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Dokumentenidentifikation DE69934449T2 27.09.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000941766
Titel Mikrokolonnen-System für Magnettrennung
Anmelder Miltenyi Biotech GmbH, 51429 Bergisch Gladbach, DE
Erfinder Miltenyi, Stefan, 51429 Bergisch Gladbach, DE;
Siebenkotten, Gregor, 50937 Köln, DE;
Koester, Mathias, 50678 Köln, DE
Vertreter Rechts- und Patentanwälte Lorenz Seidler Gossel, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69934449
Vertragsstaaten CH, DE, ES, FR, GB, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 08.03.1999
EP-Aktenzeichen 993017193
EP-Offenlegungsdatum 15.09.1999
EP date of grant 20.12.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.09.2007
IPC-Hauptklasse B03C 1/025(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse B03C 1/034(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   B03C 1/033(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   B03C 1/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung der Hochgradienten-Magnetseparation ("high gradient magnetic separation", (HGMS)) zur Trennung von biologischen Materialien einschließlich Zellen, Organellen und anderen biologischen Materialien. Insbesondere betrifft diese Erfindung Mikrosäulen und Mikrosäulensysteme für die Trennung von Makromolekülen und Zellen in einem Magnetfeld mit hohem Gradienten.

STAND DER TECHNIK

Die Hochgradienten-Magnetseparation (HGMS) bezieht sich auf ein Verfahren zum selektiven Zurückhalten magnetischer Materialien in einer Kammer oder Säule, die sich in einem Magnetfeld befindet. Diese Technik kann auch auf nichtmagnetische Ziele angewendet werden, sofern diese mit magnetischen Partikeln markiert sind. Die Technik wird in den US-Patentschriften Nr. 5,411,863 und 5,385,707 ausführlich diskutiert.

Das betreffende Material, welches selbst magnetisch ist oder an einen magnetischen Partikel gekoppelt ist, wird in einem Fluid in Suspension gebracht und der Kammer zugeführt. Bei Vorhandensein eines Magnetfeldes, welches sich über die Kammer erstreckt, wird das betreffende Material, da es magnetisch ist, in der Kammer zurückgehalten. Materialien, die nicht magnetisch sind und über keine magnetische Markierung verfügen, durchqueren die Kammer. Die zurückgehaltenen Materialien können anschließend eluiert werden, indem die Stärke des Magnetfeldes verändert wird oder indem dieses aufgehoben wird.

Die US-Patentschrift Nr. 4,508,625, die an Graham erteilt wurde (Graham '625), offenbart ein Verfahren zum Inkontaktbringen chelatkomplexierter paramagnetischer Ionen mit Partikeln, die eine negative Oberflächenladung aufweisen und sich in einer Trägerflüssigkeit befinden, um die Magnetempfindlichkeit der Partikel zu erhöhen. Anschließend werden die Trägerflüssigkeit und die Partikel einem Magnetfeld ausgesetzt, um mindestens einen Teil der Partikel von der Trägerflüssigkeit abzutrennen.

Die US-Patentschrift Nr. 4,666,595, die Graham erteilt wurde (Graham '595) offenbart eine Vorrichtung zum Entfernen intakter biologischer Zellen aus einem Fluidmedium mittels HGMS. Das Fluid, welches die Zellen enthält, wird durch eine Fließkammer geleitet, die eine Trennmatrix mit Zwischenräumen enthält, wobei das Fluid durch letztere hindurchströmt. Die Matrix wird einem starken Magnetfeld ausgesetzt, während sie von dem Fluid durchströmt wird. Dadurch werden zumindest einige der Zellen magnetisch von der Matrix zurückgehalten, während der Rest des Fluid durch sie hindurchströmt.

In Graham '595 ist weiterhin ein piezoelektrischer Schallwandler offenbart, der über das Trägerfluid mit der Matrix strömungsverbunden ist. Wenn die Aufnahmekapazität der Matrix für Zellen erschöpft ist, wird das Trägerfluid durch ein Spülfluid ersetzt. Anschließend wird der piezoelektrische Schallwandler angeregt, um hochfrequente Schallwellen durch das Fluid in der Kammer zu senden. Die Schallwellen entfernen die Zellen (Partikel) aus der Matrix, und es erfolgt eine Auswaschung durch das Spülfluid.

Die US-Patentschrift 4,664,796, die Graham et al. erteilt wurde (Graham et al. '796), offenbart ein HGMS-System zur Trennung intakter biologischer Zellen von einem Fluidmedium. Das System umfasst eine Fließkammer, die eine Trennmatrix mit Zwischenräumen enthält, wobei das Fluid durch letztere hindurchströmt, sowie eine damit in Verbindung stehende Magnetisiervorrichtung zur Kupplung des magnetischen Flusses mit der Matrix. Die Magnetisiervorrichtung umfasst einen Permanentmagneten mit sich gegenüberliegenden Nord- beziehungsweise Südpolen sowie Polschuhen zur Ausrichtung des Feldes. Die Flusskupplungsvorrichtung ist derart angeordnet, dass sie ein starkes Magnetfeld durch die Matrix sendet, während diese von dem Trägerfluid durchströmt wird, wodurch die Zellen oder Partikel von der Matrix eingefangen werden können.

Die Flusskupplungsvorrichtung ist derart angeordnet, dass der magnetische Fluss während der Spülphase, in welcher das Trägerfluid durch das Spülfluid ersetzt wird, von der Matrix fortgelenkt wird, sodass die Schleppkräfte des Spülfluids stärker als die geschwächten magnetischen Anziehungskräfte zwischen der Matrix und den Zellen oder Partikeln sind, wodurch es dem Spülfluid ermöglicht wird, die Zellen oder Partikel fortzuschleppen. Darüber hinaus kann ein piezoelektrischer Schallwandler vorgesehen sein, der dazu bestimmt ist, in Verbindung mit dem Umlenken des magnetischen Flusses durch die Flusskupplungsvorrichtung in der Spülphase, für ein langsameres Fließen des Spülfluids zu sorgen.

Die Matrix ist derart in der Fließkammer angeordnet, dass sie dem vollen magnetischen Fluss des Magneten ausgesetzt ist, wenn sich die Fließkammer in einer ersten Position befindet, und zwar während der Abtrennung der Zellen von dem Trägerfluid. Wenn die Fließkammer eine Drehbewegung von näherungsweise 90° aus der ersten Position heraus vollführt, und zwar während der Spülphase, ist die Matrix derart angeordnet, dass der magnetische Fluss im Wesentlichen ab der Matrix vorbeigeleitet wird.

Graham et al. '795 offenbaren weiterhin die Möglichkeit, einen piezoelektrischen Schallwandler, der mit der Matrix strömungsverbunden ist, einzusetzen, um im Zusammenwirken mit der Positionsänderung der Flusskupplungsvorrichtung, welche dazu dient, das Magnetfeld an der Matrix vorbeizuleiten, dafür zu sorgen, dass die Flussrate des Spülfluids verringert wird.

Nach dem Stand der Technik gibt es verschiedenartige HGMS-Verfahren sowie Verfahren zum Wiedergewinnen der Zellen/Partikel, nachdem diese mittels HGMS abgetrennt worden sind. Für sehr kleine Proben wie etwa solche, die im Rahmen von molekularbiologischen Anwendungen vorkommen, ist der Stand der Technik indes weit von den idealen Bedingungen zur Durchführung von HGMS entfernt. Um sehr kleine Proben, wie sie beispielsweise bei der Abtrennung von Boten-RNA von der Gesamt-RNA oder von Zell-Lysaten auftreten, zweckmäßig zu eluieren, bedarf es sehr kleiner Elutionsvolumina. Größere Elutionsvolumina benötigen bei den nachfolgenden Anwendungen größere Volumina an Enzymen, wodurch diese Anwendungen unannehmbar kostspielig würden und dem Vorgang insgesamt seine Effizienz und seinen Nutzwert nehmen würden. Hinzu kommt, dass kleine Totvolumina immer dann von Bedeutung sind, wenn in der Säule selbst chemische Reaktionen ablaufen sollen. Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, den Einsatz der HGMS-Technik zur Trennung sehr kleiner Proben, insbesondere im klinischen und gewerblichen Bereich, effizienter und wirkungsvoller zu machen.

In WO-A-92/16301 ist eine magnetische Trennvorrichtung mit hohem Gradienten zur Abtrennung magnetisierbarer Partikel aus einem Fluid offenbart. Die Trennvorrichtung umfasst eine Trennkammer mit einer Einlassöffnung und einer Auslassöffnung sowie ein Mittel zur Erzeugung eines axialen Magnetfeldes innerhalb der Kammer. In einer Anordnung (3) befinden sich drei Matrixelemente, welche jeweils magnetisierbares Material umfassen, übereinander in der Kammer. Die Querschnittsflächen der drei Matrixelemente unterscheiden sich jeweils voneinander, wobei die Querschnittsfläche des obersten Matrixelements am kleinsten ist, die Querschnittsfläche des untersten Matrixelements am größten ist und die Querschnittsfläche des mittleren Matrixelements zwischen den Querschnittsflächen der darüber und darunter befindlichen Matrixelemente liegt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine HGMS-Mikrotrennsäule bereitgestellt, die folgendes umfasst:

erste und zweite rohrförmige Abschnitte, wobei der erste Abschnitt integral mit dem zweiten Abschnitt ist und über dem zweiten Abschnitt angeordnet ist, wobei der erste Abschnitt eine erste Querschnittfläche und der zweite Abschnitt eine zweite Querschnittfläche aufweist, wobei die erste Querschnittfläche größer als die zweite Querschnittfläche ist; und

eine Matrix, die dafür ausgelegt ist, wahlweise mindestens eine Komponente eines Gemisches zu entfernen, wenn das Gemisch durch die rohrförmigen Abschnitte strömt, wobei die Matrix in mindestens einem Teil des ersten Abschnitts und in mindestens einem Teil des zweiten Abschnitts enthalten ist und wobei die Matrix ferromagnetisches Material umfasst.

Die nachstehend beschriebenen und erläuterten Ausführungsformen der HGMS-Mikrotrennsäule gemäß der vorliegenden Erfindung schaffen Verbesserungen bei der Hochgradienten-Magnetseparation von Materialien, die in sehr kleinen Volumina enthalten sind. Sie kombinieren die Vorteile einer Bindungsreaktion in Suspension (z.B. schnelle Kinetik, hohe Effizienz) mit denen eines Trennvorganges auf einer Säule (z.B. Reinheit, Einfachheit), wobei gleichzeitig die erforderlichen Elutionsvolumina gering bleiben. Weiterhin sorgt ein kleines Totvolumina dafür, dass chemische Reaktionen innerhalb der Säule durchgeführt werden können.

Die Trennungstechniken können in einem kontinuierlichen Verfahren oder in einem schrittweisen Verfahren eingesetzt werden, wobei die verschiedenen Schritte des Trennvorganges durch einfaches Zugeben verschiedener Puffer, Chemikalien, usw. welche möglicherweise auch unterschiedlich Temperaturen aufweisen, wie dies z.B. bei heißem Wasser der Fall ist, in einer Säule erfolgen. Der Vorgang insgesamt ist somit sehr schnell.

Das ferromagnetische Material kann ferromagnetische Kugeln oder andere ferromagnetische Partikel umfassen. Das ferromagnetische Material kann mit einer Schicht überzogen sein, welche die relative Anordnung der Partikel zueinander aufrechterhält. Vorzugweise umfasst die Schicht Lack und insbesondere einen Lack gemäß der Beschreibung in mindestens einer der US-Patentschriften 5,691,208; 5,693,539; 5,705,059; und 5,711,871. Die ferromagnetischen Kugeln oder Partikel weisen vorzugsweise einen Durchmesser von mindestens 100 &mgr;m, mit besonderem Vorzug von mehr als ungefähr 200 &mgr;m und weniger als ungefähr 2.000 &mgr;m, mit noch größerem Vorzug von mehr als ungefähr 200 &mgr;m und weniger als ungefähr 1.000 &mgr;m und mit dem größten Vorzug von ungefähr 280 &mgr;m auf. Die Matrix (d.h., die ferromagnetischen Partikel und die Schicht) nehmen vorzugsweise mindestens ungefähr 50 Prozent des Innenvolumens des ersten und des zweiten Abschnitts ein. Das Totvolumen der Säule, wobei es sich um das Volumen in den Zwischenräumen handelt, welches nicht von der Matrix eingenommen wird (d.h., das matrixfreie Volumen), sowie das Volumen desjenigen Abschnitts der Säule, der sich unterhalb der Matrix befindet, beträgt vorzugsweise weniger als ungefähr 85 &mgr;l, mit besonderem Vorzug weniger als ungefähr 70 &mgr;l, mit noch größerem Vorzug weniger als ungefähr 50 &mgr;l und mit dem größten Vorzug ungefähr 30 &mgr;l. Die sich selbst einstellende, schwerkraftbedingte Fließgeschwindigkeit ist im Allgemeinen größer als ungefähr 100 &mgr;l/min., mit besonderem Vorzug größer als ungefähr 200 &mgr;l/min. und mit dem größten Vorzug größer als ungefähr 300 &mgr;l/min.

Die Röhre kann weiterhin einen dritten Abschnitt umfassen, der mit dem zweiten Abschnitt integral ist. Der dritte Abschnitt weist eine dritte Querschnittsfläche auf, die kleiner als die Querschnittsfläche des zweiten Abschnitts ist. Weiterhin kann die Röhre einen vierten Abschnitt umfassen, der mit dem dritten Abschnitt integral ist. Der vierte Abschnitt weist ein Außenmaß (d.h. einen Außerdurchmesser, wobei es sich indes um ein Außenmaß einer Struktur handelt kann, die im Querschnitt eine andere als die Kreisform aufweist) auf, welches kleiner als das entsprechende Außenmaß des dritten Abschnitts ist. Es kann ein oberer Abschnitt vorgesehen sein, welcher integral mit dem ersten Abschnitt ist. Der obere Abschnitt weist eine Querschnittsfläche auf, die größer als die Querschnittsfläche des ersten Abschnitts ist.

Wahlweise kann die Mikrotrennsäule eine Halterung umfassen, die im zweiten Abschnitt neben der Matrix angeordnet ist. Vorzugsweise ist die Halterung im Wesentlichen kugelförmig und erheblich größer als die Partikel, aus denen die Matrix besteht. Alternativ dazu kann es sich bei der Halterung um ein poröses Geflecht oder Gitter oder um eine poröse Fritte handeln.

Die Röhre kann aus einem Material wie etwa PCTG oder aus Polyethylenen, Polyamiden, Polypropylenen, Acrylstoffen, PET, anderen Kunststoffen, die gegenwärtig für Einweg-Laborartikel verwendet werden, sowie aus Glas gebildet sein, wobei sie vorzugsweise aus einem Kunststoff gebildet ist, der mit Lack eine Bindung eingeht, und mit besonderem Vorzug aus PCTG.

Wenn eine kugelförmige Halterung zum Einsatz kommt, erstreckt sich mindestens eine Befestigung in dem zweiten Abschnitt der Röhre und dient als Unterlage für die Halterung. Vorzugsweise sind drei Befestigungen als Unterlage für die bevorzugte kugelförmige Halterung vorgesehen.

Wahlweise kann eine obere Matrixhalterung im ersten Abschnitt der Röhre angeordnet sein, und zwar neben der Matrix. Vorzugsweise umfasst die obere Matrixhalterung ein poröses Gitter oder Geflecht oder eine poröse Fritte. Zusätzlich zu den ferromagnetischen Materialien kann die Matrix wahlweise eine oder mehrere nichtmagnetische Komponenten wie etwa Glaspartikel einschließlich Kugeln oder Kunststoffpartikel oder -kugeln umfassen.

Vorzugsweise ist die Mikrotrennsäule der vorliegenden Erfindung für einen schwerkraftgespeisten Betrieb ausgelegt, alternativ dazu kann sie aber auch für einen druckgespeisten Betrieb ausgelegt sein.

Es ist eine Mikrotrennsäule offenbart, welche einen ersten und einen zweiten rohrförmigen Abschnitt umfasst, wobei der erste Abschnitt mit dem zweiten Abschnitt integral ist, sowie eine Matrix, die dafür ausgelegt ist, mindestens einen Bestandteil selektiv aus einer Mischung zu entfernen, während die Mischung durch die rohrförmigen Abschnitte fließt. Die Matrix ist in mindestens einem Teil des ersten Abschnitts und mindestens einem Teil des zweiten Abschnitts enthalten. Derjenige Teil der Matrix, der in dem ersten Abschnitt enthalten ist, trägt in stärkerem Ausmaß zum Entfernen bei als die Menge an Matrix, die im zweiten Abschnitt enthalten ist. Die Menge an Matrix, die im zweiten Abschnitt enthalten ist, trägt in stärkerem Ausmaß zum Fließwiderstand bei als die Menge an Matrix, die im ersten Abschnitt enthalten ist. Vorzugsweise weist die Matrix eine Gesamthöhe von weniger als ungefähr 20 mm, mit besonderem Vorzug von weniger als ungefähr 15 mm und mit dem größten Vorzug von weniger als ungefähr 12 mm auf. Vorzugsweise weist die Matrix im ersten Abschnitt eine Höhe von weniger als ungefähr 10 mm und mit besonderem Vorzug von weniger als ungefähr 6 mm auf.

Weiterhin ist eine Mikrotrenneinrichtung zur Verwendung bei der Durchführung von Mikrotrennvorgängen offenbart. Die Mikrotrenneinrichtung umfasst ein magnetisches Joch mit mindestens einer Kerbe, die entlang einer Länge desselben ausgebildet ist. In jeder der Kerben ist ein Paar von Magneten angeordnet. Jedes Magnetpaar grenzt einen dazwischen befindlichen Spalt ab, welcher dafür ausgelegt ist, eine Mikrotrennsäule zur Durchführung von Mikrotrennvorgängen aufzunehmen. Vorzugsweise besteht das Joch aus Stahl. Vorzugsweise umfasst das Joch mindestens zwei Kerben und mit besonderem Vorzug vier.

Jedes Magnetpaar bildet in ein Magnetfeld in dem jeweiligen Spalt, welches stärker als ungefähr 0,2 Tesla, vorzugsweise stärker als ungefähr 0,4 Tesla, mit besonderem Vorzug stärker als ungefähr 0,5 Tesla und mit dem größten Vorzug stärker als ungefähr 0,6 Tesla ist.

Die Mikrotrenneinrichtung umfasst weiterhin eine unzerbrechliche Abdeckung, die das Joch und die Magnete umschließt. Vorzugsweise besteht die Abdeckung aus Polyurethangummi. Darüber hinaus kann mindestens ein Haftmagnet in der Abdeckung vorgesehen sein, der dem magnetischen Befestigen der Mikrotrenneinrichtung an einer magnetischen Oberfläche dient.

Weiterhin ist ein Mikrosäulensystem offenbart, das eine Mikrotrenneinrichtung umfasst, welches ihrerseits ein magnetisches Joch mit mindestens einer Kerbe, die entlang einer Länge desselben ausgebildet ist, umfasst, wobei in jeder der Kerben, von denen mindestens eine vorhanden ist, ein Magnetpaar derart angeordnet ist, dass dazwischen ein Spalt entsteht; sowie mindestens eine Mikrotrennsäule, die jeweils folgendes umfasst: erste und zweite rohrförmigen Abschnitte, wobei der erste Abschnitt mit dem zweiten Abschnitt integral ist, sowie eine Matrix, die dafür ausgelegt ist, mindestens einen Bestandteil selektiv aus einer Mischung zu entfernen, während die Mischung durch die rohrförmigen Abschnitte fließt. Die Matrix ist in mindestens einem Teil des ersten Abschnitts und mindestens einem Teil des zweiten Abschnitts enthalten. Derjenige Teil der Matrix, der in dem ersten Abschnitt enthalten ist, trägt in stärkerem Ausmaß zum Entfernen bei als die Menge an Matrix, die im zweiten Abschnitt enthalten ist. Die Anzahl der Mikrotrennsäulen ist gleich der Anzahl der Spalte in dem Joch.

Ein Aspekt der HGMS-Mikrotrennsäule betrifft ein Trennungs- und Freisetzungsverfahren zum Reinigen von biologischem Material auf der Mikrosäule. Nach dem Zurückhalten des betreffenden biologischen Materials, welches an magnetische Partikel in der Matrix gekoppelt ist, kann das gebundene Material wahlweise von den magnetischen Partikeln getrennt und aus der Säule eluiert werden, während die magnetischen Partikel weiterhin von der Matrix magnetisch zurückgehalten werden. Die Trennung kann durch eine geeignete Änderung von Puffern oder der Temperatur sowie durch chemische oder enzymatische Reaktionen erfolgen, welche die Bindung zwischen den magnetischen Partikeln und dem betreffenden biologischen Material lösen.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 ist eine Schnittansicht einer Säule des Standes der Technik;

2 ist eine Schnittansicht einer bevorzugten Ausführungsform einer Mikrosäule gemäß der vorliegenden Erfindung;

3 ist eine Schnittansicht einer Mikrosäule gemäß der vorliegenden Erfindung;

4 ist eine Schnittansicht einer Säule, wobei der Schnitt senkrecht zu dem Schnitt, der in 3 dargestellt ist, erfolgt ist, und zwar auf der Höhe, die durch die Linien IV-VI angezeigt wird;

5 ist eine Schnittansicht einer Variante der Mikrosäule gemäß der vorliegenden Erfindung;

6 ist eine Schnittansicht, die eine weitere Variante der Mikrosäule gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt;

7 ist eine perspektivische Ansicht des Mikrosäulen-Trennsystems gemäß der vorliegenden Erfindung;

8A ist eine Aufsicht einer Trenneinheit gemäß der vorliegenden Erfindung;

8B ist eine Frontansicht der Trenneinheit, die in 8A dargestellt ist;

8C ist eine Aufsicht einer Trenneinheit, wobei die im Inneren befindlichen Komponenten durch gestrichelte Linien dargestellt sind;

9 zeigt die Zusammensetzung der Tropfen 1 bis 5 (prozentualer Anteil der eluierten mRNA-Probe), die von Olig(dT)-MicroBeads in einem Mikrosäulensystem stammen, wobei die Darstellung ein Agarosegel zeigt.

BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG

Die HGMS-Auftrennung sehr kleiner Proben, wie sie etwa bei vielen molekularbiologischen Anwendungen vorkommen, z.B. im Falle von mRNA, erfordert den Einsatz sehr kleiner Elutionsvolumina, um die Proben effizient und wirkungsvoll zu eluieren, sowie den Ablauf der Reaktion in einem kleinen Volumen, wobei auch das Totvolumen gering sein muss. Zur Erläuterung dieses Bedarfs sei gesagt, dass eine Säule des Standes der Technik, wie sie in 1 dargestellt ist, eine Matrix 1010 aus Metallkugeln umfasst, die ungefähr 280 &mgr;m groß sind und eine Porosität von ungefähr 28 &mgr;m verleihen. Die Höhe der Säule mit der Matrix 1010 beträgt ungefähr 20 mm, das Totvolumen der Matrix 1010 ungefähr 70 &mgr;l und das Totvolumen der Säule ungefähr 85 &mgr;l. Die Flussrate durch die Kugelmatrix beträgt ungefähr 400 &mgr;l/min.

Eine einfache Verringerung der Säulenhöhe der Matrix 1010 würde zwar der Verringerung des Volumens derselben dienen, wäre aber bei der Verarbeitung der erwähnten kleinen Proben nicht wirkungsvoll, da dies zu einer zu hohen Flussrate beim Durchströmen der Matrix führen würde. Eine Verringerung der Querschnittsfläche der Matrix erhöht die Wahrscheinlichkeit des Verstopfens und verringert darüber hinaus die Trennungsgeschwindigkeit. Eine Verringerung der Höhe der Fluidsäule verringert oder verhindert möglicherweise sogar die Tropfenbildung am Ende der Säule, da das erzeugte Druckgefälle ausreichend groß sein muss, um die Oberflächenspannung am Ende der Säule, wo die Tropfen gebildet werden, zu überwinden.

Die vorliegende Erfindung trägt sämtlichen der oben erwähnten möglichen Probleme Rechnung. In 2 ist eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung 100 dargestellt. Die Mikrosäule 100 weist im Vergleich mit Säulen, die nach dem Stand der Technik eingesetzt werden, ein erheblich verringertes Totvolumen auf, wobei jedoch optimale Fließgeschwindigkeiten beibehalten werden, und sie ist dafür ausgelegt, Makromoleküle (oder Zellen), die über spezifische biologische/chemische Wechselwirkungen magnetisch gebunden sind, von anderen Makromolekülen/Zellen zu trennen, und zwar in einem Magnetfeld mit hohem Gradienten, sowie für die Elution dieser Moleküle/Zellen in einem kleinen Volumen. Der Mikrosäule wird eine hydrophile Beschaffenheit verliehen, indem sie aus einem hydrophilen Material wie etwa einem hydrophilen Kunststoff hergestellt wird oder, insbesondere, indem die Säule innen mit einem hydrophilen Material z.B. mit Polyvinylpyrrolidon überzogen wird. Alternativ oder zusätzlich dazu können die Puffer, die auf die Säule gegeben werden, einen oder mehrere Tenside enthalten, z.B. SDS.

Die Matrix 110 umfasst einen ersten Abschnitt 110a mit einer Querschnittsfläche, die im Verhältnis zu derjenigen des zweiten Abschnitts 110b größer ist. Die Säule 100 umfasst einen verhältnismäßig großvolumigen Vorratsbehälter 112, in welchen eine zu trennende Probe gegeben wird. Der Vorratsbehälter 112 verjüngt sich trichterförmig 114 bis zu einem ersten rohrförmigen Säulenabschnitt 116 mit kleinerer Querschnittsfläche, in welchem sich ein erster Teil 110a der Matrix befindet. Der erste Abschnitt verjüngt sich zu einem zweiten rohrförmigen Säulenabschnitt 118 mit einer noch kleineren Querschnittsfläche, in welchem sich ein zweiter Teil 110b der Matrix befindet. Obgleich sämtliche der Säulen, die in den Figuren dargestellt sind, die bevorzugte zylindrische Konfiguration aufweisen, ist dies nicht als Einschränkung der vorliegenden Erfindung aufzufassen. Die Säulen können beispielsweise derart bildet sein, dass sie einen elliptischen Querschnitt, einen quadratischen Querschnitt, andere geometrische Querschnitte oder sogar nicht-geometrische Querschnitte aufweisen. Darüber hinaus müssen die Formen der Abschnitte nicht gleichartig sein. Zum Beispiel kann ein erster Abschnitt einen sechseckigen Querschnitt haben, während der zweite Abschnitt zylindrisch ist.

Die Matrix 110 enthält ferromagnetisches Material, vorzugsweise Kugeln 120, wobei es sich aber auch um andere Partikel, die nicht kugelförmig sind, oder um ein integriertes dreidimensionales Geflecht mit der gewünschten Porosität handeln kann. Das ferromagnetische Material 120 kann mit einer Schicht überzogen sein, welche die relative Anordnung der Partikel zueinander aufrechterhält. Vorzugsweise handelt es sich um eine Lackschicht. Die Kugeln/Partikel sind größer als ungefähr 100 &mgr;m, vorzugsweise größer als ungefähr 200 &mgr;m und kleiner als ungefähr 2.000 &mgr;m, mit besonderem Vorzug größer als ungefähr 200 &mgr;m und kleiner als ungefähr 1.000 &mgr;m, und mit dem größten Vorzug beträgt ihre Größe 280 &mgr;m. Ausführliche, beispielhafte Beschreibungen von Trennmatrices, die für die HGMS von Nutzen sind, finden sich in den ebenfalls anhängigen Anmeldungen Nr. 08/377,744, eingereicht am 23. Januar 1995, sowie in der US-Patentschrift Nr. 5,411,863. Die Matrix nimmt vorzugsweise mindestens 50 Prozent des Innenvolumens des ersten Abschnitts und des zweiten Abschnitts ein.

Die Säule 100 besteht vorzugsweise aus Kunststoffen wie etwa aus Polypropylenen, Polyethylenen, Acrylstoffen, PET usw., wobei sie, wenn die Matrix mit Lack überzogen ist, vorzugsweise aus einem Kunststoff, der mit dem Lack eine Bindung eingehen wird, besteht, insbesondere aus einem Harz wie etwa PCTG (Polycyclohexadimethylterephthalat, das mit Ethylenglykol modifiziert ist). Dies vereinfacht die Herstellung der Säule erheblich, da es auf diese Weise nicht mehr erforderlich ist, überschüssigen Lack zu entfernen, nachdem der Lack in die Säule gegeben wurde, um die ferromagnetischen Partikel zu beschichten. Wenn die Säule aus einem Material wie etwa Polypropylen besteht, muss der überschüssige Lack nach dem Beschichten der ferromagnetischen Partikel von den Wänden der Säule entfernt werden. Dies ist ein zeitaufwändiger, mühsamer Schritt, der die Herstellungskosten der Säule deutlich erhöht.

Wenn die Matrix 110 einem externen Magnetfeld ausgesetzt wird, wird in derselben ein Magnetfeld mit hohem Gradienten erzeugt. Wenn die Matrix aus dem Feld entfernt wird, findet in derselben eine unverzügliche Entmagnetisierung statt. In dem ersten Abschnitt 110a der Matrix ist die Flussrate geringer als im zweiten Abschnitt 110b. Der erste Abschnitt 110a der Matrix trägt am meisten zum Trennvorgang bei, da seine Querschnittsfläche und sein Volumen größer als beim zweiten Abschnitt 110b sind. Die magnetisierten Partikel der Matrix 110 halten einzeln vorliegende superparamagnetische MicroBeads (mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 50 nm/gemäß den Angaben von Miltenyi Biotec) sowie Material, das diesen anhaftet, aus einer Lösung oder Reaktionsmischung von variabler Viskosität zurück, wobei letztere durch die Säule 100 fließt und dabei vorzugsweise von der Schwerkraft angetrieben wird. Das gebundene Material kann in einem kleinen Volumen eluiert werden. Der zweite Abschnitt 110b erfüllt in erster Linie eine Fließwiderstandsfunktion, da seine Querschnittsfläche deutlich geringer ist als diejenige des ersten Abschnitts 110a, wobei die Erstere auch aus Partikeln von geringerer Größe bildet werden kann. Selbstverständlich stellt auch der erste Abschnitt 110a in einem gewissen Ausmaße ein Widerstandselement dar. Vorzugsweise kommt dem zweiten Abschnitt 110b eine gewisse Trennfunktion zu, wobei er aber alternativ dazu auch vollständig aus nichtmagnetischen Partikeln wie etwa Kunststoff oder Glas gebildet sein kann und in diesem Falle ausschließlich als Widerstandselement dienen würde.

Somit können die Glaskugeln/partikel 120' oder die Kunststoffkugeln/partikel oder die anderen nicht-ferromagnetischen Kugeln oder Partikel in dem ersten und/oder in dem zweiten Abschnitt durch einige der Kugeln/Partikel 120 ersetzt werden, ohne dass die Trennleistung der Säule und Matrix unerwünschterweise beeinträchtigt würde und ohne dass die Widerstandsfunktion des zweiten Abschnitts beeinträchtigt würde, siehe 5. In einigen Fällen können sämtliche der Kugeln/Partikel 120 im zweiten Abschnitt in dieser Weise ersetzt werden. Vorzugsweise ist die Mikrotrennsäule der vorliegenden Erfindung dafür ausgelegt, mit Schwerkraftspeisung betrieben zu werden, alternativ dazu kann sie aber auch dafür ausgelegt sein, mit Druckspeisung betrieben zu werden. Um Letzteres zu ermöglichen, passt ein Druckkolben 160 in den Vorratsbehälter 112 und kann dazu verwendet werden, das gebundene Material auszuspülen. Darüber hinaus kann gebundenes Material (z.B. Zellen) mittels Zentrifugation in einem kleinstmöglichen Volumen eluiert werden.

Eine poröse Fritte oder ein poröses Gitter 140 kann neben dem oberen Ende der Matrix 110 angeordnet sein, insbesondere bei Ausführungsformen mit Partikeln oder Kugeln, die frei beweglich sind, d.h. die nicht durch einen Lack oder ein anderes Bindemittel festgehalten werden. Die/das poröse Fritte/Gitter besteht vorzugsweise aus Glas oder Kunststoff oder Metallgeflecht und weist eine Porengröße auf, die mindestens ebenso groß oder größer als die Porengröße der Matrix und kleiner als die Größe der Partikel/Kugeln der Matrix ist.

Anstelle einer kugelförmiger Halterung 130, kann eine poröse Fritte oder ein poröses Gitter 150 neben dem unteren Ende der Matrix 110 angeordnet sein, insbesondere bei Ausführungsformen mit Partikeln oder Kugeln, die frei beweglich sind und auch bei solchen, bei denen Lack oder ein anderes Bindemittel eine Festigungswirkung ausübt, siehe 6. Die/das poröse Fritte/Gitter besteht vorzugsweise aus Glas oder Kunststoff oder Metallgeflecht und weist eine Porengröße auf, die mindestens ebenso groß oder größer als die Porengröße der Matrix und kleiner als die Größe der Partikel/Kugeln der Matrix ist.

Wenn Kugeln 120 eingesetzt werden, um die Matrix 110 zu bilden, so sind diese Kugeln größer als 100 &mgr;m, vorzugsweise größer als ungefähr 200 &mgr;m und kleiner als ungefähr 2.000 &mgr;m, mit besonderem Vorzug größer als ungefähr 200 &mgr;m und kleiner als ungefähr 1.000 &mgr;m, und mit dem größten Vorzug beträgt ihre Größe 280 &mgr;m. Selbstverständlich kann die Größe der Kugeln verändert werden, um eine angestrebte Flussrate durch die Matrix zu kalibrieren oder zu variieren. Eine zu starke Verringerung der Kugelgröße kann indes aufgrund der Verringerung der Porengröße zwischen den Kugeln, die damit einhergeht, zum Verstopfen führen. Andererseits kann eine zu starke Erhöhung der Größe der Kugeln zu einer Flussrate führen, die ungebührlich hohen Geschwindigkeiten entspricht, was negative Auswirkungen auf die prozentuale Rückhalterate der magnetischen Partikel hätte.

Es ist eine Mindesthöhe an Fluidsäule (d.h. der Höhe der Fluids oberhalb des spitz zulaufenden Endes der Säule) erforderlich, um einen Druck zu erzeugen, der ausreichend groß ist, um die Oberflächenspannung dort, wo die Tropfen gebildet werden, zu überwinden, wodurch ein problemloser Fluss gewährleistet wird. Der zweite Abschnitt 110b erhöht in wirkungsvoller Weise den Widerstand und ermöglicht den Einsatz einer Matrix 110 mit einer geringeren Gesamthöhe, wodurch auch das tatsächliche Volumen der Matrix 110 verringert wird. Die Gesamthöhe der Matrix 110 beträgt weniger als ungefähr 20 mm, vorzugsweise weniger als ungefähr 15 mm und mit dem größten Vorzug weniger als ungefähr 12 mm. Wenn kleine Elutionsvolumina von Bedeutung sind, beträgt das Totvolumen der Säule, d.h. der Zwischenraum innerhalb der Matrix, der nicht von Kugeln/Partikeln eingenommen wird, sowie das Volumen der Säule, das sich jenseits der Matrix befindet, im Allgemeinen weniger als ungefähr 85 &mgr;l, vorzugsweise weniger als ungefähr 70 &mgr;l, mit besonderem Vorzug weniger als ungefähr 50 &mgr;l und mit dem größten Vorzug ungefähr 30 &mgr;l.

Ein weiterer Faktor, der beim Entwurf der Säule berücksichtigt werden muss, ist die Oberflächenspannung, die am Ende der Säule, wo sich beim Austritt der Flüssigkeit aus der Säule Tropfen bilden, erzeugt wird. Je länger und je höher die Säule ist, umso stärker ist das Druckgefälle, das sich entwickelt, um die Oberflächenspannung zu überwinden. Wenn die Oberflächenspannung im Verhältnis zum Druckgefälle zu groß ist, wird die Tropfenbildung am Ende der Säule behindert und möglicherweise sogar verhindert, wodurch der Fluss durch die Säule zum Erliegen kommt. Somit ist es erforderlich, einen dritten Säulenabschnitt 122 auszubilden, um das Endstück 126 zu verlängern. Der dritte Abschnitt 122 hat eine geringere innere Querschnittsfläche als der zweite Abschnitt 118 sowie ein geringeres Außenmaß (z.B. Durchmessung im Fall eines zylindrischen Abschnitts). Die Länge des dritten Abschnitts kann gemäß den jeweiligen Querschnittsflächen und der angestrebten Flussrate variieren.

Die Tabelle 1 zeigt die Auswirkung der Querschnittsflächen des ersten, zweiten und dritten Abschnitts und der Höhenwerte auf die Flussrate sowie den Zusammenhang zwischen der Flussrate und der prozentualen Wiederfindungsrate der MicroBeads.

Tabelle 1. Wiederfindungsrate im Zusammenhang mit der Flussrate

Wenn eine kugelförmige Halterung 130 eingesetzt wird, erstreckt sich mindestens eine Befestigung 128 vom oberen Ende des dritten Abschnitts 122 bis in den zweiten Abschnitt hinein. Die jeweiligen Befestigungen 128 sind vorzugsweise zapfenförmig (siehe auch 3). Vorzugsweise erstreckt sich ein Satz von drei Befestigungselementen 128 (siehe 4) vom dritten Abschnitt in den zweiten Abschnitt und dient dazu, die kugelförmige Halterung 130 zu stützen. Bei der Halterung 130 handelt es sich vorzugsweise um eine Kugel, die erheblich größer als die Kugeln 120 ist und deren Größe derart ausgelegt ist, dass sie verhindert, dass die Kugeln 120 beim Befüllen der Säule 100 mit der Matrix 110 in den dritten Abschnitt gelangen, wobei diese Funktion ständig ausgeübt wird, wenn die Kugeln nicht durch einen Lack festgehalten werden. Die Halterungskugel 130 lässt indes Durchgangstellen frei, die mindestens so breit sind wie die Räume zwischen den Kugeln 120 in der Matrix 110, sodass der Fluss des Fluids durch den zweiten Abschnitt 118 und in den dritten Abschnitt 122 nicht gestört wird.

Das distale Ende des dritten Abschnitts 122 verjüngt sich zu einer Spitze 126. Das Außenmaß (z.B. der Außendurchmesser, wenn es sich bei der Spitze um die Spitze eines zylindrischen Rohres handelt) der Spitze 126 ist kleiner als dasjenige des dritten Abschnitts und legt die bevorzugte Tropfengröße des Fluid, das die Säule verlässt, fest. Eine bevorzugte Ausführungsform weist einen Außendurchmesser von ungefähr 1,5 mm auf, wobei diesen Maß selbstverständlich variiert werden kann, indem das Ende oder der "Ablauf' der Säule gemäß der angestrebten Tropfengröße geformt wird.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Trennungs- und Freisetzungsverfahren zum Reinigen von biologischem Material auf der Säule 100. Nach dem Zurückhalten des betreffenden biologischen Materials, welches an magnetische Partikel in der Matrix 110 gekoppelt ist, kann das gebundene Material wahlweise von den magnetischen Partikeln getrennt und aus der Säule 100 eluiert werden, während die magnetischen Partikel weiterhin von der Matrix 110 magnetisch zurückgehalten werden. Die Trennung kann durch eine geeignete Änderung von Puffern oder der Temperatur sowie durch chemische oder enzymatische Reaktionen erfolgen, welche die Bindung zwischen den magnetischen Partikeln und dem betreffenden biologischen Material lösen. Zum Beispiel kann mRNA von Poly-T-konjugierten Perlen gelöst werden, indem die Pufferzusammensetzung geändert wird, wobei die Temperatur vorzugsweise mehr als 30 °C beträgt. Materialien, die an Antikörper gebunden sind, sowie an Protein A oder G, können in der Säule freigesetzt werden, indem der pH-Wert, die Salzbedingungen oder die Chemikalien (DTT- statt SPDP-Bindungen) geändert werden oder aber durch Einleiten von Detergentien, z.B. von SDS oder chaotropen Mitteln.

Die Mikrosäule 100 ist dafür ausgelegt, in einem Mikrosäulen-HGMS-System gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt zu werden. Das System 300 umfasst eine Trenneinheit 200, in welcher sich eine oder mehrere Mikrosäulen 100 (in der bevorzugten Ausführungsform sind es vier) befinden, wie in 7 dargestellt ist. Die Mikrotrenneinrichtung umfasst ein Joch 210, welches die Rahmenstruktur der Einrichtung bildet und welches die Magnetfelder konzentriert. Das Joch ist derart ausgebildet, dass es in jedem der Bereiche, in welchen die Verarbeitung mit einer Mikrosäule ablaufen soll, eine Kerbe 212 umfasst.

Ein Magnetpaar 214 ist in jeder der Kerben 212 derart angeordnet, dass genau dort ein engerer Spalt 216 gebildet wird, wo das magnetische Feld der Magnete gebündelt wird und wo eine Mikrosäule zur Durchführung einer HGMS-Trennung eingeführt werden soll. Wie bereits erwähnt wurde, verbindet das Joch 210 in der bevorzugten Ausführungsform, die in den Figuren dargestellt ist, vier Paare starker Permanentmagneten (8C), die gemeinsam das Magnetfeld erzeugen, das dafür erforderlich ist, vier Trennvorgänge parallel in vier Säulen durchzuführen. Es sei erneut darauf hingewiesen, dass die vorliegende Erfindung selbstverständlich keineswegs auf die Konfiguration mit vier Mikrosäulenständen beschränkt ist und dass eine andere Anzahl genauso problemlos vorgesehen werden kann.

Zwei Magnete 218 sind vorzugsweise mit der Rückseite des Jochs 210 verbunden, um die Befestigung oder Montage der Einheit an einer ferromagnetischen Vorrichtung wie etwa einem Eisengestell zu erleichtern. Wiederum kann eine unterschiedliche Anzahl an Magneten 218 für die Montage benutzt werden. Darüber hinaus können weitere Befestigungsmittel wie etwa Klemmen, Schrauben, Bolzen usw. alternativ und zusätzlich dazu eingesetzt werden.

Die bislang beschriebene Einheit wird vollständig von einer unzerbrechlichen Abdeckung 220 umschlossen. Die unzerbrechliche Abdeckung schützt die innenliegenden Komponenten der Einheit und macht die Einheit weiterhin "anwenderfreundlicher" in dem Sinne, dass diese angenehmer zu berühren ist (wärmer, geschmeidiger) und wesentlich einfacher gereinigt/sterilisiert werden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei der Abdeckung 220 um eine Schaumstoffschicht z.B. aus Polyurethangummi, welche die Einheit 200 gegen Korrosion und chemische oder mechanische Beschädigungen schützt. Alternativ dazu können andere Abdeckungsmaterialien, die den gleichen Zweck erfüllen, eingesetzt werden.

Jeder der Spalte 216 der Trenneinheit 200 weist ein Magnetfeld auf, das stärker als ungefähr 0,2 Tesla, vorzugsweise stärker als ungefähr 0,4 Tesla, mit besonderem Vorzug stärker als ungefähr 0,5 Tesla und mit dem größten Vorzug stärker als ungefähr 0,6 Tesla ist. Eine bevorzugte Ausführungsform erzeugt Magnetfelder in der Größenordnung von 0,6 bis 0,7 T. Tabelle 2 zeigt die Beziehung zwischen der Stärke des angewendeten Magnetfeldes und der Menge an MicroBeads, die infolgedessen wiedergewonnen werden. Unabhängig von der Art der verwendeten Säule zeigt sich der gleiche Trend.

Tabelle 2. Wiederfindungsrate der MicroBeads im Zusammenhang mit der Stärke des Magnetfeldes

Wie in den 8A und 8B dargestellt ist, bildet die Abdeckung 220 oben und unten an den Spalten 216 Abschrägungen 222. Diese Abschrägungen sind dafür ausgelegt, die trichterförmigen Abschnitte 114 der Mikrosäule bündig aufzunehmen, wodurch die Mikrosäule noch besser in einer vertikalen Position innerhalb des Spalts 216 stabilisiert wird. Die Abschrägungen 222 sind am oberen und unteren Ende jedes Spalts 216 derart ausgebildet, dass die Einheit 200 entlang ihrer horizontalen Achse symmetrisch ist. Somit sind die oberen und unteren Enden der Einheit identisch, und der Anwender läuft nicht Gefahr, die Einheit "verkehrt herum" zu benutzen. Wie in 8B dargestellt ist, beträgt der Winkel der Abschrägung 222 vorzugsweise ungefähr 90°, aber dieser Winkel kann selbstverständlich entsprechend der Steilheit der Trichterform einer Mikrosäule, die in dem Spalt mit der Abschrägung gehalten werden soll, variieren.

BEISPIELE Beispiel 1

Um ein kleines Elutionsvolumen (< 50 &mgr;l) zu erzielen, betrug das Gesamtvolumen desjenigen Teils der Mikrosäule, der mit Matrix gefüllt war, 52 mm3, was einen Freiraum für 22 &mgr;l eines Fluids ließ (Matrixvolumen), wenn ferromagnetisches Standardmaterial eingesetzt wurde (Eisenkugeln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 280 &mgr;m). Unter Berücksichtigung des Volumens im Abschnitt 122 der Säule betrug das Totvolumen der Säule, das für die Elution von Bedeutung war, insgesamt 29 &mgr;l.

Um zu gewährleisten, dass bei einer Matrixhöhe von 11 mm mehr als 90 % der MicroBeads, die (in einem Puffer, der ein Detergens enthielt) auf die Säule gegeben wurden, (in einem Magnetfeld von 0,6 bis 0,7 T) zurückgehalten wurden, musste die Flussrate der MicroBead-Suspension eingestellt werden. Aus diesem Grunde kam eine zweiteilige Matrix zum Einsatz. Der untere Teil der Matrix, der 6 mm ausmachte (d.h. 110b), hatte einen Innendurchmesser von lediglich 1,9 mm, was einen starken Einfluss auf die Flussrate hatte, während die oberen 5 mm der Matrix (d.h. 110a) einen größeren Durchmesser von 3 mm hatte, um die Wahrscheinlichkeit der Verstopfens der Säule zu verringern.

Die Matrix wurde am unteren Ende durch eine Stahlkugel (d.h. 130) von 1,6 mm Durchmesser begrenzt. Weiter unterhalb verjüngte sich die innere Querschnittsfläche der Röhre (d.h. 122) auf 0,8 mm. Die Stahlkugel ruhte auf drei Brücken (d.h., Befestigungen 128), welche sie daran hinderten die Röhre zu verschließen. Die Stahlkugel sorgte dafür, dass das ferromagnetische Material während des Füllvorganges nicht durchrutschte.

Um sicherzustellen, dass die Säule bei Aufgabe des Puffers auf die Matrix für eine Tropfenbildung durch Schwerkraft ausgelegt war, wurde empirisch eine Gesamtsäulenhöhe von 24 mm bestimmt, bis zu welcher der Puffer eingefüllt werden muss. Aus diesem Grunde wurde die Säule über den Matrixbereich hinaus mittels einer Röhre 122 mit einer Länge von 12 mm und einem Durchmesser von 0,8 mm verlängert.

Die Matrix und die untere Verlängerung wiesen gemeinsam ein berechnetes Totvolumen von 29 &mgr;l auf. Um das Elutionsvolumen so gering wie möglich zu halten, kann die erste Fraktion des Puffers, die bei einer solchen Elution aus der Säule fließt (eine Puffermenge, die dem Totvolumen nahekommt) verworfen werden, da sie kein eluiertes Material enthält. Die Puffertropfengröße ist derart ausgelegt, dass sie kleiner als ungefähr 80 % des Totvolumens der Säule ist, sodass der erste Tropfen verworfen werden kann. Aus diesem Grunde wurde die Tropfengröße des (detergentienfreien) Puffers derart festgelegt, dass sie näherungsweise 24 &mgr;l betrug. Dies wurde erzielt, indem der Durchmesser der unteren Spitze der Säule auf 1,5 mm eingestellt wurde.

Darüber hinaus diente die kontrollierte Tropfengröße der Festlegung des Elutionsvolumens. Die Tropfen 2 und 3 enthielten > 80 % des eluierten Materials (siehe 9), und die Tropfen 2 bis 4 enthielten > 90 % des eluierten Material.

Die Mikrosäulen 100, die sich in der oben beschriebenen Trenneinheit 200 befanden, können mindestens 2 mg MicroBeads binden, wie über die optische Dichte der MicroBeads bei einer Wellenlänge von 450 nm (Tabelle 1) bestimmt wurde. Ungefähr 90 bis 98 % einer Menge von 0,1 bis 2 mg einfacher MicroBeads ("Basic MicroBeads", Miltenyi Biotec GmbH) werden bei Aufgabe auf eine Säule in einem Magnetfeld zurückgehalten, wie über die optische Dichte der MicroBeads bei einer Wellenlänge von 450 nm (Tabelle 1) bestimmt wurde.

Da die Flussrate in erster Linie durch die Teil der Matrix mit einem Durchmesser von 1,9 mm aufrechterhalten wird, ist es einfach, die Flussrate durch Änderung des Durchmessers der Kugeln zu verringern oder zu steigern. Die Flussrate des Puffers (der ein Detergens enthält, 1 % SDS) beträgt in einer Säule mit Standardmatrix (280-&mgr;m-Kugeln) 300 &mgr;l/min. In einer Säule mit Kugeln, deren durchschnittlicher Durchmesser 230 &mgr;m beträgt, liegt die Flussrate bei 200 &mgr;l/min. Bei automatisch hergestellten Säulen mit einer Matrix aus 280-&mgr;m-Kugeln beträgt die durchschnittliche Flussrate 320 +/- 100 &mgr;l. Die durchschnittliche Tropfengröße beträgt bei Wasser 23,9 &mgr;l.

Für viele Anwendungen ist es vorteilhaft, das gebundene Material von den MicroBeads zu eluieren, solange die MicroBeads noch an die Matrix im Magnetfeld gebunden sind. In diesem Fall wird das Material eluiert, indem ein anderer Puffer zugesetzt wird, der die chemischen Wechselwirkungen zwischen dem zurückgehaltenen Molekül und dem Andockmittel aufbricht. Ein Beispiel für die Auftrennung von Makromolekülen ist die Isolierung von mRNA aus rohem Zellextrakt über die spezifische Wechselwirkung zwischen Oligo(dT), welches an MicroBeads gekuppelt ist, und dem Poly-A-Schwanz der mRNA. (Die mRNA macht näherungsweise 0,01 % der gesamten Zellmasse aus).

1 × 107 angezüchtete Hybridomzellen wurde in PBS gewaschen, das Pellet wurde wieder in Suspension gebracht und einer Lyse mit 1 ml eines Lyse/Bindungspuffers (0,1 M Tris/HCL pH 8,1, 1 % SDS, 0,2 M LiCl, 10 mM EDTA, 5 mM DDT) unterzogen. Das SDS bewirkt die vollständige Inaktivierung des zellulären RNAasen, welche bei der Lyse freigesetzt werden.

Es wird durch eine poröse Matrix zentrifugiert (2 min. bei 13.000 × g durch drei Schichten Blottingpapier, welches sich auf einem porösen Polypropylenfilter befindet), um die hohe Viskosität des Lysats, die durch genomische DNA hervorgerufen wird, erheblich zu verringern. Dieser Vorgang kann keinen Einfluss auf die Integrität der mRNA.

50 &mgr;l an Oligo(dT)-MicroBeads wurden dem Lysat zugesetzt, und das Lysat wurde durchmischt. (Zur Hybridisierung der mRNA an die Oligo(dT)-MicroBeads ist keine zusätzlich Inkubation erforderlich).

Eine Säule, die sich in dem Magneten befand, wurde durch Aufgabe von 100 &mgr;l Lyse/Bindungspuffer konditioniert. Das Lysat wurde hinzugefügt. Nachdem es durch die Matrix geflossen war, wurden zwei Aliquote von 250 &mgr;l des Lyse/Bindungspuffers hinzugefügt, um das gesamte ungebundene Material (Proteine, DNA) auszuwaschen, sowie vier Aliquote von 250 &mgr;l an Waschpuffer (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA), um das gesamte unspezifisch gebundene Material (rRNA, DNA) auszuwaschen.

Um die mRNA von den MicroBeads zu eluieren, wurden 200 &mgr;l an Elutionspuffer (1 mM EDTA), der 65 °C warm war, hinzugefügt. Die Tropfen 1 bis 5 wurden getrennt voneinander in Röhrchen aufgefangen und auf 0,8 %igem Agarosegel mit Ethidiumbromidfärbung analysiert (siehe 9).

Tabelle 3. Prozentuale Wiederfindungsrate von näherungsweise 100 &mgr;g MicroBeads aus verschiedenen Chargen bei Anwendung verschiedener Säulen a) Durchmesser der Matrixkugeln: 230 &mgr;m
b) Durchmesser der Matrixkugeln: 280 &mgr;m
  • Prozentuale Wiederfindung von näherungsweise 2 mg MicroBeads des Charge B bei Anwendung der Säule 1
  • Charge B
  • Säule 1 97,8

Beispiel 2 – Immunomagnetische Isolierung von Protein mit Protein-G-MicroBeads

Ein weiteres Beispiel für die Auftrennung von Makromolekülen ist die Isolierung von Protein aus rohem Zellextrakt über Antikörper, die an das Protein binden und anschließend an Protein G andocken, wobei letzteres an magnetische MicroBeads gekoppelt ist.

1 × 107 Leberzellen der Maus werden einer Lyse in 1 ml Lyse-Puffer unterzogen, wobei die Zellkerne intakt bleiben (150 mM NaCl, 1 % Triton × 100, 50 mM Tris, pH 8,1). Die Zellkerne wurden durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde mit 100 ng Phycoerythrin als Standard versetzt. Anschließend wurde er mit 1 &mgr;g eines monoklonalen anti-Phycoerythrin-Antikörpers gemischt und 5 bis 30 min. lang bei 6 °C inkubiert. 10 &mgr;l an Protein-G-MicroBeads (welche mit 0,5 &mgr;g rekombinantem Protein G beladen waren) wurden hinzugefügt, woraufhin die Reaktionsmischung kurz durchmischt und dann für weitere 5 bis 30 min. bei 6 °C inkubiert wurde.

Ein Mikrosäule wurde in der beschriebenen magnetischen Trennvorrichtung angebracht und durch Waschen mit 100 &mgr;l Lyse-Puffer konditioniert. Die Reaktionsmischung wurde auf die Säule gegeben. Nachdem die Reaktionsmischung vollständig durch die Säule geflossen war, wurde die Säule durch Zugabe von 3 × 125 &mgr;l Lyse-Puffer sowie 4 × 125 &mgr;l PBS gewaschen.

Für die Elution verblieb die Säule in der magnetischen Trennvorrichtung, und der Puffer wurde durch Zugabe von 50 &mgr;l eines SDS-Gel-Probenpuffers (welcher 1 SDS enthielt) ersetzt. Der Puffer wurde in der Säule 3 min. inkubiert, um die immunomagnetischen Komplexe zu lösen. Anschließend wurde die Elution durch Zugabe von 75 &mgr;l an Probenpuffer fortgeführt, wobei diejenigen Tropfen (2 bis 4) aufgefangen wurden, welche das Antigen und den Antikörper, die von der Säule eluiert wurden, enthielten. Aufgrund des Tensids (SDS) hatten die Tropfen ein durchschnittliches Volumen von 15 &mgr;l, sodass das gesamte Elutionsvolumen 45 &mgr;l betrug.

Die Auftrennung wurde auf einem SDS-Polyacrylamidgel analysiert, wobei die Ergebnisse in 10 dargestellt sind. Die Proteine wurden durch Silberfärbung sichtbar gemacht. In 10 stehen "A" und "B" für die Eluenten von zwei unabhängigen Isoliervorgängen. "C" steht für den Größenmarker. "D" steht für den anti-Phycoerythrin-Antikörper und "E" steht für das Phycoerythrin. "F" steht für die Flussrate eines der Trennvorgänge.

Dieses Verfahren der Immunoaffinitätsaufreinigung kann in weniger als einer Stunde durchgeführt werden. Es kommt ohne Zentrifugationsschritte und lange Inkubationszeiten aus, welche für Standard-Immunopräzipitationsvorgänge typisch sind. Darüber hinaus werden sehr hohe Reinheitsgrade erzielt. Mit dem hochempfindlichen Silberfärbungsverfahren konnte nahezu ausschließlich der Antikörper und das Antigen auf der dargestellten SDS-PAGE nachgewiesen werden.


Anspruch[de]
HGMS-Mikrotrennsäule (100), welche umfasst:

erste und zweite rohrförmige Abschnitte (116, 118), wobei der erste Abschnitt (116) integral mit dem zweiten Abschnitt (118) ist und über dem zweiten Abschnitt angeordnet ist, wobei der erste Abschnitt eine erste Querschnittfläche und der zweite Abschnitt eine zweite Querschnittfläche aufweist, wobei die erste Querschnittfläche größer als die zweite Querschnittfläche ist; und

eine Matrix (110), die dafür ausgelegt ist, wahlweise mindestens eine Komponente eines Gemisches zu entfernen, wenn das Gemisch durch die rohrförmigen Abschnitte strömt, wobei die Matrix in mindestens einem Teil des ersten Abschnitts und in mindestens einem Teil des zweiten Abschnitts enthalten ist und wobei die Matrix ferromagnetisches Material (120) umfasst.
Mikrotrennsäule nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das ferromagnetische Material (120) Partikel umfasst. Mikrotrennsäule nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (120) mit einer Schicht überzogen sind, wobei die Schicht eine relative Positionierung der Partikel zueinander wahrt. Mikrotrennsäule nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Schicht Lack umfasst. Mikrotrennsäule nach den Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (120) ferromagnetische Kugeln (120) umfassen. Mikrotrennsäule nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (120) einen Durchmesser von mindestens etwa 200 &mgr;m aufweisen. Mikrotrennsäule nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel (120) mindestens 50 Prozent eines Innenvolumens des ersten und des zweiten Abschnitts (116, 118) einnehmen. Mikrotrennsäule nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Säule weiterhin einen dritten Abschnitt (122) umfasst, wobei der dritte Abschnitt integral mit dem zweiten Abschnitt (118) ist; wobei der dritte Abschnitt eine dritte Querschnittfläche aufweist; wobei die dritte Querschnittfläche kleiner als die zweite Querschnittfläche ist. Mikrotrennsäule nach Anspruch 8, wobei die Säule weiterhin einen vierten Abschnitt umfasst, wobei der vierte Abschnitt integral mit dem dritten Abschnitt ist; wobei der vierte Abschnitt ein Außenmaß aufweist, das kleiner als ein jeweiliges Außenmaß des dritten Abschnitts ist. Mikrotrennsäule nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Säule weiterhin einen oberen Abschnitt umfasst, wobei der obere Abschnitt integral mit dem ersten Abschnitt (116) ist; wobei der obere Abschnitt eine obere Querschnittfläche aufweist; wobei die obere Querschnittfläche größer als die erste Querschnittfläche ist. Mikrotrennsäule nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche weiterhin umfasst:

eine Halterung (130), die in dem zweiten Abschnitt (118) neben der Matrix (110) angeordnet ist.
Mikrotrennsäule nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Halterung (130) im Wesentlichen kugelförmig ist. Mikrotrennsäule nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Halterung ein poröses Netz, eine poröse Fritte oder ein poröses Gitter umfasst. Mikrotrennsäule nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Säule aus einem Material gewählt aus der Gruppe bestehend aus PCTG, Polyethylene, Polyamide, Polypropylene und PET gebildet ist. Mikrotrennsäule nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Säule aus PCTG gebildet ist. Mikrotrennsäule nach Anspruch 12, welche weiterhin mindestens eine Befestigung (128) umfasst, die sich in den zweiten Abschnitt (118) erstreckt, wobei die Halterung (130) auf der mindestens einen Befestigung ruht. Mikrotrennsäule nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Befestigung (128) drei sich in den zweiten Abschnitt (118) erstreckende Befestigungen umfasst. Mikrotrennsäule nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche weiterhin eine obere Matrixhalterung (140) umfasst, die in dem ersten Abschnitt (116) neben der Matrix (110) angeordnet ist. Mikrotrennsäule nach Anspruche 18, dadurch gekennzeichnet, dass die obere Matrixhalterung (140) ein Gitter, ein Netz oder eine Fritte umfasst. Mikrotrennsäule nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix (110) weiterhin eine nichtmagnetische Komponente umfasst. Mikrotrennsäule nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die nichtmagnetische Komponente Glas, zum Beispiel Glaskugeln oder Glaspartikel, umfasst. Mikrotrennsäule nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die nichtmagnetische Komponente Kunststoff, zum Beispiel Kunststoffkugeln oder Kunststoffpartikel, umfasst. Mikrotrennsäule nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Säule schwerkraftgespeist ist. Mikrotrennsäule nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Säule druckgespeist ist. Mikrotrennsäule nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix (110) eine zweiteilige Matrix ist und eine Höhe von weniger als etwa 20 mm aufweist. Mikrotrennsäule nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix (110) eine Höhe von weniger als etwa 15 mm aufweist. Mikrotrennsäule nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix (110) eine Höhe von weniger als etwa 12 mm aufweist. Mikrotrennsäule nach Anspruch 1, welche ein Hohlraumvolumen von weniger als etwa 85 &mgr;l umfasst, das in der Säule in und unter der Matrix (110) ausgebildet ist. Mikrotrennsäule nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Hohlraumvolumen bei unter etwa 50 &mgr;l liegt. Mikrotrennsäule nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Hohlraumvolumen etwa 30 &mgr;l beträgt. Mikrotrennsäule nach einem der Ansprüche 28 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix (110) eine zweiteilige Matrix umfasst. Mikrosäulensystem (300) für Hochgradienten-Magnetseparation, wobei das System umfasst;

eine Mikrotrenneinrichtung (200); und

mindestens eine Mikrotrennsäule (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Mikrosäulensystem nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrotrenneinrichtung (200) umfasst:

ein magnetisches Joch (210) mit mindestens einer entlang einer Länge desselben ausgebildeten Kerbe (212); und

ein Paar Magnete (214), die in der oder jeder Kerbe so angeordnet sind, dass sie einen Spalt dazwischen bilden, wobei der oder jeder Spalt zur Aufnahme einer besagten Mikrotrennsäule (100) darin zur Ausführung von Mikroseparation ausgelegt ist.
Mikrosäulensystem nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische Joch (210) aus Stahl besteht. Mikrosäulensystem nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Kerbe (212) mindestens zwei Kerben umfasst. Mikrosäulensystem nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Kerben (212) vier Kerben umfassen. Mikrosäulensystem nach einem der Ansprüche 33 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass jeder des Paars Magneten (214) ein Magnetfeld in jedem jeweiligen Spalt von mehr als etwa 0,2 Tesla, bevorzugter mehr als etwa 0,4 Tesla, noch bevorzugter von mehr als etwa 0,5 Tesla und sogar noch bevorzugter von mehr als etwa 0,6 Tesla bildet. Mikrosäulensystem nach einem der Ansprüche 33 bis 37, welches weiterhin eine nicht zerbrechliche Abdeckung (220) umfasst, die das Joch (210) und das mindestens eine Paar Magneten (214) umschließt. Mikrosäulensystem nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht zerbrechliche Abdeckung (220) Polyurethangummi umfasst. Mikrosäulensystem nach Anspruch 38 oder 39, welches weiterhin mindestens einen Haftmagnet (218) in der Abdeckung (220) zum magnetischen Befestigen der Mikrotrenneinrichtung (200) umfasst. Mikrosäulensystem (300) für die Hochgradienten-Magnetseparation, wobei das System umfasst:

eine Mikrotrenneinrichtung (200) mit einem magnetischen Joch (210) mit mindestens einer entlang einer Länge desselben ausgebildeten Kerbe (212) und einem Paar Magneten (214), die in jeder mindestens einen Kerbe so angeordnet sind, dass sie einen Spalt dazwischen bilden; und

mindestens eine Mikrotrennsäule (100) nach einem der Ansprüche 1 bis 31;

wobei eine in dem ersten Abschnitt (116) der mindestens einen Säule enthaltene Menge der Matrix (110) eine größere Entfernungsfunktion erreicht als eine in dem zweiten Abschnitt (118) der mindestens einen Säule enthaltene Menge der Matrix; und

wobei eine Anzahl der Mikrotrennsäulen (100) gleich einer Anzahl der Spalte ist.
Prozess zum Reinigen von biologischem Material an einer Säule nach einem der Ansprüche 1 bis 31, wobei der Prozess umfasst:

Halten von an dem biologischen Material gebundenen magnetischen Trägern mit ferromagnetischen Partikeln in einem Magnetfeld; und

Herauslösen des biologischen Materials durch Trennen des biologischen Materials von den magnetischen Trägern, während es sich noch in dem Magnetfeld befindet.
Prozess nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass das Herauslösen einen Wechsel von Puffern umfasst. Prozess nach Anspruch 42 oder 43, dadurch gekennzeichnet, dass das Herauslösen eine Temperaturänderung umfasst. Prozess nach einem der Ansprüche 42 bis 44, dadurch gekennzeichnet, dass das Herauslösen eine Änderung einer chemischen oder enzymatischen Reaktion umfasst.






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