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Dokumentenidentifikation DE602005001414T2 27.09.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001589024
Titel Photolabile Schutzgruppen
Anmelder Nimblegen Systems, Inc., Madison, Wis., US
Erfinder Stengele, Klaus-Peter, 84568 Pleiskirchen, DE
Vertreter Stolmár und Kollegen, 80331 München
DE-Aktenzeichen 602005001414
Vertragsstaaten CH, DE, FR, GB, IS, LI
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 14.04.2005
EP-Aktenzeichen 050081918
EP-Offenlegungsdatum 26.10.2005
EP date of grant 20.06.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.09.2007
IPC-Hauptklasse C07H 19/04(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C07H 21/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleosidderivate mit photolabilen Schutzgruppen, ein Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Herstellung von DNA Chips durch räumlich adressierte, lichtgesteuerte Nukleotidsynthese auf festen Substraten.

Die leichte selektive Abspaltung von funktionellen Gruppen aus Molekülen spielt in vielen Gebieten der Chemie und Biologie eine wichtige Rolle, insbesondere beispielsweise in der Synthese größerer chemischer Einheiten, wie etwa bei der Synthese von Polymeren, Naturstoffen usw.

In diesem Zusammenhang werden besonders reaktive Gruppen, die zum Beispiel die jeweilige beabsichtige Verknüpfung zweier Moleküle durch unerwünschte Nebenreaktionen beeinträchtigen oder stören können, durch chemisch oder physikalisch wieder abspaltbare funktionelle Schutzgruppen zeitweilig selektiv „maskiert" bzw. geschützt, damit sie nicht an der erwünschten Verknüpfungsreaktion teilnehmen.

Für ein vergleichendes Studium der molekularen Erkennung zwischen Biomolekülen der gleichen oder verschiedenen Strukturklassen, ist die Verwendung großer kombinatorischer Bibliotheken von auf einem Substrat immobilisierten Bindungspartnern der in Lösung angebotenen Biomoleküle von großem Vorteil. Unter dem Begriff "Biomoleküle" versteht der Fachmann insbesondere Verbindungen, die zu den Klassen der Nukleinsäuren und deren Derivate, Proteine, Peptide und Kohlenhydrate gehören.

Große kombinatorische Bibliotheken, die das Prinzip der wechselseitigen molekularen Erkennung nutzen, sind insbesondere für die Analytik von Nukleinsäuren von großer Bedeutung. Beispielsweise in der Medizin und in der pharmazeutischen Forschung werden DNA-Chips, das heißt so genannte Mikroarrays von Feldern auf einem Glas- oder Polymersubstrat immobilisierter DNA oder beliebig ausgewählter Oligonukleotide (S.P.A. Fodor, Science 277 (1997) 393, DNA Sequencing Massively Parallel Genomics) schon seit längerem eingesetzt.

Dort nehmen DNA-Chips wiederum eine wichtige Rolle bei der genetischen Analytik und Diagnostik ein. Die am weitesten verbreitete Technik zur Herstellung derartiger DNA-Chips ist die räumlich adressierte, parallele, lichtgesteuerte Oligonukleotidsynthese auf festen Substraten (siehe z.B. S.P.A. Fodor et al, Nature 364 (1993) 555, Multiplexed Biochemical Arrays with Biological Chips) unter Verwendung photolabiler Schutzgruppen, d.h. Schutzgruppen für reaktive Funktionalitäten der Nukleosid- bzw. Nukleotidbausteine, die normalerweise unter der Einwirkung von zumeist UV-Licht spezifischer Wellenlänge selektiv wieder abgespalten werden können, so dass die geschützten Funktionalitäten für eine Weiterreaktion zur Verfügung stehen.

In diesem Zusammenhang dient zur Herstellung der DNA Chips die vorstehend erwähnte so genannte photolithographische Technik. Der synthetische Aufbau der gewünschten Oligonukleotidketten auf dem Substrat wird durch geeignete labile vorzugsweise photolabile Schutzgruppen kontrolliert, die beispielsweise bei Belichtung (für diesen Zweck wird normalerweise elektromagnetische Strahlung im UV/VIS Bereich verwendet) die Anknüpfungsstelle für das jeweils nächste Nukleotid freigeben. Mit Hilfe dieser photolabilen Schutzgruppen lässt sich unter Verwendung einer räumlichen selektiven Belichtung eine kombinatorische Strategie entwickeln. Unter Verwendung dieser Strategie ist es möglich, extrem dichte, räumlich adressierbare Mikroarrays von Oligonukleotiden zu erzeugen, deren Anzahl mit der Zahl der Synthesezyklen exponentiell anwächst. Bei einer derzeit erreichbaren Fläche jedes Elements von weniger als 25 &mgr;m2 lassen sich theoretisch mehr als 106 Sondenfelder auf 1 cm2 unterbringen. Bislang wird die Belichtung mit Hilfe von Mikrospiegel-Arrays (S. Singh-Gasson, et al, Nature Biotechn. 17 (1999) 974, Maskless Fabrication of Light Directed Olignucleotide Microarrays using a Digital Micromirror Array) durchgeführt, wie sie in der Digital-Projektionstechnik verwendet werden. Damit wird die zeit- und kostenaufwendige Herstellung von Belichtungsmasken erspart, wobei eine schnelleren Herstellung der DNA-Chips mittels der photolithographischen Technik ermöglicht wird.

Daher betrifft ein zentraler Aspekt der photolithographischen Synthese die Art dieser photolabilen Schutzgruppen, die in verschiedenen chemischen Varianten in der organischen und bioorganischen Chemie erwendet werden (V.N.R. Pillay, Photolithic Deprotection and Activation of Functional Groups; in: Organic Photochemistry, Band 9, Hrsg. A. Padwa (Marcel Dekker, New York und Basel, 1987), Seite 225 ff.). Am weitesten verbreitet werden photolabile Schutzgruppen auf der Basis der 2-Nitrobenzyl-Gruppe verwendet. (J.E.T. Correy and E.R. Trenton, Caged Nucleotides and Neurotransmitters; in: Biological Applications of Photochemical Switches, in: Bioorganic Photochemistry Series, Band 2, Hrsg. Harry Morrison (Wiley Interscience, 1993), Seite 243 ff.).

Zur Herstellung von DNA Chips, beispielsweise zum Schutz der terminalen OH-Gruppe in der Oligonukleotidsynthese vom 3' zum 5' oder vom 5' zum 3' Ende wird von den Schutzgruppen des 2-Nitrobenzyltyps bislang die MeNPOC(&agr;-Methyl-Nitropiperonyloxycarbonyl-)Schutzgruppe bevorzugt, die seit längerem die Standardschutzgruppe bei der DNA-Chip Herstellung ist (S.P.A. Fodor, et al, Science 251 (1991), 767, Light Directed, Spatially Adressible Parallel Chemical Synthesis).

Nachteilig bei dieser Art der Schutzgruppen ist die Bildung des aromatischen Nitrosoketons nach der Bestrahlung, das eine sehr reaktive Abgangsgruppe darstellt. Dadurch treten unerwünschte Neben- und Folgereaktionen auf, die oftmals Fehler in der Nukleotidsynthese des resultierenden Oligo- bzw. Polynukleotids hervorrufen. Derartige Folge- und Nebenreaktionen entstehen zum Beispiel dadurch, dass ein Teil der vorhandenen photolabilen Schutzgruppen auch selbst durch die elektromagnetische Strahlung angeregt wird und im angeregten Zustand eine Vielzahl unerwünschter Nebenreaktionen, wie z.B. Zerfall, intramolekulare und intermolekulare Umlagerungen usw. hervorrufen können.

Weiter sind 2-(2-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl Verbindungen bei der Herstellung von DNA-Chips bekannt. Deren Schutzgruppen werden als 2-Nitrostyrolderivate abgespalten (DE-PS 44 44 996, DE-PS 196 20 170 und US-5,763,599). Als Folge der Abspaltung von im allgemeinen etwas reaktionsträgeren 2-Nitrostyrolen im Hinblick auf störende Nebenreaktionen sind diese Verbindungen etwas weniger störanfällig als die vorstehend erwähnten Verbindungen.

Seit kurzem wurde auch die DMBOC Gruppe (3',5'-Dimethoxybenzoinyloxycarbonylgruppe) als Schutzgruppe (M.C. Pirrung et al., J.Org. Chem. 63 (1998), 241, Proofing of Photolithographic DNA Syntheses with 3',5'-Dimethoxybenzoinyloxycarbonyl-protected Deoxynucleosidephosphoramidites) bei der selektiven Polynukleotidsynthese verwendet.

Weitere bislang verwendete Schutzgruppen sind beispielsweise NPPOC(2-(2-Nitrophenyl)propyloxycarbonyl), MeNPPOC(2-(3,4-Methylendioxy-2-nitrophenyl)propyloxycarbonyl), MeNPOC(2-(3,4-Methylendioxy-2-nitrophenyl)oxycarbonyl), DMBOC(Dimethoxybenzoinylyloxycarbonyl), NPES(2-(2-Nitrophenyl)ethylsulfonyl) und NPPS(2-Nitrophenyl)propylsulfonyl).

Derzeit verwendete photolabile Schutzgruppen weisen noch keine befriedigenden Ergebnisse in Bezug auf die Fehlerrate der auf diese Weise synthetisierten DNA-Chips auf (D.J. Lockheart und E.A. Winseler, Nature 405 (2000) 827, Genomics, Gene Expression and DNA Arrays). Die Abspaltung der Schutzgruppen verläuft nicht vollständig genug, da die Gruppen normalerweise nur eine geringe Absorptionsfähigkeit für die verwendeten UV/VIS Wellenlängen aufweisen. Außerdem treten in diesem Zusammenhang störende Nebenreaktionen mit unerwünschten Reaktionsprodukten auf, so dass ein Großteil der Oligonukleotide auf den DNA-Chips nicht verwendet werden kann.

Überdies ist die Reaktionsgeschwindigkeit der Abspaltungsreaktion bei den bislang bekannten Schutzgruppen unbefriedigend lang, da die derzeit bekannten photolabilen Schutzgruppen unter den üblichen Bestrahlungsstärken mit der 365 nm Linie einer Quecksilberdampflampe Bestrahlungszeiten von mehreren Minuten erfordern, um quantitativ abreagieren zu können.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, Nukleosidderivate mit neuen photolabilen Schutzgruppen zur Verfügung zu stellen, die die vorstehend genannten Nachteile des Standes der Technik nicht zeigen, und deren Schutzgruppen sich insbesondere schnell und ohne Nebenreaktion hervorzurufen abspalten lassen.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Nukleosidderivaten gelöst, die photolabile Schutzgruppen enthalten und die das Strukturmotiv

aufweisen, wobei R1 H, Halogen, NO2, CN, OCH3, ein Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen, oder ein gegebenenfalls substituierter Arylrest oder aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 Atomen ist,

R2 bis R7 H, NO2, CN, OCH3, ein verzweigter oder nicht verzweigter Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 5 C-Atomen, vorzugsweise ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl, oder Pentylrest oder ein gegebenenfalls substituierter Arylrest oder ein Acylrest RCO ist, wobei R ein aliphatischer Rest mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist,

X die Gruppe C=O oder C=S darstellt

Y=S, O, NR', C(R')2 ist, wobei R' H, oder ein verzweigter oder nicht verzweigter Alkylrest mit 1 bis 5 C-Atomen oder ein gegebenenfalls substituierter Arylrest ist,

Z = SO2, OCO, OCS, SCS, CO oder CS ist,

n = 0, 1, 2 oder 3 ist, unter der Bedingung, dass wenn n = 0 ist, Z aus CO, CS, SO2 ausgewählt ist

und N aus 3' bzw. 5' substituierbaren Nukleosiden wie
ausgewählt ist, wobei P = H oder eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe oder eine zur Herstellung von Oligonukleotiden übliche reaktive Gruppe ist,

B = Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil, 2,6-Diaminopurin-9-yl, 5-Methylcytosinyl-1-yl, 5-Amino-4-imidazolcarbonsäure-1-yl oder 5-Amino-4-imidazolcarbonsäureamid-3-yl ist, wobei wenn B = Adenin, Cytosin oder Guanin ist, es die primäre Aminofunktion und gegebenenfalls eine temporäre oder permanente Schutzgruppe aufweist, oder Tymin oder Uracil an der O4-Position gegebenenfalls eine permanente Schutzgruppe aufweist,

R8 = H, OH, Halogen, OR' oder SR' ist, wobei R' wie vorstehend definiert ist oder ein aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 Atomen sowie eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe ist.

Die Alkyl-, Alkoxy, oder Alkoxyalkylgruppe der Reste R1 bis R8 kann linear oder verzweigt sein, substituiert (insgesamt nur mit einem oder mehreren Halogenatomen) oder unsubstituiert sowie gesättigt oder ungesättigt sein. Zwischen den Resten kann eine Brückenverbindung bestehen, z. B. über eine Methylengruppe, so dass sich eine weitere Ringfunktion ergibt. Dasselbe gilt für die Acyl- oder Arylgruppe der Reste R1 bis R8. Hier kommen als Substituenten neben Halogenatomen Alkylgruppen in Frage. Bevorzugte Alkylreste sind Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, n-Butyl-, iso-Propyl, tert-Butylreste. Bevorzugte Alkoxyreste sind die Methoxy-, Ethoxy- oder tert-Butoxyreste. Bevorzugte aliphatische Acylreste sind Formyl, Acetyl, Propionyl oder Butyryl. Bevorzugte (Hetero)arylreste sind die Phenyl-, Thienyl-, Thiophenyl-, Furyl-, Furanyl-, Pyranyl-, Pyrrolyl-, Imidazolyl-, Pyrazonyl-, Pyridyl-, Pyrazinyl-, Pyrimidinyl, Pyrazinyl-, Pyridazinyl-, Thiazolyl-, Oxazolyl-, Indolyl-, Pyrrolinyl-, Imidazolinyl-, Pyrazolinyl-, Thiazolinyl-, Triazolyl-, Tetrazolylgruppe sowie sich daraus ergebende annellierte Ringe.

In der Position P ist „eine zur Herstellung von Oligonukleotiden übliche reaktive Gruppe" beispielsweise eine Phosphitamidgruppe. Natürlich können anstelle eines Phosphitamids auch Phosphodiester, Phosphotriester oder H-Phosphonate verwendet werden.

In den Positionen P und R8 bedeutet der Ausdruck „eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe" insbesondere in R8 eine H (DNA) oder O (RNA) Schutzgruppe wie die üblichen O-Alkyl-, O-Alkenyl-, O-Acetal- oder O-Silylether-Schutzgruppen. Bevorzugte Schutzgruppen sind O-Methyl- oder O-Ethylreste, O-Allylreste, O-Tetrahydropyranyl- oder O-Methoxytetrahydropyranylreste sowie O-t-Butyldimethylsilylreste, Dimethoxytrityl (DMT)- oder Dansylreste.

Die an den Basen B gegebenenfalls permanent vorkommenden Schutzgruppen basieren vorzugsweise auf Acyl-Schutzgruppen. Bevorzugt sind vor allem Phenoxyacetyl-, tert-Butylphenoxyacetyl-, Isobutyryl-, Acetyl-, Benzoyl-, Allyloxycarbonyl-, Phthaloyl-, Dansylethyloxycarbonyl-, 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonyl- oder Dimethylformamidinoreste. Im Falle von Adenin, Cytosin und Guanin handelt es sich vorzugsweise um Phenoxyacetyl-, tert-Butylphenoxyacetyl-, Acetyl- oder 2-(4-Nitrophenyl)ethoxycarbonylgruppen zum Schutz der exocyclischen Aminofunktionen. Die O6-Position von Guanin kann gegebenenfalls ebenfalls durch eine Schutzgruppe 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethyl oder 2-(4-Nitrophenyl)ethyl geschützt sein. Ebenso kann die O4-Position von Thymin oder Uracil eine Schutzgruppe wie zum Beispiel 2-(4-Nitrophenylsulfonyl)ethyl oder 2-(4-Nitrophenyl)ethyl aufweisen.

Halogen bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung F, Cl, Br, I, wobei die drei letztgenannten bevorzugt sind. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Nucleosidderivate ist beispielhaft in 2 gezeigt, worauf nachfolgend Bezug genommen wird. Die Erwähnung von bestimmten Halogen- und Alkylsubstitutionen schließt immer gleichwirkende Äquivalente ein, zum Beispiel schließt „Chlor-" nicht aus, dass auch die entsprechenden Jod- oder Bromverbindungen verwendet werden können. Ebensolches gilt für „Methyl", das auch die entsprechenden anderen niederen Alkylverbindungen, wie Ethyl, Propyl oder Butyl mit einschließt.

In Bezug auf die bekannten Nukleosidderivate weisen die erfindungsgemäßen Derivate den überraschenden Vorteil auf, dass die erfindungsgemäße Schutzgruppe selbst bei Bestrahlung mit sichtbarem Licht bei Wellenlängen von mehr als 380 nm, bevorzugt mehr als 390 nm und noch mehr bevorzugt von mehr als 400 nm schneller und effektiver abgespalten werden kann.

Basierend auf der vorliegenden Erfindung ist insbesondere wichtig, dass mit der erfindungsgemäßen Schutzgruppe eine Nitrogruppe und die Gruppe, die das Nukleosid mit dem Ringsystem verbindet, am Anthracengerüst in o-Stellung zueinander platziert werden, um bei Abspaltung eine &bgr;-Eliminierungsreaktion durchführen zu können.

Dies betrifft erfindungsgemäß sämtliche o-Substitutionsmuster an den Positionen 1 bis 4 des Ringsystems. Dies betrifft insbesondere die folgenden Derivate:

wobei in den Formeln 1a bis 1f die Substituenten die vorstehend erwähnten Bedeutungen haben.

Die erfindungsgemäßen 3'- oder 5'-photolabilen Nukleoside können für die photolithographische Nukleinsäurechipsynthese eingesetzt werden. Verfahren zu diesem Zweck sind dem Fachmann ausreichend bekannt.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Schutzgruppe oder des Nukleosidderivats erlaubt vorteilhafterweise den Einsatz von besonders langwelligem Licht bei der lichtgesteuerten Synthese von Oligonukleotiden oder Nukleinsäurechips. In diesem Zusammenhang werden Wellenlängen von mehr als 380 nm, bevorzugter von mehr als 390 nm und besonders bevorzugt von mehr als 400 nm bevorzugt.

Unter "Substrat" werden chemische Verbindungen verstanden, bevorzugt Oligonukleotide, Proteine, Peptide, Kohlenhydrate (Zucker), die mit der erfindungsgemäßen Verbindung eine kovalente chemische Bindung eingehen können. Jedoch schließt der Begriff Substrat auch oberflächenfunktionalisierte Trägermaterialien wie Glas, Polymere, Metall, Keramik usw. ein.

Unter dem Begriff „Nukleotid" werden erfindungsgemäß bevorzugt Oligonukleotide mit zwei bis zu 10 Nukleosiden verstanden, die untereinander sowohl über 3'-5' als auch über 5'-3' Phosphorsäureesterbindungen verbunden sind. Jedoch umfassen die erfindungsgemäßen Nukleotide zusätzlich Polynukleotide mit mehr als 10 Nukleosidbausteinen.

Die erfindungsgemäßen Nukleosidderivate können über mehrere Stufen, oder über eine Zweistufensynthese synthetisiert werden. Typischerweise wird zuerst das gewünschte Ringsystem mit dem entsprechenden Substitutionsmuster synthetisiert, bei dem anfänglich ein Alkohol der allgemeinen Formel

durch ein allgemein bekanntes Syntheseverfahren hergestellt wird, wobei R1 bis R7, X, Y und n wie vorstehend definiert sind. Dieser Alkohol wird in einem zweiten Schritt in ein Acylierungsreagenz mittels aus der Literatur bekannter Verfahren, beispielsweise in einen Chlorcarbonsäureester, zum Beispiel unter Verwendung von Diphosgen, in einen Chlorthiocarbonsäurester, zum Beispiel unter Verwendung von Thiophosgen oder in ein Sulfonylchlorid umgewandelt. Anschließend wird ein entsprechend derivatisiertes Nukleosid, beispielsweise Thymidin mit diesem Acylierungsreagenz acyliert, um das erfindungsgemäße Nukleosidderivat zu ergeben. Eine Möglichkeit zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist beispielhaft anhand von 1 erläutert.

Das freie Nukleosid zur Verwendung in erfindungsgemäßen Verfahren weist afänglich bevorzugt zwei freie OH-Gruppen auf, eine an der 3' Position und die andere an der 5' Position. Anschließend wird eine davon, entweder an der 3' oder 5' Position durch Einführung einer orthogonalen Schutzgruppe, zum Beispiel DMT oder Dansyl, intermediär geschützt, so dass die verbleibende freie Hydroxylgruppe (5' oder 3') mit dem Acylierungsreagenz reagieren kann. Bedarfsweise kann dann die intermediäre Schutzgruppe abgespalten werden, so dass die freie 3' oder 5' OH-Gruppe für weitere Reaktionen zur Verfügung steht.

Weitere Vorteile und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und den beiliegenden Figuren.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der nachstehenden Figuren und eines nicht einschränkenden Ausführungsbeispiels erläutert.

1 zeigt ein Syntheseschema für die Herstellung eines erfindungsgemäßen Nukleosidderivats,

2 zeigt einen Vergleich zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit bei der Abspaltung der Schutzgruppe (Entschützungsreaktion) eines Nukleosidderivats des Standes der Technik und einem erfindungsgemäßen Nukleosidderivat,

3 zeigt die Geschwindigkeit der Schutzgruppenabspaltung aus einem erfindungsgemäßen Nukleosidderivat in verschiedenen Lösungsmitteln.

4 zeigt die Geschwindigkeit der Entschützungsreaktion bei einer Wellenlänge von mehr als 390 nm.

5 zeigt die Geschwindigkeit der Entschützungsreaktion bei einer Wellenlänge von mehr als 410 nm.

2 zeigt die vorkommende Reaktionsgeschwindigkeit bei der Abspaltung der Schutzgruppe eines Nukleosidderivats des Standes der Technik, NPPOC-Thymidin (NPPOC-dT), im Vergleich zu einem erfindungsgemäßen Nukleosidderivat 2-NTX-3-POC-Thymidin(2-NTX-3POC-dT)(5'-[2-nitro-9-oxo-3-(2-propyloxacarbonyl)thioxanthon]thymidin).

Die Abnahme der Menge an Edukt über die Reaktionsdauer der Abspaltungsreaktion wurde bei beiden Verbindungen bei einer Wellenlänge von 365 nm (Hg Lampe) in einem Methanol/Wasser Gemisch gemessen.

Wie aus 2 ersichtlich ist, verläuft die Abnahme an Konzentration des Edukts bei 2-NTX-3POC-dT in Kurve 1 deutlich schneller als beim Edukt NPPOC-dT (Kurve 2). Dies korreliert sehr gut mit der Zunahme an Edukt in den entsprechenden Kurven 3 und 4.

Im Falle von 2-NTX-3-POC als photolabile Schutzgruppe erhielt man nach einer Reaktionsdauer von nur ungefähr 3 Sekunden 90 Produkt, während bei NPPOC nach einer Reaktionszeit von 6 Sekunden, die doppelt solange ist, erst 40 % Thymidin erhalten wurden.

3 zeigt den Reaktionsverlauf der Abspaltung der photolabilen Schutzgruppe aus 2-NTX-3-POC-dT in verschiedenen Lösungsmitteln bei 365 nm (Hg-Lampe, UG 1 Filter) in Bezug auf die Abnahme des Edukts 2-NTX-3-POC-dT und auch in Bezug auf die Zunahme des Produkts Thymidin.

Mit Ausnahme der Reaktion in Dioxan/Wasser sind die Reaktionsgeschwindigkeiten in den Mischungen Acetonitril/Wasser oder Methanol/Wasser näherungsweise gleich schnell.

4 zeigt die Geschwindigkeit der Entschützungsreaktion bei der Abspaltung der erfindungsgemäßen Schutzgruppe eines Nukleosidderivats (jeweils mit Thymidin) im Vergleich zu Schutzgruppen aus dem Stand der Technik bei Wellenlängen oberhalb 390 nm. Verglichen mit den Schutzgruppen NPPOC, 5-Benzyl(Bz)-NPPOC und 4-Ethyl-5-phenyl-NPPOC, ist die Geschwindigkeit der Entschützungsreaktion bei den Schutzgruppen 2-NTX-3-POC oder TS7POC(5'O-[(2-nitrophenyl)-5-(9-oxo-9H-thioxanthon-2-yl)pentyloxycarbonyl]) am schnellsten. Die erfindungsgemäße Schutzgruppe 2-NTX-3-POC ist im Vergleich zu TS7POC bei einer Wellenlänge von 400 nm bis zu einer Reaktionsdauer von ungefähr 4 Minuten etwas langsamer und erreicht näherungsweise dieselben Werte wie TS7POC.

TS7POC bedient sich im Gegensatz zur erfindungsgemäßen Schutzgruppe des Prinzips der sogenannten "intramolekularen Aktivierung" der Schutzgruppe, bei der eine Sensibilisatoreinheit an eine herkömmliche Schutzgruppe gebunden ist (wie es zum Beispiel in der PCT/EP 2004/002361 beschrieben wurde). Überraschenderweise hat sich im vorliegenden Fall gezeigt, dass auf bislang als unerlässlich für schnelle Reaktionszeiten bei der Entschützungsreaktion angesehene UV Sensibilisatoren, das heißt, sowohl auf einen intramolekular gebundenen Sensibilisator, wie z. B. bei TS7POC und auf einen gesondert zugegebenen Sensibilisator, wie zum Beispiel in der WO 03/74542 beschrieben ist, zur Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit der Abspaltungsreaktion verzichtet werden kann. Trotzdem werden mit den erfindungsgemäßen Derivaten oder Schutzgruppen vergleichbare Reaktionsgeschwindigkeiten wie in Anwesenheit von Sensibilisatoren für die Abspaltungsreaktion erreicht.

5 zeigt, dass bei Verwendung einer erfindungsgemäßen Schutzgruppe, nämlich 2-NTX-3-POC die Geschwindigkeit der Abspaltung bei 420 nm verglichen mit den üblichen aus dem Stand der Technik bekannten Schutzgruppen beträchtlich ist und nach einer Reaktionsdauer von ungefähr 30 Minuten eine Abspaltung zu 90 % erfolgt ist, während bei den Schutzgruppen aus dem Stand der Technik nahezu keine Reaktion zu erkennen ist.

Beispiel Synthese von 5'-[2-nitro-9-oxo-3-(2-propyloxycarbonyl)thioxanthon]thymidin

Die Synthese der Titelverbindung ist in 1 schematisch erläutert. Die Reaktion der Thioacetylsäure 1 mit (2-Nitro-5-brom)ethylbenzol 2 in kochendem DMF in Gegenwart von 1,8-Diazabicyclo[5,4,0]undec-7-en (DBU) führt zu der Bildung von 2-(3-Ethyl-4-nitrophenylsulfid)benzoesäure 3, die als Feststoff mit 70 bis 80 % Ausbeute isoliert wurde. Das Erhitzen der Benzoesäure 3 in konzentrierter Schwefelsäure über einen Zeitraum von 0,5 bis 1 Stunde gefolgt von der Zugabe der Reaktionsmischung in Wasser und Filtration ergab 3-Ethyl-2-nitro-9-oxothioxanthon 4 das für den nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Die Reaktion des Nitroderivates des Oxothioxanthons 4 aus dem vorhergehenden Schritt mit Paraformaldehyd in DMSO in Gegenwart von DBU bei 60 bis 70 °C für 4 bis 5 Stunden ergab 4-Nitro-9-oxo-3-(2-propanol)thioxanthon 5 das mittels Säulenchromatographie in guten Ausbeuten isoliert wurde. Die Behandlung der Verbindung 5 mit Diphosgen in THF bei 0 bis 4 °C in Gegenwart von Triethylamin ergab 2-Nitro-9-oxo-3-(2-propyloxycarbonyl-chlorid)thioxanthon 6 in guter Ausbeute. Die Acylierung von Thymidin mit Verbindung 6 bei 0 bis 4 °C führt zu 5'-[2-Nitro-9-oxo-3-(2-propyloxacarhonyl)thioxanthon]thymidin 7, welches über Säulenchromatographie isoliert wurde.

Spektroskopische Daten für Verbindung 5:

UV (MeOH), &lgr;max in nm (log &egr;): 359 (3.86), 252 (4.48), 212 (4.12).

1H-NMR (DMSO-D6): 8,72 (s, H-C(1)); 8,42 (dd, H-C(8)); 8,03 (s, H-C(4)); 7,86 (dd, H-C(5)); 7,99 (ddd, H-C(7)); 7,61 (m, H-C(6)).

Spektroskopische Daten für Verbindung 6:

UV (MeOH), &lgr;max in nm (log &egr;): 348 (3.87), 254 (4.54), 211 (4.27).

1H-NMR (DMSO-D6): 11,14 (s, NH); 8,40 (dd, H-C(8*)); 8,15 (s, H-C(4*)); 7,85 (dd, H-C(5*)); 7,78 (ddd, H-C (7*)); 7,60 (ddd, H-C(6*)); 7,34 (s, H-C(6)); 6,11 (m, H-C(1')); 5,33 (d, OH); 4,41 (m, 2H, CH2 für die 5'-Schutzgruppe); 4,24 (m, 2H, H-C(5',5'')); 4,18 (m, H-C(3')); 3,87 (m, H-C(4')); 3,75 (q, CH3CH); 2,10 (m, 2H, H-C(2', 2'')); 1,70 and 1,69 (2s, CH3-C(5)); 1,38 (d, CH3CH).


Anspruch[de]
Nukleosidderivate mit photolabilen Schutzgruppen der allgemeinen Formel (I)
wobei R1 = H, Halogen, NO2, CN, OCH3, ein Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen, vorzugsweise ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, oder Butylrest oder ein gegebenenfalls substituierter Arylrest oder aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 Atomen ist,

R2 bis R7 = H, NO2, CN, OCH3, ein verzweigter oder nicht verzweigter Alkyl-, Alkoxy- oder Alkoxyalkylrest mit 1 bis 5 C-Atomen oder einen gegebenenfalls substituierter Arylrest oder ein aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 fünf Atomen ist,

X die Gruppe C=O oder C=S bedeutet,

Y=S, O, NR', C(R')2 ist, wobei R' gleich H, oder ein verzweigter oder nicht verzweigter Alkylrest mit 1 bis 5 C-Atomen oder einen gegebenenfalls substituierter Arylrest ist,

Z = SO2, OCO, OCS, SCS, CO oder CS bedeutet,

n = 0, 1, 2 oder 3 bedeutet, mit der Bedingung, dass wenn n = 0 ist, Z ausgewählt ist aus CO, CS, SO2,

N ausgewählt ist aus
wobei P = H oder eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe oder eine übliche reaktive Gruppe zur Herstellung von Oligonukleotiden ist,

B = Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil, 2,6-Diaminopurin-9-yl, 5-Methylcytosinyl-1-yl, 5-Amino-4-Imidazolkarbonsäure-1-yl oder 5-Amino-4-Imidazolcarbonsäureamid-3-yl bedeutet, wobei im Falle von B = Adenin, Cytosin oder Guanin die primäre Aminofunktion und gegebenenfalls eine temporäre oder permanente Schutzgruppe aufweist bzw. Thymin oder Uracil an der O4-Position gegebenenfalls eine permanente Schutzgruppe aufweist,

R8 = H, OH, Halogen, OR' oder SR' bedeutet, wobei R' wie vorstehend definiert ist oder aliphatischer Acylrest mit 2 bis 5 Atomen sowie eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe ist.
Nukleosidderivat nach Anspruch 1, wobei eine NO2-Gruppe und die -C(R1)-(CH2)n-Z-N-Gruppe in ortho Stellung zueinander stehen Nukleosidderivat nach Anspruch 1 oder 2, wobei die übliche reaktive Gruppe zur Herstellung von Oligonukleotiden in der Position P eine Phosphitamid-Gruppe ist. Verfahren zur Herstellung von Nukleosidderivaten nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei

a) eine Verbindung der allgemeinen Formel II
in der die Reste die vorstehend genannte Bedeutung haben, mit einem Nukleosid der allgemeinen Formel III
in der R8 und B oben genannte Bedeutung haben und wobei P eine in der Nukleotidchemie übliche Schutzgruppe ist reagieren lässt.

b) wahlweise P weiter reagieren lässt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei man in der 5'-Stellung oder 3'-Stellung der entstandenen Nukleosidderivate eine Phosphitamid-Gruppe einführt. Verwendung der Nukleosidderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum lichtgesteuerten Aufbau von Oligonukleotiden oder Nukleinsäurechips. Verwendung nach Anspruch 5, wobei Licht mit einer Wellenlänge von größer als 380 nm, bevorzugt größer als 390 nm eingesetzt wird.






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