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Dokumentenidentifikation DE69736972T2 20.09.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000849359
Titel Raffinose-Synthetase-Gene und deren Verwendung
Anmelder Sumitomo Chemical Co., Ltd., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder Wantanabe, Eijiro, Takarazuka-shi, Hyogo-ken, JP;
Oeda, Kenji, Sakyo-ku, Kyoto-shi, JP
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69736972
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 18.12.1997
EP-Aktenzeichen 971224175
EP-Offenlegungsdatum 24.06.1998
EP date of grant 22.11.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 20.09.2007
IPC-Hauptklasse C12N 9/10(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 15/54(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Oligosaccharide aus der Raffinose-Familie sind Derivate der Saccharose, die durch o-&agr;-D-Galactopyranosyl-(1→6)n-o-&agr;-D-Glucopyranosyl-(1→2)-&bgr;-D-Fluctofuranosid als die allgemeine chemische Formel dargestellt werden, und sie werden als „Raffinose" bezeichnet, wenn n = 1, als „Stachyose", wenn n = 2, als „Verbascose", wenn n = 3 und als „Ajugose", wenn n = 4 ist.

Die höchsten Gehalte an solchen Oligosacchariden aus der Raffinose-Familie werden mit Ausnahme von Saccharose in Pflanzen gefunden, und es ist bekannt, dass sie nicht nur in höheren Pflanzen, einschließlich der Nacktsamer (Gymnospermae) wie etwa der Nadelbäume (z.B. Fichte) und der Bedecktsamer (Angiospermae) wie etwa der Hülsenfrüchte (Leguminosae) (z.B. Sojabohne oder grüne Bohne), der Kreuzblütler (Brassicaceae) (z.B. Raps), der Gänsefußgewächse (Chenopodiaceae) (z.B. Zuckerrübe), der Malven (Malvaceae) (z.B. Baumwolle) und der Weidengewächse (Salicaceae) (z.B. Pappel) enthalten sind, sondern auch in der Grünalge Chlorella. Daher kommen sie, ähnlich wie Saccharose, im Pflanzenreich weit verbreitet vor.

Oligosaccharide aus der Raffinose-Familie spielen bei vielen Pflanzen eine Rolle als Reservezucker in Speicherorganen oder Samen oder bei einigen Pflanzen als Translokatorzucker bei dem Phänomen des Zuckertransportes zwischen Geweben.

Darüber hinaus ist bekannt, dass Oligosaccharide aus der Raffinose-Familie einen Einfluss auf die Herstellung guter Bedingungen für enterobakterielle Flora haben, wenn sie in einer geeigneten Menge in der Nahrung vorhanden sind. Daher sind Oligosaccharide aus der Raffinose-Familie bereits als ein funktioneller Nahrungsmaterial-Zusatz für einige Nahrungsmittel verwendet und im Bereich von spezieller gesunder Nahrung eingesetzt worden.

Oligosaccharide aus der Raffinose-Familie, die eine solche Bedeutung und Nützlichkeit haben, werden durch das Raffinose-Oligosaccharid-Synthesesystem hergestellt, das in vielen Pflanzen mit Saccharose beginnt. Dieses Biosynthesesystem umschließt gewöhnlich eine Reaktion zur sequenziellen Addition von Galactosylgruppen aus Galactotinol durch eine &agr;(1→6)-Bindung an eine Hydroxyl-Gruppe, die an das Kohlenstoffatom an Position 6 eines D-Glucose-Restes in einem Saccharose-Molekül gebunden ist.

Im ersten Schritt dieses Biosynthesesystems ist Raffionse-Synthetase ein Enzym, das an der Reaktion der Raffinose-Produktion beteiligt ist, indem es eine D-Galactosylgruppe von Galactotinol durch eine &agr;(1→6)-Bindung mit einer Hydroxyl-Gruppe, die an das Kohlenstoffatom an Position 6 eines D-Glucose-Restes in einem Saccharose-Molekül gebunden ist, verbindet. Es ist vorgeschlagen worden, dass dieses Enzym einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in dem vorstehenden Synthesesystem darstellt, und es hat sich herausgestellt, dass dieses Enzym für die Kontrolle der Biosynthese der Oligosaccharide aus der Raffinose-Familie ziemlich wichtig ist.

Die Kontrolle des Expressionsspiegels oder der Aktivität der Raffinosesynthetase in Pflanzen ermöglicht es, den Gehalt an Oligosacchariden aus der Raffinose-Familie in diesen Pflanzen zu ändern. Raffinose-Synthethase ist jedoch bisher noch nicht erfolgreich als ein homogenes Protein isoliert und gereinigt worden, obwohl die Anwesenheit dieses Enzyms selbst schon in vielen Pflanzen durch die Messung seiner Aktivität mit einer biochemischen Technik bestätigt wurde. In Castillo E. et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, Bd. 38, Nr. 2, S. 351-5, berichten die Autoren von einer zweifachen Reinigung der Raffinosesynthetase aus Sojabohnen. Zusätzlich ist die Aminosäuresequenz dieses Enzyms immer noch unbekannt, und es gibt keinen Bericht über den Beginn eines Versuches, ein Gen, welches dieses Enzym codiert, zu isolieren.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

1 zeigt die Konstruktion von Plasmiden, die zur Expression eines Raffinosesynthetase-Gens in Escherichia coli verwendet wurden. pBluescriptKS-RS ist ein Plasmid, das das hinein clonierte Raffinosesynthetase-Gen enthält. RS stellt das Raffinosesynthetase-Gen dar, und die Nucleotidsequenzen, die im oberen Teil dieser Abbildung dargestellt sind, sind jene der beiden terminalen Abschnitte des Raffinosesynthetase-Gens. Eine Teilsequenz, die durch kleine Buchstaben dargestellt ist, ist eine Nucleotidsequenz, die aus dem Vektor pBluescript II KS-stammt. Die beiden umrahmten Nucleotidsequenzen sind das Startcodon (ATG) beziehungsweise das Terminationscodon (TGATAA) des Raffinosesynthetase-Gens. Die Erkennungsstellen für mehrere Restriktionsendonucleasen werden oberhalb der Nucleotidsequenzen angezeigt. pGEX-RS und pTrc-RS sind Plasmide, die für die Expression des Raffinosesynthetase-Gens in E. coli verwendet wurden. Ptac, Ptrc, GST, lacIq und rrnB stellen tac-Promotor, trc-Promotor, Glutathion-S-Transferase-Gen, Lactose-Repressor-Gen beziehungsweise Terminationssignal für die Transkription von ribosomaler RNA dar.

2 zeigt die Konstruktion von Expressionsvektoren, die zur Expression von chimären Genen in Pflanzen verwendet wurden; jeder verfügt über ein Raffinosesynthetase-Gen und einen Promotor, der damit verbunden ist. Die Karte der Restriktionsendonucleasen des in das Plasmid pBluescriptKS-RS clonierten Raffinosesynthetase-Gens wird im unteren Teil dieser Abbildung dargestellt. pBI221RS und pBI221(–)RS bezeichnen die Karten der Restriktionsendonucleasen von Expressionsvektoren, die für die Transformation von Sojabohnen verwendet wurden. 35S und NOS stellen den 35S-Promotor dar, der vom Blumenkohl-Mosaikvirus beziehungsweise dem Terminator des Nopalinsynthetase-Gens stammt.

3 zeigt die Konstruktion von Expressionsvektoren, die zur Expression von chimären Genen in Pflanzen verwendet wurden; jeder verfügt über ein Raffinosesynthetase-Gen und einen Promotor, der damit verbunden ist. Die Karte der Restriktionsendonukleasen des in das Plasmid pBluescriptKS-RS clonierten Raffinosesynthetase-Gens wird im oberen Teil dieser Abbildung dargestellt. pBI121RS und pBI121(–)RS kennzeichnen die Karten der Restriktionsendonucleasen von binären Vektoren, die für die Transformation von Senf verwendet wurden. Für den binären Vektor wird nur eine Region zwischen dem rechten Rand und dem linken Rand dargestellt. 35S, NOS und NPT stellen den 35S-Promotor dar, der vom Blumenkohl-Mosaikvirus, dem Terminator des Nopalinsynthetase-Gens beziehungsweise dem Gen für Kanamycinresistenz stammt.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die nachstehend beschriebenen gentechnischen Verfahren können im Einklang mit den herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden, z.B. wie in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6; „Current Protocols In Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBN 0-471-50338-X; und "Current Protocols in Protein Science" (1995), John Wiley & Sons, Inc. ISBN 0-471-11184-8 beschrieben.

Der hierin verwendete Ausdruck "Raffinosesynthetase-Gen" betrifft ein Gen mit einer Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz eines Proteins codiert, welches in der Lage ist, Raffinose herzustellen, indem es eine D-Galactosylgruppe durch eine &agr;(1→6)-Bindung mit einer Hydroxylgruppe verbindet, die an das Kohlenstoffatom an Position 6 eines D-Glucose-Restes in einem Saccharose-Molekül gebunden ist (nachstehend hierin einfach als das vorliegende Gen bezeichnet), und ein solches Gen kann zum Beispiel aus Pflanzen gewonnen werden.

Genauer kann das vorliegende Gen aus zweikeimblättrigen Pflanzen (Dicotyledonae) wie etwa Hülsenfrüchten (Leguminosae) (z.B. Dicke Bohne, Sojabohne) und Lippenblütlern (Laminaceae) (z.B. Japanische Artischoke) oder von einkeimblättrigen Pflanzen (Monocotyledonae) wie etwa Gräsern (Gramineae) (z.B. Mais) gewonnen werden. Spezifische Beispiele für das vorliegende Gen sind ein „Raffinosesynthetase-Gen mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 codiert; ein „Raffinosesynthetase-Gen mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz codiert, die sich durch Deletion, Substitution, Modifikation oder Addition von einer Aminosäure in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 ergibt und in der Lage ist, Raffinose herzustellen, indem es eine D-Galactosylgruppe durch eine &agr;(1→6)-Bindung mit einer Hydroxylgruppe verknüpft, die an das Kohlenstoffatom an Position 6 eines D-Glucose-Restes in einem Saccharose-Molekül gebunden ist"; ein „Raffinosesynthetase-Gen mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 3 codiert; ein „Raffinosesynthetase-Gen mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz codiert, die sich durch Deletion, Substitution, Modifikation oder Addition von einer Aminosäure in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 3 ergibt und in der Lage ist, Raffinose herzustellen, indem es eine D-Galactosylgruppe durch eine &agr;(1→6)-Bindung mit einer Hydroxylgruppe verknüpft, die an das Kohlenstoffatom an Position 6 eines D-Glucose-Restes in einem Saccharose-Molekül gebunden ist"; ein „Raffinosesynthetase-Gen mit einer Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5 codiert" und ein „Raffinosesynthetase-Gen mit einer Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 7 codiert".

Darüber hinaus werden Nucleinsäuremoleküle mit einer Länge von mindestens 15 Nucleotiden genannt, welche spezifisch mit einem Nucleinsäuremolekül, da wie vorstehend beschrieben, oder mit einem komplementären Strang davon hybridisieren. Spezifische Hybridisierung tritt bevorzugt unter stringenten Bedingungen auf und setzt keine oder sehr geringe Kreuzhybridisierung mit Nucleotidsequenzen voraus, die keine oder wesentlich andere (Oligo-)Peptide codieren. Solche Nucleinsäuremoleküle können als Sonden und/oder zur Kontrolle der Genexpression verwendet werden. Die Technik der Nucleinsäure-Sonden ist Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt; sie werden sofort erkennen, dass solche Sonden in der Länge variieren können. Bevorzugt sind Nucleinsäure-Sonden mit einer Länge von 17 bis 50, besonders bevorzugt von 21 bis 50 Nucleotiden. Natürlich kann es auch angebracht sein, Nucleinsäuren mit einer Länge von bis zu 100 oder mehr Nucleotiden zu verwenden. Die Nucleinsäure-Sonden sind für zahlreiche Anwendungen von Nutzen. Einerseits können sie als PCR-Primer für die Amplifizierung von regulatorischen Sequenzen verwendet werden. Eine andere Anwendung ist die Verwendung als eine Hybridisierungssonde, um Nucleinsäuremoleküle, die mit einem Nucleinsäuremolekül der Erfindung hybridisieren, mit Hilfe der Durchmusterung von genomischen DNA-Bibliotheken auf Homologien zu identifizieren. Nucleinsäuremoleküle, die, wie vorstehend beschrieben, komplementär zu einem Nucleinsäuremolekül sind, können auch zur Repression der Expression eines Gens, welches solche regulatorischen Sequenzen umfasst, zum Beispiel auf Grund eines Antisense- oder Triple-Helix-Effektes, oder für die Konstruktion von geeigneten Ribosomen verwendet werden (vgl. z.B. EP-B1 0 291 533, EP-A1 0 321 201, EP-A2 0 360 257), die spezifisch die (prä)-mRNA eines Gens, das ein Nucleinsäuremolekül der Erfindung umfasst, abspalten. Die Selektion von geeigneten Zielstellen und zugehörigen Ribozymen kann durchgeführt werden, wie zum Beispiel von Steinecke, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al., Hrsg. Academic Press, Inc. (1995), 449-460 beschrieben wurde. Darüber hinaus wird Fachleuten gegenwärtig sein, dass es auch möglich ist, eine solche Nucleinsäure-Sonde mit einer geeigneten Markierung für spezifische Anwendungen zu kennzeichnen, wie etwa für den Nachweis des Vorkommens eines Nucleinsäuremoleküls der Erfindung in einer Probe, die von einem Organismus stammt.

Die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle können entweder DNA oder RNA oder ein Hybrid davon sein. Darüber hinaus kann das Nucleinsäuremolekül zum Beispiel Thioester-Bindungen und/oder Nucleotid-Analoga enthalten, die allgemein in Oligonucleotid-Antisense-Ansätzen verwendet werden. Die genannten Modifikationen können bei der Stabilisierung des Nucleinsäuremoleküls gegenüber Endo- und/oder Exonukleasen in der Zelle hilfreich sein. Die Nucleinsäuremoleküle können durch einen geeigneten Vektor, der ein chimäres Gen enthält, welches die Transkription des genannten Nucleinsäuremoleküls in der Zelle gestattet, transkribiert werden. Solche Nucleinsäuremoleküle können darüber hinaus Ribozym-Sequenzen enthalten, die spezifisch die (prä)RNA, die das Nucleinsäuremolekül der Erfindung umfasst, spalten. Darüber hinaus können Oligonucleotide entworfen werden, die komplementär zu einem Nucleinsäuremolekül der Erfindung sind (Triple-Helix; vgl. Lee, Nucl. Acids Res. 6 (1979), 3073; Cooney, Science 241 (1988), 456 und Dervan, Science 251 (1991), 1360), wodurch Transkription und die Produktion des codierten Oligopeptids verhindert werden.

Das vorliegende Gen kann zum Beispiel durch das nachstehende Verfahren gewonnen werden.

Die Gewebe einer Hülsenfrucht (Leguminosae) wie etwa der Dicken Bohne (Vicia faba) oder der Sojabohne (Glycine max) werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und mit einem Mörser oder anderen Mitteln in feinpulverisierte Gewebebruchstücke zermahlen. Aus diesen Gewebebruchstücken wird RNA mit einem gebräuchlichen Verfahren extrahiert. Käuflich zu erwerbende RNA-Extraktionskits können zur Extraktion benutzt werden. Die gesamte RNA wird durch Ethanolfällung aus dem RNA-Extrakt abgetrennt. Aus der gesamten abgetrennten RNA wird RNA mit poly-A-Enden durch ein herkömmliches Verfahren fraktioniert. Käuflich zu erwerbende Oligo-dT-Säulen können für die Fraktionierung benutzt werden. cDNA wird aus der erhaltenen Fraktion (d.h. RNA mit poly-A-Enden) mit einem herkömmlichen Verfahren synthetisiert. Käuflich zu erwerbende cDNA-Synthesekits können für die Synthese benutzt werden.

Zum Beispiel können cDNA-Fragmente des „Raffinosesynthetase-Gens mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 codiert," als das vorliegende Gen durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung der vorstehend erhaltenen, aus der Dicken Bohne stammenden cDNA als eine Matrize und der in der nachstehenden Liste 1 angeführten Primer 1 bis 3 erhalten werden. Die hierin verwendeten Primer können, abhängig von dem Zweck, auf der Basis der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 entworfen und synthetisiert werden. Um zum Beispiel die Region des offenen Leserahmens des „Raffinosesynthetase-Gens mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 codiert," zu amplifizieren, können die in der nachstehenden Liste 2 angeführten Primer 1 bis 4 entworfen und synthetisiert werden.

In der gleichen Weise können cDNA-Fragmente des „Raffinosesynthetase-Gens mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 3 codiert," durch PCR-Amplifizierung mit der aus der Sojabohne stammenden cDNA, die vorstehend erhalten wurde, als eine Matrize und zum Beispiel den in der nachstehenden Liste 1 angeführten Primern 4 bis 6 erhalten werden. Die hierin verwendeten Primer können, abhängig von dem Zweck, auf der Basis der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 4 entworfen und synthetisiert werden. Um zum Beispiel die Region des offenen Leserahmens des „Raffinosesynthetase-Gens mit einer Nucleotidsequenz, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 3 codiert," zu amplifizieren, können die in der nachstehenden Liste 2 angeführten Primer 5 bis 8 entworfen und synthetisiert werden.

Die amplifizierten DNA-Fragmente können im Einklang mit herkömmlichen Verfahren subcloniert werden, zum Beispiel wie in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; und „Current Protocols In Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBN 0-471-50338-X beschrieben. Genauer kann die Clonierung zum Beispiel unter Verwendung eines TA-Clonierungskits (Invitrogen) und eines Plasmidvektors wie etwa pBluescript II (Stratagene) durchgeführt werden. Die Nucleotidsequenzen der clonierten DNA-Fragmente können zum Beispiel durch das Didesoxy-Terminierungsverfahren bestimmt werden, wie von F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulson, Proceedings of National Academy of Science USA (1977), 74, S. 5463-5467 beschrieben. Zum Beispiel kann der von Perkin-Elmer käuflich zu erwerbende ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit bevorzugt verwendet werden.

(Liste 1)

(Liste 2)

Der hierin verwendete Ausdruck „Genfragment" betrifft ein Genfragment, das einen Teilabschnitt der Nucleotidsequenz des vorliegenden Gens aufweist (nachstehend hierin einfach das vorliegende Genfragment genannt). Zum Beispiel kann es ein von einer Pflanze stammendes Genfragment sein, das einen Teilabschnitt der Nucleotidsequenz des Gens aufweist, welches eine Nucleotidsequenz besitzt, die ein Protein codiert, das in der Lage ist, Raffinose zu produzieren, indem es eine D-Galactosylgruppe durch eine &agr;(1→6)-Bindung mit einer Hydroxylgruppe verbindet, die an das Kohlenstoffatom an Position 6 eines D-Glucose-Restes in einem Saccharose-Molekül gebunden ist. Spezifische Beispiele für das vorliegende Genfragment sind ein Genfragment mit einem Teilabschnitt der Nucleotidsequenz des Gens mit der Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 codiert, und ein Genfragment mit einem Teilabschnitt der Nucleotidsequenz des Gens mit der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2, spezieller ein Genfragment mit einer Nucleotidsequenz oder einem Teilabschnitt der Nucleotidsequenz davon, welches eine der nachstehend in Liste 3 angeführten Aminosäuresequenzen codiert.

Diese Genfragmente können als Sonden im Hybridisierungsverfahren oder als Primer im PCR-Verfahren verwendet werden. Für die Primer im PCR-Verfahren wird allgemein unter dem Gesichtspunkt, dass die Spezifität der Anelierung gewährleistet ist, bevorzugt, dass die Anzahl der Nucleotide höher ist; es ist jedoch unter dem Gesichtspunkt, dass die Primer selbst dazu neigen, eine höhere Struktur anzunehmen, die eine mögliche Verschlechterung der Wirksamkeit der Anelierung verursacht, und dass komplizierte Verfahren der Reinigung nach der Synthese notwendig sind, auch bevorzugt, dass die Anzahl der Nucleotide nicht so groß ist. In gewöhnlichen Fällen wird ein Genfragment bevorzugt, das aus einer einzelsträngigen DNA besteht, deren Anzahl an Nucleotiden im Bereich von 15 bis 50 Nucleotiden liegt.

(Liste 3)

Das vorliegende Genfragment wird markiert und dann als eine Sonde im Hybridisierungsverfahren verwendet und an von Organismen stammende DNA hybridisiert, so dass ein DNA-Fragment, das die Sonde spezifisch gebunden hat, nachgewiesen werden kann. Auf diese Weise kann ein Raffinosesynthetase-Gen mit einer Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz eines Enzyms codiert, welches in der Lage ist, Raffinose herzustellen, indem es eine D-Galactosylgruppe durch eine &agr;(1→6)-Bindung mit einer Hydroxylgruppe verbindet, die an das Kohlenstoffatom an Position 6 eines D-Glucose-Restes in einem Saccharose-Molekül gebunden ist, oder ein Genfragment mit einem Teilabschnitt der Nucleotidsequenz davon aus einer von Organismen stammenden Genbibliothek nachgewiesen werden (nachstehend hierin einfach als das vorliegende Nachweisverfahren genannt).

Als die von Organismen stammende DNA kann zum Beispiel eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische DNA-Bibliothek einer gewünschten Pflanze verwendet werden. Die Genbibliothek kann auch eine käuflich zu erwerbende Genbibliothek als solche sein, oder eine Bibliothek, die im Einklang mit herkömmlichen Herstellungsverfahren für eine Bibliothek hergestellt wurde, wie zum Beispiel in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; und „Current Protocols In Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBN 0-471-50338-X beschrieben.

Als Hybridisierungsverfahren kann in Abhängigkeit von der Art des Vektors, der zur Herstellung einer Bibliothek verwendet wird, Plaque-Hybridisierung oder Kolonie-Hybridisierung verwendet werden. Genauer, wenn eine zu verwendende Bibliothek mit einem Phagenvektor konstruiert wird, wird ein geeigneter Wirtsmikroorganismus unter infektiösen Bedingungen mit dem Phagen vermischt, welcher dann mit einem Weichagar-Kulturmedium vermischt wird, und das Gemisch wird auf ein Agar-Kulturmedium aufgetragen. Danach wird eine Kultur bei 37°C gezüchtet, bis sich ein Plaque einer geeigneten Größe gebildet hat. Wenn eine zu verwendende Bibliothek mit einem Plasmidvektor konstruiert wird, wird das Plasmid in einen geeigneten Wirtsmikroorganismus transformiert, um eine Transformante zu bilden. Die erhaltene Transformante wird auf eine geeignete Konzentration verdünnt und die Verdünnung auf ein Agarmedium aufgebracht, anschließend wird eine Kultur bei 37°C gezüchtet, bis sich eine Kolonie von geeigneter Größe gebildet hat.

In beiden Fällen der vorstehenden Bibliotheken wird nach der Kultivierung ein Membranfilter auf der Oberfläche des Agar-Kulturmediums angebracht, so dass der Phage oder die Transformante auf die Membran übertragen wird. Diese Membran wird mit einem Alkali-Reagenz denaturiert, im Anschluss neutralisiert, und, wenn zum Beispiel eine Nylonmembran verwendet wird, wird die Membran mit ultraviolettem Licht bestrahlt, so dass die DNA auf der Membran fixiert wird. Diese Membran wird dann mit dem vorliegenden Genfragment, das durch ein herkömmliches Verfahren markiert worden ist, als einer Sonde der Hybridisierung unterworfen. Zu diesem Verfahren kann in der Literatur nachgeschlagen werden, zum Beispiel bei D. M. Glover, Hrsg. „DNA cloning, a practical aproach" IRL PRESS (1985), ISBN 0-947946-18-7. Es stehen zahlreiche Reagenzien und Temperaturbedingungen zur Verfügung, die für die Hybridisierung verwendet werden können; zum Beispiel wird eine Prähybridisierung durch die Zugabe von 6 × SSC (0,9 M NaCl, 0,09 M Zitronensäure), 0,1-1 % SDS, 100 &mgr;g/ml denaturierter Lachssperma-DNA und Inkubation bei 65°C über 1 Stunde durchgeführt. Das markierte vorliegende Genfragment wird dann als Sonde zugegeben und vermischt. Die Hybridisierung wird bei 42-68°C über 4 bis 16 Stunden durchgeführt. Die Membran wird mit 2 × SSC, 0,1-1 % SDS gewaschen, dann mit 0,2 × SSC, 0-0,1 % SDS abgespült und dann getrocknet. Die Membran wird zum Beispiel durch Autoradiografie oder andere Techniken analysiert, um die Position der Sonde auf der Membran nachzuweisen und damit die Position der DNA nachzuweisen, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die der der verwendeten Sonde homolog ist. Auf diese Weise können das vorliegende Gen oder das vorliegende Genfragment nachgewiesen werden. Der Clon, der der Position der auf diese Weise nachgewiesenen DNA auf der Membran entspricht, wird auf dem ursprünglichen Agar-Kulturmedium identifiziert, und der positive Clon wird selektiert, so dass der Clon, der die DNA aufweist, isoliert werden kann. Die gleichen Vorgehensweisen des Nachweises werden wiederholt, um den Clon, der die DNA aufweist, zu reinigen.

Andere Nachweisverfahren können ebenfalls verwendet werden, zum Beispiel der GENE TRAPPER cDNA Positive Selection System Kit, käuflich zu erwerben von Gibco BRL. Bei diesem Verfahren wird eine einselsträngige DNA-Bibliothek mit dem biotinylierten (d.h. als Sonde) vorliegenden Genfragment hybridisiert, anschließend folgen die Zugabe von Streptavidin-gebundenen Magnetperlen und Vermischung. Aus dem Gemisch werden die Streptavidin-gebundenen Magnetperlen mit einem Magneten eingesammelt, so dass einzelträngige DNA, die eine Nucleotidsequenz besitzt, die der der verwendeten Sonde homolog ist, welche an diese Perlen durch das vorliegende Genfragment, Biotin und Streptavidin gebunden worden war, gesammelt und nachgewiesen wird. Auf diese Weise kann das vorliegende Gen oder das vorliegende Genfragment nachgewiesen werden. Die gesammelte einzelträngige DNA kann durch Behandlung mit einer geeigneten DNA-Polymerase unter Verwendung eines geeigneten Oligonucleotides als einem Primer in eine doppelsträngige Form umgewandelt werden.

Das vorliegende Nachweisverfahren kann auch zur Analyse einer Pflanze verwendet werden. Genauer wird genomische DNA der Pflanze im Einklang mit einem herkömmlichen Verfahren hergestellt, zum Beispiel wie in „Cloning and Sequence (Plant Biotechnology Experiment Manual)", zusammengestellt unter der Leitung von Itaru Watanabe, herausgegeben von Masahiro Sugiura, veröffentlicht von Noson Bunka-sha, Tokyo (1989) beschrieben. Die genomische DNA der Pflanze wird mit mehreren Arten geeigneter Restriktionsendonucleasen aufgespalten, anschließend der Elektrophorese unterworfen, und die durch Elektrophorese aufgetrennte DNA wird im Einklang mit einem herkömmlichen Verfahren auf einen Filter übertragen. Dieser Filter wird der Hybridisierung mit einer Sonde unterzogen, die durch ein herkömmliches Verfahren aus dem vorliegenden Genfragment hergestellt worden war, und DNA-Fragmente, an die die Sonde hybridisiert, werden nachgewiesen. Die Längen der nachgewiesenen DNA-Fragmente zwischen den verschiedenen Varietäten einer speziellen Pflanzenart werden verglichen. Die Längenunterschiede ermöglichen die Analyse von Unterschieden bei phänotypischen Eigenschaften, begleitet von der Expression von Oligosacchariden aus der Raffinose-Familie, zwischen diesen Varietäten. Wenn die Längen der durch das vorstehende Verfahren nachgewiesenen DNA-Fragmente zwischen der Pflanze mit rekombinanten Genen und der Pflanze mit nicht rekombinanten Genen der selben Varietät verglichen werden, kann darüber hinaus erstere Pflanze durch den Nachweis von Hybridisierungsbanden, die in größerer Anzahl oder höherer Konzentration bei der ersteren Pflanze als bei der letzteren Pflanze vorliegen, von der letzteren unterschieden werden. Dieses Verfahren kann zum Beispiel im Einklang mit dem RFLP (Restrictionsfragmentlängenpolymorphismus)-Verfahren durchgeführt werden, wie in „Plant PCR Experiment Protocols", zusammengestellt unter der Leitung von Ko Shimamoto und Takuji Sasaki, herausgegeben von Shujun-sha, Tokyo (1995), ISBN 4-87962-144-7, S. 90-94 beschrieben.

Das PCR-Verfahren, das einen Primer mit der Nucleotidsequenz des vorliegenden Genfragmentes verwendet, macht es möglich, aus Organismen-stämmiger DNA ein Raffinosesynthetase-Gen mit einer Nucleotidsequenz, die eine Aminosäuresequenz eines Enzyms codiert, welches in der Lage ist, Raffinose herzustellen, indem es eine D-Galactosylgruppe durch eine &agr;(1→6)-Bindung mit einer Hydroxylgruppe verbindet, die an das Kohlenstoffatom an Position 6 eines D-Glucose-Restes in einem Saccharose-Molekül gebunden ist; oder ein Genfragment zu amplifizieren, das einen Teilabschnitt der Nucleotidsequenz davon besitzt (hierin nachstehend einfach als das vorliegende Amplifizierungsverfahren genannt).

Genauer wird zum Beispiel ein Oligonucleotid, das 15 bis 50 Nucleotide in der Nucleotidsequenz des vorliegenden Genfragments am 3'-Terminus aufweist, chemisch durch ein herkömmliches Syntheseverfahren hergestellt. Basierend auf der nachstehenden Codon-Tabelle, die die Übereinstimmung von Aminosäuren, die in Nucleotidsequenzen codiert sind, darstellt, kann auch ein gemischter Primer synthetisiert werden, so dass ein Rest an einer bestimmten Position im Primer in Abhängigkeit von der Variation an Codons, die eine bestimmte Aminosäure codieren können, gegen ein Gemisch aus mehreren Basen ausgetauscht wird.

CODON-TABELLE

Darüber hinaus kann auch eine Base, die in der Lage ist, mit mehreren Arten von Basen ein Paar zu bilden, wie etwa Inosin, statt des vorstehenden Gemisches aus mehreren Basen verwendet werden. Genauer können zum Beispiel Primer, die Nucleotidsequenzen, wie in Liste 4 dargestellt, besitzen, verwendet werden. In diesem Zusammenhang wird ein Oligonucleotid mit der gleichen Nucleotidsequenz wie der codierende Strang des vorliegenden Gens, welches aus doppelsträngiger DNA besteht, als „Sense-Primer" und ein Oligonucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die komplementär zu dem codierenden Strang ist, als „Antisense-Primer" bezeichnet.

Ein Sense-Primer mit der gleichen Nucleotidsequenz, wie sie auf der 5'-aufwärts gelegenen Seite im codierenden Strang eines Raffinosesynthetase-Gens oder eines Genfragmentes mit einem Teilabschnitt der Nucleotidsequenz davon, welches amplifiziert werden soll, vorliegt, und ein Antisense-Primer mit einer Nucleotidsequenz, die zu der Nucleotidsequenz auf der 3'-abwärts gelegenen Seite in diesem codierenden Strang komplementär ist, werden in Kombination für die PCR-Reaktion verwendet, um ein DNA-Fragment, zum Beispiel mit einer Gen-Bibliothek, genomischer DNA oder cDNA als einer Matrize zu amplifizieren. Zu diesem Zeitpunkt kann die Amplifizierung eines DNA-Fragmentes durch ein herkömmliches Verfahren mit Elektrophorese bestätigt werden. Für das amplifizierte DNA-Fragment wird seine Restriktionsendonucleasen-Karte erstellt, oder seine Nucleotidsequenz wird durch ein herkömmliches Verfahren bestimmt, sodass das vorliegende Gen oder das vorliegende Genfragment identifiziert werden kann. Als die hierin verwendete Gen-Bibliothek kann zum Beispiel eine cDNA-Bibliothek oder eine Bibliothek genomischer DNA einer gewünschten Pflanze verwendet werden. Bei der Gen-Bibliothek von Pflanzen kann eine käuflich zu erwerbende Bibliothek, die von einer Pflanze stammt, als solche verwendet werden; oder eine Bibliothek, die nach einem herkömmlichen Herstellungsverfahren für eine Bibliothek hergestellt wurde, zum Beispiel wie in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder „Current Protocols In Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBN 0-471-50338-X beschrieben, kann ebenfalls verwendet werden. Als die genomische DNA oder cDNA, die in dem vorliegenden Amplifizierungsverfahren verwendet wird, kann zum Beispiel auch cDNA oder genomische cDNA verwendet werden, die aus einer gewünschten Pflanze präpariert worden ist.

Genauer wird zum Beispiel ein Primer, der nach der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 entworfen wurde, für das vorliegende Amplifizierungsverfahren mit cDNA, die von der Japanischen Artischoke stammt, welche zur Familie der Lippenblütler (Laminaceae) gehört, als eine Matrize verwendet, so dass ein Fragment des Raffinosesynthetase-Gens, das die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 6 besitzt, amplifiziert werden kann. Darüber hinaus wird zum Beispiel ein Primer, der nach der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 entworfen wurde, für das vorliegende Amplifizierungsverfahren mit cDNA, die vom Mais stammt, welcher zu der Familie der Gräser (Gramineae) gehört, als eine Matrize verwendet, so dass ein Fragment des Raffinosesynthetase-Gens, das die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 8 besitzt, amplifiziert werden kann.

(Liste 4)

Das vorliegende Amplifizierungsverfahren kann auch für die Analyse eines Pflanzengens verwendet werden. Genauer wird zum Beispiel genomische Pflanzen-DNA, die aus verschiedenen Varietäten einer bestimmten Pflanzenart präpariert wurde, als eine Matrize für das vorliegende Amplizierungsverfahren verwendet, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren. Das amplifizierte DNA-Fragment wird mit einer Lösung aus Formaldehyd vermischt, welche durch Erhitzen auf 85°C über 5 Minuten denaturiert wird, gefolgt von schneller Abkühlung auf Eis. Die Probe wird der Elektrophorese unterworfen, zum Beispiel auf einem 6 % Polyacrylamidgel, das 0 % oder 10 % Glycerin enthält. Für diese Elektrophorese kann ein käuflich zu erwerbender Elektrophoreseapparat für SSCP (Einzelstrandnonformationspolymorphism) verwendet werden, und die Elektrophorese wird durchgeführt, wobei das Gel auf einer konstanten Temperatur gehalten wird, z.B. 5°C, 25°C oder 37°C. Auf dem Elektrophoresegel wird ein DNA-Fragment zum Beispiel durch ein Verfahren wie etwa dem Silberfärbverfahren mit käuflich zu erwerbenden Reagenzien nachgewiesen.

Aus den Unterschieden im Verhalten zwischen den Varietäten in der Elektrophorese des nachgewiesenen DNA-Fragmentes wird eine Mutation im Raffinosesynthetase-Gen nachgewiesen, und eine Analyse dieser durch die Mutation verursachten Unterschiede in phänotypischen Merkmalen, begleitet von der Expression von Oligosacchariden aus der Raffinose-Familie, wird durchgeführt. Dieses Verfahren kann im Einklang mit dem SSCP-Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel wie in „Plant PCR Experiment Protocols", zusammengestellt unter der Leitung von Ko Shimamoto und Takuji Sasaki, herausgegeben von Shujun-sha, Tokio (1995), ISBN 4-87962-144-7, S. 141-146, beschrieben.

Das vorstehend beschriebene, vorliegende Nachweisverfahren oder Amplifizierungsverfahren kann auch verwendet werden, um ein Raffinosesynthetase-Gen oder ein Genfragment, das einen Teilabschnitt der Nucleotidsequenz davon besitzt, zu identifizieren, und dann das identifizierte Gen oder Genfragment davon zu isolieren und zu reinigen, um das vorliegende Gen zu erhalten (hierin nachstehend einfach als Verfahren zur Beschaffung des vorliegenden Gens genannt).

Das vorliegende Gen oder das vorliegende Genfragment kann zum Beispiel erhalten werden, indem eine aus dem vorliegenden Genfragment bestehende Sonde nachgewiesen wird, die durch das vorliegende Nachweisverfahren an DNA in der Organismen-stämmigen Gen-Bibliothek hybridisiert ist, wie vorstehend beschrieben, um DNA zu identifizieren, die eine zu der verwendeten Sonde homologe Nucleotidsequenz besitzt; indem ein Clon, der die DNA aufweist, gereinigt wird; und indem Plasmid- oder Phagen-DNA aus dem Clon isoliert und gereinigt wird. Wenn die auf diese Weise erhaltene DNA ein Genfragment ist, das einen Teilabschnitt der Nucleotidsequenz des Raffinosesynthetase-Gens besitzt, ergibt weitere Durchmusterung der Gen-Bibliothek mit dem vorliegenden Gen-Nachweisverfahren unter Verwendung der DNA als eine Sonde das vorliegende Gen in voller Länge.

Das vorliegende Gen oder das vorliegende Genfragment kann identifiziert werden, indem zum Beispiel Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines Primers mit der Nucleotidsequenz des vorliegenden Genfragmentes durchgeführt wird, um ein DNA-Fragment aus der Organismen-stämmigen DNA durch das vorliegende Amplifizierungsverfahren zu amplifizieren, wie vorstehend beschrieben; und indem dann eine Karte für die Restriktionsendonucleasen erstellt oder eine Nucleotidsequenz für das amplifizierte DNA-Fragment bestimmt wird. Auf der Basis der Nucleotidsequenz des erhaltenen Genfragmentes wird ein Antisense-Primer zur Analyse der 5'-terminalen Sequenzen synthetisiert und ein Sense-Primer wird zur Analyse der 3'-terminalen Sequenzen synthetisiert. Die Nucleotidsequenz des vorliegenden Gens in voller Länge kann durch das RACE-Verfahren unter Verwendung dieser Primer und eines käuflich zu erwerbenden Kits, z.B. Marathon-Kit von Clontech, bestimmt werden. Das vorliegende Gen in voller Länge kann erhalten werden, indem neue Primer, die auf beiden terminalen Sequenzen in der auf diese Weise bestimmten Nucleotidsequenz basieren, und die Polymerase-Kettenreaktion erneut durchgeführt wird.

Das vorstehend beschriebene Verfahren zur Beschaffung des vorliegenden Gens ermöglicht es, Raffinosesynthetase-Gene als die vorliegenden Gene von verschiedenen Organismen zu erhalten. Zum Beispiel ein Gen, das eine Raffinosesynthetase mit einer Aminosäuresequenz codiert, die etwa 50 % oder höhere Homologie in der Region, die der Länge von 400 oder mehr Aminosäuren entspricht, mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 aufweist, und in der Lage ist, Raffinose herzustellen, indem es eine D-Galactosylgruppe durch eine &agr;(1→6)-Bindung mit einer Hydroxylgruppe verbindet, die an das Kohlenstoffatom an Position 6 eines D-Glucose-Restes in einem Saccharose-Molekül gebunden ist. Genauer kann zum Beispiel ein Raffinosesynthetase-Gen mit der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 4 erhalten werden, indem ein DNA-Fragment, das ein Genfragment mit einem Teilabschnitt der Nucleotidsequenz des Raffinosesynthetase-Gens enthält, durch das vorliegende Amplifizierungsverfahren unter Verwendung von Primern, die auf Basis der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 entworfen wurden, und cDNA der Sojabohne als eine Matrize amplifiziert und identifiziert wird; indem anschließend das identzifizierte DNA-Fragment isoliert und gereinigt wird, gefolgt von den vorstehenden Prozessen zur Erlangung eines Gens in voller Länge, welches das DNA-Fragment enthält.

Ein chimäres Gen, das das vorliegende Gen und einen hiermit verbundenen Promotor umfasst (hierin nachstehend einfach als das vorliegende chimäre Gen bezeichnet), kann konstruiert werden.

Der zu verwendende Promotor ist nicht speziell eingeschränkt, solange er in dem zu transformierenden Wirtsorganismus seine Funktion erfüllt. Der Promotor kann zum Beispiel synthetische Promotoren einschließen, die in Escherichia coli funktionieren, wie etwa der Lactose-Operon-Promotor von E. coli, Tryptophan-Operon-Promotor für und der tac-Promotor von E. coli; der Alkoholdehydrogenase-Gen (ADH)-Promotor von Hefe, der späte Haupt (Ad.ML)-Promotor von Adenovirus, der frühe SV40-Promotor und der Baculovirus-Promotor.

Wenn der Wirtsorganismus eine Pflanze oder eine Zelle davon ist, kann der Promotor zum Beispiel T-DNA-stämmige konstitutive Promotoren wie etwa den Nopalinsynthetase-Gen (NOS)-Promotor und den Octopinsynthase-Gen (OCS)-Promotor, Virus-stämmige Promotoren von Pflanzen, wie etwa den vom Blumenkohlmosaikvirus stammenden 19S- und 35S-Promotor, abgeleitete Promotoren wie etwa den Phenylalaninammonium-Lyase (PAL)-Gen-Promotor, Chalcon-Synthetase (CHS)-Gen-Promotor und den mit Pathogenese assoziierten Protein (PR)-Gen-Promotor einschließen. Darüber hinaus kann auch der Vektor pSUM-GY1 (vgl. JP-A 06-189777/1994) verwendet werden, welcher einen Promotor besitzt, der spezifische Expression in einem spezifischen Pflanzengewebe veranlasst, z.B. ein Promotor des von der Sojabohne stammenden Gens für das Samenspeicherprotein Glycinin. Die Verwendung eines chimären Gens, das auf eine Weise konstruiert ist, dass es einen solchen Promotor besitzt, ermöglicht es, den Gehalt an Oligosacchariden aus der Raffinose-Familie in einem spezifischen Gewebe einer Pflanze zu erhöhen oder zu senken.

Das vorliegende chimäre Gen wird dann im Einklang mit herkömmlichen gentechnischen Verfahren in einen Wirtsorganismus eingeführt, um eine Transformante zu erzeugen. Falls erforderlich, kann das vorliegende chimäre Gen in Form eines Plasmids verwendet werden, abhängig von dem Transformationsverfahren, mit dem das Gen in den Wirtsorganismus eingeführt wird. Darüber hinaus kann das vorliegende chimäre Gen einen Terminator beinhalten. In diesem Fall ist es allgemein bevorzugt, dass das chimäre Gen in der Weise konstruiert ist, dass es einen Terminator stromabwärts des Raffinosesynthetase-Gens aufweist. Der zu verwendende Terminator ist nicht spezifisch eingeschränkt, solange er seine Funktion in einem zu transformierenden Wirtsorganismus erfüllt. Wenn der Wirtsorganismus zum Beispiel eine Pflanze oder eine Zelle davon ist, kann der Terminator zum Beispiel T-DNA-stämmige konstitutive Terminatoren wie etwa den Nopalinsynthetase-Gen (NOS)-Terminator und Pflanzen-stämmige Terminatoren wie etwa Terminatoren des Allium-Virus GV1 oder GV2 einschließen.

Falls erforderlich, kann das vorliegende Gen in Form eines Plasmids verwendet werden. Wenn der Wirtsorganismus zum Beispiel ein Mikroorganismus ist, wird das konstruierte Plasmid durch herkömmliche Mittel in den Mikroorganismus eingeführt, wie zum Beispiel in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder „Current Protocols In Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBN 0-471-50338-X beschrieben. Der auf diese Weise transformierte Mikroorganismus wird anhand einer Markierung wie etwa Resistenz gegen Antibiotika oder Auxotrophie selektiert. Wenn der Wirtsorganismus eine Pflanze ist, wird das konstruierte Plasmid durch ein herkömmliches Verfahren wie etwa die Infektion mit Agrobakterium (vgl. JP-B 2-58917/1990 und JP-A 60-70080/1985), Elektroporation in Protoplasten hinein (vgl. JP-A 60-251887/1985 und JP-B 5-68575/1993) oder Partikelschuss-Verfahren (vgl. JP-A 5-508316/1993 und JP-A 63-258525/1988) in eine Pflanzenzelle eingeführt. Die Pflanzenzelle, die durch das Einbringen eines Plasmids transformiert wurde, wird anhand eines Antibiotikums wie etwa Kanamycin oder Hygromycin selektiert. Aus der auf diese Weise transformierten Pflanzenzelle kann eine transformierte Pflanze mit einem herkömmlichen Kultivierungsverfahren für Pflanzenzellen regeneriert werden, wie zum Beispiel in „Plant Gene Manipulation Manual (How to Produce Transgenic Plants)" geschrieben von Uchimiya, 1990, Kodan-sha Scientific (ISBN 4-06-153513-7), S. 27-55 beschrieben. Darüber hinaus ermöglicht das Sammeln von Samen der transformierten Pflanze ebenfalls, die transformierte Pflanze zu vermehren. Zusätzlich ermöglicht das Kreuzen der erhaltenen transformierten Pflanze mit der nicht transformierten Pflanze, progene Pflanzen mit dem Charakter der transformierten Pflanze zu erzeugen.

Der Gehalt an Oligosacchariden aus der Raffinose-Familie kann durch Einführen des vorliegenden Gens in einen Wirtsorganismus oder eine Zelle davon und durch Modifizieren des Stoffwechsels in dem Wirtsorganismus oder der Zelle davon verändert werden. Als ein solches Verfahren kann zum Beispiel ein Verfahren zur Stoffwechselmodifikation verwendet werden, um den Gehalt an Oligosacchariden aus der Raffinose-Familie in einem Wirtsorganismus oder einer Zelle davon zu erhöhen, indem das vorliegende chimäre Gen, das das vorliegende Gen und einen hiermit verbundenen Promotor umfasst, konstruiert wird, wobei das vorliegende Gen in einer ursprünglichen Richtung mit dem Promotor verbunden wird, die für Transkription, Translation und Expression als ein Protein geeignet ist, und dann das vorliegende chimäre Gen in den Wirtsorganismus oder eine Zelle davon eingeführt; oder es wird ein Verfahren zur Stoffwechselmodifikation verwendet, um den Gehalt an Oligosacchariden aus der Raffinose-Familie in einem Wirtsorganismus oder einer Zelle davon zu senken, indem das vorliegende chimäre Gen, dass das vorliegende Gen und einen hiermit verbundenen Promotor umfasst, konstruiert wird, wobei das vorliegende Gen in einer reversen Richtung mit dem Promotor verbunden wird, die für Translation und Expression als ein Protein ungeeignet ist, und dann das vorliegende chimäre Gen in den Wirtsorganismus oder eine Zelle davon eingeführt wird.

Der hierin verwendete Ausdruck „Raffinosesynthetase-Protein" betrifft ein Protein, das in dem vorliegenden Gen codiert wird (hierin nachstehend einfach als vorliegendes Protein bezeichnet). Zum Beispiel kann es ein Enzymprotein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 einschließen, oder es hat eine Aminosäuresequenz, die durch Deletion, Erstzung, Modifikation oder Addition von einer Aminosäure in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 abgeleitet ist; und in der Lage ist, Raffinose herzustellen, indem es eine D-Galactosylgruppe durch eine &agr;(1→6)-Bindung mit einer Hydroxylgruppe verbindet, die an das Kohlenstoffatom an Position 6 eines D-Glucose-Restes in einem Saccharose-Molekül gebunden ist.

Spezifische Beispiele für das vorliegende Protein sind ein Enzymprotein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 (799 Aminosäuren; Molekulargewicht 89 kDa) und ein Enzymprotein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 3 (781 Aminosäuren; Molekulargewicht 87 kDa).

Das vorliegende Protein kann, obwohl es zum Beispiel aus Pflanzen aus der Familie der Hülsenfrüchte (Leguminosae) wie etwa der Dicken Bohne (Vicia faba) durch ein herkömmliches biochemisches Verfahren wie etwa (NH4)2SO4-Fällung, Ionenaustauschsäule, hydrophobe Säule, Hydroxyapatitsäule oder Gelfiltrationssäule hergestellt werden kann, auch aus dem Wirtsorganismus, der mit dem vorliegenden Plasmid transformiert worden ist, oder einer Zelle davon gewonnen werden. Genauer wird das vorliegende Gen zum Beispiel unter Verwendung des GST-Gene Fusion Vectors Kit von Pharmacia in ein Expressionsvektorplasmid inseriert, welches an den Kit gebunden ist. Das entstandene Vektorplasmid wird im Einklang mit einem herkömmlichen gentechnischen Verfahren in einen Mikroorganismus wie etwa E. coli eingeführt. Eine Kultur der erhaltenen Transformante wird auf einem Kulturmedium mit zugesetztem IPTG (Isopropylthio-&bgr;-D-galactosid) gezüchtet, so dass das vorliegende Protein exprimiert und als ein fusioniertes Protein in der Kultur erhalten werden kann. Das exprimierte und induzierte fusionierte Protein kann durch ein herkömmliches Verfahren wie etwa Aufbruch von Bakterienzellen, Verwendung von Säulen oder SDS-PAGE-Elektrophorese isoliert und gereinigt werden. Die Spaltung des fusionierten Proteins mit einer Protease wie etwa Thrombin oder dem Blut-Koagulationsfaktor Xa ergibt das vorliegende Protein. Dies kann bevorzugt zum Beispiel im Einklang mit dem Verfahren durchgeführt werden, das in „Current Protocols In Protein Science" (1995), John Wiley & Sons, Inc. ISBN 0-471-11184-8 beschrieben ist. Die Aktivität des vorliegenden Proteins kann zum Beispiel durch das Verfahren gemessen werden, das von L. Lehle und W. Tanner, Eur. J. Biochem., 38, 103-110 (1973) beschrieben worden ist.

Ein anti-Raffinosesynthetase-Antikörper, der in der Lage ist, ein Raffinosesynthetase-Protein zu binden (hierin nachstehend einfach als vorliegender Antikörper bezeichnet), kann durch ein herkömmliches immunologisches Verfahren hergestellt werden, das das vorliegende Protein, das vorstehend gewonnen wurde, als ein Antigen verwendet. Genauer kann der vorliegende Antikörper zum Beispiel im Einklang mit dem Verfahren hergestellt werden, das von Ed Harlow und David Lane, „Antibodies: A Laboratory Manual" (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2 beschrieben wurde.

Das vorliegende Protein kann nachgewiesen werden, indem Testproteine mit dem vorliegenden Antikörper behandelt werden und ein Protein nachgewiesen wird, welches den vorliegenden Antikörper spezifisch gebunden hat. Ein solches Nachweisverfahren kann im Einklang mit einer immunologischen Technik, wie etwa dem Western-Blot-Verfahren oder dem enzymverbundenen Immunadsorptions-Test (ELISA) durchgeführt werden, zum Beispiel wie von Ed Harlow und David Lane, „Antibodies: A Laboratory Manual" (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben wurde.

Das Western-Blot-Verfahren wird zum Beispiel wie nachstehend durchgeführt: Proteine werden aus einer Pflanze extrahiert, zum Beispiel im Einklang mit dem Verfahren, das in Methods in Enzymology, Band 182, „Guide to Protein Purification" S. 174-193, ISBN 9-12-182083-1 beschreiben wurde. Die Zusammensetzung einer Extraktionspufferlösung kann in Abhängigkeit von dem verwendeten Pflanzengewebe geeignet verändert werden. Die extrahierten Proteine werden im Einklang mit einem herkömmlichen SDS-PAGE-Verfahren der Elektrophorese unterworfen. Nach Durchführung der Elektrophorese werden die Proteine im Gel durch das Western-Blot-Verfahren mit einem herkömmlichen elektrischen Verfahren auf eine Membran übertragen. Genauer liegt dieses Gel zum Beispiel über 10 Minuten in einer Transfer-Pufferlösung (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20 % Methanol), und wird dann auf eine PVDF-Membran übertragen, die in der gleichen Größe wie die des Gels geschnitten worden war. Das Gel wird zusammen mit der Membran in einen käuflich zu erwerbenden Transferapparat des halbtrockenen Typs gesetzt. Die Übertragung wird bei konstantem Strom von 0,8 bis 2 mA/cm2 über 45 Minuten bis 1 Stunde durchgeführt. Die auf die Membran übertragenen Proteine können immunologisch mit einem Kit für den Western-Blot-Nachweis nachgewiesen werden, indem ein primärer Antikörper und ein sekundärer Antikörper oder Protein A, der/das mit alkalischer Phosphatase oder Meerrettichperoxidase markiert ist, verwendet werden. Zu diesem Zeitpunkt kann das vorliegende Protein auf der Membran durch die Verwendung des vorliegenden Antikörpers als einen primären Antikörper nachgewiesen werden.

Bei dem ELISA-Verfahren, zum Beispiel, wird die Eigenschaft von Proteinen, an die Oberfläche einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen, hergestellt aus einem Harz, zu binden, im Prinzip für den immunologischen Nachweis eines Antigens genutzt, das schließlich an die Oberfläche der ELISA-Platte gebunden ist. Die Testproteine werden als eine Lösung zugegeben und an die ELISA-Platte gebunden, anschließend erfolgt die Blockierung, zum Beispiel durch die Zugabe von PBS, das ein Protein wie etwa 5 % Rinderserumalbumin enthält. Danach wird die Vertiefung mit PBS gewaschen, dem eine den vorliegenden Antikörper enthaltende Lösung zugegeben wird, um die Reaktion hervorzurufen. Nachdem die Vertiefung gewaschen wurde, wird eine weitere Lösung, die einen zweiten Antikörper enthält, der mit alkalischer Phosphatase oder Meerrettichperoxidase markiert ist, zur Vertiefung zugegeben, gefolgt von einer Waschung. Schließlich wird eine Substratlösung für den Nachweis in die Vertiefung zugegeben, und die Farbentwicklung des Substrates wird mit einem ELISA-Lesegerät nachgewiesen.

In einem anderen Verfahren wird der vorliegende Antikörper zugegeben und an die ELISA-Platte gebunden, gefolgt von der Blockierung, zum Beispiel durch die Zugabe von PBS, die ein Protein wie etwa 5 % Rinderserumalbumin enthält. Die Testproteine werden dann als eine Lösung zugegeben, und ein Antigen, das in den Testproteinen enthalten ist, wird an den vorliegenden Antikörper, der an die Platte gebunden ist, gebunden, gefolgt von einer Waschung, und der vorliegende Antikörper wird weiter in die Vertiefung zugegeben. Der vorliegende Antikörper, der diesmal verwendet wird, ist bevorzugt einer, der aus einer Tierart gewonnen wurde, die sich von der, die für die Herstellung des zuerst verwendeten vorliegenden Antikörpers verwendet wurde, unterscheidet. Eine Lösung, die einen sekundären Antikörper enthält, der mit alkalischer Phosphatase oder Meerrettichperoxidase markiert ist, wird dann in die Vertiefung zugegeben, gefolgt von einer Waschung. Der sekundäre Antikörper, der diesmal verwendet wird, muss die Eigenschaft haben, den später zugegebenen vorliegenden Antikörper zu binden. Schließlich wird eine Substratlösung für den Nachweis zugegeben, und die Farbentwicklung wird mit einem ELISA-Lesegerät nachgewiesen.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter erläutert:

Beispiel 1 (Reinigung von Galactinol)

Etwa 250 ml Zuckerrüben-Restmelasse wurde fünffach mit Methanol verdünnt. Die Verdünnung wurde bei 21.400 × g über 15 Minuten bei Zimmertemperatur zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Der erhaltene Überstand wurde in einen 2-Liter-Erlenmeyerkolben übertragen, in den Isopropanol mit halbem Volumen nach und nach unter Rühren zugegeben wurde. Der Kolben wurde für eine Weile bei Zimmertemperatur stehen gelassen, bis der entstandene Niederschlag sich an der Wand des Kolbens absetzte. Der Überstand wurde dann durch Abgießen verworfen. Zu dem Niederschlag wurden 500 ml Ethanol zugegeben, und das Gemisch wurde durch Rühren mit einem Rotationsschüttler gewaschen. Die Waschung wurde mehrere Male wiederholt. Der gewaschene Niederschlag wurde von der Flaschenwand abgekratzt und anschließend auf einem Filterpapier luftgetrocknet. Der luftgetrocknete Niederschlag (trockenes Pulver) wurde in gereinigtem Wasser zu etwa 40 % (Gew./Vol) gelöst. Zu dieser Lösung wurde AG501-X8(D) von BioRad zugegeben, anschließend wurde gerührt. Dieser Vorgang wurde wiederholt, bis man die Farbe der Lösung fast nicht mehr erkennen konnte. Die entstandene Lösung wurde mit einer Sep-Pak QMA-Säule von Milipore behandelt und weiter mit Sep-Pak CM-, Sep-Pak C18- und Sep-Pak Silikasäulen von Milipore vorbehandelt. Die entstandene Lösung wurde mit einem Volumen von 5 ml auf eine Säule mit Wako-Gel LP40C18 (Wako Pure Chemical Industries, 2,6 cm × 85 cm) gegeben und mit gereinigtem Wasser eluiert. Der Zuckergehalt des Eluats wurde mit einem tragbaren Zuckerrefraktometer gemessen, und die Zuckerzusammensetzung wurde mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) mit einer Zucker-Pak Na-Säule (7,8 mm × 300 mm) von Milipore analysiert. Der Nachweis von Zuckern wurde mit dem Differentialrefraktometer, Modell 410, von Waters durchgeführt. Das Galactinol enthaltende Eluat wurde lyophilisiert, und das entstandene lyophilisierte Pulver wurde in 5 ml gereinigtem Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf eine Säule von TOYOPEARL HW40(S) (Toso, 2,6 cm × 90 cm) gegeben und mit gereinigtem Wasser eluiert. Das Eluat wurde in gleicher Weise, wie vorstehend beschrieben, analysiert, sodass gereinigtes Galaktinol erhalten wurde.

Das erhaltene Galactinol wurde bei 25°C über 40 Minuten in dem Reaktionsgemisch behalten, das am Ende 80 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 6,5), 2 mg/ml Galactinol und 8,3 U &agr;-Galactosidase (Boehringer Mannheim, E. coli-Überproduzierer 662038) umfasste. Das Reaktionsgemisch wurde mit Chloroform extrahiert, und die Wasserschicht wurde durch HPLC-Analyse analysiert. Es wurde bestätigt, dass das entstandene Galactinol in Galactose und Myoinosit hydrolysiert wurde.

Beispiel 2 (Messung der Aktivität von Raffinosesynthetase)

Die Aktivität von Raffinosesynthetase wurde unter den nachstehenden Bedingungen im Einklang mit der Beschreibung von L. Lehle und W. Tanner, Eur. J. Biochem., 38, 103-110 (1973), gemessen.

Zunächst wurden 2 &mgr;l einer Probe, die zur Messung der Aktivität verwendet werden sollte, zu 18 &mgr;l Reaktionsgemisch zugegeben, welches am Ende 100 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 5 mM DTT (Dithiothreit), 0,01 % BSA, 200 &mgr;M Saccharose, 5 mM Galactinol, 740 KBq/ml (31,7 &mgr;M) [14C] Saccharose umfasste, und das Reaktionsgemisch wurde über 3 bis 20 Stunden auf 37°C gehalten. Nach der Reaktion wurden dem Reaktionsgemisch 30 &mgr;l Ethanol zugegeben, anschließend wurde gerührt und bei 15.000 UpM über 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einem Volumen von 5 &mgr;l für eine Dünnschichtchromatographie auf eine HPDC-Platte aus Cellulose (Merck, 10 cm × 20 cm) aufgebracht und mit n-Butanol Pyridin : Wasser: Essigsäure 60 : 40 : 30 : 3 entwickelt. Die entwickelte Platte wurde getrocknet und dann mit einem Bildanalysator (Fuji Photographic Film, FUIIX Bio Imaging Analyzer BAS-2000II) zur Bestimmung der produzierten [14C] Raffinose quantitativ analysiert.

Beispiel 3 (Reinigung von Raffinosesynthetase)

Die Reinigung von Raffinosesynthetase aus der Dicken Bohne wurde wie folgt durchgeführt: Für jede gereinigte Proteinlösung wurden die in der Proteinlösung anwesenden Proteine durch SDS-PAGE (Daiichi Kagaku Yakuhin) analysiert, und ihre Enzymaktivität wurde im Einklang mit dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren gemessen.

Zunächst wurden 300 g unreifer Samen der Dicken Bohne (Nintoku Issun) bei –80°C gelagert, aufgetaut und dann geschält. Die geschälten Samen wurden in 600 ml 100 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 5 mM DTT (Dithiothreit), 1 mM EDTA, 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) und 1 mM Benzamid gegeben und auf Eis mit einem Mörser zerrieben. Das zerriebene Material wurde mit 21.400 × g über 50 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Zu dem entstandenen Überstand wurden 10 % Polyethylenimin (pH-Wert 8,0) zu einem 1/20-Volumen zugegeben. Das Gemisch wurde bei 4°C über 15 Minuten gerührt und mit 15.700 × g über 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Zu dem entstandenen Überstand wurden 196 g/l (NH4)2SO4 unter Rühren zugegeben. Das Gemisch wurde über 30 Minuten in Eis gerührt und mit 15.700 × g über 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Zu dem entstandenen Überstand wurden weitere 142 g/l (NH4)2SO4 unter Rühren zugegeben. Nach dem Rühren in Eis über 30 Minuten wurde das Gemisch mit 15.700 × g über 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der entstandene Niederschlag wurde in 50 ml 100 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4) und 5 mM DTT (Dithiothreit) gelöst, und die Lösung wurde gegen 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 1 mM DTT (Dithiothreit) und 1 mM EDTA bei 4°C über Nacht dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Suspension mit 70.000 × g über 60 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Zu dem entstandenen Überstand wurden 1 mM Benzamidin·HCl, 5 mM &egr;-Amino-n-capronsäure, 1 &mgr;g/ml Antipain, 1 &mgr;g/ml Leupeptin und 10 mM EGTA zugegeben, und 2 M KCl wurde darüber hinaus nach und nach in einem Volumen von 1/40 zugegeben. Das Gemisch wurde auf eine DEAE-Sephacel-Säule (Pharmacia, 2.5 cm × 21.5 cm) gegeben, mit 0,05 M KCl, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 1 mM DTT (Dithiothreit) und 1 mM EDTA äquilibriert, und die adsorbierten Proteine wurden mit einem Gradienten von 0,05 bis 0,5 M KCl eluiert. Die Reinigungsschritte bis zu diesem Stadium wurden dreimal wiederholt, und Fraktionen, die Raffinosesynthetase-Aktivität aufwiesen, wurden kombiniert und anschließend wie folgt gereinigt:

Zu der eluierten Fraktion mit Raffinosesynthetase-Aktivität wurde nach und nach gesättigtes (NH4)2SO4 zu einem Volumen von R zugegeben. Die Lösung wurde auf eine Säule aus Phenyl-Sepharose (Pharmacia, 2.5 cm × 10.2 cm) gegeben, die mit 20 % gesättigtem (NH4)2SO4, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 1 mM DTT (Dithiothreit) und 1 mM EDTA äquilibriert worden war, und die adsorbierten Proteine wurden mit einem Gradienten von 20 % bis 0 % (NH4)2SO4 eluiert. Die entstandene aktive Fraktion wurde durch die Zugabe von 0,01 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH-Wert 7,5) auf ein 2-faches Volumen verdünnt. Die verdünnte Lösung wurde auf eine Econo-Pac 1ODG-Säule (BioRad, 5 ml) gegeben, die zuvor mit 0,01 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH-Wert 7,5) und 2 mM DTT (Dithiothreit) äquilibriert worden war, und die adsorbierten Proteine wurden mit einem Gradienten von 0,01 bis 0,5 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH-Wert 7,5) und 2 mM DTT (Dithiothreit) eluiert. Es stellte sich heraus, dass die aktive Fraktion, die bis zu diesem Stadium erhalten worden war, auf 6.500-fache oder höhere spezifische Aktivität gereinigt worden war. Ein Teil der entstandenen gereinigten Proteinlösung mit Raffinosesynthetase-Aktivität wurde auf eine Superdex 200-Säule (Pharmacia, 1.6 cm × 60 cm) gegeben, die mit 0,2 M KCl, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 1 mM DTT (Dithiothreit) und 1 mM EDTA äquilibriert worden war. Die auf diese Weise aufgetrennten Proteine wurden der SDS-PAGE unterzogen, und die Raffinosesynthetase-Aktivität wurde gemessen. Es wurde eine Proteinbande mit Raffinosesynthetase-Aktivität identifiziert, die ein Molekulargewicht von etwa 90 kDa bei der SDS-PAGE aufwies.

Beispiel 4 (Analyse eines Teilabschnitts der Aminosäuresequenz von Raffinosesynthetase)

Zu etwa 1 ml der gereinigten Proteinlösung, die in Beispiel 3 mit einer Econo-Pac 1ODG-Säule (BioRad, 5 ml) gereinigt worden war, wurde 100 % TCA in einem Volumen von 1/9 zugegeben, und das Gemisch wurde über 30 Minuten auf Eis stehen gelassen. Nach Zentrifugation bei 10.000 × g über 15 Minuten wurde der entstandene Niederschlag in 500 &mgr;l kaltem Aceton (–20°C) suspendiert, anschließend wiederum zentrifugiert. Diese Waschung mit Aceton wurde wiederholt, und der gesammelte Niederschlag wurde getrocknet und dann in 200 &mgr;l SDS-Probenpufferlösung gelöst und anschließend der SDS-PAGE unterzogen. Nach Elektrophorese wurde das Gel CBB-gefärbt, aus dem die Bande eines Raffinosesynthetase-Proteins ausgeschnitten wurde.

Zu dem auf diese Weise gewonnenen Gel wurden 1 ml 50 %iges Acetonitril und 0,2 M Ammoniumcarbonat (pH-Wert 8,9) zugegeben, und die Waschung wurde unter Rühren bei Zimmertemperatur über 20 Minuten fortgesetzt. Das Gel wurde noch einmal in gleicher Weise gewaschen und unter reduziertem Druck bis zu einem Ausmaß getrocknet, dass eine Volumenreduktion eintrat. Zu diesem Gel wurden 1 ml 0,02 % Tween-20 und 0,2 M Ammoniumcarbonat (pH-Wert 8,9) gegeben, und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über 15 Minuten gerührt. Nach Entfernung der Lösung wurden 400 &mgr;l 8 M Harnstoff und 0,4 M NH4HCO3 zugegeben, dann wurden weiter 40 &mgr;l of 45 mM DTT (Dithiothreit) zugegeben, und das Gemisch wurde bei 50°C über 20 Minuten stehen gelassen. Nach vollständiger Rückkehr auf Zimmertemperatur wurden 4 &mgr;l 1 M Jodessigsäure zugegeben, und das Gemisch wurde im Dunkeln bei Zimmertemperatur 20 Minuten gerührt. Nach Entfernung der Lösung wurde 1 ml gereinigtes Wasser zugegeben, und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über 5 Minuten gerührt, anschließend gewaschen. Nach zwei weiteren Waschungen wurden 1 ml 50 %iges Acetonitril und 0,2 M Ammoniumcarbonat (pH-Wert 8,9) zugegeben, und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über 15 Minuten gerührt. Die gleiche Behandlung wurde noch einmal wiederholt, worauf die Lösung entfernt wurde, und das Gel wurde unter reduziertem Druck zu einem Ausmaß getrocknet, dass eine Volumenreduktion eintrat.

Zu diesem Gel wurde eine Achromobacter-Protease-I-Lösung (Takara, Rest-spezifischer Protease-Kit) mit einem Volumen von 100 &mgr;l zugegeben. Darüber hinaus wurden 0,02 % Tween-20 und 0,2 M Ammoniumcarbonat (pH-Wert 8,9) in einer Menge zugegeben, dass das Gel nicht aus der Oberfläche der Lösung hervorstand, und das Gemisch wurde bei 37°C über 42 Stunden stehen gelassen. Darüber hinaus wurden 500 &mgr;l 0,09 %ige TFA und 70 % Acetonitril zugegeben, und das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur über 30 Minuten gerührt. Das entstandene Gemisch wurde in einem Probenröhrchen in ein Ultraschallbad überführt und über 5 Minuten mit Ultraschall behandelt (BRANSON, 60 W Leistung). Die auf diese Weise behandelten Röhrchen mit Inhalten wurden zentrifugiert, und der entstehende Extrakt wurde in einem weiteren, mit Silikon überzogenen Probenröhrchen gesammelt. Andererseits wurden 500 &mgr;l 0,09 % TFA und 70 % Acetonitril wiederum zu dem Niederschlag zugegeben, gefolgt von wiederholter Extraktion in gleicher Weise, wie vorstehend beschrieben. Die entstandenen Extrakte wurden kombiniert und dann unter reduziertem Druck zu einem Ausmaß konzentriert, dass eine Lösung mit einem Volumen von 200 bis 300 &mgr;l übrig blieb. Zu dem Konzentrat wurden 25 &mgr;l 8 M Harnstoff und 0,4 M NH4HCO3 zugegeben, und das Gemisch wurde in einem Ausmaß konzentriert, dass eine Lösung mit einem Volumen von 100 &mgr;l oder weniger übrig blieb. Das Konzentrat wurde mit gereinigtem Wasser auf etwa 100 &mgr;l gebracht, und das Gemisch wurde durch einen Ultrafree C3 GV-Filter (Millipore) filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde dann durch eine Aquapore BU-300 C-4-Säule (2,1 mm × 300 mm) mittels eines Gradienten von 0,1 % TFA/2,1 % bis 68,6 % Acetonitril eluiert. Die Absorption bei 215 nm wurde überwacht, um eine Fraktion mit einem Gipfel bei dieser Absorption zu sammeln. Die gesammelte Probe wurde unter reduziertem Druck bis zur vollständigen Trockenheit eingedampft und dann mit einem Proteinsequenziergerät 473A von ABI analysiert, um einen Teilabschnitt der Aminosäuresequenz einer Raffinosesynthetase zu bestimmen.

Beispiel 5 (Herstellung von cDNA)

Etwa 2 g unreife Samen der Dicken Bohne (Nintoku Issun) wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann mit einem Mörser zerrieben, 20 ml Isogen (Nippon Gene) wurden hinzu gegeben, und das Gemisch wurde weiterhin gründlich zerrieben. Das zerriebene Material wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt, zu welchem 4 ml Chloroform zugegeben wurden, und das Gemisch wurde mit einem Vortex-Mischgerät gerührt und dann bei 6.500 × g über 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die wässrige Schicht wurde gesammelt, und 10 ml Isopropanol wurden zugegeben, und das Gemisch wurde gerührt und dann bei 6.500 × g über 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde mit 10 ml 70 %igem Ethanol gewaschen und dann in 1 ml Elutionspufferlösung (10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 % SDS) gelöst. Die Lösung wurde bei 60°C über 10 Minuten stehen gelassen und dann bei 10.000 × g über 1 Minute zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Zu dem entstandenen Überstand wurde ein äquivalentes Volumen an Oligotex-dT30 (Takara) zugegeben, und das Gemisch wurde gerührt und dann bei 65°C über 5 Minuten stehen gelassen. Das Gemisch wurde auf Eis gestellt und dann über 3 Minuten stehen gelassen, worauf 200 &mgr;l 5 M NaCl zugegeben wurden, und das Gemisch wurde bei 37°C über 10 Minuten stehen gelassen. Das Gemisch wurde dann bei 10.000 × g bei 4°C über 3 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde gesammelt und dann in 1 ml TE-Pufferlösung suspendiert, und die Suspension wurde bei 65°C über 5 Minuten stehen gelassen, worauf sie auf Eis gestellt und über 3 Minuten stehen gelassen wurde, anschließend wurde sie bei 10.000 × g über 3 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen.

Zu dem entstandenen Niederschlag wurden 100 &mgr;l 3 M Natriumacetat und 2 ml Ethanol zugegeben, und RNA wurde durch Ethanol ausgefällt und gesammelt. Die gesammelte RNA wurde zweimal mit 70 %igem Ethanol gewaschen und dann in 20 &mgr;l sterilisiertem Wasser gelöst, was für die anschließende Synthese von cDNA verwendet wurde. Die Menge an erhaltener RNA wurde durch die Messung der Absorption bei 260 nm bestimmt.

Für die Synthese von cDNA wurden der First Strand Synthesis Kit für RT-PCR (Amersham) und cDNA Synthesis Kit (Takara) verwendet, und alle Schritte wurden im Einklang mit den Anweisungen durchgeführt.

Beispiel 6 (Nucleotidsequenz-Analyse des Raffinosesynthetase-Gens von cDNA)

Basierend auf der in Beispiel 4 erhaltenen Aminosäuresequenz wurden gemischte synthetische DNA-Primer mit den in der nachstehenden Liste 5 angeführten Nucleotidsequenzen synthetisiert. Das PCR-Verfahren wurde mit den Gene Amp PCR Systems 2400 und DNA Thermal Cycler, Modell 480 von Perkin-Elmer, unter Verwendung des Klen Taq cDNA Kit von Clontech durchgeführt. Die Polymerase-Kettenreaktion wurde mit vorstehenden Primern bei 94°C über 1 Minute, bei 50°C über 3 Minuten und bei 72°C über 3 Minuten durchgeführt, und diese Reaktion wurde 40 Mal wiederholt. Als ein Ergebnis ergaben die Kombinationen von Primern 8,2 und 13,3 RV, Primern 13,4 und 10,3 RV und Primern 7,4 und 10,3 RV, die die in der nachstehenden Liste 5 angeführten Nucleotidsequenzen besaßen, eine Amplifizierung der 1,2 kB-, 0,5 kB- beziehungsweise 1,2 kB-Banden. Diese amplifizierten DNA-Fragmente wurden mit einem TA-Clonierungskit (Invitrogen) cloniert, worauf eine Sequenzreaktion unter Verwendung des ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit von Perkin-Elmer und eine Analyse der Nucleotidsequenz mit einem 373S-DNA-Sequenziergerät von ABI folgten. Als ein Ergebnis stellte sich heraus, dass diese DNA-Fragmente eine Nucleotidsequenz aufwiesen, die sich von Base 813 bis Base 1915, Base 1936 bis Base 2413 beziehungsweise Base 1226 bis Base 2413 in der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 erstreckten. Basierend auf diesen Nucleotidsequenzen wurden synthetische DNA-Primer mit den in der nachstehenden Liste 6 angeführten Nucleotidsequenzen hergestellt, und die Nucleotidsequenzen in beiden terminalen Regionen der cDNA wurden unter Verwendung des Marathon cDNA Amplification Kit von Clontech analysiert. Als ein Ergebnis wurde die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 schließlich bestimmt.

(Liste 5)

(Liste 6)

Beispiel 7 (Clonierung des Raffinosesynthetase-Gens von cDNA der Dicken Bohne)

Die nach der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 entworfenen Primer, d.h. Primer mit Nucleotidsequenzen, die in der nachstehenden Liste 7 angeführt sind, wurden synthetisiert. Unter Verwendung dieser Primer und von in Beispiel 5 erhaltener cDNA als einer Matrize wurde ein DNA-Fragment der Region des offenen Leserahmens mittels PCR unter den in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen amplifiziert. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und XbaI, deren Erkennungssequenzen in den verwendeten Primern enthalten waren, gespalten. Unter Verwendung des Ligation Kit (Takara) wurde das auf diese Weise gespaltene DNA-Fragment in das Plasmid pBluescriptII KS- (Stratagene), das zuvor mit BamHI und XbaI gespalten worden war, cloniert. Die Nucleotidsequenz des clonierten DNA-Fragments wurde mit dem ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit von Perkin-Elmer bestätigt. Es stellte sich heraus, dass in dem auf diese Weise erhaltenen Clon die Base an Position 1591 in der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 von Thymin (T) zu Cytosin (C) verändert worden war. Dies war jedoch eine Nonsense-Mutation ohne eine Änderung der Aminosäure; daher wurde dieser Clon als pBluescriptKS-RS bezeichnet und in dem nachfolgenden Experiment verwendet.

(Liste 7)

Beispiel 8 (Expression des Raffinosesynthetase-Gens der Dicken Bohne in E. coli)

Das Plasmid pBluescriptKS-RS, das das in Beispiel 7 erhaltene Raffinosesynthetase-Gen der Dicken Bohne trägt, wurde mit BamHI und NotI gespalten und in das Plasmid pGEX-4T3 (Pharmacia) cloniert, das mit BamHI und NotI gespalten worden war, um das Plasmid pGEX-RS zu ergeben, wie in 1 dargestellt.

Das Plasmid pBluescriptKS-RS wurde mit NcoI and XbaI gespalten und in das Plasmid pTrc99A (Pharmacia) cloniert, das mit NcoI and XbaI gespalten worden war, um das Plasmid pTrc-RS, wie in 1 gezeigt, zu ergeben.

Diese Plasmide wurden in den Stamm HB101 von E. coli eingeführt, und die entstandenen Transformanten wurden zur Bestätigung der Expression der Raffinosesynthetase verwendet. Über-Nacht-Kulturen der Transformanten wurden mit einem Volumen von jeweils 1 ml in 100 ml LB-Kulturmedium geimpft und bei 37°C über etwa 3 Stunden inkubiert, anschließend erfolgte die Zugabe von IPTG (Isopropylthio-&bgr;-D-galactosid) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM und weitere Inkubation über 5 Stunden. Die Kulturen wurden mit 21.400 × g über 10 Minuten zentrifugiert, und die Bakterienzellen wurden gesammelt. Die gesammelten Bakterienzellen wurden bei –80°C gelagert. Zu den gefrorenen Bakterienzellen wurde ein 10faches Volumen an 100 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 1 mM EDTA, 5 mM DTT (Dithiothreit), 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) und 1 mM Benzamid zugegeben, und die Bakterienzellen wurden aufgetaut und suspendiert. Diese Suspensionen wurden mit einem Ultraschallaufbruchgerät (Branson) behandelt, um den Aufbruch der Bakterienzellen zu erreichen. Die erhaltenen aufgebrochenen Zellgemische wurden bei 16.000 × g über 10 Minuten zentrifugiert, und lösliche Proteinlösungen wurden gesammelt.

Die auf diese Weise erhaltenen Proteinlösungen wurden mit einem Volumen von jeweils 4 &mgr;l zur Messung der Aktivität der Raffinosesynthetase im Einklang mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet. Die Reaktion wurde bei 37°C über 64 Stunden durchgeführt. Als eine Kontrolle wurde der Stamm HB101 von E. coli verwendet, der mit einem der Vektoren, pGEX-4T3, transformiert worden war. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt. Die Synthese von Raffinose wurde in den Proben der Transformanten HB101 (pGEX-RS) und HB101 (pTrc-RS) nachgewiesen.

TABELLE 1

Beispiel 9 (Clonierung des Raffinosesynthetase-Gens von cDNA der Sojabohne)

In gleicher Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde c-DNA von unreifen Samen der Sojabohne (Glycine max) Williams 82 gewonnen. Unter Verwendung dieser cDNA als eine Matrize und von Primern, die nach der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 entworfen worden waren, d.h. Primer mit den in der nachstehenden Liste 8 angeführten Nucleotidsequenzen, wurde ein DNA-Fragment mittels PCR unter den in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen amplifiziert. Das auf diese Weise durch PCR amplifizierte DNA-Fragment wurde mit einem TA-Clonierungskit (Invitrogen) cloniert, gefolgt von der Sequenzreaktion unter Verwendung des ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit von Perkin-Elmer und der Analyse der Nucleotidsequenz mit einem 373S-DNA-Sequenziergerät von ABI. Basierend auf dieser Sequenz wurden Primer mit in der nachstehenden Liste 9 angegebenen Nucleotidsequenzen synthetisiert. Die Synthese der cDNA wurde mit dem Marathon-Kit von Clontech unter Verwendung von mRNA durchgeführt, die in gleicher Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, von Blättern der Sojabohne Williams 82 erhalten wurde. Die erhaltene cDNA wurde mit Ligase an einen in diesem Kit enthaltenen Adapter ligiert. Dieser Schritt wurde im Einklang mit der beiliegenden Anweisung durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise hergestellten, über den Adapter ligierten cDNA wurde die Polymerase-Kettenreaktion mit den in der nachstehenden Liste 9 angeführten Primern durchgeführt. Die Nucleotidsequenzen in beiden terminalen Regionen des Gens wurden im Einklang mit der dem Marathon Kit beiliegenden Anweisung durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 4 bestimmt.

(Liste 8)

(Liste 9)

Beispiel 10 (Beschaffung des Raffinosesynthetase-Gens von cDNA der Japanischen Artischocke)

In gleicher Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde cDNA von den Blättern der Japanischen Artischocke (Stachys sieboldii) erhalten. Unter Verwendung dieser cDNA als eine Matrize und Primern, die nach der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 entworfen worden waren, d.h. Primer mit in der nachstehenden Liste 10 angegebenen Nucleotidsequenzen, wurde ein DNA-Fragment mittels PCR unter den in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen amplifiziert. Das auf diese Weise durch PCR amplifizierte DNA-Fragment wurde mit einem TA-Clonierungskit (Invitrogen) cloniert, gefolgt von der Sequenzreaktion unter Verwendung des ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit von Perkin-Elmer und der Analyse der Nucleotidsequenz mit einem 373S-DNA-Sequenziergerät von ABI. Als ein Ergebnis wurde die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 6 bestimmt.

Basierend auf der auf diese Weise erhaltenen Nucleotidsequenz werden synthetisierte DNA-Primer hergestellt, und in gleicher Weise, wie in Beispiel 9 beschrieben, werden die Nucleotidsequenzen in beiden terminalen Regionen des Gens mit dem Marathon Kit von Clontech analysiert.

(Liste 10)

Beispiel 11 (Beschaffung des Raffinosesynthetase-Gens von cDNA von Mais)

In gleicher Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde cDNA von den Blättern des Mais (Zea mays L.) Pioneer 3358 erhalten. Unter Verwendung dieser cDNA als eine Matrize und von Primern, die nach der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 entworfen worden waren, d.h. Primer mit in der nachstehenden Liste 11 angegebenen Nucleotidsequenzen, wurde ein DNA-Fragment mittels PCR unter den in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen amplifiziert. Das auf diese Weise durch PCR amplifizierte DNA-Fragment wurde mit einem TA-Clonierungskit (Invitrogen) cloniert, gefolgt von der Sequenzreaktion unter Verwendung des ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit von Perkin-Elmer und der Analyse der Nucleotidsequenz mit einem 373S-DNA-Sequenziergerät von ABI. Basierend auf dieser Sequenz wurden Primer mit in der nachstehenden Liste 12 angeführten Nucleotidsequenzen synthetisiert. In gleicher Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde mRNA, die von den Blättern des Mais (Zea mays L.) Pioneer 3358 erhalten worden war, mit Ligase an einen in dem Matathon-Kit von Clontech enthaltenen Adapter ligiert. Dieser Schritt wurde im Einklang mit der beiliegenden Anweisung durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise hergestellten, über den Adapter ligierten cDNA wurde die Polymerase-Kettenreaktion mit den in der nachstehenden Liste 12 angeführten Primern in der vorstehend beschriebenen Weise durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 8 bestimmt.

Basierend auf der auf diese Weise erhaltenen Nucleotidsequenz wurden synthetisierte DNA-Primer hergestellt, und in gleicher Weise, wie in Beispiel 9 beschrieben, wird die Nucleotidsequenz in der 5'-terminalen Region des Gens mit dem Marathon Kit von Clontech analysiert.

(Liste 11)

(Liste 12)

Beispiel 12 (Konstruktion von Expressionsvektoren für das Chimäre Gen in Pflanzen, das 35S-Raffinosesynthetase-Gen der Dicken Bohne)

Das Plasmid pBluescriptKS-RS mit dem Raffinosesynthetase-Gen der Dicken Bohne, das in Beispiel 7 erhalten wurde, wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und SacI gespalten. Unter Verwendung des Ligation Kit (Takara) wurde das auf diese Weise gespaltene DNA-Fragment in den binären Vektor pBI121 (Clontech) cloniert, welcher zuvor mit BamHI und SacI gespalten worden war. Der auf diese Weise erhaltene Vektor wurde pBI121-RS genannt.

Für ein Antisense-Experiment wurde das zuvor mit BamHI und SacI gespaltene Plasmid pBI121 (Clontech) an Linker, die in der nachstehenden Liste 13 aufgeführt sind, ligiert, um pBI121(–) zu geben. Dieses pBI121(–) wurde verwendet, um pBI121(–)-RS in gleicher Weise herzustellen, wie vorstehend für die Herstellung von pBI121-RS beschrieben.

Ein ähnlicher Vektor wurde mit pBI221 hergestellt. Das in Beispiel 7 erhaltene Plasmid pBluescriptKS-RS wurde mit den Restriktionsendonucleasen BamHI und SacI gespalten. Unter Verwendung des Ligation Kit (Takara) wurde das auf diese Weise gespaltene DNA-Fragment in den Vektor pBI221 (Clontech) cloniert, welcher zuvor mit BamHI und SacI gespalten worden war. Der auf diese Weise erhaltene Vektor wurde pBI221-RS genannt.

Für ein Antisense-Experiment wurde das zuvor mit BamHI und SacI gespaltene Plasmid pBI221 (Clontech) an Linker, die in der nachstehenden Liste 13 aufgeführt sind, ligiert, um pBI221(–) zu ergeben. Dieses pBI221(–) wurde verwendet, um pBI221(–)-RS in gleicher Weise herzustellen, wie vorstehend für die Herstellung von pBI221-RS beschrieben wurde.

Die Konstruktion dieser Expressionsvektoren wird in den 2 und 3 dargestellt.

(Liste 13)

Beispiel 13 (Transformation von Senf mit dem Raffinosesynthetase-Gen der Dicken Bohne)

Die in Beispiel 12 hergestellten Vektoren pBI121-RS und pBI121(–)-RS wurden zur Transformation von Senf (Brassica juncia) durch das Verfahren der Infektion mit Agrobakterium verwendet.

Agrobacterium tumefaciens (Stamm C58C1, resistent gegen Rifampicin), das zuvor durch Behandlung mit Calciumchlorid in einen kompetenten Zustand versetzt worden war, wurde unabhängig mit zwei Plasmiden, pBI121-RS und pBI121(–)-RS, die in Beispiel 12 hergestellt worden waren, transformiert. Die Selektion auf Transformanten wurde auf LB-Kulturmedium durchgeführt, das 50 &mgr;g/ml Rifampicin und 25 &mgr;g/ml Kanamycin enthielt, indem das Kennzeichen der Resistenz gegen Kanamycin benutzt wurde, welches durch das Kanamycin-Resistenzgen (Neomycin-Phosphotransferase, NPTII) der eingeführten Plasmide übertragen wurde.

Das erhaltene transformierte Agrobakterium (Agrobacterium tumefaciens, Stamm C58, resistent gegen Rifampicin) wurde auf LB-Kulturmedium, das 50 &mgr;g/ml Rifampicin und 25 &mgr;g/ml Kanamycin enthielt, bei 28°C über einen ganzen Tag und eine ganze Nacht kultiviert, und die Kultur wurde zur Transformation von Senf durch das nachstehend beschriebene Verfahren verwendet.

Die Senfsamen wurden aseptisch auf 1/2 MS-Kulturmedium, 2 % Saccharose, 0,7 % Agar ausgesät. Nach einer Woche wurden Keimblätter und Blattstiele der keimenden Pflanzen mit einem Skalpell ausgeschnitten und auf MS-Kulturmedium, 3 % Saccharose, 0,7 % Agar, 4,5 &mgr;M BA, 0,05 &mgr;M 2,4-D, 3,3 &mgr;M AgNO3 übertragen und anschließend über 1 Tag kultiviert. Die vorinkubierten Keimblätter und Blattstiele wurden in eine 1000-fache Verdünnung der Agrobakterium-Kultur, um eine Infektion zu verursachen, über 5 Minuten übertragen. Die infizierten Keimblätter und Blattstiele wurden wieder in das selbe Kulturmedium wie das für die Vorinkubation verwendete übertragen und für 3 bis 4 Tage kultiviert. Die kultivierten Keimblätter und Blattstiele wurden in MS-Kulturmedium, 3 % Saccharose, 4,5 &mgr;M BA, 0,05 &mgr;M 2,4-D, 3,3 &mgr;M AgNO3, 500 mg/l Cefotaxim übertragen und unter Schwenken über 1 Tag sterilisiert. Die sterilisierten Keimblätter und Blattstiele wurden in MS-Kulturmedium, 3 % Saccharose, 0,7 % Agar, 4,5 &mgr;M BA, 0,05 &mgr;M 2,4-D, 3,3 &mgr;M AgNO3, 100 mg/l Cefotaxim, 20 mg/l Kanamycin übertragen und über 3 bis 4 Wochen kultiviert. Die Keimblätter und Blattstiele wurden in MS-Kulturmedium, 3 % Saccharose, 0,7 % Agar, 4,5 &mgr;M BA, 0,05 &mgr;M 2,4-D, 100 mg/l Cefotaxim, 20 mg/l Kanamycin übertragen und kultiviert. Die Kultivierung auf diesem Kulturmedium wurde mit Subkultivierungen in Intervallen von 3 bis 4 Wochen fortgesetzt. Wenn die Regeneration der Schösslinge eintrat, wurden diese Schösslinge auf MS-Kulturmedium, 3 % Saccharose, 0,7 % Agar, 20 mg/l Kanamycin subkultiviert und über 3 bis 4 Wochen kultiviert. Die Wurzeln bildenden Pflanzen wurden auf Vermikulit:Torfmoos = 1:1 übertragen und auf 21°C bis 22°C in einem Tag/Nacht-Rhythmus = 12 Stunden:12 Stunden konditioniert. Mit fortschreitendem Wachstum des Pflanzenkörpers wurden die Pflanzen in geeigneter Kultivierungserde gezogen. Von Blättern der regenerierten Pflanzen wurde genomische DNA im Einklang mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren extrahiert, und die Gen-Insertion in das Pflanzengenom wurde mittels PCR unter Verwendung der in der nachstehenden Liste 14 angeführten Primer bestätigt.

(Liste 14)

Beispiel 14 (Transformation eines somatischen Embryos der Sojabohne mit dem Raffinosesynthetase-Gen der Dicken Bohne)

Kultivierte Zellen eines somatischen Embryos der Sojabohne „Fayette" (400 bis 500 mg FW) wurden einschichtig innerhalb eines Kreises mit einem Durchmesser von 20 mm auf dem zentralen Abschnitt einer 6 cm großen Agarplatte angeordnet. Zwei Plasmide, pBI221-RS und pBI221(–)-RS mit chimären Genen, die aus dem Raffinosesynthetase-Gen und dem 35S-Promotor in Beispiel 12 hergestellt worden waren, wurden im Einklang mit der Offenlegung der japanischen Patentanmeldung Nr. 3-291501/1991 in die somatischen Sojabohnenembryos eingeführt. Das heißt, diese Plasmide wurden mit dem &bgr;-Glucuronidase (GUS)/Hygromycin-Resistenz-Gen (HPT)-Koexpressionsvektor pSUM-GH:NotI zur Selektion vermischt, beschrieben in Soshiki Baiyo, 20, 323-327 (1994). Diese gemischten Plasmide wurden für die Gen-Einführung in die somatischen Embryos der Sojabohne mit einer Partikelkanone (800 mg/überzogene Goldpartikel 200 &mgr;g/Schuss; Projektilstopper-Probendistanz, 100 mm) verwendet. Nach der Einführung wurden Rotationskulturen in dem MS-modifizierten flüssigen Wachstumsmedium (Sigma), das 25 bis 50 &mgr;g/ml Hygromycin enthielt, unter Beleuchtung bei 25°C über 16 Stunden gezüchtet, und transformierte somatische Embryos wurden selektiert.

Mit den gegen Hygromycin resistenten somatischen Sojabohnenembryos mit einer gelblich-grünen Farbe und Fähigkeit zum Wachstum, die nach etwa 3 Monaten selektiert wurden, wird die Polymerisation-Kettenreaktion mit Primern, die in der vorstehenden Liste 14 angeführt sind, durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Region des Raffinosesynthetase-Gens der Dicken Bohne amplifiziert wird oder nicht. Dies bestätigt, dass das Raffinosesynthetase-Gen der Dicken Bohne in das Genom der Sojabohne inseriert ist.

Darüber hinaus werden die erhaltenen somatischen Embryos zur Regeneration von Pflanzen verwendet, um transformierte Sojabohne mit dem Raffinosesynthetase-Gen der Dicken Bohne zu bilden.

Zusammensetzung des Kulturmediums

LB- und MS-Kulturmedien, die in den vorstehenden Beispielen verwendet worden sind, weisen die nachstehenden Zusammensetzungen auf. (LB-Kulturmedium) Bacto-Trypton 10 g Bacto-Hefeextrakt 5 g NaCl 10 g/l Liter H2O (pH 7,0)
(MS-Kulturmedium) KNO3 2022 mg/l NH4NO3 1650 mg/l NH4Cl 2140 mg/l KH2PO4 170 mg/l MgSO4·7H2O 370 mg/l CaCl2·2H2O 440 mg/l MnSO4·4H2O 22,3 mg/l ZnSO4·7H2O 8,6 mg/l CuSO4·5H2O 0,025 mg/l KI 0,83 mg/l CoCl2·6H2O 0,025 mg/l H3BO3 6,2 mg/l NaMoO4·2H2O 0,25 mg/l FeSO4·7H2O 27,8 mg/l Na2EDTA 37,3 mg/l Nicotinsäure 0,5 mg/l Thiamin HCl 1 mg/l Pyridoxin HCl 0,5 mg/l Inosit 100 mg/l Glycin 2 mg/l

Kurze Beschreibung der Sequenzen 1. SEQ ID NO: 1:

Die Sequenz der SEQ ID NO: 1 stellt eine Aminosäuresequenz eines Raffinosesynthetase-Proteins dar, die in dem von der Dicken Bohne erhaltenen Raffinosesynthetase-Gen codiert ist.

2. SEQ ID NO: 2:

Die Sequenz der SEQ ID NO: 2 stellt eine cDNA-Nucleotidsequenz des von der Dicken Bohne erhaltenen Raffinosesynthetase-Gens dar.

3. SEQ ID NO: 3:

Die Sequenz der SEQ ID NO: 3 stellt eine Aminosäuresequenz eines Raffinosesynthetase-Proteins dar, die in dem von der Sojabohne erhaltenen Raffinosesynthetase-Gen codiert ist.

4. SEQ ID NO: 4:

Die Sequenz der SEQ ID NO: 4 stellt eine cDNA-Nucleotidsequenz des von der Sojabohne erhaltenen Raffinosesynthetase-Gens dar.

5. SEQ ID NO: 5:

Die Sequenz der SEQ ID NO: 5 stellt eine Aminosäuresequenz eines Raffinosesynthetase-Proteins dar, die in dem von der Japanischen Artischocke erhaltenen Raffinosesynthetase-Gen codiert ist.

6. SEQ ID NO: 6:

Die Sequenz der SEQ ID NO: 6 stellt eine cDNA-Nucleotidsequenz des von der Japanischen Artischocke erhaltenen Raffinosesynthetase-Gens dar.

7. SEQ ID NO: 7:

Die Sequenz der SEQ ID NO: 7 stellt eine Aminosäuresequenz eines Raffinosesynthetase-Proteins dar, die in dem von Mais erhaltenen Raffinosesynthetase-Gen codiert ist.

8. SEQ ID NO: 8:

Die Sequenz der SEQ ID NO: 8 stellt eine cDNA-Nucleotidsequenz des von Mais erhaltenen Raffinosesynthetase-Gens dar.

9. Liste 1:

Die in Liste 1 dargestellten Nucleotidsequenzen sind die der typischen Primer, die für die Amplifizierung eines cDNA-Fragmentes eines Raffinosesynthetase-Gens verwendet worden sind. Alle diese Sequenzen basieren auf der Nucleotidsequenz in der nicht codierenden Region des Gens. Primer 1 ist ein Sense-Primer, der dem 5'-Terminus eines cDNA-Fragmentes des von der Dicken Bohne stammenden Raffinosesynthetase-Gens entspricht. Primer 2 und 3 sind Antisense-Primer, die dem 3'-Terminus eines cDNA-Fragments des von der Dicken Bohne stammenden Raffinosesynthetase-Gens entsprechen. Primer 4 ist ein Sense-Primer, der dem 5'-Terminus eines cDNA-Fragmentes des von der Sojabohne stammenden Raffinosesynthetase-Gens entspricht. Primer 5 und 6 sind Antisense-Primer, die dem 3'-Terminus des cDNA-Fragments des von der Sojabohne stammenden Raffinosesynthetase-Gens entsprechen. In Abhängigkeit von dem Zweck können Erkennungssequenzen für geeignete Restriktionsendonucleasen an die 5'-Termini dieser Nucleotidsequenzen in einer geeigneten Weise angefügt werden.

10. Liste 2:

Die in Liste 2 dargestellten Nucleotidsequenzen sind die von typischen Primern, die für die Amplifizierung eines offenen Leserahmens verwendet werden, der die Aminosäuresequenz eines Raffinosesynthetase-Proteins in der cDNA-Sequenz eines Raffinosesynthetase-Gens codiert. Primer 1 und 2 sind Sense-Primer, die dem N-Terminus des von der Dicken Bohne stammenden Raffinosesynthetase-Proteins entsprechen. Primer 3 und 4 sind Antisense-Primer, die dem C-Terminus des von der Dicken Bohne stammenden Raffinosesynthetase-Proteins entsprechen. Primer 5 und 6 sind Sense-Primer, die dem N-Terminus des von der Sojabohne stammenden Raffinosesynthetase-Proteins entsprechen. Primer 7 und 8 sind Antisense-Primer, die dem C-Terminus des von der Sojabohne stammenden Raffinosesynthetase-Proteins entsprechen. In Abhängigkeit von dem Zweck können Erkennungssequenzen für geeignete Restriktionsendonucleasen an die 5'-Termini dieser Nucleotidsequenzen in einer geeigneten Weise angefügt werden.

11. Liste 3:

Die in Liste 3 dargestellten Aminosäuresequenzen sind Teilabschnitte der Aminosäuresequenzen eines Raffinosesynthetase-Proteins.

#1 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 110 bis Aminosäure 129 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#2 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 234 bis Aminosäure 247 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#3 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 265 bis Aminosäure 279 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#4 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 296 bis Aminosäure 312 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#5 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 346 bis Aminosäure 361 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#6 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 383 bis Aminosäure 402 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#7 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 411 bis Aminosäure 433 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#8 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 440 bis Aminosäure 453 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#9 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 457 bis Aminosäure 468 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#10 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 471 bis Aminosäure 516 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#11 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 517 bis Aminosäure 559 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#12 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 574 bis Aminosäure 582 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#13 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 586 bis Aminosäure 609 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#14 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 615 bis Aminosäure 627 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

#15 ist dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz äquivalent, der sich von Aminosäure 716 bis Aminosäure 724 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

12. Liste 4:

Die in Liste 4 dargestellten Nucleotidsequenzen sind die von typischen Primern, die basierend auf einigen der in Liste 3 dargestellten Aminosäuresequenzen synthetisiert wurden. Das nach der Nummer des Primers verwendete Symbol „F" bedeutet, dass der durch dieses Symbol gekennzeichnete Primer eine Sense-Sequenz hat. Das nach der Nummer des Primers verwendete Symbol „RV" bedeutet, dass der durch dieses Symbol gekennzeichnete Primer eine Antisense-Sequenz hat. Primer 1 entspricht dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz, der sich von Aminosäure 119 bis Aminosäure 129 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt. Primer 2 entspricht dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz, der sich von Aminosäure 234 bis Aminosäure 247 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt. Primer 3 entspricht dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz, der sich von Aminosäure 265 bis Aminosäure 279 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt. Primer 4 entspricht dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz, der sich von Aminosäure 458 bis Aminosäure 468 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt. Primer 5 entspricht dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz, der sich von Aminosäure 522 bis Aminosäure 534 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt. Primer 6 entspricht dem Teilabschnitt der Aminosäuresequenz, der sich von Aminosäure 716 bis Aminosäure 724 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 erstreckt.

13. Liste 5:

Die in Liste 5 dargestellten Nucleotidsequenzen sind die von typischen Primern, die basierend auf den Teilabschnitten der Aminosäuresequenzen des gereinigten Raffinosesynthetase-Proteins der Dicken Bohne synthetisiert wurden. Die in Klammern dargestellten Basen bedeuten, dass ein Gemisch dieser Basen bei der Synthese verwendet wurde. Das nach der Nummer der Primer verwendete Symbol „RV" bedeutet, dass der durch dieses Symbol gekennzeichnete Primer eine Antisense-Sequenz besitzt.

14. Liste 6:

Die in Liste 6 dargestellten Nucleotidsequenzen sind die von typischen Primern, die für die Analyse von beiden terminalen Regionen einer cDNA-Nucleotidsequenz des Raffinosesynthetase-Gens der Dicken Bohne durch das RACE-Verfahren verwendet wurden. Das nach der Nummer der Primer verwendete Symbol „RV" bedeutet, dass der durch dieses Symbol gekennzeichnete Primer eine Antisense-Sequenz besitzt.

15. Liste 7:

Die in Liste 7 dargestellten Nucleotidsequenzen sind die von typischen Primern, die bei der Clonierung des Raffinosesynthetase-Gens der Dicken Bohne verwendet wurden. RS-N entspricht dem N-Terminus des offenen Leserahmens und enthält zwei Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen BamHI und NcoI auf der 5'-terminalen Seite. RS-C ist ein Antisense-Primer, der dem C-Terminus des offenen Leserahmens entspricht, und enthält eine Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease XbI auf der 5'-terminalen Seite.

16. Liste 8:

Die in Liste 8 dargestellten Nucleotidsequenzen sind die von typischen Primern, die bei der Clonierung eines Fragmentes des Raffinosesynthetase-Gens der Sojabohne verwendet wurden. Die durch das Symbol „I" gekennzeichnete Base war Inosin, das bei der Synthese verwendet wurde. Das nach der Nummer des Primers verwendete Symbol „RV" bedeutet, dass der durch dieses Symbol gekennzeichnete Primer eine Antisense-Sequenz besitzt.

17. Liste 9:

Die in Liste 9 dargestellten Nucleotidsequenzen sind die von typischen Primern, die für die Analyse der cDNA-Nucleotidsequenz eines Fragmentes des Raffinosesynthetase-Gens der Sojabohne verwendet wurden. Das nach der Nummer des Primers verwendete Symbol „RV" bedeutet, dass der durch dieses Symbol gekennzeichnete Primer eine Antisense-Sequenz besitzt.

Die Analyse der Nucleotidsequenzen wurde durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von SN-1 und SV-3RV durchgeführt. SC-5 und SC-6 wurden für die Analyse einer Nucleotidsequenz in der 3'-terminalen Region verwendet, und SN-3RV und SN-4RV wurden für die Analyse einer Nucleotidsequenz in der 5'-terminalen Region verwendet.

18. Liste 10:

Die in Liste 10 dargestellten Nucleotidsequenzen sind die von typischen Primern, die für die Analyse der cDNA-Nucleotidsequenz eines Fragmentes des Raffinosesynthetase-Gens der Japanischen Artischocke verwendet wurden. Die durch das Symbol „I" gekennzeichnete Base war Inosin, das bei der Synthese verwendet wurde. Das nach der Nummer des Primers verwendete Symbol „RV" bedeutet, dass der durch dieses Symbol gekennzeichnete Primer eine Antisense-Sequenz besitzt.

19. Liste 11:

Die in Liste 11 dargestellten Nucleotidsequenzen sind die von typischen Primern, die für die Analyse der cDNA-Nucleotidsequenz eines Fragmentes des Raffinosesynthetase-Gens von Mais verwendet wurden. Die durch das Symbol „I" gekennzeichnete Base war Inosin, das bei der Synthese verwendet wurde. Das nach der Nummer des Primers verwendete Symbol „RV" bedeutet, dass der durch dieses Symbol gekennzeichnete Primer eine Antisense-Sequenz besitzt.

20. Liste 12:

Die in Liste 12 dargestellten Nucleotidsequenzen sind die von typischen Primern, die für die Analyse der cDNA-Nucleotidsequenz eines Fragmentes des Raffinosesynthetase-Gens von Mais verwendet wurden. M-10 und M-11 wurden für die Analyse einer Nucleotidsequenz in der 3'-terminalen Region verwendet.

21. Liste 13:

Die in Liste 13 dargestellten Nucleotidsequenzen sind die von typischen Adaptern, die für die Konstruktion von Vektoren für Antisense-Experimente verwendet wurden.

Diese synthetischen DNA-Fragmente nehmen eine doppelsträngige Form an, wenn sie vermischt werden, weil sie komplementäre Stränge sind. Dieses doppelsträngige DNA-Fragment besitzt an beiden Termini kohäsive Enden von Spaltstellen für die Restriktionsendonucleasen BamHI und SacI und enthält die Restriktionsstellen für die Restriktionsendonucleasen BamHI und SacI in der doppelsträngigen Region.

22. Liste 14:

Die in Liste 14 dargestellten Nucleotidsequenzen sind die von typischen Primern, die für das PCR-Experiment verwendet wurden, um die Gen-Einführung in das Genom einer rekombinanten Pflanze zu bestätigen. 35S ist ein Primer an der 35S-Promoter-Stelle, der zur stromabwärts gelegenen Region gerichtet ist, und NOS ist ein Primer an der NOS-Terminator-Stelle, der zur stromaufwärts gelegenen Region gerichtet ist. RS-F ist ein Sense-Primer des Raffinosesynthetase-Gens der Dicken Bohne, und RS-RV ist ein Antisense-Primer des Raffinosesynthetase-Gens der Dicken Bohne.

SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZPROTOKOLL


Anspruch[de]
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Pflanzen-Raffinosesynthetase codiert, die fähig ist, Raffinose herzustellen durch die Verknüpfung einer D-Galactosylgruppe über eine &agr; (1→6)-Bindung mit einer Hydroxylgruppe, die an das Kohlenstoffatom in der Position 6 des D-Glucoserestes in einem Saccharosemolekül gebunden ist, wobei das Nucleinsäuremolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 7 codieren;

(b) Nucleinsäuremolekülen, umfassend den codierenden Bereich einer Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8;

(c) Nucleinsäuremolekülen, die mit dem komplementären Strang eines Nucleinsäuremoleküls wie unter (a) oder (b) angegeben bei stringenten Bedingungen hybridisieren, wobei die Pflanze eine Leguminose, ein Lippenblütler (Lamiaceae) oder eine Monokotyledone ist;

(d) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz sich aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der Sequenz eines der Nucleinsäuremoleküle von (a) bis (c) unterscheidet;

(e) einem Fragment eines der Nucleinsäuremoleküle von (a) bis (d), das ein Protein codiert, das fähig ist, Raffinose herzustellen durch die Verknüpfung einer D-Galactosylgruppe über eine &agr; (1→6)-Bindung mit einer Hydroxylgruppe, die an das Kohlenstoffatom in der Position 6 des D-Glucoserestes in einem Saccharosemolekül gebunden ist;

(f) Nucleinsäuremolekülen nach (d) oder (e), wobei die Pflanze eine Leguminose, ein Lippenblütler (Lamiaceae) oder eine Monokotyledone ist;

(g) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 codieren;

(h) Nucleinsäuremolekülen, umfassend den codierenden Bereich der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 2;

(i) Nucleinsäuremolekülen, die mit dem komplementären Strang eines Nucleinsäuremoleküls wie unter (g) oder (h) angegeben bei stringenten Bedingungen hybridisieren;

(j) einem Fragment eines der Nucleinsäuremoleküle von (g) bis (i), das ein Protein codiert, das fähig ist, Raffinose herzustellen durch die Verknüpfung einer D-Galactosylgruppe über eine &agr; (1→6)-Bindung mit einer Hydroxylgruppe, die an das Kohlenstoffatom in der Position 6 des D-Glucoserestes in einem Saccharosemolekül gebunden ist; und

(k) Nucleinsäuremolekülen nach (i) oder (j), wobei die Pflanze eine Leguminose ist.
Nucleinsäuremoleküle nach Anspruch 1, wobei die Leguminose eine Puffbohnen- oder Sojapflanze ist. Nucleinsäuremoleküle nach Anspruch 1, wobei der Lippenblütler eine japanische Artischocke ist. Nucleinsäuremoleküle nach Anspruch 1, wobei die Monokotyledone eine grasartige Pflanze (Gramineae) ist. Nucleinsäuremoleküle nach Anspruch 4, wobei die grasartige Pflanze (Gramineae) Getreide ist. Nucleinsäuremolekül, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 funktionell verbunden mit einem Promotor. Plasmid, umfassend ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, gegebenenfalls in funktioneller Verbindung mit einem Promotor oder einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 6. Wirtsorganismus, enthaltend das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 6 oder das Plasmid nach Anspruch 7. Wirtsorganismus nach Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus eine Pflanzenzelle oder eine Pflanze ist. Verfahren zur Herstellung eines Raffinosesynthetase-Proteins oder eines Teils davon, umfassend die Schritte der Isolierung und Reinigung eines Raffinosesynthetase-Proteins oder eines Teils davon aus einer Kultur, die erhalten wird durch Züchten des Wirtsorganismus nach Anspruch 8 oder 9. Isoliertes Raffinosesynthetase-Protein, das durch das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 codiert wird. Antisense-Nucleinsäuremolekül oder Ribozym, das spezifisch an ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 hybridisiert oder bindet. Verfahren zur Modifizierung des Metabolismus eines Wirtsorganismus, umfassend das Einbringen des Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 der 6 oder eines Antisense-Nucleinsäuremoleküls oder Ribozyms nach Anspruch 12 in den Wirtsorganismus oder eine Zelle davon, so dass der Gehalt der Oligosaccharide der Raffinose-Familie in dem Wirtsorganismus oder der Zelle davon verändert wird. Isoliertes Raffinosesynthetase-Protein, das fähig ist, Raffinose herzustellen durch die Verknüpfung einer D-Galactosylgruppe über eine &agr; (1→6)-Bindung mit einer Hydroxlgruppe, die an das Kohlenstoffatom in der Position 6 des D-Glucoserestes in einem Saccharosemolekül gebunden ist, wobei das Protein mit dem Raffinosesynthetase-Protein von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 durch Deletion, Ersatz, Modifikation oder Hinzufügung einer Aminosäure verwandt ist. Anti-Raffinosesynthetase-Antikörper, der fähig ist, spezifisch an das Raffinosesynthetase-Protein nach Anspruch 11 oder 14 zu binden. Verwendung des Anti-Raffinosesynthetase-Antikörpers nach Anspruch 15 für den Nachweis eines Raffinosesynthetase-Proteins.






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