionen wurde eine Modifikation des von Paigen et al. (29) beschriebenen Verfahrens verwendet. Die gefrorenen Gewebeblöcke wurden auf einem Cytochrom angeordnet und aufeinanderfolgende Sektionen von 8 &mgr;m der aufsteigenden Aorta wurden auf beschichteten Glasträgern gesammelt, bis wir den am weitesten kranial gelegenen Teil des Aortasinus durch Untersuchung von nicht gefärbten Sektionen lokalisieren konnten. Sobald diese Sektion (Nr. 1) identifiziert war, wurden die 35 kranialen Sektionen, welche 280 &mgr;m der aufsteigenden Aorta umfassen, für die weitere Bewertung auf separaten Trägern angeordnet. Jede fünfte Sektion der ersten 280 &mgr;m der aufsteigenden Aorta wurde mit Oil red O (Riedel de Haen, Deutschland) angefärbt und zur Kontrastfärbung wurden Hemalaun (Merck, Darmstadt, Deutschland) und elastic van Gieson (Chroma-Gesellschaft, Schmid GmbH, Köngen, Deutschland) verwendet. Blindwerte der Läsionsfläche und der Intima- und Mediafläche wurden unter Verwendung eines Video-Computer-unterstützten Mikroskopieplanimetriesystems (Zeiss, Oberkochen, Deutschland; Videokamera 3 CCD, Sony; 40x Linsenvergrößerung; IBAS-2 mit IBAS-Version 2.0 Standard, Kontron, München, Deutschland) bestimmt.

Die Anzahl der Läsionen wurde wie zuvor beschrieben gezählt, indem jede fünfte Sektion bewertet wurde. Bei dieser Vorgehensweise lagen zwischen jeder bewerteten Sektion 40 &mgr;m. Die Anzahl der Läsionen in jedem Querschnitt wurde ebenfalls gezählt. Die Größe der Läsionen wurde als Länge der Läsion entlang des luminalen Aortaperimeters bestimmt, die zu dem gesamten luminalen Aortaperimeter in der Sektion in Relation gesetzt wurde.

Das Ausmaß der Proliferation der Neointima wurde quantitativ bestimmt, indem die Fläche (&mgr;m2) der Neointima und der Media in jeder aufsteigenden Aorta von 3 Sektionen (Nr. 10, 20 und 30) gemessen wurde. In jeder Sektion wurden 4 Sektoren (bei 0°, 90°, 180° und 270°) der Gefäßwand in einem definierten Fenster von 63 &mgr;m × 63 &mgr;m analysiert, um die durch die Endothelschicht und innere elastische Lamina und externe elastische Lamina eingeschlossene Neointimafläche zu messen. Das Verhältnis von Neointima- zu Mediafläche (NI/M) und wurde für jedes Tier gemittelt.

1.1.3 Immunohistochemische Analyse

Serielle Cryostatsektionen (8 &mgr;m) der folgenden 3 Teile der aufsteigenden Aorta wurden ausgewählt: 8-32 &mgr;m, 120-144 &mgr;m und 240-264 &mgr;m distal zu dem Aortasinus. Die gefrorenen Sektionen wurden in eiskaltem Aceton fixiert und für 10 min getrocknet. Die Sektionen wurden dann für 10 min in Mäuseserum (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) mit einer Verdünnung von 1:1000 inkubiert. Nach Spülen mit RPMI 1640 (Life Technologies, Paisley, Schottland) wurden die Sektionen für 40 min bei Raumtemperatur mit einem monoklonalen Ratte-Anti-Maus-Antikörper gegen ICAM-1 (CF54) oder VCAM-1 (CD106, Dianova GmbH, Hamburg, Deutschland) bei einer Verdünnung von 1:100 inkubiert. Die Detektion von Monozyten/Makrophagen wurde unter Verwendung von monoklonalem Ratte-Anti-Maus-Antikörper CD11b (MAC-1) (Serotec Ltd., Oxford, England) durchgeführt.

Nach zusätzlichen Waschschritten mit TRIS-Puffer (USB, Cleveland, OH, USA) und Inkubation mit einem sekundären Antikörper (AffiniPureMouse Anti-Ratte-IgG, Dianova, Deutschland) (1:400) für 10 min und anschließender Inkubation mit einem verbindenden Antikörper (Doppelsystem Brückenantikörper; Dianova, Hamburg, Deutschland) (1:600) für 10 min wurden die Sektionen mit einem Alkaliphosphatase-Antialkaliphosphatase-Komplex (APAPP) (1:50; Dianova, Hamburg, Deutschland) für 30 min inkubiert. Die Entwicklung der Sektionen wurde in Neufuchsin-Entwicklerlösung durchgeführt. Schließlich erfolgte eine Kontrastfärbung mit Hemalaun (Merck, Darmstadt, Deutschland) für 10 sek. Kontrollsektionen wurden nur mit verbindendem sekundärem Antikörper und APAAP-Komplex behandelt.

1.1.4 Quantitative Bestimmung der immunohistochemischen Färbung

Die Intensität der Färbung mit ICAM-1 und VCAM-1 wurde von 1 bis 4 wie folgt bewertet: Note 1 = keine Färbung, Note 2 = schwache Färbung, Note 3 = moderate Färbung und Note 4 = starke Färbung der vaskulären Zellen. In jeder Sektion wurde die Anzahl der CD11b-positiven Zellen gezählt und die Lokalisierung der Zellen wurde klassifiziert als an der Wand anhaftend oder als in der Intima oder in der Media lokalisiert.

1.1.5 Bestimmung der Plasmacholesterin-Gesamtwerte

Von allen Mäusen wurde über die Schwanzvene Blut gesammelt, vor Beginn des Experiments nachdem sie über Nacht nüchtern waren, nach 35 Tagen Fütterung mit den unterschiedlichen Diäten und zum Todeszeitpunkt. Die Plasmacholesterin-Gesamtwerte wurden unter Verwendung des CHOD-PAP-Verfahrens (Boehringer Mannheim, Deutschland) wie zuvor beschrieben (32) bestimmt.

1.1.6 Statistische Analyse

Die Ergebnisse wurden durch Zweiwege-Analyse der Varianz mit wiederholten Messungen und durch Einweg-Analyse der Varianz mit paarweisen Kontrasttests nach Scheffé analysiert. Unterschiede in der Expression von ICAM-1, VCAM-1 und CD11b-positiven Monozyten wurden mit der nicht parametrischen Kruskal-Wallis-Einweg-Anova analysiert. Die Werte der Neotintimafläche und das NI/M-Verhältnis wurden für alle Gruppen gemittelt und die Unterschiede wurden ebenfalls mit der Kruskal-Wallis-Einweg-Anova analysiert. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ±SEM. Alle Tests wurden mit SPSS für Windows Version 6.1.3 durchgeführt.

1.2 Ergebnisse 1.2.1 Cholesterinwerte und Manifestation der Atherosklerose

Die mittleren Cholesterinkonzentrationen in der Untersuchungsgruppe am Tag 35 waren: Gruppe 1 (Kontrolle) 92 ± 3 mg/dl, Gruppe 2 (atherogene Diät) 445 ± 10 mg/dl und Gruppe 3 (atherogene Diät und c3Ado) 410 ± 19 mg/dl. Tabelle 1 fasst die Merkmale der verschiedenen Gruppen zusammen. Bemerke den weiteren Anstieg von Tag 35 bis Tag 65 während der c3Ado-Behandlung (Gruppe 3), der statistisch signifikant war (p<0,026) und auf eine Wechselwirkung von 3-Deazaadenosin mit dem Lipoprotein-Metabolismus zurückzuführen sein kann.

Um die Aorta auf die Bildung von Fettstreifen hin zu untersuchen, wurden pro Tier 7 gefrorene Sektionen der aufsteigenden Aorta quantifiziert. Kontrollmäuse zeigten keinerlei atherosklerotische Veränderungen, wohingegen Tiere der Untersuchungsgruppe 2 mehrere lipidhaltige Läsionen zeigten, welche die Gefäßwand der aufsteigenden Aorta bedeckten, wie durch Anfärbung mit Oil red O (2) gezeigt wurde. Die durchschnittliche Anzahl der Läsionen pro Tier betrug in dieser Gruppe 5,4 ± 1,6 (Bereich 0-14) und der Prozentsatz der bedeckten Aortaauskleidung betrug 3,4 ± 2,8% (siehe Tabelle 3). Im Gegensatz dazu wiesen Tiere der Gruppe 3, welche c3Ado zusätzlich zu der atherogenen Diät erhielten, keine nachweisbaren Läsionen in den untersuchten Sektionen auf.

Die Mäuse in Gruppe 2 zeigten eine merklich erhöhte Proliferation der Neointima im Vergleich zu Tieren der Gruppe 1 oder Gruppe 3 (3). Eine planimetrische Analyse der Intimafläche der proximalen aufsteigenden Aorta zeigte eine starke Zunahme der Neointima (450 ± 775 &mgr;m2) im Vergleich zu Kontrollmäusen (160 ± 38 &mgr;m2; p<0,001). Die Behandlung mit c3Ado führte bei Mäusen, die mit der atherogenen Diät ernährt wurden, zu einer Hemmung der Proliferation der Neointima (125 ± 32 &mgr;m2; p<0,001). Die Dicke der Neointima, wie durch das NI/M-Verhältnis gemessen, war in Mäusen, die mit c3Ado behandelt wurden, um 94% geringer im Vergleich zu Mäusen mit der atherogenen Diät allein (0,002 ± 0,0004 gegenüber 0,033 ± 0,005; p<0,001). Kontrollmäuse zeigten dasselbe NI/M-Verhältnis im Vergleich zu der Behandlungsgruppe. In Tabelle 3 und 1 sind diese Ergebnisse zusammengefasst.

1.2.2 Monozyten und Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1

Tiere, die mit der atherogenen Diät gefüttert wurden, zeigten CD11b-positive monozytische Zellen, welche an dem Endothel anhafteten und in der Intima der Aorta lokalisiert waren. Die meisten dieser Zellen standen im Zusammenhang mit atherosklerotischen Läsionen (5). Im Gegenstz dazu wurden in Tieren der Gruppe 3, die c3Ado erhalten hatten, keine monozytischen Zellen in der Intima nachgewiesen, und nur wenige anhaftende CD11b-positive Zellen auf der luminalen Oberfläche detektiert. In Sektionen von Kontrolltieren auf Standarddiät waren keine Monozyten vorhanden.

Wir untersuchten außerdem die Regulierung der Adhäsionsmoleküle VCAM-1 und ICAM-1, von denen jeweils vermutet wurde, dass sie direkt an der Bildung von atherosklerotischen Läsionen beteiligt sind. Die immunohistologische Anfärbung zeigte eine starke endotheliale Expression von VCAM-1 und ICAM-1 in allen analysierten gefrorenen Sektionen der aufsteigenden Aorta von Mäusen auf einer atherogenen Diät. Beide Adhäsionsmoleküle wurden in Läsionen stark exprimiert, mit Ausdehnung auf nicht beteiligte Bereiche. In bemerkenswertem Gegensatz dazu lag bei Mäusen, die mit c3Ado behandelt wurden, überhaupt keine Expression von VCAM-1 und ICAM-1 vor, wie sie bei Kontrolltieren gefunden wurde (4). c3Ado hemmte die endotheliale Expression beider Adhäsionsmoleküle vollständig. Für eine quantitative Auswertung der Bilder wird auf Tabelle 2 verwiesen.

Tabellen Tabelle 1. Entwicklung des Körpergewichts und Cholesteringesamtwerte

Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. Die Unterschiede zwischen den Kontrollen und den Gruppen 2 und 3 waren statistisch signifikant.

*p < 0,001, analysiert durch Zweiwege-Analyse der Varianz mit wiederholten Messungen und durch Einweganalyse der Varianz mit paarweisem Kontrasttest nach Scheffé. NS bedeutet nicht signfikant.

Tabelle 2. Endotheliale Expression von VCAM-1, ICAM-1 und quantitative Bestimmung der Endothel- und Intima-Monozyten.

Die Unterschiede zwischen Gruppe 2 und Gruppe 3 waren statistisch signifikant.* p < 0,001 und ✝ p = 0,004, analysiert durch Mittelwertsummen, die mit dem Kruskal-Wallis-Test erhalten wurden.

⧧ Mittelwert ± SEM pro bewertete Sektion von 3 definierten Sektionen pro Tier.

Tabelle 3. Quantitative Bestimmung der Neointima- und Media-Flächen und Häufigkeit der Fettstreifenläsionen

Die Unterschiede waren statistisch relevant. * p < 0,001, analysiert durch Mittelwertesummen, die mit dem Kruskal-Wallis-Test erhalten wurden.

✝Mittelwert ± SEM, ermittelt aus 3 Sektionen pro Tier.

⧧Mittelwert ± SEM, berechnet aus 7 Sektionen pro Tier.

Beispiel 2 Blockierung der Herzallotransplantatabstoßung und der Herzallotransplantatatherosklerose Materialien und Methoden 2.1.1. Tiere und Konzeption des Experiments

3-Deazaadenosin wurde oral verabreicht, indem es in das reguläre Futter mit einer Endkonzentration von 0,04 mg/g eingemischt wurde, entsprechend einer täglichen oralen Dosis von 10 mg/kg c3Ado pro Tier, zusätzlich oder in Abwesenheit von Cyclosporin (0,2 mg/kg Körpergewicht), bei Lewis-Ratten, die heterotopisch transplantierte Herzen von Fisher-Ratten erhielten. Als dritte Kontrollgruppe wurde den anderen Allotransplantatempfängern nur Cyclosporin täglich verabreicht. Alle Tiere erhielten über den gesamten Untersuchungszeitraum eine Standardiät. Die Allotransplantate wurden an Tag 120 geerntet, der Transplantatherzschlag wurde durch tägliches Abtasten beurteilt und der vollständige Stillstand des Transplantatschlags wurde als Abstoßung interpretiert. Alle Ratten nahmen die Herzallotransplantate ohne jegliche weitere Behandlung für die Dauer der Beobachtung an.

2.1.2 Immunohistochemische Analyse

Für die immunohistochemische Analyse von VCAM-1 und ICAM-1 wurden 2 vollständige transverse Sektionen des transplantierten Herzens mit einer Dicke von etwa 3 mm erhalten und in OCT (Optimum Cutting Temperature)-Verbindung gehalten. Serielle Sektionen wurden geschnitten und für 10 min in kaltes Aceton eingetaucht. Die Anfärbevorgänge wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt. Die Expression der Adhäsionsmoleküle wurde auf Grundlage der Endothelzellen und der Weichmuskelzellen der epikardialen Arterien und der intramyokardialen Ateriolen beurteilt. Die Analyse wurde halbquantitativ durchgeführt, indem die Intensität der Anfärbung bewertet und die Anzahl der angefärbten Zellen gezählt wurde.

2.1.3 Definition von Transplantatvaskulopathie

Die Definition von Transplantatvaskulopathie wurde wie folgt durchgeführt: Blutgefäße, die eine gut definierte Weichmuskelzellschicht und innere elastische Lamina in der Gefäßwand aufwiesen, wurden als auffindbare Arterien identifiziert. Jeder vollständige Querschnitt der auffindbaren Arterien wurde berechnet. Die Sektionen wurden von zwei unabhängigen Bewertern, denen der Status der Träger verdeckt wurde, untersucht und histologische Veränderungen wurden halbquantitativ beurteilt. Die Veränderungen der Verdickung der Intima wurden als gering (Note 1, < 25% Okklusion des Lumens) bewertet, wenn die Intima leicht erkennbar war, oder als moderat (Note 2, 25-50% Okklusion) bis schwer (Note 3, > 50% Okklusion) bewertet.

2.2 Ergebnisse 2.2.1 Überleben des Transplantats und Komplikationen

Die Isotransplantate und Allotransplantate in Ratten, welche 3-Deazaadenosin oder Cyclosporin oder beide Wirkstoffe zusammen erhielten, schlugen während der Dauer der Beobachtung weiter. Die Stärke des Allotransplantatschlags war vergleichbar mit derjenigen der Isotransplantate. Es traten keine Komplikationen als Ergebnis der 3-Deaza-Therapie auf. In Mäusen, welche 3-Deaza erhielten, fand bei den Transplanten keinerlei Abstoßung statt, wohingegen bei Tieren, welche nur Cyclosporin erhielten, eine schwache Abstoßung erkennbar war.

Daher verminderte 3-Deazaadenosin die Abstoßung von transplantierten Herzen signifikant mit der gleichen (oder besseren) Effizienz wie der bekannte immunosuppressive Wirkstoff Cyclosporin.

2.2.2 Transplantatatherosklerose

Native Herzen und Isotransplantate zeigten keine Verdickung der Intima der Koronararterien. In der Gruppe der Ratten, die Cyclosporin erhielten, zeigten die intramyokardialen und epikardialen Arterien eine signifikante Verdickung der Intima und ein Drittel der Gefäße war nach 120 Tagen nahezu verschlossen. In der Gruppe der Ratten, die 3-Deazaadenosin erhielten, lag fast keine arterielle Verdickung der Intima vor. Daher hemmte 3-Deazaadenosin Transplantatatherosklerose in den transplantierten Herzen signifikant.

2.2.3 Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1

Isotransplantate und native Herzen zeigten beide gleichmäßig keine ICAM-1- und VCAM-1-Expression. Im Gegensatz dazu waren diese Moleküle in der Neointima von transplantierten Herzen, die Cyclosporin allein erhielten, stark hochreguliert. Umgekehrt gab es fast keine Expression von ICAM-1 und VCAM-1 in Ratten, die 3-Deazaadenosin erhielten.

Daher blockiert 3-Deazaadenosin die Expression von ICAM-1 und VCAM-1 in der Intima von Koronararterien von transplantierten Herzen.

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Anspruch[de]
Verwendung von 3-Deazaadenosin und Salzen davon oder von Vorläuferverbindungen von 3-Deazaadenosin, die im Körper unter physiologischen Bedingungen zu 3-Deazaadenosin abgebaut werden können, zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Transplantatvaskulopathie, wobei die Vorläuferverbindung ausgewählt ist aus 3-Deazaadenosinphosphaten, 3-Deazaadenosin-3'-monophosphorsäure, 3-Deazaadenosin-3',5'-cyclophosphat und/oder 3-Deazaadenosin-5'-diphosphorsäure. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Transplantatvaskulopathie mit der Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1 in Endothelialzellen assoziiert ist. Verwendung nach Anspruch 1 bis 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Transplantatatherosklerose in transplantierten Organen. Verwendung nach Anspruch 3 zur Herstellung eines Medikaments gegen Atherosklerose in transplantierten Herzen. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche zur Verringerung der Abstoßung von transplantierten Organen. Verwendung nach Anspruch 5 zur Verringerung der Abstoßung von transplantierten Herzen. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung von In-Stent-Restenose. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche zur Herstellung eines Medikaments zur Senkung des Homocysteinspiegels. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche in Kombination mit einem immunosuppressiven Medikament. Verwendung nach Anspruch 9 im Kombination mit Cyclosporin. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche in Kombination mit einem cholesterinsenkenden Mittel. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, worin das Medikament oral verabreicht wird. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, worin die tägliche Dosis in einem Bereich zwischen 0,1 bis 500 mg/kg Körpergewicht liegt. Stent, der mit 3-Deazaadenosin oder einem Salz davon oder einer Vorläuferverbindung von 3-Deazaadenosin, die im Körper unter physiologischen Bedingungen zu 3-Deazaadenosin abgebaut werden kann, beschichtet ist, wobei die Vorläuferverbindung ausgewählt ist aus 3-Deazaadenosinphosphaten, 3-Deazaadenosin-3'-monophosphorsäure, 3-Deazaadenosin-3',5'-cyclophosphat und/oder 3-Deazaadenosin-5'-diphosphorsäure. Stent nach Anspruch 14, der kovalent beschichtet ist. Stent nach Anspruch 14 zur Verwendung bei der Vorbeugung von Restenose, bei der Vorbeugung von Reperfusionsschaden, bei der Behandlung und Vorbeugung von infektiösen und inflammatorischen Koronarsyndromen, bei der Vorbeugung und Behandlung von dilatativer Kardiomyopathie, bei der Vorbeugung und Behandlung von viraler Myokarditis und bei der Vorbeugung und Behandlung von Infektionen durch Parasiten. Stent nach Anspruch 16 zur Verwendung bei der Vorbeugung von Restenose nach Koronareingriffen.






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