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Dokumentenidentifikation DE102006010786A1 13.09.2007
Titel Mikroorganismus und Verfahren zur Herstellung von 2-Methylzitronensäure
Anmelder Westfälische Wilhelms-Universität Münster, 48149 Münster, DE
Erfinder Ewering, Christian, 48565 Steinfurt, DE;
Brämer, Christian Oliver, Dr., 67574 Osthofen, DE;
Steinbüchel, Alexander, Prof. Dr., 48341 Altenberge, DE
Vertreter Viering, Jentschura & Partner, 81675 München
DE-Anmeldedatum 08.03.2006
DE-Aktenzeichen 102006010786
Offenlegungstag 13.09.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.09.2007
IPC-Hauptklasse C12N 1/21(2006.01)A, F, I, 20060308, B, H, DE
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft rekombinante Mikroorganismen, die für die Herstellung von 2-Methylzitronensäure geeignet sind, sowie Verfahren zur Herstellung von 2-Methylzitronensäure unter Verwendung dieser Mikroorganismen. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Mikroorganismen, die für die biotechnologische Herstellung von 2-Methylzitronensäure ind Fermentationsverfahren geeignet sind, sowie Fermentationsverfahren zur Herstellung von 2-Methylzitronensäure die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mikroorganismus durchgeführt werden.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft rekombinante Mikroorganismen, die für die Herstellung von 2-Methylzitronensäure geeignet sind, sowie Verfahren zur Herstellung von 2-Methylzitronensäure unter Verwendung dieser Mikroorganismen. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Mikroorganismen, die für die biotechnologische Herstellung von 2-Methylzitronensäure in Fermentationsverfahren geeignet sind, sowie Fermentationsverfahren zur Herstellung von 2-Methylzitronensäure die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen durchgeführt werden.

Zitronensäure ist eine der am weitesten verbreiteten Säuren im Pflanzenreich und tritt als Stoffwechselprodukt in allen Organismen auf. Heutzutage wird Zitronensäure industriell aus dem transgenen Pilz Aspergillus niger gewonnen, der bei niedrigem pH und Eisenmangel Zitronensäure ausscheidet.

In gelöster Form wirkt Zitronensäure kalklösend und wird in Reinigungsmitteln eingesetzt. Ferner werden die Zitronensäure und ihre Salze von der Lebensmittelindustrie als Säuerungsmittel und als Konservierungsmittel verwendet.

Zitronensäure und ihre Salze haben ebenfalls die Eigenschaft, dass sie die Blutgerinnung verhindert. Aus diesem Grund werden sie z.B. in der Medizin verwendet, um Blutspenden oder Blutproben zu konservieren.

Die Salze Trinatriumcitrat und Trilithiumcitrat werden in der Bauchemie – je nach zugesetzter Menge – als Verzögerer oder Beschleuniger für zementäre Massen eingesetzt.

2-Methylzitronensäure (2-MC) kann aufgrund gegenüber der Zitronensäure veränderter Eigenschaften, wie z.B. Chelatfähigkeit, Säurestärke, Pufferkapazität, Geschmack, in vielen Einsatzgebieten eine Alternative zur Zitronensäure darstellen.

Insbesondere ist hierbei die Verwendung als diätisches Säuerungsmittel zu nennen, da 2-MC im menschlichen Körper nicht metabolisiert wird.

Weitere Einsatzmöglichkeiten wären in der Baustoffindustrie, z.B. als Verzögerer im Beton, und bei der Herstellung alternativer Polymerwerkstoffe, da 2-Methylzitronensäure leicht mit alkoholischen Gruppen, z.B. sich selbst, Glycerin oder Sorbit, zu verestern ist. 2-Methylzitronensäureester könnten daher beispielsweise als Weichmacher bei der Herstellung von Kunststoffen eingesetzt werden, um diese elastischer zu machen. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist die Verwendung von 2-Methylzitronensäure als Edukt für die fermentative Produktion von Acrylsäure (Straathof et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005 Jun; 67(6): 727-34).

Ferner wäre die Verwendung von 2-Methylzitronensäure als Antimetabolit für schnell wachsende Zellen, beispielsweise in der Tumortherapie, vorstellbar, da 2-Methylzitronensäure eine wachstumsinhibierende Wirkung auf Zellen besitzt (Horswill et al., J. Biol. Chem. 2001 Jun 1; 276(22): 19094-101).

Die Darstellung von 2-Methylzitronensäure wurde 1956 von Habicht und Schneeberger beschrieben (Habicht & Schneeberger, Helvetica Chimica Acta, 1956, 34: 1316–1319). Mittels klassischer, organischer Synthese erfolgte eine Umsetzung von ☐-Oxal-Carbonsäureester mit ☐-Brom-Fettsäureester unter Zink in siedendem Benzol und anschließender Verseifung der gebildeten, substituierten Zitronensäureester in alkoholischer KOH Lösung. Das Verfahren liefert nicht nur sehr geringe Ausbeuten von wenigen Prozent, sondern ist überdies hinaus aufwendig und aufgrund des verwendeten Lösungsmittels Benzol und der damit verbundenen Entsorgungs- oder Recyclingkosten nicht für einen kostengünstigen, großtechnischen Produktionsprozess geeignet.

Biologisch wird 2-Methylcitronensäure von einer Reihe von Organismen, insbesondere Hefen und Bakterien, in dem sogenannten Methylcitratzyklus hergestellt. Der dem klassischen Citratzyklus stark ähnelnde Methylcitratzyklus (MCC) wurde im Jahr 1974 erstmals durch die Arbeitsgruppe von Tabuchi als ein Stoffwechselweg der Propionatverwertung in Hefen beschrieben. In den letzten Jahren zeigte sich, besonders durch die Zugänglichkeit umfangreicher Sequenzdaten, dass die Gene des MCC bei Gram-negativen Bakterien weit verbreitet sind.

Horswill und Escalante-Semerena beschrieben 2001 (Biochemistry 2001 Apr 17; 40(15): 4703-13) eine in vitro Synthese von 2-Methylzitronensäure mit Hilfe von rekombinant hergestellter 2-Methylcitrat-Synthase aus Salmonella enterica. Dieses Verfahren ist lediglich für die Herstellung kleinster Produktmengen geeignet; außerdem ist die Herstellung der erforderlichen rekombinanten 2-Methylcitrat-Synthase aufwendig.

Im Rahmen von Untersuchungen zum Abbau von Lävulinsäure in dem chemolithoautotrophen Bakterium Ralstonia eutropha konnte nachgewiesen werden, dass dieses Bakterium die kurzkettige Fettsäure Propionsäure ebenfalls über den MCC verstoffwechselt. Die Gene des MCC bilden ein Gencluster, der aus den Genen prpR, prpB, prpC, acnM, ORF5 und prpD besteht. Das Translationsprodukt von prpC, eine 2-Methylzitronensäure-Synthase, katalysiert den einleitenden Schritt des MCC, die Verknüpfung von Propionyl-CoA mit Oxalessigsäure zu 2-Methylzitronensäure. Diese wird von einer durch das acnM-Gen kodierten 2-Methyl-cis-Aconitat Hydratase zur 2-Methyl-cis-aconitsäure dehydratisiert und dann zur 2-Methylisozitronensäure hydratisiert. An dieser Isomerisierung sind die Genprodukte von acnM und ORF5 beteiligt. Diese ersten Schritte des MCC verlaufen analog zu den einleitenden Schritten des Zitronensäurezyklus. 2-Methyl-isozitronensäure wird dann durch eine Methylisozitronensäure-Lyase (prpB-Genprodukt) in Succinat und Pyruvat gespalten; diese Substanzen werden anschließend durch den "normalen" Stoffwechsel genutzt. Das prpR-Genprodukt ist an der Regulation des MCC beteiligt.

Trotz dieser Erkenntnisse existiert zur Zeit kein biotechnologisches Verfahren zur Produktion von 2-Methylzitronensäure, da 2-Methylzitronensäure bisher in nur geringen Mengen intrazellulär als kurzlebiges Stoffwechsel-Intermediat vorlag. Eine biotechnologische Herstellung in einem Fermentationsverfahren war bisher nicht möglich, da kein Mikororganismus mit ausreichender Syntheseleistung vorhanden war.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Mikroorganismus für die Herstellung von 2-Methylzitronensäure in einem biotechnologischen Fermentationsverfahren bereitzustellen, der eine gegenüber dem Stand der Technik gesteigerte Syntheserate von 2-Methylzitronensäure aufweist und vorzugsweise diese zusätzlich in das Kulturmedium sezerniert. Diese Aufgabe wird durch einen Mikroorganismus mit den Merkmalen gemäß dem Hauptanspruch gelöst.

Es ist weiterhin Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein auf einem fermentativen Prozess basierendes, mikrobielles Herstellungsverfahren von 2-Methylzitronensäure bereitzustellen. Diese Aufgabe wird durch den Einsatz eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus in einem mikrobiellen Fermentationsverfahren gelöst. Hierdurch wird ermöglicht, eine ausreichend hohe Konzentration von 2-Methylzitronensäure im Kulturmedium zu erhalten, die eine einfache und kostengünstige Reinigung derselben aus dem Kulturüberstand erlaubt.

Die vorliegende Erfindung stellt einen rekombinanten Mikroorganismus bereit, der in der Lage ist, im Vergleich zum Ausgangsorganismus größere Mengen an 2-Methylzitronensäure zu produzieren. Ein derartiger Mikroorganismus umfasst oder enthält ein Nukleinsäuremolekül, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert. Mit Hilfe der 2-Methylcitrat-Synthase kann der Mikroorganismus aus Propionyl-CoA und Oxalacetat 2-Methylcitrat produzieren. Zusätzlich zu der dadurch im Vergleich zum Ausgangsorganismus gesteigerten 2-Methylcitrat-Synthase-Aktivität, kann der erfindungsgemäße Mikroorganismus eine verminderte 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase-Aktivität aufweisen. Dies bewirkt sowohl eine gesteigerte Synthese von 2-Methylzitronensäure als auch eine verminderte Umsetzung derselben in Folgeprodukte, was zu einer Akkumulation von 2-Methylzitronensäure im Mikroorganismus als auch zu einer Sekretion derselben in das Kulturmedium führt.

„Nukleinsäuremoleküle" im Sinne dieser Erfindung umfassen Nukleinsäuresequenzen (DNA und RNA), welche für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodieren. „2-Methylzitronensäure" und „2-Methylcitrat" werden in der vorliegenden Beschreibung als gegeneinander austauschbare Begriffe verwendet, da 2-Methylzitronensäure unter physiologischen Bedingungen deprotoniert, d.h. als 2-Methylcitrat vorliegt. „2-Methylcitrat-Synthase" bezieht sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf jedes Enzym, das in der Lage ist, aus Propionyl-CoA und Oxalacetat 2-Methylcitrat zu synthetisieren. „2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase" bezieht sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf jedes Enzym, das in der Lage ist, 2-Methylcitrat zu 2-Methyl-cis-Aconitat zu dehydratisieren.

Ein erfindungsgemäßer rekombinanter Mikroorganismus umfasst daher ein Nukleinsäuremolekül, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert. In einer Ausführungsform weist der Mikroorganismus eine im Vergleich zum Ausgangsorganismus verminderte 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase-Aktivität auf. Der Ausgangsorganimus kann die Wildtyp-Form des Organimus sein.

„Rekombinanter Mikroorganismus" bezieht sich im Zusammenhang der Erfindung auf einen gentechnisch veränderten Mikroorganismus, der beispielsweise ein durch Klonierung erweitertes Erbgut aufweist. Eine solche gentechnische Veränderung wird beispielsweise durch Transformation mit einem Nukleinsäuremolekül erreicht. „Ausgangsorganimus" bezieht sich auf den erfindungsgemäßen Mikroorganismus vor dem Rekombinationsereignis. Der Ausgangsorganismus kann die Wildtyp-Form des Organismus oder eine bereits mutierte oder rekombinante Form sein. „Wildtyp-Form" bezieht sich im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung auf ein Organismus/Lebewesen, dessen Genom in einem natürlichen Zustand vorliegt, wie er durch die Evolution entstanden ist.

Das Nukleinsäuremolekül, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert, kann DNA oder RNA sein. Falls es sich um DNA handelt, kann diese entweder als Plasmid oder als chromosomale, d.h. in das Genom integrierte DNA vorliegen.

Der erfindungsgemäße Mikroorganismus kann ein prokaryotischer oder ein eukaryotischer Mikroorganismus sein. In bestimmten Ausführungsformen wird 2-Methylcitrat von prokaryotischen oder eukaryotischen Mikroorganismen, beispielsweise von einzelligen prokaryotischen oder eukaryotischen Mikroorganismen hergestellt. In einer Ausführungsform der Erfindung werden Gram-negative Bakterien verwendet. Diese Mikroorganismen zeichnen sich durch ihre einfache gentechnische Modifizierbarkeit und ihr schnelles Wachstum aus. In einigen Ausführungsformen stammen die prokaryotischen Mikroorganismen oder Mutanten dieser Mikroorganismen, aus der Gattung Bacillus, Burkholderia, Corynebacterium, Pseudomonas, oder Ralstonia. Beispiele solcher Mikroorganismen sind Burkholderia sacchari IPT101T, Pseudomonas putida KT2440, Ralstonia eutropha H16, Bacillus subtilis und Corynebacterium glutamicum.

Die im Vergleich zum Ausgangsorganismus gesteigerte 2-Methylcitrat-Synthase Aktivität wird durch die Überexpression des Nukleinsäuremoleküls, das für eine solche Synthase kodiert, erreicht. Diese Überexpression lässt sich durch die Verwendung eines geeigneten Promoters erreichen. Ein solcher Promoter kann konstitutiv aktiv oder induzierbar sein. Ein induzierbarer Promoter wird durch bestimmte Substanzen, die z.B. dem Medium zugegeben werden können, aktiviert. Beispiele für geeignete bakterielle Promotoren sind lacP, T3, T7, lambda PR oder PL, trp und ara.

Der Begriff „Promoter" wie hierin verwendet, bezieht sich auf Nukleinsäuresequenzen, die für die Expression der Gensequenzen benötigt werden. Promotoren können von Organismus zu Organismus variieren, eine Vielzahl geeigneter Promotoren sind dem Fachmann bekannt. In Prokaryoten enthält die Promoter-Region beispielsweise sowohl den Promoter, der die Inititation der Transkription kontrolliert, als auch DNA Sequenzen, die, wenn sie in RNA transkribiert sind, die Translation initiieren. Solche Regionen schließen normalerweise die 5' nicht kodierenden Sequenzen ein, die an der Initiation der Transkription und Translation beteiligt sind, wie zum Beispiel die TATA-Box, Capping-Sequenzen, die CAAT-Sequenz und ähnliche.

Das Nukleinsäuremolekül, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert, kodiert in einer Ausführungsform der Erfindung für eine prokaryotische 2-Methylcitrat-Synthase, die beispielsweise aus einem Organismus der Gattung Bacillus, Burkholderia, Corynebacterium, Pseudomonas, oder Ralstonia stammt. Das Nukleinsäuremolekül umfasst besonders bevorzugt die kodierende Nukleotidsequenz des prpC-Gens von Bacillus subtilis, Burkholderia sacchari, Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas putida oder Ralstonia eutropha oder funktionelle Varianten davon. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, umfasst das Nukleinsäuremolekül die Nukleotidsequenz der kodierenden Region des prpC-Gens aus Pseudomonas putida KT2440, die in SEQ ID NO. 1 dargestellt ist, oder funktionelle Varianten davon. Die durch die dargestellte Sequenz kodierte 2-Methylcitrat-Synthase aus Pseudomonas putida KT2440, zeigt bei heterologer Expression in E.coli mit Propionyl-CoA besonders hohe spezifische Aktivitäten.

Weitere 2-Methylcitrat-Synthasen, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, werden beispielsweise durch die prpC-Gene von Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruinosa, Vibrio cholerae und Salmonella enterica kodiert.

Die Degeneration des genetischen Codes erlaubt in einer Nukleinsäuresequenz die Substitution bestimmter Codons durch andere Codons, die dieselbe Aminosäure kodieren und daher zu demselben Proteinprodukt führen würden. Die Nukleinsäuresequenz kann daher variieren, da mit Ausnahme von Methionin und Tryptophan, alle anderen Aminosäuren durch mehr als ein Codon kodiert werden können. Daher kann die 2-Methylcitrat-Synthase der vorliegenden Erfindung durch Nukleinsäuren, die sich von der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Sequenz signifikant unterscheiden, kodiert werden ohne dass die Aminosäuresequenz eine andere wäre. Zusätzlich kann die Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz enthalten, die aus der Addition, Deletion oder Substitution von mindestens einem Nukleotid zu der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Sequenz entsteht. Zum Beispiel könnte das Nukleinsuremolekül gemäß der Erfindung zusätzlich zu der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Sequenz, flankierende nicht kodierende Nukleotide am 5'- und 3'-Ende der kodierenden Sequenz enthalten, die beispielsweise Restriktionsendonuklease-Schnittstellen einführen. Aus diesem Grund ist die Erfindung nicht auf eines der genannten Nukleinsäuremoleküle beschränkt, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert, sondern schließt alle Nukleinsäuremoleküle, die für ein derartiges funktionelles Protein kodieren und damit unter den Begriff „funktionelle Varianten" fallen, ein.

Ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus kann das obige Nukleinsäuremolekül in einen Genlokus des Mikroorganismus integriert, der für eine 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase kodiert, aufweisen. Das Nukleinsäuremolekül kann derart in das entsprechende Gen, das für eine 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase kodiert, integriert sein, dass eine Verminderung der 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase Aktivität des Mikroorganismus bewirkt wird. Eine solche Verminderung wird beispielsweise durch Unterbrechung des Gens oder Deletion von Teilen des Gens bzw. des gesamten Gens bewirkt. Alle diese Ausgestaltungen können dazu führen, dass kein funktionelles Genprodukt mehr hergestellt werden kann. Es ist ferner möglich die Herstellung des Genprodukts auf Translationsebene zu blockieren. Solche Möglichkeiten schließen unter anderem die Inhibition der Translation durch gegen die mRNA gerichtete Anti-Sense RNA oder RNAi ein und sind dem Fachmann bekannt. Möglich ist für diesen Zweck auch, einen Transkriptonsinhibitor, der die Ablesung des entsprechenden für eine 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase kodierenden Genes kodiert, rekombinant in dem ausgewählten Organismus zu produzieren.

Falls die Unterbrechung des Gens auf Nukleinsäurebene erfolgt, kann die Integration des Nukleinsäuremoleküls in den entsprechenden Genlokus mit einem geeigneten Nukleinsäuremolekül über homologe Rekombination erfolgen. Dazu wird eine Nukleinsäuresequenz verwendet, die für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert und optional weitere regulatorische oder andere Elemente enthalten kann und die an ihren Enden von Nukleotidsequenzen flankiert wird, die homolog zu Nukleotidsequenzen in dem Gen sind, das in dem entsprechenden Mikroorganismus eine 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase kodiert. Über die homologen Regionen integriert sich das Nukleinsäuremolekül dann über Rekombination in das Genom des Mikroorganismus, wodurch ein Teil der Gensequenz, die eine 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase kodiert, deletiert bzw. das entsprechende Gen disruptiert wird, was zur Verminderung oder kompletten Ausschaltung der 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase-Expression führt. Auf diese Weise kann 2-Methylcitrat in dem Mikroorganismus akkumuliert werden.

In einer Ausgestaltung der Erfindung ist der Genlokus, der für eine 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase kodiert, der acnM Genlokus. Dabei kann es sich um den R.eutropha H16 acnM-Genlokus mit der in SEQ ID NO. 2 dargestellten Nukleotidsequenz oder funktionellen Varianten davon handeln.

In einer Ausgestaltung ist der erfindungsgemäße Mikroorganismus Ralstonia eutropha bzw. der Mikroorganismus, der unter der Hinterlegungsnummer DSM18021 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen hinterlegt ist

Neben den Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines dieser Mikroorganismen für die Herstellung von 2-Methylzitronensäure. Dabei umfasst das Verfahren zur Herstellung eines solchen Mikroorganismus das Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert, in den Mikroorganismus.

In einem solchen Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus, kann das Nukleinsäuremolekül, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert, mittels eines Vektors in den Mikroorganismus transformiert werden.

Demzufolge umfasst die Erfindung in einem weiteren Aspekt ebenfalls einen Vektor, der ein Nukleinsäuremolekül, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert, umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor, in dem das Nukleinsäuremolekül enthalten ist, ein Expressionsvektor. Ein derartiger Expressionsvektor kann neben regulatorischen Sequenzen und den Nukleinsäuresequenzen, die für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodieren, Replikations- und Kontrollsequenzen umfassen, die von einem Organismus stammen, der mit dem zur Expression verwendeten Wirt kompatibel ist, sowie weiterhin mindestens einen Selektionsmarker, der einen selektierbaren Phänotyp auf eine transformierte Zelle überträgt. Beispiele für solche Selektionsmarker sind Resistenzen gegen ein cytotoxisches Agens, wie z.B. ein Antibiotikum, ein Schwermetall oder ein Toxin, eine virale Immunität oder ähnliches. Eine kleine Auswahl geeigneter Marker umfasst Nukleinsäuresequenzen, die einem Mikroorganismus gemäß der Erfindung Resistenz gegen Belomycin, Gentamycin, Hygromycin, Kanamycin, Ampicillin, Phleomycin, Spectinomycin, Streptomycin, Sulfonamid oder Tetracyclin verleihen. Andere Marker umfassen zum Beispiel Nukleinsäuresequenzen, die für eine Alkalische Phosphatase, myc, Hämagglutinin, &bgr;-Glucuronidase, Luciferase und GFP kodieren. Eine große Zahl dazu geeigneter Vektoren, z.B. pBluescript, pUC18, pBBR, pESC, pKS, pET oder pcDNA3, ist detailliert beschrieben und kommerziell erhältlich.

In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst der Vektor die kodierende Nukleotidsequenz des prpC-Gens oder funktionelle Varianten davon aus einem Organismus der Gattung Bacillus, Burkholderia, Corynebacterium, Pseudomonas, oder Ralstonia, vorzugsweise Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas putida, Ralstonia eutropha oder Burkholderia sacchari. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 1 oder funktionelle Varianten davon.

In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist der verwendete Vektor pBluescript SK oder pJQ200mp18Tc.

Die regulatorischen Elemente, die neben der kodierenden Region in dem Vektor enthalten sein können, sind vor allem solche, die für die Transkription, Translation oder Rekombination in einer Wirtszelle notwendig sind. Solche regulatorischen Elemente schließen beispielsweise Promotoren, Transkriptionsterminationssequenzen und Ribosombindungsstellen ein. Regulatorische Elemente sind "operativ" mit der das Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft. Eine operative Verknüpfung ist eine Verknüpfung, bei der die regulatorischen Sequenzelemente und die proteinkodierende Sequenz derart verbunden sind, dass Genexpression möglich ist. Die genaue Beschaffenheit der zur Genexpression erforderlichen regulatorischen Bereiche kann zwischen verschiedenen Spezies variieren. In der Regel umfassen diese Bereiche jedoch einen Promotor, der in der Regel aus dem Promotor per se besteht, d.h. DNA-Elemente, welche die Transkriptionsinitiation steuern, sowie aus DNA-Elementen, die nach ihrer Transkription in mRNA den Beginn der Translation regulieren. Solche Promotoren können 5' nicht kodierende Sequenzen einschließen, die an der Initiation von Transkription und Translation beteiligt sind, wie zum Beispiel die –35/-10-Elemente und das Shine-Dalgarno Element in Prokaryoten. Diese Regionen können ferner auch Enhancer- oder Repressorelemente enthalten. Zusätzlich können auch die 3' nicht kodierenden Regionen regulatorische Elemente enthalten, die an der Termination der Transkription beteiligt sind. Falls diese Terminationssequenzen in einer speziellen Wirtszelle nicht oder nur unzureichend funktionell sind, können sie durch Signale ersetzt werden, die in der betreffenden Zelle ausreichend funktionell sind.

In einer Ausführungsform besitzt der Vektor die Fähigkeit sich in einem Wirtsorganismus replizieren zu können. Zusätzlich kann der Vektor Elemente enthalten, die die Selektion der erfolgreich transformierten Mikroorganismen erlaubt, d.h. in der Regel ein Gen, das Resistenz gegenüber einem bestimmten Antibiotika vermittelt, umfassen.

Unter Transformation ist erfindungsgemäß die Aufnahme von Nukleinsäuremolekülen in Zellen jedes beliebigen Typs, unabhängig davon, ob es sich um Bakterien-, Pilz-, Hefe-, Tier- oder Pflanzenzellen handelt, zu verstehen.

Zur Transformation können alle dem Fachmann bekannten Techniken zur Einführung von Nukleinsäuren in Zellen verwendet werden. Neben viralen Gentransfersystemen gibt es eine Reihe nicht-viraler Systeme. Bei Verwendung biochemischer Methoden wird die Fremd-DNA über Endocytose in die Wirtszelle aufgenommen. Dazu wird die DNA vorher mit verschiedenen Substanzen komplexiert. Dazu zählen beispielsweise Calciumphosphat, Polykationen wie DEAE-Dextran, oder kationische Lipidmoleküle wie DOTMA (Lipofektin). Biophysikalische Verfahren zum Einbringen eines Vektors in einen Mikroorganismus schließen Hitzeschock, Mikroinjektion und Elektroporation ein. Herkömmliche Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in Zellen sind im Stand der Technik bekannt, zum Beispiel aus Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, 2.

Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY und Ito, H., et al., 1983, J. Bacteriol., Vol. 153, S.163–168.

Der Fachmann kann die für die zu transformierenden Zellen geeignete Methode aufgrund seines Fachwissens oder einfacher Experimente auswählen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 2-Methylzitronensäure.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Schritte:

  • (a) Einbringen eines wie oben definierten Nukleinsäuremoleküls, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert, in einen Mikroorganismus, um einen wie oben definierten erfindungsgemäßen Mikroorganismus zu erzeugen,
  • (b) Kultivieren der Mikroorganismen unter dafür geeigneten Bedingungen in einem Kulturmedium, und
  • (c) Isolieren der 2-Methylzitronensäure aus dem Kulturmedium.

Geeignete Kultivierungsbedingungen für die unterschiedlichen Mikroorganismen sind dem Fachmann bekannt.

Dem Kulturmedium wird während der Kultivierung der erfindungsgemäßen Mikroorganismen ein Substrat, zugesetzt, das von der 2-Methylcitrat-Synthase zu Synthese von 2-Methylcitrat verwendet werden kann. Dieses Substrat können beispielsweise Lävulinsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Valeriansäure, die entsprechenden korrespondierenden Salze, oder Kombinationen der vorgenannten Stoffe sein.

In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Kultivierung eines erfindungsgemäßen transgenen R. eutropha H16 bei 30 °C und 150 rpm in einem Kulturmedium, das 1% (w/v) Natriumgluconat, 0,1 % (w/v) Ammoniumchlorid und 300 &mgr;g/ml eines Antibiotikums zur Selektion, vorzugsweise Kanamycin, enthält. Als Substrate werden am Ende der exponentiellen Wachstumskurve 0,5 % bis 2,0 % (w/v) Natriumpropionat oder Natriumlävulinat und Diatriumfumarat oder Dinatriumsuccinat zugesetzt und die Inkubation für weitere 144 h bei 30°C fortgesetzt.

Nach dem Kultivieren der Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen liegt 2-Methylzitronensäure vorzugsweise in einer Konzentration von mindestens 10 g/l Kulturmedium vor, und kann daraus im folgenden isoliert werden.

Soweit die von den Mikroorganismen gebildete 2-Methylzitronensäure nicht bereits von den Zellen in das umgebende Medium abgegeben worden ist, werden die Zellen mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren aufgeschlossen. Dazu gehören chemische, enzymatische als auch physikalisch-mechanische Methoden. Als Beispiel seien hier der Aufschluss mittels einer Glasperlenmühle, French-Press, Ultraschallbehandlung oder mittels eines Hochdruckhomogenisators genannt. Die festen Zellbestandteile können anschließend durch Zentrifugation abgetrennt werden.

Aus dem Kulturmedium kann 2-Methylzitronensäure als Calciumsalz ausgefällt werden. Dazu wird Calciumchlorid beispielsweise im 3-5fachen molaren Überschuss verglichen zu 2-Methylzitronensäure zu den zellfreien Kulturüberständen gegeben und erhitzt. Der Niederschlag kann nach dem Waschen mit heißem Wasser auf einem Kationenaustauscher allmählich vom Calciumsalz zurück in die freie Säure überführt werden. Durch Einengen lässt sich dann 2-Methylzitronensäure aus dem Eluat auskristallisieren.

Die Erfindung wird nun durch die folgenden, nicht einschränkenden experimentellen Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügte Figuren beschrieben, wobei

1 einen Überblick über die Entstehung aller verwendeten Plasmide und die Generierung des 2-Methylzitronensäure produzierenden Stammes R. eutropha H16 (☐acnMRe☐KmprpCPp) zeigt.

2 ein typisches HPLC-Elutionsprofil eines Überstandes der 2-Methylzitronensäure produzierenden Kultur zeigt. Der Haupt-Peak bildet mit mehr als 25 % 2-Methylzitronensäure ab.

3 lichtmikroskopische Aufnahmen von Kristallen gereinigter 2-Methylzitronensäure zeigt.

Beispiele Produktion von 2-Methylzitronensäure in genetisch veränderten Ralstonia eutropha H16, die eine Pseudomonas putida 2-Methylcitrat-Synthase exprimieren und defizient an endogener 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase-Aktivität sind Herstellung der kombinierten knock-out/-in Expressionskassette

zeigt schematisch alle Einzelschritte zur Herstellung der verwendeten Expressionskassette.

Ein 1.164-bp DNA Fragment des R. eutropha acnMRe-Gens (kodierend für 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase) wurde durch PCR von genomischer DNA durch die Oligonukleotide acnMReUP (PstI) (SEQ ID NO. 5; 5'-AAACTGCAGCAAGGAAAAGGTGGTCGGCGCCTATCTG-3') und acnMRe RP (XbaI) (SEQ ID NO. 6; 5'-AAATCTAGACAGGTGGTCGGTGGTGATGTTGTCG-3') amplifiziert (angefügte Restriktionsendonukleaseschnittstellen unterstrichen). Das PCR Produkt wurde über PstI und XbaI in den Vektor pBlueskript SK ligiert, das resultierende Plasmid pSK ::acnMRe genannt.

Parallel wurde mittels der Primer prpCPpUP(HindIII) (SEQ ID NO. 7; 5'-AAAAAAGCTTCAAGAAAGGAGAAACACCRTGGCCGAAG-3') und prpCPpRP (ClaI) (SEQ ID NO. 8; 5'-AAAATCGATAGCTATTCAGCGCTGCTCGATCGGCACGAAC-3') ein Genabschnitt von Pseudomonas putida genomischer DNA amplifiziert, die zuvor als putative 2-Methylcitrat-Synthase identifiziert worden war. Das PCR Produkt wurde über HindIII and ClaI in den Vektor pBlueskript SK ligiert, das resultierende Plasmid pSK::prpCPp genannt. ☐Km, ein Kanamycin-Resistenz-Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors, wurde mittels HindIII Verdau aus dem Vektor pSKsym☐Km (Overhage et al., 1999) geschnitten und in den HindIII-linearisierten pSK ::prpCPp ligiert. Dieser Vektor wurde pSK::☐KmprpCPp genannt. Von diesem Templat wurde mittels PCR und den Oligonukleotiden ☐KmUP (SmaI) (SEQ ID NO. 9; 5'-AAACCCGGGACAGCAAGCGAACCGGAATGACCAGCTGGGG-3') und prpCPpRP (ClaI) (SEQ ID NO. 8) ein 2,162-bp Fragment amplifiziert, das ☐Km und prpCPp enthält. Dieses wurde in StuI linearisierten pSK::acnMRe ligiert und ergab den Vektor pSK ::☐acnMRe☐KmprpCPp, der als Templat in einer PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer acnMReUP (PstI) (SEQ ID NO. 5) und acnMReRP (XbaI) (SEQ ID NO. 6) Verwendung fand. Das 2947-bp PCR Produkt wurde in den SmaI geschnittenen Suicide-Vektor pJQ200mp18Tc ligiert; das resultierende Hybrid-Plasmid wurde pJQ200mp18Tc::☐acnMRe☐KmprpCPp genannt.

Generierung von isogenischen acnMRe-Mutanten von R. eutropha H16

pJQ200mp18Tc::☐acnMRe☐KmprpCPp wurde mittels Konjugation aus dem E. coli 517-1 Stamm in R. eutropha H16 überführt, und die resultierenden Transkonjuganden auf NB Agar-Platten mit 150 &mgr;g/ml Kanamycin und 10 % (w/v) Saccharose selektioniert. Richtige Integration der Knock-out/Expressions-Kassette wurde mittels PCR verifiziert.

Kultivierung von R. eutropha (☐acnMRe☐KmprpCPp) zur 2-Methylzitronensäure-Synthese

Die Kultivierung erfolgte in 300 ml Erlenmeyerkolben gefüllt mit 50 ml Mineralsalzmedium (MSM) bei 30 °C und 150 rpm. MSM bestand aus 1,0 % (w/v) Natriumglukonat, 0,10 Ammoniumchlorid und 300 &mgr;g/ml Kanamycin. Am Ende der exponentiellen Wachstumskurve wurden 0,5 % bis 2,0 % (w/v) Natriumpropionat oder Natriumlävulinat zugesetzt; 0,5 % bis 2.0 % (w/v) di-Natriumfumarat oder di-Natriumsuccinat wurden zusätzlich als zweites Substrat beigemischt. Die Kulturen wurden für weitere 144 h bei 30 °C kultiviert, in regelmäßigen Zeitabständen wurden analytische Proben genommen. In diesen wurde mittels HPLC die Konzentration an 2-Methylzitronensäure bestimmt. Am Ende der Kultivierung wurde der zellfreie Überstand lyophilisiert.

HPLC Analyse

HPLC-Analysen wurden auf einer LaChrom Elite® HPLC (VWR-Hitachi International GmbH, Darmstadt, Deutschland) bestehend aus einer Metacarb 67 H advanced C Säule (Varian, Palo Alto, USA) und einem VWR-Hitachi Säulenofen Typ 22350 durchgeführt. Die Säule war beschickt mit einem sulfonierten Polystyren Resin in Hydrogenform (Größe: 300 × 6.5 mm). Ein VWR-Hitachi RI-Detektor (Typ 2490), mit Temperaturkontrolle wurde zur Detektion verwendet. Das Injektionsvolumen betrug 20 &mgr;l. Der Eluent bestand aus 5 mN Schwefelsäure (aq) mit einer Flussrate von 0,8 ml/min. Zur Auswertung wurde EZ Chrome Elite Software (VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland) und als Referenz chemisch synthetisierte DL-2-Methylzitronensäure (Dr. Ehrenstorfer GmbH, Augsburg, Deutschland) benutzt.

Aufreinigung von 2-Methylzitronensäure aus den Kulturüberständen

Um 2-Methylzitronensäure als Calciumsalz auszufällen wurde CaCl2 im vierfachen molaren Überschuss verglichen zu 2-Methylzitronensäure zu den zellfreien Kulturüberständen gegeben und auf 95 °C erhitzt. Der Niederschlag wurde mit heißem Wasser gewaschen und auf einem Amberlite-IR 120 Kationenaustauscher (Merck, Darmstadt, Deutschland) allmählich vom Calciumsalz zurück in die freie Säure überführt. Durch Einengen ließ sich 2-Methylzitronensäure auskristallisieren.

Zusammenfassung

Mit oben beschriebenen Methoden wurde ein rekombinanter R. eutropha (☐acnMRe☐KmprpCPp) Stamm generiert und zur 2-Methylzitronensäure-Produktion verwendet. gibt ein typisches HPLC-Elutionsprofil eines Kulturüberstandes der beschriebenen Mutante wieder. Der 2-Methylzitronensäure-Peak ist markiert und zeigt, dass 2-Methylzitronensäure den Hauptbestandteil (> 25 %) des Kulturmediums ausmacht. Die mit diesem Verfahren erzielten Ausbeuten liegen bei annähernd 20 g/l Kulturüberstand. Die Tatsache, dass 2-Methylzitronensäure in den Zellüberstand sekretiert wird, ermöglicht eine einfache Aufreinigung mittels konventioneller Methoden. zeigt 2-Methylzitronensäurekristalle von einer Reinheit > 96 %.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.


Anspruch[de]
Ein rekombinanter Mikroorganismus, wobei der Mikroorganismus ein Nukleinsäuremolekül, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert, umfasst. Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus eine im Vergleich zum Ausgangsorganismus verminderte 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase-Aktivität aufweist. Mikroorganismus gemäß Anspruch 2, wobei der Ausgangsorganismus die Wildtyp-Form des Organismus ist. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1–3, wobei das Nukleinsäuremolekül DNA ist. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei der Mikroorganismus ein prokaryotischer oder eukaryotischer Mikroorganismus ist. Mikroorganismus gemäß Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus zu einer der Gattungen Burkholderia, Pseudomonas, Ralstonia, Bacillus oder Corynebacterium gehört. Mikroorganismus gemäß Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus Burkholderia sacchari IPT101T, Pseudomonas putida KT2440, Ralstonia eutropha H16, Bacillus subtilis oder Corynebacterium glutamicum ist. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1–7, wobei der Mikroorganismus eine gesteigerte 2-Methylcitrat-Synthase-Aktivität aufweist, die durch die Überexpression des Nukleinsäuremoleküls, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert, erreicht wird. Mikroorganismus gemäß Anspruch 8, wobei das Nukleinsäuremolekül, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert, unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven oder induzierbaren Promotors steht. Mikroorganismus gemäß Anspruch 9, wobei der Promotor aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den Promotoren lacP, T3, T7, lambda PR oder PL, trp und ara besteht. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Nukleinsäuremolekül für eine prokaryotische 2-Methylcitrat-Synthase kodiert und aus einem Organismus stammt, der zu der Gattung Pseudomonas, Burkholderia, Bacillus, Corynebacterium oder Ralstonia gehört. Mikroorganismus gemäß Anspruch 11, wobei das Nukleinsäuremolekül die kodierende Nukleotidsequenz des prpC-Gens aus Burkholderia sacchari, Pseudomonas putida, Ralstonia eutropha, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum oder funktionelle Varianten davon umfasst. Mikroorganismus gemäß Anspruch 12, wobei das Nukleinsäuremolekül die Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist oder funktionelle Varianten davon, umfasst. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1–13, wobei das Nukleinsäuremolekül in einen Genlokus des Mikroorganismus eingebracht ist, der für eine 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase kodiert. Mikroorganismus gemäß Anspruch 14, wobei das Nukleinsäuremolekül derart in den Genlokus des Mikroorganismus, der für eine 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase kodiert, eingebracht wird, dass eine Verminderung der 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase-Aktivität des Mikroorganismus bewirkt wird. Mikroorganismus gemäß Anspruch 14 oder 15, wobei der Genlokus, der für eine 2-Methyl-cis-Aconitat-Hydratase kodiert, der acnM Genlokus ist. Mikroorganismus gemäß Anspruch 16, wobei der Genlokus die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 oder funktionelle Varianten davon aufweist. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1–17, wobei der Mikororganismus der Mikororganismus ist, der unter der Hinterlegungsnummer DSM18021 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen hinterlegt ist. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1–18, das das Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert, in den Mikroorganismus umfasst. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das Nukleinsäuremolekül, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert, mittels eines Vektors in den Mikroorganismus eingebracht wird. Ein Vektor, wobei der Vektor ein Nukleinsäuremolekül, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase aus einem Organismus der Gattung Bacillus, Burkholderia, Corynebacterium, Pseudomonas oder Ralstonia kodiert, umfasst. Vektor gemäß Anspruch 21, wobei der Vektor die Nukleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 1 umfasst. Vektor gemäß Anspruch 21 oder 22, wobei der Vektor pBluescript SK oder pJQ200mp18Tc ist. Verfahren zur Herstellung von 2-Methylzitronensäure, wobei das Verfahren

a) das Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das für eine 2-Methylcitrat-Synthase kodiert, in einen Mikroorganismus mittels eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 19–20, um einen Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1–18 zu erzeugen,

b) das Kultivieren der Mikroorganismen unter dafür geeigneten Bedingungen in einem Kulturmedium, und

c) das Isolieren der 2-Methylzitronensäure aus dem Kulturmedium umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Kulturmedium mindestens ein oder mehrere Substrat (e) enthält, das aus Lävulinsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Valeriansäure, korrespondierenden Salzen davon sowie Mischungen ausgewählt werden. Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei das zumindest eine Substrat in einer Konzentration von 0.5–2 Gew.-% am Ende der exponentiellen Wachstumsphase des Mikroorganismus dem Kulturmedium zugesetzt werden. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei nach dem Kultivieren der Mikroorganismen 2-Methylzitronensäure in einer Konzentration von mindestens 10 g/l Kulturmedium vorliegt. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24–27, wobei das Isolieren von 2-Methylcitrat aus dem Kulturmedium folgende Schritte umfasst:

a) Abtrennen der Zellen,

b) Zugabe von Calciumchlorid und Erhitzen,

c) Abtrennen und Waschen des Niederschlags mit heißem Wasser,

d) Aufgabe auf einen Kationenaustauscher,

e) Elution von 2-Methylzitronensäure, und

f) Auskristallisieren von 2-Methylzitronensäure aus dem Eluat.






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