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Dokumentenidentifikation DE60216526T2 27.09.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001578978
Titel VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON DOPA UND DOPAMIN AUS HAARWURZELKULTUREN VON BETA VULGARIS
Anmelder Council of Scientific & Industrial Research, New Delhi, IN
Erfinder GOKARE, Ravishankar A., Mysore, Karnataka, IN;
BHAMIDI, Suresh, Mysore, Karnataka, IN;
RAO, Ramachandra, Mysore, Karnataka, IN
Vertreter Luderschmidt, Schüler & Partner, 65189 Wiesbaden
DE-Aktenzeichen 60216526
Vertragsstaaten CH, DE, FR, GB, IT, LI, NL
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 16.12.2002
EP-Aktenzeichen 027883586
WO-Anmeldetag 16.12.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/IB02/05390
WO-Veröffentlichungsnummer 2004055192
WO-Veröffentlichungsdatum 01.07.2004
EP-Offenlegungsdatum 28.09.2005
EP date of grant 29.11.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.09.2007
IPC-Hauptklasse C12P 13/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12P 13/22(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dopa und Dopamin aus Haarwurzelkulturen von Beta vulgaris.

Hintergrund und Referenzen gemäß Stand der Technik

L-Dopa (Dihydroxy-L-phenylalanin) und Dopamin sind Neurotransmitterprecursor, die für die symptomische Erleichterung von Parkinson-Erkrankungen verwendet werden (Pras, N. et al., 1989, Biotechnology and Bioengineering 34, 214-222). Der hohe Preis, Nachfrage und hohe Dosierung führten zu alternativen und preiswerten Verfahren für ihre Herstellung. L-Dopa wird hauptsächlich als ein sekundärer Metabolit in Pflanzenzellkulturen von Mucuna pruriens (Pras et al., 1989) und Kallus hergestellt, sowie in transformierten Wurzelkulturen von Stizolobium Hassjoo (Sung und Huang, 2000, Biotech Prog, 16, 1135-1140). L-Dopa wird auch von verschiedenen Bakterien, nämlich Escherichia coli und Erwinia herbicola (Foor et al., 1993, Appl. Environ. Microbilo 59: 3070-3075) und Psudomonas melanogenum (Tanaka et al., 1974, Agri. Biol. Chem., 38(3), 633-639) hergestellt.

Es wird Bezug genommen auf Wichers et al. (1993) (PCTOC 33, 259-264), wo sowohl Dopa als auch Dopamin in Pflanzenorganen, wie zum Beispiel Blättern, sowie in Zellkulturen von Mucuna pruriens festgestellt wurden. Sie haben ebenfalls berichtet, dass Zugabe von 2,4-D zu Zellsuspensionen den Dopamin-Gehalt erhöht und Zugabe von NaCl bei einer Konzentration von 0,5 M bei der Freisetzung von L-Dopa in das Medium behilflich ist.

Verschiedene Biotransformationsprozesse wurden ebenfalls für die Herstellung von L-Dopa berichtet, nämlich Bioumwandlung von Tyrosin zu L-Dopa durch immobilisierte Zellen von Mucuna pruriens (Wichers et al., 1983, Planta 158: 482-486) und auch für immobilisierte Zellen von Papaver somniferum (Stano et al., 1995, Phytochemistry, 38(4) 859-860).

Beta vulgaris-Haarwurzelkulturen sind dafür bekannt, Betalaine herzustellen, die natürliche rote Pigmente sind. Aufgrund von konjugierten Doppelbindungen sind sie gefärbt. Unter höheren Pflanzen ist das Auftreten von Betalainen auf die Ordnung der Centrospermae beschränkt. Sie werden jedoch auch im Pilz Amanita muscaria berichtet. Interessanterweise sind in Mikroorganismen sowie in Tieren Betalaine unbekannt. (Bohm und Rink 1988). Betalaine, die gelben Betaxanthine und rot-violetten Betacyanine sind eine Gruppe von wasserlöslichen Pigmenten. Die Betaxanthine sind Konjugate von Betalamsäure mit Aminosäuren, sind korrespondierende Amine (einschließlich Dopamin), und die Betacyanine sind Derivate von Betanidin, dem Konjugat aus Betalamsäure mit Cyclo-Dopa. Tyrosinase und Dopa-Dioxygenase sind die Hauptenzyme, die für die Biosynthese des Grundgerüsts von Betalainen verantwortlich sind. (Mueller et al 1996, Steiner et al 1996, 1999, Girod und Zryd 1991, Mueller et al 1997). Tyrosinase ist verantwortlich für die Bildung von DOPA und seine Oxidation zu Cyclo-Dopa, die Dopa-Dioxygenase katalysiert die Dopa-Extradiol-Spaltung, die zu der Bildung von Betalamsäure führt. Der entscheidende Schritt, die Bindung von Betalamsäure mit Cyclo-Dopa, wird als nicht-enzymatischer Schritt vorgeschlagen (Trezzini und Zyrd 1990, Terradas und Wyler 1991). Kobayashi et al (2001) berichteten die Bildung von Betacyaninen aus Dopamin in Zell- und Haarwurzelkulturen von Beta vulgaris.

Es wird Bezug genommen auf Steiner et al (Planta 1999, 208: 114-124), wo sie gefunden haben, dass Tyrosinase in der Betalain-Biosynthese von höheren Pflanzen involviert ist, indem sie Kalluskulturen von Portulaca grandiflora verwendeten, die Betacyanine herstellt. Sie haben auch berichtet, dass Betalaine durch die Wirkung von Tyrosinase in Haarwurzeln und Kallus von Beta vulgaris gebildet werden. Schliemann et al (Phytochemistry 49(6) 1593-1598) berichteten 1998 diese Betalainbildung aus L-Dopa in einem Modellprobensystem. In ihren Experimenten haben sie Dopa mit Dopa-Dioxygenase aus Amanita muscaria inkubiert, was in der Bildung von 4,5-Seco-Dopa resultiert, welches spontan zu Betalamsäure recycliert.

In all den oben angegebenen Berichten wurde gesagt, dass in biosynthetischen Pfaden von Betalainen Dopa ein Precursor der Betalaine ist, bisher jedoch wurde nicht über die Akkumulierung/Herstellung von Dopa und Dopamin in Haarwurzelkulturen von Beta vulgaris berichtet.

Aufgaben der Erfindung

Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Extraktion und Herstellung von Dopa und Dopamin aus Beta vulgaris-Haarwurzeln zu entwickeln.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zur Verbesserung der Produktion von Dopa und Dopamin aus Beta vulgaris-Haarwurzeln zur Verfügung zu stellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von Dopa und Dopamin aus Haarwurzeln von Beta vulgaris zur Verfügung, wobei die Haarwurzeln bei Infektion des Explantats unter Verwendung eines Isolats von Agrobacterium rhizogenes-Wildstamm erhalten werden und durch Unterkultur in MS (Murashige-Skoog 1962, Physiol plant 15, 473-479), ein Medium ohne jegliche Phytohormone, und mit der Zugabe von 3% Saccharose gehalten werden und der pH des Mediums auf 5,8 eingestellt wird, bevor autoklaviert wird, und die Kolben in einem Schüttler bei 90 Upm gehalten werden und für 24 Tage Kultivierungszeit im Dunkeln kultiviert werden, wobei die Haarwurzeln in verschiedenen Wachstumsstufen mit 2% Ameisensäure, 0,1 N HCl und 80% heißem Ethanol in einem Mörser mit Pistill unter Verwendung von Glaspulver extrahiert werden, filtriert werden und das Extrakt unter Vakuum konzentriert wird und das Konzentrat durch einen Membranfilter (0,22 &mgr;m) filtriert wird und zur HPLC-Analyse eingespritzt wird und die Dopa- und Dopamingehalte durch Vergleich von Flächen mit authentischen Standards (Sigma, St. Louis, USA) quantifiziert werden und Experimente ausgeführt werden um zu wissen, welche Stufe der Kultur maximalen Dopa- und Dopamingehalt ansammelt, was die Zugabe von Tyrosin bei exponentieller Stufe der Kultivierungszeit beinhaltet, und gefunden wird, dass Haarwurzelkulturen in den Anfangsstufen (6 Tage alte Kulturen) mehr Dopa ansammeln und bei 15 Tagen die Dopamin-Ansammlung maximal ist und wenn Tyrosin (Hi media labs, Mumbai, Indien) mit 3 mg/40 ml Kulturmedium ergänzt wird, der Dopagehalt maximal ist, d.h. 46 &mgr;g/g DW am 15. Tag, und der Dopamingehalt ebenfalls auf 1,972 mg/g DW am 20. Tag der Kulturzeit erhöht wird.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von Dopa und Dopamin aus Haarwurzelkulturen von B. vulgaris zur Verfügung, wobei das genannte Verfahren die Schritte aufweist:

  • a) Kultivieren von Haarwurzeln von B. vulgaris unter Verwendung von Nährmedium, Sterilisation in einem Autoklaven,
  • b) Inokulieren von Haarwurzeln in dem Bereich von 0,1-0,5 g Frischgewicht/40 ml Kulturmedium, gewachsen für 2-24 Tage, um höheres Wachstum und Metabolite zu erhalten,
  • c) Wahl des richtigen Kulturstadiums von Haarwurzeln für maximale Dopa- und Dopaminherstellung, basierend auf dem biosynthetischen Pfad von Betalainen, sowie
  • d) Extraktion der Haarwurzeln mit Lösungsmittel, um Dopa und Dopamin zu erhalten.

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst das verwendete Nährmedium MS-Medium mit 2 bis 4% Saccharose als Hauptkohlenstoffquelle.

Noch eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein Verfahren zur Verfügung, wobei die Sterilisation in Schritt (a) für 10 bis 30 Minuten bei einer Temperatur in dem Bereich von 110 bis 130°C ausgeführt wird.

Noch eine weitere Ausführungsform, bei der in Schritt (d) die Haarwurzeln unter Verwendung von Ameisensäure in dem Bereich von 1-4% (v/v), 0,1 N HCl und 80% heißem Ethanol extrahiert werden.

Noch eine weitere Ausführungsform, in welcher die Extrakte zentrifugiert, filtriert und unter Vakuum konzentriert werden.

Noch eine weitere Ausführungsform, bei welcher die Zugabe von Ameisensäure in dem Bereich von 1-4% (V/V) zur Extraktion die Herstellung von Dopa und Dopamin erhöht.

In noch einer weiteren Ausführungsform, wobei weitere Zugabe von Tyrosin in dem Bereich von 1-5 mg/40 ml Kulturmedium zu der 3-7 Tage alten Kultur in erhöhter Ausbeute an Dopa und Dopamin resultiert.

Noch eine weitere Ausführungsform, wobei die Haarwurzeln von Beta vulgaris in flüssigem Nährmedium aseptisch kultiviert werden und mit 1-5% Ameisensäure bei exponentiellem Wachstum extrahiert werden.

Noch eine weitere Ausführungsform, bei welcher die exponentielle Wachstumsphase in Schritt (c) für maximale Ansammlung von Dopa in der Kultur im Bereich von zwischen 5-8 Tagen liegt.

Noch eine weitere Ausführungsform, bei welcher in Schritt (c) die exponentielle Wachstumsphase für maximale Anreicherung von Dopamin in der Kultur im Bereich von 12-16 Tagen liegt.

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Haarwurzeln aus Rote-Beete-Wurzeln unter Verwendung des Wildstammes von Agrobacterium rhizogenes erhalten.

In noch einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden sie auf Murashige und Skoog's Basismedium in 150 ml Erlenmeyerkolben kultiviert.

In noch einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Haarwurzeln von B. vulgaris in verschiedenen Wachstumsstufen mit 2% (v/v) Ameisensäure in Wasser, 0,1 N HCl und 80% heißem Ethanol extrahiert.

In noch einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Extrakte zentrifugiert, durch ein Whatman #1 Filterpapier filtriert und unter Vakuum konzentriert, in dem jeweiligen Lösungsmittel wie z.B. 2% (v/v) Ameisensäure in Wasser, 0,1 N HCl und 80% heißem Ethanol zur HPLC-Analyse gelöst.

In noch einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die HPLC-Analyse mit einem Shimadzu LC-10A-System (Shimadzu Corporation, Japan) ausgeführt und der Chromatograph ist mit einer 5 &mgr;m Nucleosil-C18-Säule (250 mm lang, 4 mm ID, Waters, USA) ausgerüstet, unter Verwendung eines Mc Ilvaline-Puffers (0,1 M Ammoniumacetat/Essigsäurepuffer, pH 4,7) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min. und detektiert mit einem UV-Detektor (280 nm) und mit einem Fluoreszensdetektor (Xenon-Bogenlampe, Anregung bei 280 nm und Emission bei 314 nm).

In noch einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird Tyrosin bei einer Konzentration von 3 mg/40 ml in die Kulturen von Beta vulgaris zugeführt, die im exponentiellen Stadium ihres Wachstums sind, und die Wirkung auf die Dopa- und Dopamin-Anreicherung wird aufgezeichnet.

Die folgenden Beispiele werden im Wege der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung gegeben und sollten nicht als den Umfang der Erfindung einschränkend betrachtet werden.

BEISPIEL 1

Haarwurzelkulturen von Beta vulgaris werden durch Infektion eines Explantats mit einem Wildstamm von Agrobacterium rhizogenes erhalten. 300 mg Frischgewicht von Haarwurzeln von Beta vulgaris (4 Tage alt) werden in 40 ml Nährmedium, aus Murashige und Skoog's Salzen in einem 150 ml Erlenmeyerkolben inokuliert. Der pH des Mediums wird auf 5,8 eingestellt, bevor 15 Minuten bei 121°C bei 15 1b Druck autoklaviert wird. Die Haarwurzeln werden alle 2 Wochen in frisches MS (Murashige-Skoog)-Medium mit 3% Saccharose und ohne Phytohormonzugabe subkultiviert und werden im Dunkeln auf einem Rotationsrüttler (90 Upm) gehalten. Die maximale Biomasse wird am 20. Tag der Kulturzeit als 6,75 g Frischgewicht (FW) je 40 ml Kulturmedium aufgezeichnet, was im weiteren abnimmt, um ein Minimum von 5,2 g FW/40 ml Kulturmedium am 24. Tag der Kulturzeit zu erreichen.

BEISPIEL 2

300 mg Frischgewicht Haarwurzelkulturen von Beta vulgaris aus 4 Tage alten Kulturen werden in 40 ml Nährmedium aus Murashige und Skoog's Salzen in 150 ml Erlenmeyerkolben inokuliert. In Zeitintervallen von 6, 12, 15, 20 und 24 Tagen des Kultivierungszeitraums werden die Haarwurzeln auf L-Dopa und Dopamin unter Verwendung von 80% heißem Ethanol, 0,1 N HCl und 2% Ameisensäure in einem Mörser mit Pistill unter Verwendung von neutralisiertem Glaspulver extrahiert. Die Extrakte werden zentrifugiert, filtriert, konzentriert und zur HPLC-Analyse auf L-Dopa und Dopamin verwendet. Betalaingehalt in den Haarwurzeln wird gemessen, nachdem die Wurzeln in angesäuertem Wasser (Ascorbinsäure-Wasser) extrahiert und bei 5000X g 15 Minuten zentrifugiert wurden. Die Überstände werden gesammelt und die optische Dichte wird spektrophotometrisch bei 480 nm und 540 nm auf Betaxanthine bzw. Betacyanine gemessen.

Dopa- und Dopamingehalte werden durch HPLC-Analyse der Proben quantifiziert und werden mit solchen von authentischen Standards verglichen. Die Identifizierung der Peaks ist markanter, wenn ein Fluoreszenzdetektor verwendet wird.

Die Extrahierbarkeit von L-Dopa und Dopamin aus B. vulgaris unter Verwendung von verschiedenen Lösungsmitteln ist in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1: Extrahierbarkeit von Dopa und Dopamin aus Haarwurzelkulturen von Beta vulgaris unter Verwendung von verschiedenen Lösungsmitteln

Unter den für die Extraktion von Dopa und Dopamin verwendeten Lösungsmitteln hat sich 2% Ameisensäure als gut erwiesen, verglichen mit 80% heißem Ethanol und 0,1 N HCl. Die Dopa-Herstellung wird unter Verwendung von 2% Ameisensäure als Extraktionslösungsmittel analysiert, was mehr Gehalt in den Anfangsstufen der Kultur (exponentielle Phase), d.h. am 6. Tag der Kulturzeit, verzeichnet. Der Dopamingehalt ist während des 15. Tags der Kultivierungszeit mehr, wobei er später einen Abfall zeigt. Wenn mit 2% Ameisensäure extrahiert sind die Dopa-Extraktionsgehalte 1,7- bzw. 1,5-fach höher als die mit 80% Ethanol bzw. 0,1 N HCl extrahierten. Auch die Dopamin-Wiedergewinnung ist höher, wenn 2% Ameisensäure für die Extraktion verwendet wird, was 1,9- bzw. 1,4-fach höher ist im Vergleich zu der mit 80% Ethanol bzw. 0,1 N HCl extrahierten. Basierend auf den Ergebnissen werden weitere Extraktionen mit 2% Ameisensäure in allen Experimenten mit B. vulgaris-Haarwurzelkulturen zur Herstellung von Dopa und Dopamin ausgeführt.

BEISPIEL 3

300 mg Frischgewicht Haarwurzeln von Beta vulgaris (4 Tage alt) werden in 40 ml Nährmedium aus Murashige und Skoog's Salzen in 150 ml Erlenmeyerkolben inokuliert. Der pH des Mediums wird vor dem Autoklavieren für 15 Minuten bei 121 °C bei 15 1b Druck auf 5,8 eingestellt. Tyrosin (gelöst in einigen Tropfen 0,1 N NaOH, wobei der Rest des Volumens mit destilliertem Wasser aufgefüllt ist) mit einer Konzentration von 3 mg/40 ml Kulturmedium wird an den 6 Tagen Kultivierungszeitraum zugegeben. Die Haarwurzeln werden mit 2% Ameisensäure in einem Mörser mit Pistill unter Verwendung von neutralisiertem Glaspulver extrahiert. Die Extrakte werden zentrifugiert, unter Verwendung eines Whatman #1 Filterpapiers filtriert, konzentriert und für HPLC-Analyse verwendet. Dopagehalt steigt von 32 &mgr;g/g DW am 6. Tag der Kulturzeit auf 46 &mgr;g/g DW am 15. Tag, wobei es später auf 9 &mgr;g/g DW am 24. Tag abfällt. Der L-Dopagehalt in diesem Falle ist 1,53-fach höher im Vergleich zu den ungefütterten Kulturen. Dopamingehalt steigt von 0,412 mg/g DW am 6. Tag auf 1,972 mg/g DW am 20. Tag und fällt später weiter ab bis er einen Wert von 0,762 mg/g DW am 24. Tag erreicht. Dopamingehalt ist in diesem Fall (gefüttert mit Tyrosin) 2,02-fach höher im Vergleich zu (ungefütterten) Kontroll-Kulturen. Betalaingehalt hat ebenfalls einen Anstieg im Vergleich mit der Kontrolle gezeigt. Maximale Betalainanreicherung wird am 20. Tag der Kultivierungszeit mit 13,1 mg/g DW von einem Anfangswert von 3,1 mg/g DW am 6. Tag aufgezeichnet, was wiederum auf 8 mg/g DW am 24. Tag abfällt. Somit stellt diese Untersuchung stellt wertvolle Information für die richtige Zeit (Kultivierungszeit) zur Verfügung, um die Haarwurzelzellen zur besseren Anreicherung von L-Dopa und Dopamin zu ernten, sowie das geeignete Lösungsmittel für ihre Extraktion. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2: Dopa- und Dopamingehalt in mit Tyrosin gefütterten B. vulgaris-Haarwurzelkulturen

Die Hauptvorteile der vorliegenden Untersuchung sind

  • 1. In vitro-Kultur von Haarwurzeln wird verwendet zur Herstellung von Dopa und Dopamin.
  • 2. Da Haarwurzeln hormonelle Autotrophie entwickeln, erfordert das Verfahren ein relativ billiges Medium für die phytochemische Herstellung.
  • 3. Das schnellere Wachstum und Genetik, sowie biochemische Stabilität von Haarwurzeln ist ein zusätzlicher Vorteil.
  • 4. Die Identifizierung der richtigen Stufe der Kultivierungszeit für maximale Anreicherung von Dopa und Dopamin vereinfacht dieses Verfahren als kommerziell durchführbares.
  • 5. Die Metaboliten Dopa und Dopamin können leicht unter Verwendung von 2% Ameisensäure extrahiert werden, die eine schwache Säure ist, im Vergleich zu HCl und 80% heißem Ethanol.
  • 6. Verwendung von Precursorn wie Tyrosin, die leicht für bessere Produktion von Dopa und Dopamin erhältlich sind, ist nützlich.
  • 7. Da Dopamin wasserlöslich ist, kann seine direkte Verwendung nach Extraktion in Wasser ein zusätzlicher Vorteil sein.
  • 8. Da Haarwurzeln zum Aufskalieren (scale-up) in Bioreaktoren besser zugänglich sind, kann Tyrosin für maximale Anreicherung dieser Phytochemikalien in einem großen Maßstab zugegeben werden.


Anspruch[de]
Verfahren zur Herstellung von Dopa und Dopamin aus Haarwurzelkulturen von Beta Vulgaris, welches Verfahren die Schritte umfasst, dass man:

a) Haarwurzeln von Beta Vulgaris unter Verwendung eines Nährmediums kultiviert, in einem Autoclaven sterilisiert;

b) Haarwurzeln im Bereich von 0,1 bis 0,5 g Frischgewicht/40ml Kulturmedium inokuliert, gewachsen für 2 bis 24 Tage um ein höheres Wachstum und Metaboliten zu erhalten;

c) das richtige Kulturstadium der Haarwurzeln für eine maximale Dopa- und Dopaminherstellung wählt, bezogen auf den biosynthetischen Pfad der Betalaine; und

d) die Haarwurzeln mit Lösungsmittel extrahiert um Dopa und Dopamin zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, worin in Schritt a) das verwendete Nährmedium MS Medium umfasst mit 2 bis 4% Saccharose als Hauptkohlenstoffquelle. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt a) die Sterilisation 10 bis 30 Minuten bei einer Temperatur im Bereich von 110 bis 130°C ausgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt d) die Haarwurzeln unter Verwendung von Ameisensäure im Bereich von 1 bis 4% (v/v) 0,1 N HCl und 80% heißem Ethanol extrahiert werden. Verfahren nach Anspruch 1, worin in Schritt d) die Extrakte zentrifugiert, gefiltert und unter Vakuum konzentriert werden. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zugabe von Ameisensäure im Bereich von 1 bis 4% (V/V) zur Extraktion die Herstellung von Dopa und Dopamin verbessert. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zugabe von Tyrosin im Bereich von 1 bis 5 mg/ 40 ml Kulturmedium zu 3 bis 7 Tage alten Kultur zu einer verbesserten Ausbeute von Dopa und Dopamin führt. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Haarwurzeln von Beta Vulgaris in einem flüssigen Nährmedium aseptisch kultiviert werden, und mit 1 bis 5% Ameisensäure bei exponentiellem Wachstum extrahiert werden. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt c) die exponentielle Wachstumsphase zur maximalen Akkumulation von Dopa in Kulturen im Bereich zwischen 5 und 8 Tagen liegt. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt c) die exponentielle Wachstumsphase zur maximalen Akkumulation von Dopamin in Kulturen im Bereich 12 bis 16 Tage liegt.






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