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Dokumentenidentifikation DE60215917T2 13.09.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001359934
Titel TRIPEPIDE UND TRIPEPDID-DERIVTE ZUR BEHANDLUNG VON NEURODEGENERATIVEN ERKRANKUNGEN
Anmelder NeuroTell AG, Hergiswil, CH
Erfinder RAPIN, Jean, F-75014 Paris, FR;
WITZMANN, Klaus, Hans, 84546 Egglkofen, DE;
GRUMEL, Jean-Marie, F-69160 Tassin la Demi-Lune, FR;
GONELLA, Jacques, CH-4132 Muttenz, CH
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 60215917
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 05.02.2002
EP-Aktenzeichen 027118330
WO-Anmeldetag 05.02.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/EP02/01180
WO-Veröffentlichungsnummer 2002062828
WO-Veröffentlichungsdatum 15.08.2002
EP-Offenlegungsdatum 12.11.2003
EP date of grant 08.11.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.09.2007
IPC-Hauptklasse A61K 38/06(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Tripeptiden bzw. Tripeptidderivaten bei der Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, insbesondere der Alzheimer-Krankheit und von Mild Cognitive Impairment, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend Tripeptide bzw. Tripeptidderivate und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

Neurodegenerative Krankheiten zeichnen sich durch einen Abbau bzw. eine Degeneration der Nerven aus, der in der Regel durch Apoptose hervorgerufen wird. Beispiele für neurodegenerative Krankheiten schliessen die Alzheimer-Krankheit, Mild Cognitive Impairment, die Parkinson-Krankheit wie auch die mit AIDS verbundenen neurologischen Störungen ein. Bei z.B. der Alzheimer-Krankheit führt der Nervenabbau zu einer Gedächtnisstörung, einer Störung des Sprach- und Denkvermögens, sowie einer Störung der Fähigkeit, Entscheidungen zu treffen. Wie es zu diesen Störungen im einzelnen kommt, ist bislang nicht geklärt. Biochemisch ist unter anderem eine Veränderung des kortikalen cholinergen Systems mit einer Verminderung bei der Bildung des Neurotransmitters Acetylcholin nachweisbar. In der Hirnrinde von Patienten, die unter der Alzheimer-Krankheit leiden, ist die Acetylcholinkonzentration um 20 bis 40 % vermindert. In der Folge werden Nervenenden attackiert, und dies führt letztlich zum Absterben von Hirnzellen. Hiervon ist insbesondere der Hippokampus betroffen.

Vor diesem Hintergrund setzen Therapieansätze für die Alzheimer-Krankheit daher bei einer Stabilisierung der Acetylcholinkonzentration an, und zwar durch Inhibierung der Acetylcholinesterase, die Acetylcholin zu Acetat und Cholin abbaut. Die Verwendung von Acetylcholinesterase-Inhibitoren weist jedoch den Nachteil auf, dass sie nur zu einer zeitweiligen Verbesserung führen, nicht jedoch die Nervendegeneration stoppen oder sogar rückgängig machen können.

Andererseits sind sogenannte neurotrophe Faktoren bzw. Neurotrophine bekannt, denen eine massgebliche Rolle für das Überleben, das Wachstum und die Differenzierung diskreter neuronaler Populationen zugeschrieben wird. Diese Neurotrophin-Familie schliesst den Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor, NGF), vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (brain derived neurotrophic factor, BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), Neurotrophin-4 (NT-4) und die CNTF-Familie (ziliare neurotrophe Faktoren) ein. Neurotrophine sind kleine basische Proteine mit einem Molekulargewicht im Bereich von 26 bis 28 kDa. NGF ist das am besten charakterisierte Mitglied der Neurotrophin-Familie, und es hat sich herausgestellt, dass NGF eine Aktivität in vielen verschiedenen Geweben zeigt.

Im peripheren Nervensystem (PNS) ist NGF für die Entwicklung von sympathischen und bestimmten sensorischen Nerven massgeblich. Im zentralen Nervensystem (ZNS) nimmt NGF eine trophische Rolle bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung cholinerger Neuronen im basalen Vorderhirn ein. Es spielt zudem eine Rolle bei der neuronalen Regeneration im erwachsenen ZNS-Gewebe.

Es ist bekannt, dass cholinerge Neuronen Acetylcholin stärker in Anwesenheit von NGF als in dessen Abwesenheit herstellen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in Primaten eine Verabreichung von NGF zu einer Regeneration von cholinergen Zellkörpern führte. Aufgrund dieser Erkenntnisse wird vermutet, dass eine veränderte Aktivität von NGF daher ein Ausgangspunkt bei der Degeneration von cholinergen Neuronen sein kann. Zumindest theoretisch scheinen daher neurotrophe Substanzen als geeignet für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten, wie z.B. der Alzheimer-Krankheit. Diese physiologisch vorkommenden Substanzen weisen jedoch einen kurzen Wirkungsradius auf, der denen autokriner oder parakriner Substanzen ähnelt. Daher ist es bis heute nicht möglich, herkömmliche therapeutische Wege (enteral oder parenteral) für ihre Verabreichung zu nutzen, da sie im Blutkreislauf und anderen Geweben der Proteolyse unterliegen und hierdurch desaktiviert werden. Zudem ist bekannt, dass sie nicht die Bluthirnschranke überwinden können, was jedoch eine Voraussetzung für eine Wirkung auf das ZNS ist.

So haben klinische Versuche mit rekombinanten humanen Neurotrophinen bislang nicht zum Erfolg geführt. Eine in Betracht kommende intrazerebrale Verabreichung sollte zudem aus praktischen Erwägungen ausgeschlossen sein. Daher ist eine Übertragung der Ergebnisse aus in vitro-Experimenten mit NGF oder anderen Neurotrophinen sowie mit Fragmenten dieser Peptide auf eine mögliche therapeutische Verabreichung nicht ohne weiteres möglich.

EP-A-0 316 218 offenbart die nootrope Wirkung von Verbindungen mit z.B. Cinnamoyl-glycyl-L-phenylalanin-L-prolinamid.

EP-A-1 018 341 offenbart Antistressmittel, die als Wirkstoff Tripeptide, wie z.B. Ile-Pro-Pro oder Val-Pro-Pro, enthalten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:

Somit ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, bestimmte Substanzen bereitzustellen, die Nervendegenerationen, insbesondere von Hippokampuszellen, stoppen und vorzugsweise umkehren, als auch einer herkömmlichen therapeutischen Verabreichung zugänglich sind und die somit ihre Verwendung als Medikament für die Behandlung neurodegenerativer Krankheiten ermöglichen. Weiterhin ist es ein erfindungsgemässes Ziel, entsprechende pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen.

Dieses erfindungsgemässe Ziel wird gelöst durch die Verwendung der Verbindungen der folgenden Formel (I):

wobei

X NH2, NH-C1-3-Alkyl, N(C1-3-Alkyl)2 darstellt;

R1 ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Phe, die wahlweise mit einer oder mehreren (C1-5)-Alkoxygruppen, (C1-5)-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert sein kann, oder Ile ableitet;

R2 ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Gly oder Ile ableitet;

Y1 und Y2 H oder (C1-5)-Alkyl darstellen;

R3 und R4 H darstellen; und

R5 H darstellt;

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon;

zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Behandlung neurodegenerativer Krankheiten nützlich ist.

Die erfindungsgemässe pharmazeutische Zusammensetzung umfasst Verbindungen der obigen Formel (I), wobei

X NH2, NH-(C1-3)-Alkyl, N(C1-3-Alkyl)2 darstellt;

R1 ein Rest ist, der sich von der Aminosäure Phe ableitet, die wahlweise mit einer oder mehreren (C1-5)-Alkoxygruppen, (C1-5)-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert sein kann;

R2 einen Rest darstellt, der sich von einer der Aminosäuren Gly oder Ile ableitet;

Y1 und Y2 unabhängig voneinander H oder (C1-3)-Alkyl darstellen;

R3 und R4 H darstellen; und

R5 H darstellt;

oder pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon, und

einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

FIGUREN:

1 zeigt die Korrelation der experimentellen und berechneten Werte der Blut-Hirn-Verteilung.

GENAUE BESCHREIBUNG:

Sofern nicht anders angegeben, können die Aminosäurereste sowohl in der D- als auch in der L-Form vorliegen, wobei die L-Form bevorzugt ist.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), in denen R1 ein Rest ist, der sich von der Aminosäure Phe ableitet, die wahlweise durch eine oder mehrere (C1-5)-Alkoxygruppen, (C1-5)-Alkylgruppen oder ein oder mehrere Halogenatome substituiert sein kann, oder der sich von der Aminosäure Ile ableitet, R2 ein Rest ist, der sich von den Aminosäuren Gly oder Ile ableitet, R3, R4 und R5 Wasserstoff darstellen, X NH2, NH(C1-3-Alkyl) oder N(C1-3-Alkyl)2 darstellt, und Y1 und Y2 unabhängig voneinander H oder (C1-3)-Alkyl darstellt.

Die bevorzugten Verbindungen der Formel (I) sind Glycyl-L-phenylalanyl-L-prolinamid, N,N-Diethyl-isoleucyl-phenylalanyl-L-prolinethylamid, N,N-Diethyl-isoleucyl-isoleucyl-prolinamid oder oder dessen pharmazeutisch annehmbaren Salze.

Die verwendeten Abkürzungen für die Aminosäuren (Phe für Phenylalanin usw. wie auch die teilweise unten verwendeten Einbuchstabenabkürzungen wie F für Phenylalanin) sind dem Fachmann geläufig (siehe z.B. Beyer und Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 21. Auflage, S. Hirzel Verlag Stuttgart 1988). So bedeutet Phe Phenylalanin, Gly Glycin usw.. Der Ausdruck "ein Rest, der sich von der Aminosäure Phe ableitet", bezeichnet somit einen Benzyl (-CH2-C6H5)-Rest. Entsprechend bezeichnet "ein Rest, der sich von der Aminosäure Gly ableitet", ein Wasserstoffatom, "ein Rest, der sich von der Aminosäure Ala ableitet", eine Methylgruppe usw..

Die erfindungsgemäss verwendeten Verbindungen der Formel (I) sind wasserlösliche Substanzen und somit für eine enterale oder parenterale Verabreichung geeignet.

Die erfindungsgemäss verwendeten Verbindungen sind jedoch nicht alle gleichermassen für die orale/enterale oder parenterale Verabreichung geeignet. Während z.B. HCl-Gly-Phe-ProNH2 hauptsächlich für die parenterale Verabreichung in Betracht kommt, sind N,N-Diethyl-Ile-Ile-ProNH2 und N,N-Diethyl-Ile-Phe-ProNHEt für die parenterale und insbesondere orale Verabreichung geeignet. Die Eignung der erfindungsgemäss zu verwendenden Verbindungen für die orale Verabreichung kann unter Verwendung des sogenannten Parallel Artificial Membrane Permeation Assay abgeschätzt werden, das unten in grösserem Detail beschrieben wird. Für die orale Verabreichung werden solche Verbindungen mit Werten von mehr als 10, vorzugsweise mehr als 30, noch bevorzugter mehr als 45, wie durch dieses Assay bestimmt, bevorzugt.

Eine wesentliche Voraussetzung für die Wirksamkeit der erfindungsgemäss zu verwendenden Tripeptide und Tripeptidderivate ist ihre Konzentration im ZNS. Neben anderen Faktoren ist diese durch das Mass des Durchlasses durch die Blut-Hirn-Schranke bestimmt, die über aktiven oder passiven Transport stattfinden kann. Ein sogenannter erleichterter Transport oder Transporte über Lipidträger (lipid safts) wird als Mechanismus in Betracht gezogen. Das Transportgleichgewicht wird unabhängig von der Art oder dem Mechanismus durch den Blut-Hirn-Verteilungskoeffizienten (log BB) ausgedrückt. Je höher dieser Koeffizient, desto höher ist die Konzentraton im ZNS.

Die Definition und Bestimmung des Blut-Hirn-Verteilungskoeffizienten durch Molecular Modelling im Zusammenhang mit QSAR (quantitative structure activity relationships) ist unten genauer beschrieben. Der Hirn-Blut-Verteilungskoeffizient der erfindungsgemäss zu verwendenden Verbindungen beträgt vorzugsweise –3,5 oder höher, besonders bevorzugt liegt er im Bereich von –3,0 und höher.

Weiterhin zeigen die erfindungsgemäss verwendeten Substanzen der Formel (I) eine hohe Affinität für Tyrosinkinase-Rezeptoren (TrkA, TrkB und TrkC). Da die neurotrophe Substanz NGF bekanntermassen über ein Andocken an diese Rezeptoren wirkt, ist eine hohe Affinität für diese Rezeptoren ein starkes Indiz für die neurotrophe Wirkung der erfindungsgemäss zu verwendenden Verbindungen. Die Bindekonstanten (pKD) können durch Molecular Modelling bestimmt werden, und ein entsprechendes Verfahren wird unten in grösserem Detail beschrieben. Die erfindungsgemäss verwendeten Verbindungen weisen vorzugsweise pKD-Werte von 5,5 oder mehr auf, noch bevorzugter sind pKD-Werte von 7 oder mehr.

Die Synthese der erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate ist nicht besonders beschränkt und kann gemäss bekannten Verfahren, vorzugsweise stereospezifischen Verfahren der Peptidchemie, durchgeführt werden, bei denen die L- bzw. D-Konfiguration der jeweiligen Aminosäuren bzw. ihrer Derivate beibehalten wird. Verschiedene Peptidsynthesen sind in Beyer und Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 21. Auflage, S. Hirzel Verlag Stuttgart 1988, Seiten 829 bis 834, beschrieben. Erfindungsgemäss bevorzugt sind insbesondere die N-Carbonsäureanhydrid-Methode (NCA-Methode) und die Methode unter Verwendung von gemischten Carbonsäureanhydriden; wie durch die folgenden Reaktionsgleichungen veranschaulicht: NCA-Methode:

  • 1. Boc-AA1-NCA+H-L-Pro-NH2 → BOC-AA1-L-Pro-NH2
  • 2. Boc-AA1-L-Pro-NH2+TFA → TFA-H-AA1-L-Pro-NH2
  • 3. Boc-AA2-NCA+TFA-H-AA1-L-Pro-NH2 → HCl-H-AA2-L-AA1-Pro-NH2
  • 4. Boc-AA2-AA1-L-Pro-NH2+HCl → HCl-H-AA2-AA1-L-Pro-NH2

Gemischte Carbonsäure-Anhydrid-Synthese:

  • 1. Boc-AA1OH+Cl-COOCH2(CH3)2 → Boc-AA1-OCOO-CH2CH(CH3)2
  • 2. Boc-AA1-OCOOCH2CH(CH3)2 → Boc-AA1-L-Pro-NH2
  • 3. Boc-AA2-OH+Cl-COOCH2CH(CH3)2 → Boc-AA2-OCOOCH2CH)CH3)2
  • 4. Boc-AA2-OCOOCH2CH(CH3)2+TFA-H-AA1-L-Pro-NH2 → Boc-AA2-AA1-L-Pro-NH2
  • 5. Boc-AA2-AA1-L-Pro-NH2+HCl → HCl-H-AA2-AA1-L-Pro-NH2
wobei AA1 bzw. AA2 die mittlere bzw. endständige Aminosäure (abgeleitet von R1 bzw. R2) bezeichnen, Boc einen tert-Butyloxycarbonylrest bezeichnet, NCA N-Carbonsäureanhydrid bezeichnet, und TFA Trifluoressigsäure bezeichnet. Die Ausgangsstoffe sind jeweils im Handel erhältlich.

Bei Verwendung von Aminosäuren, die weitere funktionelle Gruppen aufweisen, wie z.B. Serin, können diese in dem Fachmann geläufiger Weise geschützt werden.

Zudem können die erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate in einer (gegebenenfalls modifizierten) Merryfield-Synthese an der Festphase synthetisiert werden, vorzugsweise unter Verwendung von Fluoren-9-yl-methoxy-carbonyl-Schutzgruppen (Fmoc-Reste) oder Fmoc/tert-Butyl (tBu)-geschützten Aminosäuren.

Die oben beschriebenen Reaktionen weisen in der Regel Ausbeuten in der Grössenordnung von über 90 %, bezogen auf den einzelnen Reaktionsschritt, und eine Gesamtausbeute von mehr als 60 % auf. Die Reinheit der so synthetisierten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate betrug im allgemeinen über 98 % und war daher ausreichend für die Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen. Die Strukturen der Tripeptide bzw. Tripeptidderivate können durch Massenspektroskopie (MS), Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), automatisierte Aminosäure-Analyse (AAA), optische Drehung (OR), Infrarot- und Ultraviolett-Spektroskopie (IR, UV) bestätigt werden.

Regelmässig wirksam ist eine Verabreichung in einer Dosis von mehr als 5 mg pro Kilogramm Körpergewicht, insbesondere bei mehrfacher parenteraler Verabreichung.

Aufgrund ihrer molekularen Struktur weisen diese Substanzen eine sehr geringe Toxizität sowohl in akuten wie auch in chronischen Toxizitätsuntersuchungen auf. Die geringste letale Dosis (i.v.) in Ratten betrug 250 bis 350 mg pro Kilogramm Körpergewicht. Daher zeigen die getesteten Substanzen ein komfortables therapeutisches Verhältnis, das eine Voraussetzung für eine therapeutische Anwendung im Menschen darstellt.

Die Tripeptide bzw. Tripeptidderivate können für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die für die Verabreichung über verschiedene Wege geeignet sind, z.B. parenteral (intravenös, intramuskulär, subkutan), über den Atemwegstrakt (bukkal, sublingual, nasal, bronchial), den transdermalen Weg (perkutan) und die enterale Route (peroral). Im letzten Fall ist eine geeignete Dosierung notwendig, um den "first pass effect" zu überwinden.

Die erfindungsgemässen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten weiterhin einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, pharmazeutisch annehmbare Verdünnungsmittel oder Adjuvantien. Zur Formulierung können Standardtechniken verwendet werden, wie z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, 20. Ausgabe (Williams & Wilkins, PA, USA) offenbart.

Die Verabreichungsform wird in Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg gewählt und umfasst unter anderem Tabletten, Kapseln, Pulver und Lösungen.

Für die orale Verabreichung werden vorzugweise Tabletten und Kapseln verwendet, die ein geeignetes Bindemittel, z.B. Gelatine oder Polyvinylpyrrolidon, einen geeigneten Füllstoff, wie z.B. Lactose oder Stärke, ein geeignetes Gleitmittel, wie z.B. Magnesiumstearat, und wahlweise weitere Zusatzstoffe enthalten.

Eine besonders bevorzugte Formulierung für die orale Verabreichung ist eine beschichtete Tablette, enthaltend 100 oder 200 mg N,N-Diethyl-Ile-Ile-ProNH2, Siliciumdioxid, Magnesiumstearat, Macrogol 400/600, Hypromellose (E404), Titandioxid und Croscarmellose-Na.

Für die parenterale Verabreichung sind sterile wässrige Lösungen bevorzugt. Geeignete wässrige Lösungsmittel schliessen Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Hank-Lösung und Ringer-Lösung ein. Bevorzugt ist unter anderem eine physiologische Kochsalzlösung enthaltend 20 g/l des Tripeptids bzw. Tripeptidderivats, z.B. Glycyl-L-phenylalanyl-L-prolinamid.

Eine besonders bevorzugte Formulierung für die parenterale Verabreichung ist eine Ampulle zur Injektion, enthaltend 5 bis 10 ml einer Injektionslösung für die Infusion, umfassend 100 oder 200 mg lyophilisiertes Gly-Phe-ProNH2, Essigsäure, Natriumacetat und Wasser zur Injektion.

Die anti-neurodegenerative Wirkung der erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate ist überraschend, da Peptide regelmässig einer proteolytischen Spaltung durch Endo- oder Exopeptidasen und weiterer Metabolisierung unterliegen, so dass ein Erreichen der Blut-Hirn-Schranke und sogar deren Überwindung nicht erwartet werden konnte. Das Ausmass und die Geschwindigkeit einer solchen Spaltung wird durch die Halbwertszeit des Tripeptids bzw. Tripeptidderivats im Plasma angezeigt. Es ist bekannt, dass die Halbwertszeit von Tripeptiden, wie z.B. Thyroliberin, sehr kurz ist. Daher war es überraschend, dass die erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate unerwartet lange Halbwertszeiten (≥ 24 h) aufweisen. Diese lange Halbwertszeit ist eine weitere Voraussetzung für eine ausreichende antineurodegenerative Wirkung.

Zudem konnte an Hepatocyten experimentell gezeigt werden, dass die erfindungsgemässen Tripeptide bzw. Tripeptidderivate nicht in der Leber metabolisiert werden. Dieses Ergebnis wurde durch Analyse des Plasmas und der zugesetzten Hepatozyten bestätigt, in dem 4 Stunden nach Exposition nur das unveränderte Tripeptid gefunden wurde.

Die hervorragenden therapeutischen Eigenschaften der erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate werden im folgenden anhand eines besonders geeigneten Modells für die Alzheimer-Krankheit dargelegt. In diesem Modell konnte gezeigt werden, dass die Verabreichung der erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate nicht nur zu einer Erhöhung der Anzahl von Hippokampus-Neuronen führt, sondern auch zu einer Verbesserung der Lernfähigkeit der in den Tests verwendeten Ratten. Bevor diese Versuche im Detail beschrieben werden, wird jedoch zuvor die Bestimmung des Hirn-Blut-Verteilungskoeffizienten und eine ausgewählte Synthese des Tripeptidderivats beschrieben, das in den darauffolgenden Versuchsreihen verwendet wurde.

EXPERIMENTELLER ABSCHNITT: (1) Bestimmung des Hirn-Blut-Verteilungskoeffizienten:

Wie bereits oben dargelegt, stellt die Blut-Hirn-Schranke für wasserlösliche Stoffe in der Regel ein Hindernis dar, das die Anwendung vieler wasserlöslicher Stoffe für die Behandlung des ZNS bei herkömmlicher Verabreichung verhindert. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate diese Blut-Hirn-Schranke zu überwinden vermögen. Dieses Ausmass der Blut-Hirn-Verteilung der erfindungsgemäss verwendeten Tripeptide bzw. Tripeptidderivate kann wie folgt quantifiziert werden.

Als Technik zur Quantifizierung bestimmter physikochemischer oder pharmakologischer Eigenschaften chemischer Verbindungen hat sich die sogenannte QSAR (quantitative structure activity relationship)-Technik etabliert. Hierbei wird eine in der Regel lineare Korrelation zwischen einer bestimmten experimentellen Eigenschaft der Verbindungen (wie z.B. des Hirn-Blut-Verteilungskoeffizienten (HB)) mit berechneten strukturellen Parametern A, B, C usw. durch Anpassung der sogenannten Deskriptoren (X1, X2 usw.) gefunden, wobei die Gleichung prinzipiell die folgende Form aufweist:

Log HB = (X1 × A) + (X2 × B) + (X3 × C) + ... + Konstante.

Mit den so bestimmten Deskriptoren ist es dann möglich, die jeweilige experimentelle Eigenschaft, wie z.B. den Hirn-Blut-Verteilungskoeffizienten, von Verbindungen, für die diese experimentellen Daten nicht vorliegen, zu berechnen. Entsprechend wird erfindungsgemäss die Hirn-Blut-Verteilung wie folgt bestimmt.

Auf Grundlage von experimentellen Daten von 75 Verbindungen (siehe Luco, J.M., J. Chem. Inf. Comput. Sci. (1999), 39, 396–404) und bestimmten Parametern, wie im folgenden dargelegt, konnte eine lineare Korrelation zwischen berechneten und experimentellen Werten erhalten werden.

Die Verbindungen wurden hierbei unter Verwendung des Molecular Modelling-Programmpakets SYBYL konstruiert (Tripos Associates Inc., 1699 S. Henley Road, Suite 303, St. Louis, MO63144, USA). Um Konformationen niedriger Energie der Verbindungen eines ausgewählten Satzes (A-F-P, A-dF-P, A-F-dP, A-dF-dP) zu bestimmen, wurde eine Zufallssuche ausgeführt. Alle Torsionswinkel mit Ausnahme der der Peptidbindung wurden als flexibel betrachtet. Die Grundgerüstkonformationen der Strukturen mit der geringsten Energie wurden dann als Ausgangskonformation für alle Verbindungen verwendet.

Alle manuell konstruierten Verbindungen wurden unter Verwendung des Tripos-Kraftfeldes (siehe Clark, M., Kramer, III, R.D. und van Optenbosch, N. (1989), J. Comp. Chem. 10, 982–991) mit Gasteiger (PEOE)-Partialladungen (Gasteiger, J., Marsili, M. (1980; Tetrahedron 36, 3219–3238)) und einer distanzabhängigen dielektrischen Konstante von 4 energetisch minimiert.

Das Molecular Graphics-Programm MOE (Chemical Computing Group Inc., Montreal, Canada, http:\\www.chemcomp.com) ermöglicht dann die Berechnung von einem anwendbaren Satz von Deskriptoren, die nur von der Verknüpfung der Verbindungen und der Atomtypen (Typen im Sinne der Kraftfeldparameter) abhängen (siehe Labute auf der oben erwähnten home page). Die hier verwendeten Deskriptoren schliessen eine einfache Annäherung der van der Waals-Oberfläche der Verbindungen ein. Für die Testserie von 1947 organischen Verbindungen konnte eine hohe Korrelation (r2 = 0,9666) zwischen der exakten van der Waals-Oberfläche und der 2D-Annäherung erhalten werden. Der erste Satz der 14 Parameter (PEOE-VSA) zieht die Ladungsverteilung (PEOE) des Moleküls unter Verwendung gleichförmiger Intervallgrenzen in Betracht. Ein zweiter Satz von 10 Deskriptoren (SlogP-VSA) beschreibt das Log (P) der Verbindungen und ein dritter Satz von 8 Deskriptoren (SMR-VSA) hängt von der molekularen Polarisierbarkeit ab.

Die Werte für die oben beschriebenen 32 Deskriptoren wurden jeweils für die 75 Verbindungen berechnet (siehe Lucco, J.M., J. Chem. Inf. Comput. SCI. (1999), 39, 396–404), um eine Korrelation zu der experimentellen Hirnblutverteilung zu finden. Eine Regression der Hauptkomponenten wurde durchgeführt, um ein lineares Modell für Log (HB) als eine Funktion der Deskriptoren abzuschätzen. In einer ersten Berechnung ergab sich, dass 8 Deskriptoren aufgrund sehr geringen Beitrages vernachlässigt werden konnten. Nach dem zweiten Durchlauf ohne diese 8 Deskriptoren erschienen 9 Deskriptoren mit Beiträgen von weniger als 0,1. Letztendlich ergab sich auf Grundlage der Berechnungen von 70 Verbindungen (5 stark abweichende Verbindungen wurden weggelassen) unter Verwendung der verbleibenden 15 Deskriptoren eine relativ lineare Korrelation. Diese Korrelation ist grafisch in 1 gezeigt (in der Grafik verwendete Komponenten: 15; condition number 663.7658; root mean square error (RMSE): 0.20126; correlation coefficient (R2): 0.93240; crossvalidated R2: 0.88321).

Log(HB) ist wie folgt definiert: Log (HB) = Log (Konzentration im Gehirn)/(Konzentration im Blut)).

Die durch diese Korrelation erhaltenen Deskriptoren können dann für die Berechnung der Hirn-Blut-Verteilung von den erfindungsgemässen Tripeptiden bzw. Tripeptidderivaten verwendet werden.

Unter anderem wurden folgende Werte erhalten, die sich auf die im physiologischen pH-Bereich vorliegenden Formen beziehen:

A1:
aliphatische Aminosäuren einschliesslich Substitution an der Aminogruppe, gemäss Formel (I) Y1Y2N-CR2H-CO-
A2:
aromatische Aminosäuren einschliesslich Substitution am Phenylring, sowie aliphatische Aminosäuren, gemäss Formel (I) -NH-CHR1-CO-.
A3:
Prolin und Derivate D: rechtsdrehend

Aus diesen Berechnungen können die folgenden Schlüsse gezogen werden:

  • (a) Die Verwendung des Prolinamids, des Prolin(diethyl)amids oder des Prolinmethylesters anstelle der freien Säure des Prolins ist im Hinblick auf die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke vorteilhaft.
  • (b) Unter den verwendeten Bausteinen von A2 sind die aromatische Aminosäure F und deren Alkylderivate sowie Isoleucin vorteilhaft.
  • (c) Unter den verwendeten Bausteinen von A1 sind die aliphatischen Aminosäuren L und I sowie die Substitution der Aminogruppe von G und I durch 2 Ethylgruppen besonders vorteilhaft.
  • (d) Die optische Chiralität der Aminosäurebausteine spielt zumindest bei der passiven Überwindung der Blut-Hirn-Schranke offenbar keine Rolle.

(2) Gastrointestinale Absorption:

Die Absorption eines oral verabreichten Arzneimittels wird durch seine Fähigkeit bestimmt, die gastrointestinale Schranke zu überwinden. Das Parallel Artificial Membrane Permeation Assay-System (PAMPA) ist eine einfache und schnelle Methode zum Vorhersagen der gastrointestinalen Arzneistoffabsorption. Die Arzneistoffpermeation von biologischen Zellschichten wird hauptsächlich mit passiven Diffusionsprozessen in bezug gesetzt. Das PAMPA-Verfahren misst die Permeation von möglichen neuen Arzneimitteln durch eine künstliche Membran durch passive Diffusion, und erlaubt eine Klassifizierung in niedrige, mittlere und hohe Absorber.

Die Vorgehensweise gemäss dem Parallel Artificial Membrane Permeation-Assay, beschrieben von Kansy et al., wurde verwendet (M. Kansy, F. Senner, K. Gobernator, Physicochemical High Throughout Screening: Parallel Artificial Membrane Permeation Assay in the Description of Passive Absorption Processes, J. Med. Chem., 1998, 41(7), 1007–1010). Die künstliche Membran wurde durch Pipettieren einer Lösung von Lecithin in einem organischen Lösungsmittel auf ein Trägerfiltermaterial in Platten mit 96 Vertiefungen hergestellt. Für alle Testverbindungen wurden Stammlösungen von 5 mM in Ethanol hergestellt. Sie wurden dann in Tris-Puffer (0,05 M, pH 7,4) auf eine Endkonzentration von 500 &mgr;M verdünnt. Die Permeationsraten aller getesteten Verbindungen wurden 3-fach oder 4-fach gemessen. Die Diffusionszeit durch die künstliche Membran betrug 16 Stunden. Für alle Verbindungen wurden Referenzwerte ohne Phospholipidschicht einzeln bestimmt. Konzentrationen in den Akzeptorfächern wurden durch UV-Differenzspektroskopie unter Verwendung eines Mikrotiter-Plattenlesers Spectramax Plus384 von Molecular Devices gemessen. Für jede Verbindung wurde der &lgr;max-Wert in einem vorhergehenden Durchlauf bestimmt, und die Messungen wurden bei dieser Wellenlänge durchgeführt. Die Permeationsraten wurden als Flussraten ausgedrückt, die durch die folgende Formel berechnet werden: Fluss (%) = OD (Testvertiefung)/OD (Kontrollvertiefung) × 100. Als interne Standards wurden 3 Arzneistoffe mit bekannten Flussraten für geringe, mittlere und hohe Permeation in die Testplatte eingeführt: Bretylium, Hydrocortison und Kumarin. Nach dem Permeationsexperiment wurde die Unversehrtheit der Membran überprüft, um zu überprüfen, ob die Testverbindungen die künstliche Membran durch eine toxische oder unspezifische Wirkung verletzt haben und daher einen falschen positiven Wert ergaben. Lucifer Yellow, ein nicht-durchlässiger Farbstoff, wurde auf jede Vertiefung nach dem Experiment aufgetragen, und die Konzentration des Markers wurde in einem Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter gemessen. Vertiefungen, in denen die Konzentration von Lucifer Yellow 1 % der in den Kontrollvertiefungen detektierten Menge (ohne künstliche Membran) überstieg, wurden nicht berücksichtigt. In dem Experiment überstieg nur eine Vertiefung (mit der Referenzverbindung Bretylium) diese Grenze und wurde daher nicht berücksichtigt.

Tabelle 1 zeigt die Flussraten der 7 getesteten Verbindungen und der 3 Referenzverbindungen.

Die durch die 3 Referenzverbindungen bereitgestellte interne Kontrolle, deren Flussraten mehrfach von uns und anderen gemessen worden sind (siehe Kansy et al. oben), hat gezeigt, dass es keine Abnormalitäten gab und gute Bedingungen vorlagen, in denen das Experiment durchgeführt wurde. Bretylium, eine aktiv transportierte Verbindung, die eine geringe Bioverfügbarkeit in Menschen zeigt, zeigt eine Flussrate von 0 % in diesem Experiment. Die Flussraten für Hydrocortison und Kumarin, publiziert von Kansy et al. (siehe oben), betrugen 52 bzw. 66 %. Diese Daten stimmen gut mit den Ergebnissen überein, die wir in unserem Experiment erhalten haben (Tabelle 1).

Das PAMPA-Verfahren erlaubt eine Klassifizierung der Verbindungen in 3 Gruppen.

Geringe (Flussrate < 20 %), mittlere (20 % < Flussrate < 50 %) und hohe (Flussrate > 50 %) Permeatoren. Gemäss dieser Klassifizierung werden HCl-Gly-Phe-ProNH2 wie auch TRH und H-Gly-Phe-Pro-OH schwach absorbierende Verbindungen sein, und N,N-Diethyl-Ile-Ile-ProNH2, N-Isopropyl-Ile-Ile-ProNH2, N,N-Diethyl-Gly-Ile-ProNH2 und N,N-Diethyl-Ile-Phe-ProNHEt werden als mittlere bis hochabsorbierende Verbindungen nach peroraler Verabreichung vorhergesagt.

Aufgrund der in dieser Untersuchung erhaltenen Ergebnisse kann die folgende Abstufung der Testverbindungen bezüglich der Permeabilität der biologischen Membranen vorgenommen werden:

HCl-Gly-Phe-ProNH2, H-Gly-Phe-Phe-OH < TRH, N,N-Diethyl-Gly-Ile-ProNH2 < N-Isopropyl-Ile-Ile-ProNH2 < N,N-Diethyl-Ile-Ile-ProNH2 < N,N-Diethyl-Ile-Phe-ProNHEt

Eine Beschränkung des PAMPA-Permeationstestsystems, wie hier beschrieben, ist die Tatsache, dass es nur Verbindungen detektieren kann, die durch die transzelluläre Route transportiert werden. Eine Verbindung, die die parazelluläre oder aktive Route bevorzugt, kann geringe Flussraten ergeben, obwohl eine gute Absorption im Menschen nach peroraler Verabreichung vorliegt.

(3) Bestimmung der Bindekonstanten:

Auf Grundlage der Röntgenstruktur oder Modellen von Dimerfragmenten von TrkA, TrkB und TrkC wurden Bindestudien von mehreren Verbindungen der Formel (I) durchgeführt. Für alle Anordnungen der Liganden zwischen beiden Monomeren sollten ihre Affinitätskonstanten (pKd = pKi) mittels theoretischer Methoden berechnet werden (siehe R. Wang, L. Liu, L. Lai, Y. Tang, J. Mol. Model., 1998, 4, 379–394).

(a) Modellierung der Dimeranordnung der Rezeptoren:

Die Grundlage aller folgenden Untersuchungen ist die Röntgenstruktur (pdb = 1www) eines TrkA-Fragments, an das NGF bindet (siehe C. Wiesmann, M.H. Ultsch, S.H. Bass, A.M. De Vos, Nature 1999, 401, 184).

Wir nehmen an, dass die Liganden in ähnlicher Weise wie NGF an die zwei Monomere von TrkA, TrkB und TrkC binden können. Je höher die Affinität der Liganden, desto näher werden die beiden Monomere zusammengehalten, was als Hauptfunktion für die Aktivität in Betracht gezogen wird. Da NGF viel grösser ist als die Tripeptidderivate, sind Modelle gebildet worden, die die Bindung von relativ kleinen Molekülen erlauben. Für diesen Zweck wurden die Koordinaten von NGF aus der Röntgenstruktur entfernt und ein Monomer wurde manuell nahe an den van der Walls-Kontakt des anderen Monomers bewegt (unter Verwendung des Molecular Modelling-Pakets SYBYL (TRIPOS Associates Inc.). Um eine relevante Anordnung von beiden nicht-belegten Monomeren zusammenzufinden, wurde molekulare Dynamiksimulation (MD) unter Verwendung des AMBER-ALL-ATOM-Kraftfelds (siehe S.J. Weiner et al., J. Amer. Chem. Soc. 1984, 106, 765–784) bei 150 K über 20.000 fs durchgeführt. Die resultierende Struktur nach dieser Simulierung wurde durch einen Energiegradienten bei 0,1 kcal/mol Å2 optimiert. Diese Struktur wurde als Templat verwendet, um die Strukturen von TrkB und TrkC zu modellieren, wie auch für die Bindestudien.

Modelle für die Dimeranordnung von TrkB und TrkC wurden unter Verwendung des Homologie-Modellwerkzeugs COMPOSER (siehe T.L. Blundell, D. Carney, S. Gardner, F. Hayes, B. Howlin, T. Hubbard, Eur. J. Biochem. 1988, 172-513-20) von SYBYL und anschliessender MD- und Energieminimierung generiert. Die resultierenden Strukturen wurden bezüglich der Qualität unter Verwendung von PROCHECK (siehe R.A. Laskowski, M.W. MacArthur, D.S. Moss, J.M. Thornton, J. Appl. Cryst. 1993, 26, 283–291) überprüft.

(b) Bindestudien der Liganden:

Das Programm GOLD (siehe D.T. Jones, J. Mol. Biol., 1999, 292(2), 195–202; D.T. Jones, W.R. Taylor, J.M. Thornton, Nature 1992, 358, 86–89) wurde für das "automatische" Binden der Liganden verwendet. Um ein optimales Anbinden jedes Liganden an die drei Rezeptoren sicherzustellen, wurden zwei leicht unterschiedliche Bindungsstellen untersucht. Unter Verwendung von GOLD für jeden Durchlauf wurden 20 Strukturen (insgesamt 40) bestimmt. Da die Proteinstrukturen als fix erachtet werden, wurden alle 40 Anordnungen optimiert, wobei nur das Rückgrat des Rezeptors fix gehalten wurde.

(c) Bestimmung der Affinitätskonstanten:

Für alle Protein-Ligand-Komplexe wurden die Wechselwirkungsenergien der Liganden mit den Rezeptoren unter Verwendung des Tripos-Kraftfelds, den sogenannten Fitnesswerten, unter Verwendung von GOLD und dem Programm SCORE (siehe Wang et al., ibid) berechnet, um die pKd-Werte zu bestimmen, die den pKi-Werten im Fall von Enzyminhibitorkomplexen entsprechen (je höher der Fitness- oder pKd-Wert, desto höher ist die Affinität der Liganden). SCORE zieht nicht nur die Wechselwirkungsenergien in Betracht, sondern auch die Solvatisierungs-, Desolvatisierungs- und Entropiewirkungen in den Bindeanordnungen.

Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle zusammengefasst, die die besten pKd (pKi)-Werte für jeden Liganden an einen Rezeptor zeigt. Die Tabelle zeigt auch die Werte der Hirn-Blut-Verteilung, wie oben bestimmt.

Die höchste Affinität wurde für Et2-IFP-NH-Et [pKi-Wert von 7,29 (etwa 100 nM) bei Bindung an TrkA (durch SCORE)] vorhergesagt. Einige Wasserstoffbindungen können detektiert werden, aber am wichtigsten sind hydrophobe Wechselwirungen von beiden N-terminalen Ethylgruppen, wie auch von der Ile-Seitenkette mit drei Histidinresten und der Phenylalanin-Seitenkette mit phe327 des Rezeptors. Für alle restlichen Liganden ist die Affinität ungefähr eine Grössenordnung geringer.

(4) Synthese von HCl-H-Gly-L-Phe-L-Pro-NH2 Schritt 1: Boc-L-Phe-OH+H-L-Pro-NH2 → Boc-L-Phe-L-Pro-NH2

87,6 g Boc-L-Phe-OH wurden in einer Mischung aus 50 ml Dimethylformamid (DMF) und 300 ml 1,2-Dimethoxyethan (DME) gelöst und auf –15°C abgekühlt. Dann wurden 37 ml N-Methylmorpholin (NMM) (1 Äquivalent) auf einmal hinzugefügt und dann 45 ml Isobutylchloroformiat (IBCF)(1 Äquivalent) über einen Zeitraum von 10 Minuten hinzugetropft. Die Mischung wurde dann bei –15°C weitere 5 Minuten gerührt. 40 g TFA.H-L-Pro-NH2 (1,06 Äquivalente) wurden hierzu nach und nach über einen Zeitraum von 5 Minuten hinzugefügt, und anschliessend wurden 315 ml N,N-Diisopropyl-N-ethylamin (DIEA) (1 Äquivalent) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck umgesetzt. Dann wurde die Reaktionsmischung in einem Rotationsverdampfer, ausgestattet mit einer Wasserstrahlpumpe und einer Trockeneis/Aceton-Falle, auf konzentriert, und der Rest wurde in 1 l Ethylacetat aufgenommen. Anschliessend wurde zwölfmal mit jeweils 80 ml einer 1 N wässrigen KHSO4-Lösung, einmal mit 80 ml Kochsalzlösung, zehnmal mit jeweils 80 ml einer gesättigten wässrigen NaHCO3-Lösung, einmal mit einer 80 ml Kochsalzlösung in einem 2 Q-Trenntrichter gewaschen. Das anschliessende Trocknen erfolgte über 50 g Na2SO4. Nach Filtrieren durch einen Sinterglastrichter (grobe Porosität) wurde wiederum wie oben auf konzentriert. Dann wurde der Verdampfungsrest (ein trockener Schaum) in 1 l Hexan verrieben, und ein Feststoff wurde auf einem Sinterglastrichter (120 mm im Durchmesser × 120 mm, mittlere Porosität) aufgesammelt.

Das anschliessende Trocknen erfolgte in einem Exsikkator über einen Zeitraum von 12 Stunden bei Raumtemperatur und einem Druck von 0,1 bis 1 mmHg (Vakuumölpumpe, mit Trockeneis/Aceton-Falle). So wurden 92,8 g Boc-L-Phe-L-Pro-NH2 erhalten (Ausbeute: 77,8 %). Analysedaten: Molmasse (Massenspektrometrie): 317 g/mol Schmelzpunkt: 60°C (Zersetzung) Reinheit (HPLC): 95,2 % optische Rotation [Na/20°C]: –23,9 H2O [KF]: 1,84 % Schwermetalle: 25,4 ppm Lösungsmittel: 2,02 % Elementaranalyse: 64,0 % C 7,4 % H 11,4 % N 17,0 % O

Schritt 2: Boc-L-Phe-L-Pro-NH2 → TFA.H-L-Phe-L-Pro-NH2

Das in Schritt 1 erhaltene Boc-L-Phe-L-Pro-NH2 (180 g) wurde in einem 2 l-Rundhalskolben, ausgestattet mit einem magnetischen Rührer, in 250 ml Methylenchlorid gelöst bzw. suspendiert. Dann wurden 250 ml Trifluoressigsäure über eine Stunde mit der Lösung bei Raumtemperatur (15–25°C) und Atmosphärendruck umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde dann in 5 l tert-Butylmethylether (TBME) unter Rühren ausgefällt und das Präzipitat auf einem Sinterglastrichter aufgesammelt, und anschliessend wurde zweimal mit 1,5 l Diethylether und zweimal mit 1 l Hexan gewaschen. Das anschliessende Trocknen erfolgte wie in Schritt 1.

Schritt 3: Boc-Gly-OH+TFA.H-L-Phe-L-Pro-NH2 → Boc-Gly-L-Phe-L-Pro-NH2

44 g Boc-Gly-OH (1 Äquivalent) wurden in einer Mischung von 50 ml DMF und 300 ml DME gelöst und dann auf –15°C abgekühlt. Dann wurden 28 ml NMM (1 Äquivalent) in einem Schub hinzugefügt und dann 34 ml (1 Äquivalent) IBCF über einen Zeitraum von 10 Minuten hinzugetropft. Die Mischung wurde dann bei –15°C über weitere 5 Minuten gerührt.

94,5 g TF.A.H-L-Phe-L-Pro-NH2 (1,06 Äquivalente) wurden hierzu nach und nach über einen Zeitraum von 5 Minuten hinzugefügt, und anschliessend wurden 44 ml DIEA (1 Äquivalent) hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck umgesetzt. Dann wurde die Reaktionsmischung in einem Rotationsverdampfer, ausgestattet mit einer Wasserstrahlpumpe und einer Trockeneis/Aceton-Falle, aufkonzentriert, und der Rest wurde in 1,2 l Ethylacetat aufgenommen. Anschliessend wurde fünfmal mit jeweils 80 ml einer 1 N wässrigen KHSO4-Lösung, einmal mit 80 ml Kochsalzlösung, fünfmal mit jeweils 80 ml einer gesättigten wässrigen NaHCO3-Lösung, und einmal mit einer 80 ml Kochsalzlösung in einem 2 l-Trenntrichter gewaschen. Das anschliessende Trocknen erfolgte über 50 g Na2SO4. Nach Filtrieren durch einen Sinterglastrichter (grobe Porosität) wurde wiederum wie oben auf konzentriert. Dann wurde der Verdampfungsrest (ein trockener Schaum) in einer Mischung aus 1 l Diethylether und 2 l Hexan verrieben, und ein Feststoff wurde auf einem Sinterglastrichter (120 mm im Durchmesser × 120 mm, mittlere Porosität) aufgesammelt.

Das anschliessende Trocknen erfolgte in einem Exsikkator über einen Zeitraum von 12 Stunden bei Raumtemperatur und einem Druck von 0,1 bis 1 mmHG (Vakuumölpumpe, mit Trockeneis/Acetonfalle). So wurden 100 g Boc-Gly-L-Phe-L-Pro-NH2 erhalten (Ausbeute: 94,7 %). Analysedaten: Molmasse (Massenspektrometrie): 418 g/mol Schmelzpunkt: 66°C (Zersetzung) Reinheit (HPLC): 98,6 % optische Rotation [Na/20°C]: –27,9 H2O [KF]: 3,78 % Schwermetalle: 40,2 ppm Lösungsmittel: 1,8 % Elementaranalyse: 61,2 % C 7, 5 % H 12,8 % N 18,4 % O

Schritt 4: Boc-Gly-L-Phe-L-Pro-NH2 → HCL.H-Gly-L-Phe-L-Pro-NH2

Das im 3. Schritt erhaltene Boc-Gly-L-Phe-L-Pro-NH2 (149 g) wurde in 300 ml Methylenchlorid gelöst bzw. suspendiert und dann wurden 300 ml 4 N HCl/Dioxan hinzugefügt. Die Mischung wurde über eine Stunde bei Raumtemperatur (15–25°C) bei Atmosphärendruck in einem 2 l-Rundhalskolben mit magnetischem Rührer umgesetzt.

Anschliessend wurde 1 l Diethylether zu der Reaktionsmischung hinzugefügt und das Präzipitat mit einem Sinterglastrichter aufgesammelt. Das Präzipitat wurde dann zweimal mit 1,5 l Diethylether gewaschen und wie in Schritt 1 getrocknet. Analysedaten: Molmasse (Massenspektrometrie): 318 g/mol Schmelzpunkt: 93°C (Zersetzung) Reinheit (HPLC): 98,8 % optische Rotation [Na/20 °C]: –19,1 H2O [KF]: 2,79 % Schwermetalle: 15,9 ppm Lösungsmittel: 0,72 ‰ Elementaranalyse: 53,7 % C 6,4 % H 14,3 % N 14,9 % O

(b) Synthese von N,N-Diethyl-Ile-Phe-Pro-NH-Et:

N,N-Diethyl-Ile-Phe-Pro-NH-Et-Acetat wurde durch Festphasensynthese wie folgt hergestellt:

H-R:
H-Pro-(SASRIN)-N-Et (von Bachem AG, CH; auf Polystyrolbasis)
A:
20 % Piperidin in DMF
B:
DCCl/HOBt/DMF
C:
95 % TFA, hiernach Verdampfung
D:
RP-HPLC auf C18, System: 0,1 % TFA/Acetonitril
E:
Anionenaustauscher in Acetatform, Eluierung mit Wasser
Analysedaten: Erscheinung: gelbliches Produkt Löslichkeit: 1 mg/ml in 5 % Essigsäure (klare farblose Lösung) Aminosäureanalyse: Pro 1,00 (1) Phe 0,03 (1) Ile 0,01 (1) N,N-Diethyl-Ile kann nicht bestimmt werden; Ile-Phe-Bindung, unvollständige Hydrolyse ESI-MS: m = 458,5 u (durchschnittliche Masse) Reinheit (HPLC): > 95 % Wassergehalt: 3,9 %

(c) Synthese von N,N-Diethyl-Ile-Ile-Pro-NH-Et;

N,N-Diethyl-Ile-Ile-Pro-Nh-Et-Acetat-Salz wurde durch Festphasensynthese wie folgt hergestellt:

Fmoc-R
= Fmoc-Ramage-Harz (D-2200) Fmoc-Ile-Pro-PH (B-2135), Fmoc-Ile-OH (B-1340
A:
= 20 % Piperidin in DMF
B
= TBTU/DIPEA/DMF
C
= 95 % TFA, hiernach Ausfällung mit IPE
D
= RP-HPLC auf C18, System: 0,1 % TFA/Acetonitril
E
= Anionenaustauscher in Acetatform, Eluierung mit H2O
Analysedaten: Erscheinung: gelbliches Produkt Löslichkeit: 1 mg/ml in Wasser (klare farblose Lösung) Aminosäureanalyse: Pro 1,00 (1) Ile 0,03 (1) N,N-Diethyl-Ile kann nicht bestimmt werden; Ile-Ile-Binding, unvollständige Hydrolyse ESI-MS: m = 396,5 u (durchschnittliche Masse) Reinheit (HPLC): > 96 % Wassergehalt: 2,0 %

(5) Bestimmung der metabolischen Stabilität: Isolierung und Kultur von Ratten-Hepatozyten:

Hepatozyten aus erwachsenen männlichen Wistar-Ratten (OIFFA Credo, L'Arbresle, Frankreich) wurden durch eine in situ-Leberperfusion unter Verwendung von Kollagenase (erhalten von Sigma, St. Louis, MO, USA) gemäss dem von Seglen (Preparation of isolated rat liver cell, Methods Cell Biol. 13, 29–83, 1976) beschriebenen und von Williams et al. (Rat hepatocyte primary culture, III. Improved dissociation and attachment techniques and the enhancement of survival by culture medium, in vitro 13: 809–817, 1977) modifizierten Verfahren isoliert. Nach Abschätzung der Zellenlebensfähigkeit durch die periphere Renitenz von intakten Zellen im Phasenkontrastmikroskop und dem Tryptanblau-Test wurden frisch isolierte Hepatozyten in basalem Williams Medium E (WME), ergänzt mit 10 % (V/V) fötalem Kälberserum, 70 &mgr;M Kortisol, 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES-Puffer und 4 mM NaOH, gewaschen. Sie wurden dann in einer Dichte von 0,5 × 106 Zellen pro 50 mm Kunststoff-Zellkulturschalen in dem zuvor beschriebenen Medium für die Zellanhaftung 6 Stunden lang bei 37°C ausplattiert. Anschliessend wurden die Hepatozyten dreimal mit Serum und cholesterinfreiem Medium (SF-WME), enthaltend 4 g/l Rinderalbuminfraktion V (Sigma) als Transporter für 7,8 &mgr;M einer Mischung freier Fettsäuren (Cheesebeug M and Padieu P, expression of major liver metabolic function in long-term serum-free rat liver epithelial cell lines. In vitro 20: 780–795, 1984) gewaschen und dann in das SF-WME, ergänzt durch die verschiedenen Tripeptide der Formel (I), transferiert. Für jede Gruppe von Experimenten wurden Hepatozyten von 3 oder 4 Lebern verwendet.

Statistik:

Signifikanzen wurden unter Verwendung des Student t-Tests berechnet. Die Werte wurden als Durchschnitt ± Standardabweichung ausgedrückt.

Analyse der Tripeptide in Hepatozyten:

  • Verfahren: (Hepatozyten in Suspension)
  • Plasmaprobe: Ausfällung mit Trichloressigsäure
  • Zentrifugation und Aliquot des Überstandes an HPLC
  • Ionenaustauschsäule: Nucleosil C18 (250 × 4,6 mm)
  • Puffer TEAP 0,1 %/CH3CN, 1 ml/min
  • Auslesung bei 210 nm

  • Testbedingungen der Tripeptide
  • 20 &mgr;g/24 h/106 Zellen
  • 106 Zellen/ml
  • Verminderung der Substanz auf 10 &mgr;g/ml und 1,0 &mgr;g/ml

Jede Substanz in jeder Konzentration wird 10 mal während 24 Stunden analysiert (1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 16 h, 20 h, 24 h).

Ergebnisse:

Die folgenden Halbwertszeiten wurden erhalten:

(6) Tiermodelle: (a) Einleitung:

Es gibt keine Tiermodelle für die Alzheimer-Krankheit. Das transgene Mausmodell ist nur von beschränktem Nutzen, sofern es das Verhalten betrifft. wir stellen daher drei unterschiedliche Rattenmodelle vor. Jedes Modell reproduziert eine der physiopathologischen Merkmale der Krankheit: neurofibriläre Degeneration im Vincristin-Modell, Degeneration von Beta-Amyloid im Gp120-Modell und Apoptose im Dexamethason-Modell.

Vincristin ist ein Antikrebsmittel, das als Synchronisiermittel verwendet wird. Dieses Molekül bindet an die Spindel der Mikrotubuli, wodurch die zelluläre Vervielfachung während der Metaphase blockiert wird. Es ist ein Spindelgift. Die Neuronen vermehren sich nicht unter physiologischen Bedingungen, aber die Axone sind aus Neurofibrilen, deren Struktur der von Mikrotubuli in der Spindel ähnlich sind. Vincristin bindet an diese Neurofibrilen, wodurch sie periphere neurale Verhaltensstörungen in Patienten, bei denen Geschwulste behandelt werden, hervorrufen. Diese Wirkungen beeinträchtigen hauptsächlich die weisse Materie der Axone. Da Vincristin nicht die Blut-Hirn-Schranke durchdringt, muss es intracerebroventrikulär verabreicht werden. Die wiederholte ICV-Verabreichung von Vincristin bewirkt eine Degeneration der Fortführungswege mit dem Erscheinen von abnormalen Neurofilbrilen, die denen ähnlich sind, die bei der Alzheimer-Krankheit beobachtet werden. Diese Degeneration beeinträchtigt hauptsächlich die periventrikulären Strukturen. Die Hippokampi werden durch eine Verminderung in ihren Verzweigungen beeinträchtigt, während die Zellkörper der Neuronen sich nicht ändern. Wir zeigten auch, dass die wiederholte Verabreichung von Vincristin nur über einen kurzen Zeitraum (maximal 5 Tage) möglich ist. Nach diesem Zeitraum bildet sich eine Schutzschicht auf den Gliazellen, die die Diffusion von Vincristin von dem CSV zu den benachbarten Nervenzellen verhindert. Es gibt keine sich spontan entwickelnde Alzheimer-Krankheit in Ratten, die die verschiedenen Arten von degenerativen Läsionen (Beta-Amyloid-Plaques, neurofibriläre und vakuoläre Degeneration) zeigen würde. ICV-Verabreichung von Vincristin, die eine neurofibriläre Degeneration bewirken kann, kann als ein teilweises Tiermodell für diese Krankheit verwendet werden. Die Studien, die wir an Ratten in unserem Labor durchgeführt haben, zeigten eine Verminderung in der Hippokampusverzweigung. Nach der Verabreichung von Vincristin war die Lernfähigkeit der Tiere vermindert, während eine neurofibriläre Degeneration des Hippokampus beobachtet wird. Da es schwierig ist, diese Degeneration in einem Screening-Modell zu bewerten, sind die einzigen Bewertungsparameter die Lernfähigkeiten. Dieses Modell ist standardisiert und in unserem Labor validiert worden, um eine gute Reproduzierbarkeit zu erhalten.

Dexamethason ist ein Corticoid, das dem natürlichen Cortisol ähnlich ist. Stress bewirkt eine Freisetzung von Catecholamin und Cortisol (Corticosteron in Ratten). Wiederholter Stress – "chronischer Stress" – führt zu einer Herunterregulierung der Hippokampus-Rezeptoren an Glucocorticoide. Diese Studien, die zuerst in Ratten begannen, wurden in Menschen betätigt, wo eine spezifische Form der Depression (Golfkriegs-Syndrom) zuerst beobachtet wurde, dann eine irreversible Beeinträchtigung der kognitiven Fähigkeiten folgte. MRI-Studien an Menschen zeigten eine Degeneration der Hippokampusneuronen. Ein ähnliches Syndrom wurde bei Krankheiten beobachtet, die mit Hypercortizismus (Morbus Cushing) oder einer Langzeit-Corticoidbehandlung (Multiple Sklerose) verbunden waren. In Ratten bewirkt die wiederholte Verabreichung von Dexamethason zuerst eine Herunterregulierung der Typ II-Rezeptoren des Hippokampus, gefolgt von einer Degeneration der Neuronen in den CAII- und CAIII-Schichten. Die Lernfähigkeit der Tiere ist beeinträchtigt. Dieses Modell ist standardisiert und in unserem Labor validiert worden, um eine gute Reproduzierbarkeit zu erhalten.

Gp120 ist ein Oberflächen-Glycoprotein des HIV-Virus. Dieses Glycoprotein spielt eine fundamentale Rolle bei der Bindung des Virus und dem Übergang der viralen RNS in die Wirtszelle. Das isolierte Gp120 bindet auch an CD4-Rezeptoren und führt zu einer Läsion der Membranen unter Entstehung von Poren, durch die Calciumionen eindringen, die letztlich zur zellulären Apoptose führen. Auf der Oberfläche der Zellen bildet Gp120 eine Abscheidung glycierter Proteine, die den Beta-Amyloid-Abscheidungen recht ähnlich sind. Das HIV-Virus vermag nicht die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, jedoch die mit dem Virus befallenen Makrophagen. Im ZNS stirbt dann die Makrophage ab und lässt ihren Zellinhalt einschliesslich des Gp120 und anderer desaktivierter Viruspartikel frei. Das Gp120 bindet dann an das CD4 der Gliazellen und auch an Neuronen, was die im Endstadium von AIDS beobachteten komplexen Demenzen bewirkt. Die beobachteten Läsionen sind denen der Alzheimer-Krankheit ähnlich, zeigen aber eine andere Verteilung. In der Alzheimer-Krankheit werden die cholinergischen Strukturen des Kerns, der Basis und des lymbischen Systems zuerst verändert, während bei einer komplexen AIDS-Demenz die Verteilung der Plaques allgemein ist. Wir haben verschiedene Rattenuntersuchungen unter Verwendung dieses Gp120-Modells durchgeführt. Die Verabreichung in die cecerebrospinale Flüssigkeit bewirkt eine wichtige Verminderung der Hippokampusneuronen in Verbindung mit einer Verminderung im regionalen Glukoseverbrauch und einer Verminderung im Blutfluss. Die Degeneration wird in den CAII- und CAIII-Schichten des Hippokampus beobachtet, was eine Beeinträchtigung der Lernfähigkeiten induziert. Dieses Modell ist standardisiert und in unserem Labor validiert worden, wobei eine gute Reproduzierbarkeit erhalten wurde.

(b) Materialien und Methoden: Tiere:

70 männliche Wistar-Ratten (Charles River, Saint Aubin les Elbeuf, Franreich), jeweils mit einem durchschnittlichen Gewicht von 280 bis 300 g, wurden in diesem Tierexperiment verwendet. Über einen Zeitraum von 1 Woche wurden die Tiere in Ställen in einem Tierlabor gehalten, in denen die folgenden Parameter gesteuert wurden:

  • • Tag/Nacht-Rhythmus: 7:00 bis 19:00 Uhr
  • • Temperatur: 22 ± 1°C
  • • Hypometrie: 50 ± 10

Die Tiere bekamen Trinkwasser und ein Standardfutter UAR A03 ad libitum.

Vincristin-Modell:

Die Ratten wurden leicht mit Ether anästhetisiert, ein Einschnitt wurde in die Schädelhaut vorgenommen, und der Schädel wurde mittels eines Zahnbohrers durchbohrt. Eine Metallnadel wurde stereotaktisch zu dem lateralen Ventrikel geführt und dann mittels Zahnzement fixiert. An jedem Tag des Experiments wurde die Durchgängigkeit der Nadel kontrolliert.

3 Tage nach Einführen der Nadel (Erholung von dem postoperativen Schock) wurden den nicht-anästhetisierten Tieren 5 &mgr;l normale Kochsalzlösung mit Vincristin in einer Dosis von 5 &mgr;g/kg/Tag injiziert. (Die Laborexperimente zeigten, dass die Degeneration von der Vincristindosis abhing; die Dosis von 5 &mgr;g/kg/Tag bewirkte einen 40 bis 60 %-igen Verlust der Verzweigungen im Hippokampus.) Die Verabreichung wurde jeden Tag über einen Zeitraum von 5 Tagen wiederholt.

3 Tage nach der letzten Vincristin-Verabreichung wurden die Tiere mit Chloral (360 mg/kg) anästhetisiert und, ausgehend von der externen Carotidarterie, wurde ein permanenter Flusskatheter rückwärts in eine herkömmliche Carotidarterie eingeführt. Dieser Katheter wurde wiederum auf dem Schädel gelassen und mittels Zahnzement fixiert. Nach 2 Tagen hatten sich die Tiere von dem postoperativen Schock erholt. Die Modellvalidierungsexperimente zeigten, dass die Degeneration insbesondere wichtig war nach der ersten Vincristin-Verabreichung wie auch während der ersten Tage im Anschuss an die letzte Verabreichung. Der stationäre Zustand wurde am Tag 3 nach der letzten Verabreichung erreicht, und das Modell war über einen Zeitraum von mehreren Monaten stabil. Nach Ablauf dieses Zeitraums wurde eine zweite Art von Degeneration beobachtet, die die weisse Materie beeinträchtigt, die sicherlich von Apoptosephänomenen herrührt.

5 Tage nach der letzten Vincristin-Verabreichung wurden die 20 Ratten zufällig in zwei Gruppen von jeweils 10 Tieren eingeteilt:

  • • eine Gruppe von 10 Ratten, die über einen Zeitraum von 10 Tagen eine Intracarotidinjektion von 1 ml/kg/Tag normaler Kochsalzlösung erhielten (Kontrollgruppe)
  • • eine Gruppe von 10 Ratten, die über einen Zeitraum von 10 Tagen 20 mg/kg/Tag HCl-Gly-Phe-ProNH2, gelöst in normaler Kochsalzlösung, erhielten.

Die Injektionen wurden um 9 Uhr morgens verabreicht.

Während der letzten 5 Behandlungstage wurden die Ratten unter den herkömmlichen Lernbedingungen der drei Modelle zwischen 10 Uhr morgens und 11 Uhr morgens gehalten (siehe unten).

Dexamethasonmodell:

20 Ratten wurden 50 mg/kg/Tag Dexamethason über einen Zeitraum von 21 Tagen oral verabreicht. Am Tag 19 wurden die Tiere mit Chloral anästhetisiert (360 mg/kg), und ein Katheter wurde wie oben beschrieben in die Carotidarterie eingebracht. Am Tag 21 wurden die Tiere zufällig in zwei Gruppen unterteilt:

  • • eine Gruppe von 10 Ratten, die über einen Zeitraum von 10 Tagen eine Intracarotidinjektion von 1 ml/kg/Tag normaler Kochsalzlösung erhielten (Kontrollgruppe)
  • • eine Gruppe von 10 Ratten, die über einen Zeitraum von 10 Tagen 20 mg/kg/Tag HCl-Gly-Phe-ProNH2, gelöst in normaler Kochsalzlösung, erhielten.

Die Injektionen wurden um 9 Uhr morgens verabreicht.

Während der letzten 5 Behandlungstage wurden die Ratten unter den herkömmlichen Lernbedingungen der drei Modelle zwischen 10 Uhr morgens und 11 Uhr morgens gehalten (siehe unten).

Nach dem letzten Lernversuch um 11 Uhr morgens wurden die Ratten enthauptet, und die Hippokampuszellen wurden schnell entfernt und auf eine auf 0°C gekühlte Platte aufgetragen. Die Anzahl von Glucocorticoid-Rezeptoren wurde durch ein Bindungsverfahren unter Verwendung von gelabeltem Corticoid und einem spezifischen Inhibitor für die Bindung des Corticoids an den Rezeptor (hier ein Agonist) bestimmt. Der Proteingehalt wurde durch die Lowry-Methode gemessen.

Die Hippokampuszellen jeder Ratte wurden in 2 ml Natrium-EDTA-Glycerinmolybdat-Puffer homogenisiert. Das Homogenisat wurde bei 100.000 g 60 Minuten lang zentrifugiert. Ein Aliquot des Überstandes wurde in destilliertem Wasser verdünnt, und der Proteingehalt wurde nach der Lowry-Methode gemessen. Die Proteinkonzentration betrug zwischen 1,3 und 1,7 mg/ml.

Der Rest des Überstandes wurde in drei Teile von jeweils 0,2 ml eingeteilt. Steigende Konzentrationen (25, 50 und 50 nmol/ml) Dexamethason 3H (Amersham 50 Ci/mM) wurden zu diesen Teilen hinzugefügt. Drei andere Präparationen wurden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wobei eine sättigende Menge eines Total-Antagonisten der Rezeptoren (RU 28362) hinzugefügt wurde, um eine nicht-spezifische Bindung des gelabelten Dexamethasons zu erhalten.

Nach einer Nacht Inkubation bei 4°C wurde Holzkohle/Dextran zugefügt, um die Proteine und das gebundene Dexamethason zu absorbieren. Nach Zentrifugieren wurde die Radioaktivität des Überstandes durch Flüssigszintillation gemessen.

Die radioaktiven Mengen des an den Proteingehalt gebundenen Dexamethasons wurde aufgenommen. Die Ergebnisse werden in Femtomolen des an den Rezeptor gebundenen gelabelten Corticoids pro mg des Proteins ausgedrückt.

Gp120-Modell:

In diesem Experiment wurden 30 Ratten verwendet.

Tag 0. Die Tiere wurden leicht mit Ether anästhetisiert, ein Einschnitt wurde in die Schädelhaut vorgenommen, und der Schädel wurde mittels eines Zahnbohrers durchbohrt. Eine Metallnadel wurde dann stereotaktisch zu dem lateralen Ventrikel geführt und dann mittels Zahnzement fixiert. An jedem Tag des Experiments wurde die Durchgängigkeit der Nadel kontrolliert.

Tag 3. 3 Tage nach Einführen der Nadel (Erholung von dem postoperativen Schock) erhielten die Tiere eine intraventrikuläre Injektion von 10 nM/kg/Tag von Gp120 (gelöst in normaler Kochsalzlösung) in einem Volumen von 20 &mgr;l. Diese Verabreichung wurde täglich über einen Zeitraum von 5 Tagen wiederholt.

Tag 18. 10 Tage nach der letzten Verabreichung von Gp120 wurden die Ratten mit Chloral (360 mg/kg) anästhetisiert. Ein permanenter Flusskatheter wurde rückwärts in die herkömmliche Carotidarterie eingeführt. Dieser Katheter wurde wiederum auf dem Schädel belassen, wo er fixiert wurde.

Tag 21. 3 Tage später (Erholung vom postoperativen Schock) wurden die 30 Ratten in drei Gruppen von jeweils 10 Tieren zufällig unterteilt.

  • • die erste Gruppe von 10 Ratten, erhielt eine Intracarotidinjektion von 1 ml/kg/Tag in normaler Kochsalzlösung über einen Zeitraum von 10 Tagen
  • • die zweite Gruppe von 10 Ratten erhielt 10 mg/kg/Tag HCl-Gly-Phe-ProNH2, (gelöst in normaler Kochsalzlösung) über einen Zeitraum von 10 Tagen
  • • die dritte Gruppe erhielt 20 mg/kg/Tag HCl-Gly-Phe-ProNH2 unter den gleichen Bedingungen.

Die Injektionen wurden zwischen 9 Uhr und 9:30 Uhr morgens verabreicht.

Tag 26 bis 30. Die Tiere aller drei Gruppen wurden unter die herkömmlichen Lernbedingungen des gesamten Protokolls gebracht. Die Lernabschnitte fanden zwischen 10 Uhr und 11 Uhr morgens statt.

Tag 30. Nach dem letzten Lernversuch wurden die Ratten enthauptet, das Gehirn schnell entfernt und bei 80°C in flüssigem Stickstoff dampfgefroren. Hirnschnitte wurden durch einen Cryocut bei –20°C vorgenommen.

Die Schnitte wurden aufgetaut und mit Neutralrot gefärbt. Nach Fixierung wurde die Anzahl an Neuronen auf einer Hippokampusscheibe gemessen. Die Methode wird durch Zählen der Neuronen auf der gleichen Scheibe standardisiert. Ein Index der Anzahl von Neuronen im Vergleich zu einer Kontrollratte erlaubt eine zuverlässigere Quantifizierung als ein einfaches Zählen.

Lernverhalten:

Während der letzten 5 Tage der Behandlung wurden die Tiere um 10 Uhr morgens (1 Stunde nach der Verabreichung von HCl-Gly-Phe-ProNH2) in einen Lernkäfig zur Geräuschvermeidungskonditionierung (Conditioning avoidance response) eingebracht. Die Tiere lernten, auf eine Stange zu klettern, um vor einem elektrischen Schock zu fliehen, und dann um diesen zu vermeiden. Dieses Verfahren wurde standardisiert und in unserem Labor quantifiziert (siehe M. Le Poncin, J.C. Lafitte, J.R. Rapin, Sound Avoidance Conditioning and a Mathematical approach to the description of acquisition performance, Math. Biosciences 59 (1982) 242–268).

Über einen Zeitraum von 5 Tagen wurden die Tiere jeden Tag für insgesamt 10 Tests pro Tag unter diese Lernbedingungen gebracht. Die Ergebnisse werden ausgedrückt als Prozentsatz der richtigen Antworten, und die Kinetiken der Antworten werden durch eine multiexponentielle Maximalkurve dargestellt.

In allen Experimenten, die wir im Labor durchgeführt haben, zeigten alle Kontrolltiere eine Vermeidungsantwort am Tag 5 des Lernens (100 % richtige Antworten).

Das Kurvenmaximum stellt die Lernfähigkeit dar. Die Steigung der Kurve beschreibt die Lerngeschwindigkeit. Die Fläche unter der Kurve (AUC) stellt eine gute Bewertung aller Konditionierparameter dar. Der maximale Wert der Fläche unter der Kurve beträgt 500, wenn die Tiere 100 richtige Antworten ab Tag 0 zeigen. Tatsächlich wird eine durchschnittliche Fläche unter der Kurve pro Tag berechnet, was einen maximalen Wert von 100 ergibt. In den absoluten Kontrolltieren beträgt diese durchschnittliche Fläche unter der Kurve 40 ± 4.

In den oben erwähnten Experimenten waren die Kontrolltiere solche, die nur ein Reagens erhielten, das die Degeneration bewirkt. Unter diesen Bedingungen werden die optimalen Werte der Kontrolltiere bei weitem nicht erreicht.

Reagentien:

Alle verwendeten Reagentien waren Grade I-Reagentien und wurden von Aldrich (Saint Quentin Fallavier, Frankreich) bereitgestellt.

Dexamethason 3H wird von Amersham (England) bereitgestellt.

Der spezifische Agonist (RU 28362) wird von Russel bereitgestellt.

HCl-Gly-Phe-ProNH2 wurde wie oben synthetisiert verwendet.

Statistische Analyse:

Die Ergebnisse werden als Durchschnitt mit einer Standardabweichung (SEM) der erhaltenen Ergebnisse von 10 Ratten pro experimenteller Gruppe ausgedrückt.

Nach der ANOVA-Varianzanalyse werden signifikante Ergebnisse mit dem Student-Test erhalten.

Die Variabilität wird als eine Funktion der kleinsten Quadrate für jeden Versuchstag berechnet. Die Signifikanz wird durch einen t-Test bestimmt.

(d) Ergebnisse: (1) Vincristin-Modell:

Geräuschvermeidungskonditionierung durch das Stangenklettern-Testverfahren:

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt. Für jeden Lerntag entsprechen die angegebenen Werte in der Tabelle dem Prozentsatz der Vermeidung. Die Ratte vermeidet die elektrische Entladung durch das Klettern auf die Stange. Am ersten Tag wird in keiner der Tiergruppen eine Vermeidung beobachtet. Die Lerngeschwindigkeit und das Lernvermögen sind bei den Ratten stark vermindert, die Vincristin durch ICV-Injektion erhalten haben. Die Intrakarotid-Injektionsbehandlung mit HCl-Gly-Phe-ProNH2 stellt teilweise die Lernparameter wieder her. Dieses signifikante Ergebnis wird für die Flächen unter der Kurve und am Tag 2, 3 und 4 beobachtet.

Tabelle I: Wirkung von HCl-Gly-Phe-ProNH2 (20 mg/kg/Tag über einen Zeitraum von 10 Tagen) auf die Lernfähigkeiten von Ratten, die zuvor mit Vincristin (5 &mgr;g/kg/Tag als ICV-Injektion über einen Zeitraum von 5 Tagen) behandelt wurden. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der richtigen Antworten ausgedrückt.
  • n = 10 pro Zeitpunkt, m ± SEM, ** p > 0,01, Vergleich zwischen Kontrolle und HCl-Gly-Phe-ProNH2-behandelten Tieren

(2) Dexamethason-Modell: Geräuschkonditionierung:

Die Ergebnisse sind unten in Tabelle II dargestellt. Oral verabreichtes Dexamethason führt zu einer signifikanten Beeinträchtigung der Lernfähigkeiten. HCl-Gly-Phe-ProNH2 stellt die Lernfähigkeiten schon vom zweiten Tag an teilweise wieder her. Intravenös verabreichtes HCl-Gly-Phe-ProNH2 stellt die Durchschnittsfläche unter der Kurve signifikant wieder her.

Tabelle II: Wirkung von HCl-Gly-Phe-ProNH2 in eine Dosis von 20 mg/kg/Tag über einen Zeitraum von 10 Tagen auf die Lernfähigkeiten, die durch eine Vorbehandlung mit oral verabreichtem Dexamethason beeinträchtigt wurden. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz richtiger Antworten ausgedrückt.
  • n = 10 pro Gruppe pro Zeitpunkt, m ± SEM, * p < 0,05 ** p < 0,01, Vergleich zwischen Kontrolle und HCl-Gly-Phe-ProNH2-behandelten Tieren

Bestimmung der Corticoid-Rezeptoren:

Die Ergebnisse sind in Tabelle III dargestellt.

Tabelle III: Bestimmung der Typ II-Glucocorticoid-Rezeptoren in dem Hippokampus von Ratten, die mit Dexamethason vorbehandelt wurden. Die Ergebnisse werden in Femtomol/mg Proteinen ausgedrückt.
  • n = 10, m ± SEM, ** p < 0,01, Vergleich zwischen Kontrolle und HCl-Gly-Phe-ProNH2-behandelten Tieren

Die wiederholte Verabreichung von HCl-Gly-Phe-ProNH2 vermindert die Herunterregulierung der Glucocorticoid-Rezeptoren im Hippokampus.

(3) Gp120-Modell: Geräuschkonditionierung:

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV dargestellt. Die intracerebroventrikuläre Verabreichung von Gp120 führt zu einer Beeinträchtigung der Lernparameter.

Injiziertes HCl-Gly-Phe-ProNH2 stellt die Fähigkeiten des Tieres in Abhängigkeit von der Dosis wieder her. Die wiederholte Verabreichung von 20 mg/kg ist wirksamer als die Verabreichung von 10 mg/kg. Dieser Unterschied wird sowohl quantitativ als auch im Lerngeschwindigkeitsparameter beobachtet.

Tabelle IV: Wirkung von HCl-Gly-Phe-ProNH2 auf die Lernparameter der mit Gp120 als intracerebroventrikuläre Injektion behandelten Ratte. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz richtiger Antworten ausgedrückt.
  • n = 10, m ± SEM, * p < 0,05 ** p < 0,01, Vergleich zwischen Kontrolle und behandelten Tieren

Neuronenzählung:

Die Neuronen wurden in den CAIII-Schichten des Hippokampus gezählt. Die Anzahl von Neuronen in einem Feld, die theoretisch immer identisch ist, wird zu einem theoretischen Wert in bezug gesetzt, der in den Kontrolltieren beobachtet wurde. Per Definition ist der in den Kontrolltieren gefundene Wert 100 mit einer maximalen Variation von 5 %. Tabelle V zeigt die Ergebnisse dieser Neuronenzählung.

Tabelle V: Zählung der Hippokampusneuronen nach IVC-Verabreichung von Gp120. Wirkung der wiederholten Injektion von HCl-Gly-Phe-ProNH2 in Dosen von 10 und 20 mg/kg.
  • n = 10, m ± SEM, ** p < 0,01, Vergleich zwischen Kontrolle und behandelten Tieren

Nur die Verabreichung von 20 mg/kg HCl-Gly-Phe-ProNH2 führt zu einer signifikanten Erhöhung der Neuronenanzahl.

(d) Diskussion – Schlussfolgerung:

Die wiederholte IVC-Verabreichung von Vincristin bewirkt eine Degeneration der Verzweigung der Hippokampusneuronen: sie ist tatsächlich eine neurofibrilläre Degeneration. Diese Degeneration ist umfassender und sie beeinträchtigt sogar die periventrikulären Neuronen, zu denen das Vincristin diffundiert. Daher sind diese Erkenntnisse ähnlich zu solchen, die in von der Alzheimer-Krankheit beeinträchtigten Hirnen beobachtet werden. Der Unterschied betrifft die Lokalisierung der neurofibrillären Degeneration und der beeinträchtigten Strukturen.

Die Hippokampusstrukturen sind für uns von besonderem Interesse, weil ihre Zerstörung zu einer verminderten Lernleistung führt. Dies ist in diesem Modell der Fall, in dem die Ratten, die Vincristin erhalten, nicht mehr lernen können, wie der elektrische Schock durch Klettern auf die Stange vermieden wird. Es betrifft gleichermassen die anderen Modele, selbst wenn die Degeneration von einer anderen Art ist.

Im Fall von Dexamethason findet eine Herunterregulierung der Rezeptoren, die dem Phänomen der Apoptose vorhergeht, statt. Bislang gibt es keine Degeneration.

Im Gegensatz hierzu gibt es eine Degeneration mit Gp120, aber diese ist noch nicht vollständig.

In allen drei Fällen haben wir die Modelle zum Erhalt einer Rückgewinnung standardisiert. Wenn z.B. die Dosis von Gp120 verdoppelt wird, oder wenn die Dosis beibehalten aber die Behandlungsdauer verdoppelt wird, gibt es eine fast vollständige Degeneration. Die Lernparameter sind fast Null, und die Neuronenanzahl ist sehr gering.

Weiterhin halten bestimmte Neuronen nicht mehr Farbstoff zurück, selbst wenn sie noch funktionell sind. Letztlich ist es noch möglich, die Degeneration zu stoppen, wenn die Behandlung während der progressiven Phase begonnen wird. Die Ergebnisse, die wir beobachteten, entsprechen keinem Wiederwachstum von Neuronen, sondern einem verminderten neuronalen Verlust.

Die direkte Verabreichung von HCl-Gly-Phe-ProNH2 verbessert also die Lernfähigkeit signifikant, selbst wenn sie nach ICV-Verabreichung von Vincristin oder Gp120 oder nach oraler Behandlung mit Dexamethason beeinträchtigt werden. Gleichzeitig wird die neuronale Funktionalität des Hippokampus verbessert.


Anspruch[de]
Verwendung von Verbindungen der folgenden Formel (I):
wobei

X NH2, NH-C1-3-Alkyl, N(C1-3-Alkyl)2 darstellt;

R1 ein Rest ist, der sich von der Aminosäure Phe ableitet, die wahlweise. mit einer oder mehreren (C1-5)-Alkoxygruppen, (C1-5)-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert sein kann, oder ein Rest ist, der sich von Ile ableitet;

R2 ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Gly oder Ile ableitet;

Y1 und Y2 unabhängig voneinander H oder (C1-3)-Alkyl darstellen;

R3 und R4 H darstellten; und

R5 H darstellt;

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon;

zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die neurodegenerative Krankheit die Alzheimer-Krankheit ist. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die neurodegenerative Krankheit MCI (mild cognitive impairment) ist. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindung der Formel (I) Glycyl-L-phenylalanyl-L-prolinamid, N,N-Diethyl-isoleucyl-phenylalanyl-L-prolinethylamid, N,N-Diethyl-isoleucyl-isoleucyl-prolinamid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon ist. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Verbindungen der folgenden Formel (I):
wobei

X NH2, NH-C1-5-Alkyl, N(C1-5-Alkyl)2 darstellt;

R1 ein Rest ist, der sich von der Aminosäure Phe ableitet, die wahlweise mit einer oder mehreren (C1-5)-Alkoxygruppen, (C1-5)-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert sein kann;

R2 ein Rest ist, der sich von einer der Aminosäuren Gly oder Ile ableitet;

Y1 und Y2 H darstellen;

R3 und R4 H darstellen; und

R5 H darstellt; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon; und pharmazeutisch annehmbare Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei R2 ein Rest ist, der sich von der Aminosäure Gly ableitet. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Verbindung der Formel (I) Glycyl-L-phenylalanyl-L-prolinamid, N,N-Diethyl-isoleucyl-phenylalanyl-L-prolinethylamid, N,N-Diethyl-isoleucyl-isoleucyl-prolinamid oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon ist. Verbindung der Formel (I), wie in Anspruch 5 definiert, zur Verwendung als Arzneimittel.






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