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Dokumentenidentifikation DE60032594T2 11.10.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001173255
Titel VERWENDUNG VON PIRENOXIN ZUM SCHUTZ DES KORNEALGEWEBES WÄHREND PHOTOKERATEKTOMIE
Anmelder Farmigea S.p.A., Pisa, IT
Erfinder Boldrini, Enrico, 56127 Pisa, IT;
Ciuffi, Mario, Viale Pieraccini 6, 50134 Firenze, IT
Vertreter v. Bezold & Partner, 80799 München
DE-Aktenzeichen 60032594
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 13.03.2000
EP-Aktenzeichen 009112590
WO-Anmeldetag 13.03.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/IT00/00081
WO-Veröffentlichungsnummer 2000054757
WO-Veröffentlichungsdatum 21.09.2000
EP-Offenlegungsdatum 23.01.2002
EP date of grant 27.12.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 11.10.2007
IPC-Hauptklasse A61P 27/02(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 31/535(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Pirenoxin zum Schutz der Hornhautgewebe bei Photokeratektomie-Eingriffen. Spezieller betrifft die Erfindung die Verwendung von Pirenoxin und Salzen davon als Mittel, welche in der Lage sind, innerhalb der Hornhaut die Oxidationsphänomene zu inhibieren, welche durch reaktive Sauerstoffspezies (oder ROS, „reactive oxygen spezies"), die in den Geweben nach der Laserbestrahlung gebildet werden, bestimmt werden.

Wie bekannt, wird in der Augenchirurgie und insbesondere der refraktiven Augenchirurgie, welche die Modifizierung der Brechkraft des Auges zum Ziel hat, um nicht vernachlässigbare Sehdefekte zu korrigieren, von verschiedenen mehr oder weniger etablierten oder in Entwicklung begriffenen Techniken Gebrauch gemacht, von denen einige Beispiele radiale Keratektomie, Epikeratophakie und Keratomileusie sind. Neben diesen hat auf dem Gebiet der Ophthalmologie auch die Verwendung von Laser, insbesondere Festkörperlaser (wie der Neodym:Yttrium-Aluminium-Granat-Laser, bekannt als Nd:YAG) und vor allem Excimerlaser, stark zugenommen.

Ein Excimerlaser ist ein gepulster Laser, welcher aufgrund des Zerfalls angeregter Edelgasdimere (Excimere, erhalten aus Gasmischungen von Halogen und Edelgasen) in der Lage ist, große Mengen Energie in Form von Strahlung im Bereich des fernen Ultravioletts (UV-C) in Form von gepulsten Wellenzügen mit einer vorbestimmten Dauer, Frequenz und Fluenz abzugeben. Jedes Photon, welches während der Bestrahlung emittiert wird, hat ausreichend Energie, um die intramolekularen Bindungen des exponierten Materials aufzubrechen, auf solche Weise, dass die bestrahlten Moleküle in kleine flüchtige Fragmente „aufgebrochen" werden, welche bei Überschallgeschwindigkeit ausgetrieben werden, ein Prozess, der als „Photozersetzung" bekannt ist.

Bei den Anwendungen unter Einsatz des Excimerlasers bei Hornhautchirurgie-Eingriffen wird gewöhnlich ein Argon-Fluor-Laser eingesetzt, der Strahlung mit einer Wellenlänge von 193 nm emittiert, welcher geeignet ist, um hochpräzise Eingriffe mit optimaler Kontrolle bezüglich der Eindringtiefe und minimaler thermischer oder mechanischer Schädigungswirkung auf dem exponierten Gewebe benachbarte Gewebe durchzuführen. Im Gegensatz zu anderen auf dem klinischen Gebiet verwendeten Lasern emittiert der Excimerlaser nicht Energie, die in einem Brennpunkt konzentriert ist, sondern hat einen Radius mit einem großen Querschnitt, welcher mittels Durchgang durch geeignete Spalte gesteuert wird, um große Oberflächengebiete der Hornhaut mit einer genauen Kontrolle der Gestalt und Größen der exponierten Zonen zu treffen. Die emittierte Energie wird fast vollständig von einer Oberflächenschicht mit einer Dicke von einigen wenigen Mikron adsorbiert und führt bei jedem Puls mittels Verdampfung zur Ablation von Hornhautschichten, die nur geringfügig dicker als molekulare Schichten sind, mit einer Reproduzierbarkeit, die mit anderen Techniken nicht erreichbar ist.

Der Excimerlaser wird in großem Umfang für die refraktive Hornhautremodellierung in Techniken, die als photorefraktive Keratektomie oder PRK und LASIK (Laser-Intrastroma-Keratomileusis) bekannt sind, zur Korrektur verschiedener Ametropien, von denen die häufigste Myopie ist, verwendet. Wie bekannt, ist die letztere ein Defekt, der durch eine Hornhautkrümmung bestimmt wird, welche höher ist als durch die Länge des Augapfels erforderlich, so dass Lichtstrahlen von außen in solcher Weise gebrochen werden, dass sie in einem Brennpunkt zusammentreffen, bevor sie die Retina erreichen. In diesem Fall sorgt die Verwendung eines Excimerlasers dafür, dass Schichten von Hornhautgewebe, deren Dicke zur Mitte hin zunimmt, abgetragen werden, wodurch die Krümmung der Hornhaut verringert wird. Wenn die Technik zur Korrektur von Hypermetropie verwendet wird, wobei im Gegensatz dazu die zu erhaltende Modifizierung eine Erhöhung der Hornhautkrümmung ist, ist die Menge des abgetragenen Gewebes innerhalb der Peripherie der exponierten Zone erheblicher als in der Mitte. Schließlich kann zur Korrektur des Astigmatismus, der bekanntermaßen eine Ametropie ist, welche durch einen Krümmungsunterschied in verschiedenen Meridianen der Augenoberfläche verursacht wird, die Ablationstiefe asymmetrisch sein, abhängig von dem zu „verflachenden" Meridian.

In jüngerer Zeit wurde die Verwendung des Excimerlasers für die therapeutische Entfernung von Hornhaut-Oberflächengeweben zur Behandlung verschiedener Hornhautunregelmäßigkeiten und -trübungen, wie z.B. des dystrophischen, degenerativen, zikatriziellen oder infektiven Typs, vorgeschlagen. Ein solcher Eingriff, bezeichnet als phototherapeutische Keratektomie oder PTK, wurde beispielsweise zur Behandlung von wiederkehrenden Hornhauterosionen, postoperativer Keratitis, Hornhautdystrophien wie Reis-Buckler-Dystrophien, Hornhauttrübungen oder Narbengewebe verursacht durch Herpes simplex, Oberflächenunregelmäßigkeiten nach chirurgischen Eingriffen, wie zum Beispiel als Ergebnis einer Keratoplastik oder von refraktiven Hornhautinterventionen, vorgenommen. Im Gegensatz zur refraktiven Photokeratektomie hat PTK die Eliminierung von Unregelmäßigkeiten auf der Hornhautoberfläche zum Ziel, um deren Profil zu glätten, und beinhaltet somit die Ablation von Gewebeschichten mit unterschiedlicher Dicke in den verschiedenen Zonen behandelter Hornhautoberfläche.

Obwohl die oben beschriebenen Photokeratektomie-Eingriffe als eine weniger traumatische Alternative zu chirurgischen ophthalmischen Techniken erscheinen, ist der Wiederherstellungsprozess nach der Photoablation nicht ohne Nachteile, welche mehr oder weniger vorübergehend und für den Patienten langweilig sind oder ihn behindern, worunter zum Beispiel zikatrizielle Hornhautprobleme, die Bildung von Trübungen unter der Epithelschicht, bezeichnet als „Haze", welche eine Reduktion des Sehvermögens als Ergebnis von „Lichtstreuungs"-Phänomenen (Lichtdiffusion) bestimmen, und in einigen Fällen eine Verringerung der Brechungswerte als Ergebnis der Operation fallen. Es scheint von Fachleuten nicht bestreitbar zu sein, dass solche Effekte mindestens teilweise das Ergebnis der Bildung freier Radikale und allgemein reaktiver Sauerstoffspezies sind, welche als Nebenwirkung von UV-Bestrahlung und Temperaturerhöhung, die in den betroffenen Geweben auftritt, nachgewiesen wurde.

Wie bekannt, meint der Begriff „reaktive Sauerstoffspezies (oder Substanzen)" oder ROS gegenwärtig zusammen die freien Radikale und nicht-radikalischen chemischen Spezies, welche gegenwärtig an oxidativen biologischen Prozessen beteiligt sind und deren Überschuss bezüglich der natürlichen Gleichgewichtsbedingungen als Grundlage einer ständig zunehmenden Anzahl degenerativer und pathologischer Phänomene betrachtet wird. Speziell umfasst der Begriff ROS das anionische Superoxidradikal O2 ·, das Hydroxylradikal OH, Singulettsauerstoff 1O2 und Wasserstoffperoxid H2O2, sowie die Alkoxid- und Peroxid-Radikale RO· und ROO·, welche aus organischen Molekülen während der Oxidationsprozesse gebildet werden. Die Aktivität dieser Spezies innerhalb des Organismus betrifft verschiedene Zellkomponenten, unter denen sich eine große Anzahl von Strukturproteinen und Enzymen, DNA, RNA und vor allem die Membranlipide befinden.

In der Tat ist die Lipid-Peroxidation der am meisten bekannte Mechanismus, über den ROS ihre degenerative Aktivität auf die Zellstrukturen ausüben und mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA), die in den zytoplasmatischen Membranen enthalten sind, oft als Phospholipidester, schädigen. Im ersten Schritt dieses Prozesses zieht die Wirkung eines freien Radikals ein Wasserstoffatom H· von der Lipidkette ab und bildet ein freies Radikal R*, welches eine molekulare Umlagerung der Doppelbindungen erfährt, was zu einem konjugierten Dienradikal führt. Das Letztere reagiert schnell mit molekularem Sauerstoff und bildet somit ein Lipidperoxidradikal ROO·, welches, nachdem es ein ausreichend starkes Oxidationsmittel ist, um eine andere PUFA anzugreifen, den Verlängerungsschritt der Reaktion startet. Auf solche Weise werden ein Lipidhydroperoxidradikal ROOH und dementsprechend ein weiteres Lipidperoxidradikal ROO· gebildet. Deshalb läuft der oben beschriebene Hauptzweig der Reaktion mit Hilfe von Radikalkettenangriffen auf die Membranlipide ab, welche somit Schritt für Schritt zu den entsprechenden Hydroperoxiden überführt werden, bis zur Kettenbeendigung mit Hilfe eines freien Radikals.

Verschiedene Agenzien, die in natürlicher Weise in den Zellgeweben vorliegen, können die oben beschriebene Wirkung entfalten und dienen praktisch als Radikalfänger oder Antioxidantien. Von diesen sind die bekanntesten die Vitamine C (Ascorbinsäure) und E (Alpha-Tocopherol), antioxidative Enzyme wie Superoxiddismutase (SOD), Catalase, Glutathionperoxidase und verschiedene niedermolekulare Verbindungen, unter denen sich Glutathion (GSH), Tyrosin und Harnsäure befinden. Der natürliche Schutz vor oxidativem Stress, der von diesen Substanzen entfaltet wird, könnte jedoch nicht stark genug sein, um der Abbauwirkung von ROS entgegenzuwirken, in welchem Fall die Lipid-Peroxidation zu einer irreversiblen Schädigung der Zellmembranen führen kann.

Es wurde auch demonstriert, dass die oxidierten Formen von Übergangsmetallionen, wie zum Beispiel Fe3+ und Cu2+, in Gegenwart von H2O2 den Oxidationsmechanismus durch eine nicht-enzymatische Reaktion, die als Fenton-Reaktion bekannt ist, beschleunigen können. In Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie z.B. Ascorbat, wird ein Teil der oxidierten Ionen zu dem niedrigeren Oxidationszustand reduziert (beispielsweise Fe2+) und die Reaktion, deren Rate von dem Fe3+:Fe2+-Verhältnis abhängt, läuft ab und führt zur Umwandlung von Wasserstoffperoxid in das Hydroxylion OH plus ein Hydroxylradikal OH·. Das letztere repräsentiert die reaktivste ROS-Spezies.

Obwohl es schwierig ist, ROS aufgrund ihrer Reaktivität und deshalb kurzen Lebenszeiten nachzuweisen, wurde die Bildung freier Radikale in Geweben, die einer Photoablation unter Verwendung eines Excimerlasers unterworfen wurden, oft demonstriert. Beispielsweise wurde die Anwesenheit freier Radikale in Rinder-Hornhäuten, die einer Bestrahlung unter Einsatz eines ArF-Lasers ausgesetzt wurden, durch EPR-Spektroskopie (paramagnetische Elektronenresonanz) (R.J. Landry et al., Laser and Light in Ophthalmol., 6: 87–90, 1994) offenbart, während Messungen der Temperaturerhöhung auf der Ebene des Hornhautendothels und analytische Bestimmungen der Verringerung der SOD-Aktivität auf der Ebene des wässrigen Humors die Bildung von ROS in der Hornhaut von PRK-behandelten Kaninchen bestätigte (K. Bigihan et al., Jpn. J. Ophthalmol. 40, 154–157, 1996). Die Lipid-Peroxidation wurde wiederum in der Kaninchen-Hornhaut nach einer PTK-Behandlung unter Einsatz eines Excimerlasers durch sowohl einen histochemischen Test als auch den analytischen Nachweis der Anwesenheit von Abbauprodukten in Hornhaut-Lipidextrakten, insbesondere konjugierten Dienen und Ketodienen (S. Hayashi et al., British J. Ophthalmol. 81, 141–144, 1997), nachgewiesen.

Ferner wurde mittels EPR-Spektroskopie die Bildung von freien Radikalen auch festgestellt, wenn Hornhautgewebe unter Einsatz eines Festkörper-Nd:YAG-Lasers bei einer Wellenlänge von 213 nm statt 193 nm, welche Wellenlänge typisch für den Argon-Fluor-Excimerlaser ist, bestrahlt werden. Jedoch wurde in diesem Fall zusätzlich zu einer oxidativen Schädigung, welche mit der unter Verwendung des Excimerlasers erhaltenen vergleichbar ist, auch ein stärkerer zytotoxischer Effekt nachgewiesen, der in irgendeiner Weise von der höheren Wellenlänge der Strahlung abhängig ist (E. Ediger et al., Lasers Surg. Med., 21:88–93, 1997).

Neben der Wirkung der UV-Strahlung auf die primäre Bildung von ROS wurde auch beobachtet, dass die Chemotaxis-Aktivität der so gebildeten Lipid-Hydroperoxide in situ polymorphkernige Zellen und Makrophagen entzieht, welches wiederum durch Bildung weiterer ROS die schädigende Wirkung der Bestrahlung erhöht und eine Reihe zytotoxischer Effekte induziert (H. Goto et al., Curr. Eye Res., 10:1009–1014, 1991).

Obwohl die oben angegebene Literatur die Bildung freier Radikale und reaktiver Sauerstoffspezies bei der Photoablationsbehandlung demonstriert und dieses Phänomen mit anderen möglichen postoperativen Komplikationen in Beziehung setzt, wird der Schutz der Hornhautgewebe durch Verabreichung exogener Mittel mit ROS-antagonisierender Aktivität sowohl vor als auch nach der Operation nicht als besonders wichtig betrachtet. Praktisch besteht die derzeit angewandte pharmakologische Therapie für Photokeratektomie-Behandlungen aus einer topischen okularen Applikation von Antibiotika nach der Operation, mit der klaren Absicht, die Augenoberfläche während des Vernarbungsprozesses in sterilem Zustand zu halten, und von anti-inflammatorischen Arzneimitteln (steroidalen oder, entsprechend den jüngsten Trends, nicht-steroidalen), um postoperativen Entzündungsbedingungen entgegenzuwirken.

Dementsprechend ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Hornhautgewebe, die einer UV-Strahlung ausgesetzt sind, sowohl vor als auch bald nach der Behandlung mit einem Mittel zu versorgen, das geeignet ist, eine Schutzwirkung gegenüber der Zellschädigung zu entfalten, welche durch die reaktiven Sauerstoffspezies ausgelöst wird, und deren Aktion zu blockieren. Insbesondere muss das vorgeschlagene Mittel wirksam sein, um der Lipid-Peroxidation in den Hornhaut-Zellgeweben entgegenzuwirken.

Bei den Studien bezüglich der Wirkungen von ROS und der Inhibierung von Lipid-Peroxidation durch verschiedene exogene Moleküle mit Aktivität als Radikalfänger oder Antioxidationsmittel wurde festgestellt, dass Pirenoxin, ein Wirkstoff, der bereits auf einem anderen Gebiet des Auges, nämlich der Augenlinse, bekannt ist und therapeutisch verwendet wird, eine bemerkenswerte Aktivität hinsichtlich der Inhibierung von Lipid-Peroxidation in den Hornhautgeweben zeigt und deshalb in der Lage ist, eine Schutzwirkung gegen die zellulären Modifikationen als Folge von Laserbestrahlung zu entfalten.

Pirenoxin oder 1-Hydroxy-5-oxo-5H-pyrido-[3,2a]-phenoxazin-3-carbonsäure (auch bezeichnet als Pirfenosson) ist eine bekannte Verbindung mit der folgenden Formel:

welche in der Ophthalmologie, gewöhnlich in Form ihres Natriumsalzes, zur Behandlung des grauen Stars verwendet wird. Der Letztere ist ein anomaler progressiver Zustand der Augenlinse, welcher durch einen zunehmenden Transparenzverlust gekennzeichnet ist. Wie bekannt, ist der graue Star öfter das Ergebnis degenerativer Modifikationen, die oft in einem Alter von mehr als 50 Jahren auftreten, während sie selten das Ergebnis von Traumata oder Giftexposition sein können. Zunächst ist die Sicht trüb, dann funkeln diffus helle Lichter und es kann sich eine Sehstörung und Doppelsicht entwickeln. Letztlich tritt eine Anopie auf, wenn der graue Star nicht behandelt wird. Neben der chirurgischen Behandlung, welche für stärker fortgeschrittene Degenerationszustände erforderlich wird und die Ablation der Augenlinse beinhaltet (mit oder ohne chirurgische Implantation einer intraokularen Linse), kann der graue Star durch die ophthalmische topische Verabreichung von Pirenoxin in Form eines Augenwassers behandelt werden.

Es wurde postuliert, dass das Vermögen von Pirenoxin zur Inhibierung der Bildung von Linsentrübungen das Ergebnis mindestens drei verschiedener Wirkungsmechanismen ist: (a) Inhibierung der Oxidationsaktivität der Chinon-Moleküle auf die lentikulären Proteine durch Bindung ihrer -SH-Gruppen; (b) Aktivierung und Normalisierung der Kationenpumpenaktivität, welche durch die Kapsel der Augenlinse ausgeübt wird; (c) Inhibierung der Sorbitsynthese und Verringerung der osmotischen Schädigung, welche das Ergebnis der Speicherung dieser Substanz ist (S. Iwata, J. Pharmac. Soc. Jap., 1964; 844: 435–440; F. Ikemoto et al., in: Proc. 50th Congr. Pharmacol. Soc. Jap., Kanto Region, 1974: I. Korte et al.; Ophthalmic Res. 1979; 11: 123–125).

Bei den jüngsten Studien der biologischen Aktivität von Pirenoxin wurde auch herausgefunden, und dies ist der Gegenstand der europäischen Patentanmeldung Nr. EP 0885612 des vorliegenden Anmelders, dass dieses Molekül neben der Aktivität bei der Behandlung von grauem Star auch entzündungshemmende Eigenschaften aufweist. Diese Eigenschaften, welche bei Tiermodellen bestätigt wurden, entfalten sich über einen Wirkungsmechanismus, der in der genannten Patentanmeldung nicht aufgeklärt wurde, obwohl in der obengenannten Patentbeschreibung eine inhibierende Aktivität des oxidativen Katabolismus von Arachidonsäure postuliert wird, was zur Bildung von Prostaglandinen führt.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde herausgefunden, wie bereits berichtet, dass Pirenoxin vorteilhaft zum Schutz der Hornhautgewebe während Excimerlaserbehandlungen eingesetzt werden kann, da es eine Aktivität zur Inhibierung der Lipid-Peroxidation in den Hornhautzellgeweben aufweist.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Verwendung von 1-Hydroxy-5-oxo-5H-pyrido-[3,2a]-phenoxazin-3-carbonsäure (Pirenoxin) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Herstellung eines topischen ophthalmischen Arzneimittels, geeignet zum Schutz der Hornhautgewebe bei Photokeratektomie-Eingriffen. Wie bereits ausgeführt, wird das vorgeschlagene Arzneimittel als Inhibitor der ROS-Aktivität (reaktive Sauerstoffspezies) auf der Ebene der Hornhautgewebe und insbesondere als Inhibitor der Lipid-Peroxidation auf der Ebene dieser Gewebe entwickelt.

Die Verwendung von Pirenoxin als Schutzmittel vor und nach einer Operation findet Anwendung bei jeder Photokeratektomie-Behandlung und ist ferner mutmaßlich breiter anwendbar bei denjenigen Behandlungen, welche derzeit verbreiteter sind, wie zum Beispiel Hornhaut-Photoablation mittels Excimerlaser, sowohl refraktiv als auch therapeutisch, und im ersten Fall mittels sowohl PRK- als auch LASIK-Technik.

Die ophthalmischen Präparationen der vorliegenden Erfindung enthalten den Wirkstoff, d.h. Pirenoxin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, in einer Menge von 0,0001 Gew.-% bis 0,01 Gew.-%, ausgedrückt als freie Säure. Günstiger enthalten die Medikamente 0,001 bis 0,005 Gew.-% Pirenoxin, ausgedrückt als freie Säure, wobei die optimale Konzentration diejenige ist, die gegenwärtig zur Therapie von grauem Star eingesetzt wird, d.h. 0,005 Gew.-%. Günstiger liegt das Pirenoxin in Form des Natriumsalzes vor. Bei Verwendung in Form eines Augenwassers, das 0,005 Gew.-% des aktiven Wirkstoffs enthält, kann die Präparation gemäß der Erfindung verabreicht werden, um den gewünschten Effekt der ROS-Inhibierung zu erhalten, bei einer Dosis von 1 bis 2 Tropfen 2 × oder 3 × täglich, vorzugsweise 2 Tropfen 3 × täglich, beginnend mindestens ein oder zwei Tage vor der Operation und nach der Operation für mindestens ein oder zwei Tage fortgesetzt. Im Allgemeinen kann die Dosierung und Posologie in großem Umfang variiert werden, ohne die gesamte Schutzwirkung gegen ROS, die von dem Produkt entfaltet wird, zu beeinträchtigen.

Das ophthalmische topische Arzneimittel, welches Pirenoxin oder ein Salz davon enthält, kann im Allgemeinen in denselben Formen wie hergestellt oder vorgeschlagen zur Verwendung des gleichen Wirkstoffs für die Therapie von grauem Star oder Augenentzündung, wie in der obengenannten europäischen Patentveröffentlichung EP-A-0885612 beschrieben, vorliegen. Insbesondere kann das Produkt in Form einer wässrigen Lösung oder Suspension für ein Augenwasser oder in Form einer Emulsion, Salbe, eines Gels oder einer Creme vorliegen. Vorzugsweise wird das Produkt als wässrige ophthalmische Lösung verabreicht. Aufgrund der Instabilität des Wirkstoffs wird Pirenoxin normalerweise in den bereits verwendeten Medikamenten zur Behandlung von grauem Star als Zweikomponentenpräparation formuliert, wobei eine erste Komponente gefriergetrocknetes Pirenoxin umfasst und die zweite Komponente einen für das Auge annehmbaren wässrigen Träger oder ein annehmbares Verdünnungsmittel umfasst. Die beiden Komponenten werden vor der Verwendung rekonstituiert und die so erhaltene Lösung kann im Allgemeinen bei Umgebungstemperatur für etwa 2 Wochen ohne Abbau gelagert werden.

Im Allgemeinen können die Zusammensetzungen, welche Pirenoxin oder ein Salz davon gemäß der Erfindung enthalten, nach dem bekannten Stand der Technik formuliert werden, beispielsweise nach der Lehre von „Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook", Hack Publ. Co., U.S.A. Gewöhnlich sollten ein oder mehrere Agenzien zur Regulierung des Tonus zugegeben werden, wodurch die Lösung einen geeigneten Osmolaritätswert erhält. Irgendeines der gewöhnlich im Stand der Technik verwendeten Produkte kann verwendet werden, beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Mannit, Dextrose, Borsäure, Propylenglycol. Die Präparation kann auch Säuren oder Basen als Mittel zur Regulierung des pH-Werts und/oder Puffer umfassen, beispielsweise Mononatriumphosphat-Dinatriumphosphat-, Natriumborat-Borsäure- oder Natriumsuccinat-Succinsäure-Systeme. Für eine gute Toleranz im Auge sollte der pH-Wert zwischen 4,5 und 8,5 liegen. Ferner sollte die Zusammensetzung auch Konservierungsmittel und antimikrobielle Mittel enthalten, wie zum Beispiel Benzalkoniumchlorid, Natriummerthiolat oder Thimerosal, Methyl-, Ethyl- und Propylparaben, Chlorbutanol, sowie Chelatbildner und Sequestriermittel, wie zum Beispiel Edetate oder EDTA. Falls das Produkt in Dosierungseinheitsbehältern verpackt ist, kann die Anwesenheit von Konservierungsmitteln vermieden werden. Wenn jedoch Behälter für mehrere Dosen verwendet werden, beispielsweise Gefäße für Augenwasser, die 5 bis 15 ml enthalten, ist die Anwesenheit der Konservierungsmittel nötig.

Ferner kann die ophthalmische Präparation weitere optionale Bestandteile enthalten, wie z.B. Verdickungsmittel, Antioxidantien, Stabilisatoren, oberflächenaktive Mittel, etc. Nur als Beispiel wird die Zusammensetzung eines bereits im Handel erhältlichen Produkts, das für die Behandlung des grauen Stars bestimmt ist, im Folgenden beschrieben. Die Formulierung kann auch für die Verwendung des Produkts als Hornhaut-Schutzmittel gegen freie Radikale und ROS geeignet sein.

Einige Versuchsergebnisse, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, werden im Folgenden als Beispiel zusammen mit den Begleitzeichnungen angegeben, worin:

1 die Wirkung von 10–5 M Pirenoxin auf die Fluoreszenzbildung von lipidlöslichen Substanzen in Kaninchen-Hornhäuten nach Inkubation mit f-MLP-stimulierten autologen Makrophagen zeigt. Jeder Balken ± SEM repräsentiert den Mittelwert (in Klammern die Anzahl der behandelten Hornhäute). *:p < 0,01 gegenüber Kontrolle. Die Kontrollwerte sind signifikant höher als die Grundwerte (p < 0,0002);

2 die in vitro-Fluoreszenzbildung von lipidlöslichen Substanzen in UV312-bestrahlten (80mJ/cm2) Epithelhornhautzellen nach Inkubation in Gegenwart und Abwesenheit von 10–5 M Pirenoxin zeigt. Die Ergebnisse sind der Mittelwert von drei Experimenten;

3 die ex vivo-Wirkungen von Pirenoxin-Einträufelungen (60 &mgr;l jede Stunde für 8 Stunden im Verlauf von zwei Tagen) in die Kaninchenaugen hinsichtlich der Bildung konjugierter Diene in den Hornhäuten, die in vitro einer Eisen-induzierten Lipid-Peroxidation unterworfen wurden, zeigt. Jeder Balken ± S.E.M. repräsentiert den Mittelwert (in Klammern die Anzahl der behandelten Hornhäute). (a): ausgedrückt durch den Unterschied zwischen der Probe und dem Grundwert (ohne Eisen-Induktion: 1,3 ± 0,21 nmol/Hornhauthälfte; n = 8). *:p < 0,02 gegenüber Kontrolle.

Beispiel Formulierung von gefriergetrocknetem Natriumpirenoxin

Die Trockenpulverkomponente des Produkts hat die folgende Zusammensetzung, wobei die Mengen für die Rekonstitution in einer Lösung von 7 ml angegeben sind: Natriumpirenoxin (äquivalent zu 0,350 mg Pirenoxin) 0,376 mg Taurin 34,34 mg

Bei der Präparation werden Taurin und Natriumpirenoxin separat in entionisiertem Wasser gelöst, die beiden Lösungen werden durch Filtration sterilisiert und dann zusammengemischt und dem Gefriertrocknungsprozess unterworfen.

Das wässrige Lösungsmittel hat die folgende Zusammensetzung: Polyvinylalkohol 98 mg Succinsäure 2,31 mg Natriumsuccinat·6H2O 89,215 mg Natriumchlorid 34,3 mg Benzalkoniumchlorid 0,175 mg Natriumedetat 0,89 mg Entionisiertes Wasser auf 7 ml

Neben den in der obigen Beschreibung genannten Bestandteilen enthält diese Formulierung PVA als Verdickungsmittel. Der pH-Wert der Lösungsmittelkomponente beträgt 6. Die Formulierung wird hergestellt, indem alle Bestandteile, außer Benzalkoniumchlorid, zuerst gemischt und in Wasser gelöst werden. Nach der vollständigen Lösung aller Produkte wird Benzalkoniumchlorid unter fortgesetztem Rühren zugegeben und die Mischung wird durch Filtration sterilisiert. Der pH-Wert des rekonstituierten Produkts beträgt 6–6,3.

Aktivitätstests als Inhibitor der Lipid-Peroxidation

Zur Beurteilung der Leistung von Pirenoxin als Schutzmittel gegen die Wirkung von ROS in den Hornhautgeweben und insbesondere gegen die Lipid-Peroxidation wurde die in vitro-Aktivität von Pirenoxin sowohl in Hornhaut-Homogenaten in Gegenwart des Fe(III)-Ascorbinsäure-Oxidationssystems als auch der ganzen Hornhaut, die der Wirkung von ROS, erzeugt durch autologe Makrophagen, unterworfen wurde, beurteilt.

Ferner wurden die Wirkungen des UV-Lichts auf die Hornhaut sorgfältig beobachtet, da das Hornhautgewebe der äußeren Umgebung und deshalb der kombinierten Wirkung von Sauerstoff und Strahlung ständig ausgesetzt ist.

Die ersten Experimente, welche durch Bestrahlung von Hornhaut-Epithelzellen mit UV312 durchgeführt wurden, legen nahe, dass auch in diesem Fall Pirenoxin einen Schutz gegen Oxidation bietet.

Dasselbe Molekül wurde hinsichtlich seiner ex vivo-Wirkung beim Schutz der Hornhaut gegen oxidative Angriffe in vitro, katalysiert durch die Anwesenheit von Eisen, sowie gegen die Wirkung eines physiologischen Eisen-Komplexes, Ferritin, zuvor mit UV bestrahlt und dann in das Hornhaut-Stroma injiziert, untersucht. In beiden Fällen ergab Pirenoxin erfolgreiche Ergebnisse.

Aufgrund der durchgeführten Experimente scheint Pirenoxin bisher ein wirksames Mittel zum Schutz der Hornhaut, welche durch reaktive Sauerstoffspezies erzeugte Pathologien beeinträchtigt ist, darzustellen.

In vitro-Wirkung von Pirenoxin auf die Wirkung von ROS, induziert in Epithel- und Endothel-Homogenaten von Kaninchen-Hornhäuten.

Die Versuchsprozedur zur Berteilung der von Pirenoxin in Hornhaut-Epithel- und Endothelzellen ausgeübten inhibierenden Wirkung gegen die Lipid-Peroxidation machte Gebrauch von dem Fe(III)-Ascorbinsäure-System, um das Peroxidationsphänomen zu induzieren. Der oxidative Angriff auf die Membranlipide wurde durch spektrophotometrische Bestimmungen sowohl der konjugierten Diene als auch der fluoreszierenden lipidlöslichen Substanzen, welche bekanntermaßen durch den oxidativen Abbau von Lipidmolekülen erzeugt werden, bestätigt.

Die verwendete Versuchsprozedur beinhaltete die folgenden Schritte: a) Entfernen der Hornhaut aus dem Auge von männlichen pigmentierten Kaninchen, die geeignet für die Studie ausgewählt und vorbereitet wurden; b) Inkubation der Letzteren in 100 &mgr;M Phosphatpuffer, pH 7,5, in Gegenwart von 1000 E Kollagenase und 5 &mgr;M CaCl2 für 20 Stunden bei 37°C; c) Zentrifugation bei 35000 UpM bei 0°C für 10 Minuten und Waschen des Sediments mit Phosphatpuffer; d) Homogenisierung des zellulären Sediments in 1 ml Puffer, pH 7,4 (10 % Gew./Vol.); e) Inkubation eines geeigneten Homogenat-Aliquots mit 10 &mgr;M FeCl3 und Ascorbinsäure in Phosphatpuffer, pH 7,4, bei 27°C für 30 Minuten in Gegenwart und in Abwesenheit von 10–5 M Pirenoxin; f) Extraktion der lipidlöslichen Substanzen unter Verwendung einer Chloroform-Methanol-Mischung (2:1 Vol./Vol.). Die Bestimmung der im Lipidextrakt enthaltenen konjugierten Diene erfolgte gemäß Buege at al. (Methods Enzymol., 52: 302–310, 1974), während die fluoreszierenden lipidlöslichen Substanzen nach Fletcher et al. (Anal. Biochem. 52: 1–2, 1973) bestimmt wurden. Die Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Tabelle 1

  • Jeder Wert ± SEM repräsentiert den Mittelwert von mindestens 3 (× 2) Bestimmungen.
  • *p < 0,05 und #:p < 0,001 gegenüber den relativen Grundwerten;
  • **:p < 0,001 und ##:p < 0,005 gegenüber relativen Kontrollen.

Aus den in der obigen Tabelle angegebenen Daten ist ersichtlich, dass Pirenoxin eine eindeutige inhibierende Aktivität gegenüber der Lipid-Peroxidationswirkung von ROS, induziert durch das Fe(III)-Ascorbinsäure-System, ausübt, wie aus der bemerkenswerte Abnahme der konjugierten Diene und signifikanten Abnahme der fluoreszierenden lipidlöslichen Substanzen in Anwesenheit des obigen Moleküls abgeleitet werden kann.

In vitro-Schutzwirkung von Pirenoxin auf Hornhäute, die der Wirkung von ROS, gebildet durch f-MLP-stimulierte autologe Kaninchen-Makrophagen, unterworfen wurden

Zur Beurteilung der Inhibierung, welche von Pirenoxin gegen die oxidierende Aktivität von Makrophagen-produzierten ROS auf der Ebene der Hornhaut entfaltet wurde, wurde die folgende Prozedur durchgeführt: (a) broncho-alveolares Waschen des Kaninchens, um die Makrophagen zu erhalten; (b) Entnahme der Hornhaut aus dem Kaninchenauge; (c) Inkubation der Hornhäute mit 10–7 M f-MLP-stimulierten oder unstimulierten Makrophagen (800000 Zellen/Mulde) für zwei Stunden bei 37°C, 5 % CO2 in Gegenwart und Abwesenheit von 10–5 M Pirenoxin; (d) Trennung und Homogenisierung der Epithel- und Endothel-Hornhautzellen und anschließende Bestimmung der Fluoreszenz wie in den Schritten b, c, d, und f der obigen Methodik beschrieben.

Die in 1 angegebenen Ergebnisse zeigen, dass durch Inkubation der ganzen Hornhäute zusammen mit autologen Makrophagen in Gegenwart von Pirenoxin die Niveaus der induzierten Fluoreszenz beträchtlich niedriger lagen als bei den Kontrollen und vergleichbar mit denjenigen normaler Hornhäute (Grundwerte) sind.

In vitro-Schutzwirkung von Pirenoxin auf die Wirkung von ROS, induziert in UVB-bestrahlten Epithelzellen

Die Schutzwirkung von Pirenoxin auf Epithel-Hornhautzellen (SIRC), die 36 Sekunden lang mit UV312-Licht (80 mJ/cm2) nach dem folgenden Verfahren bestrahlt worden waren: (a) die Hornhautzellen wurden in Mulden von 35 mm Durchmesser ausplattiert; (b) bei 80 % Konfluenz wurden die Zellen mit einem Medium mit niedrigem (0,2 %) Serumgehalt in Kontakt gebracht, um deren Proliferation während des Experiments zu inhibieren; (c) die Zellen wurden mit UV-Licht in Gegenwart und in Abwesenheit von 10–5 M Pirenoxin bestrahlt, 17 Stunden lang bei 37°C inkubiert und in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, homogenisiert; (d) die lipidlöslichen fluoreszierenden Substanzen und die Proteine, die in geeigneten Homogenat-Aliquots enthalten waren, wurden bestimmt.

Die in 2 und in der Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse zeigen, dass Pirenoxin eine Schutzwirkung entfaltet. In der Tat waren die lipidlöslichen fluoreszierenden Substanzen, welche von den Epithel-Hornhautzellen nach der UV312-Bestrahlung und in Gegenwart dieses Moleküls gebildet wurden, beträchtlich geringer (etwa 2,5-fach) als die von Zellen gebildeten, welche auf dieselbe Weise bestrahlt wurden, jedoch nicht durch Pirenoxin geschützt wurden, und zeigen Fluoreszenzwerte ähnlich denjenigen von unbestrahlten Zellen.

Tabelle 2

Ex vivo-Wirkung von Pirenoxin auf Kaninchen-Hornhäute, welche in vitro der Wirkung von ROS unterworfen wurden

Unter Verwendung des gleichen Fe(III)-Ascorbinsäure-Systems zur Induzierung der Lipid-Peroxidation wie bei dem ersten beschriebenen Test wurde die Schutzwirkung von Pirenoxin ex vivo nach der folgenden Versuchsprozedur beurteilt: (a) das rechte Auge von Kaninchen desselben Typs wie im vorhergehenden Test wurde topisch jede Stunde für 8 Stunden im Verlauf von zwei Tagen mit 2 Tropfen von 0,005 %igem Pirenoxin in 0,145 M NaCl (1 Tropfen = 30 &mgr;l, entsprechend etwa 1,5 &mgr;g) behandelt; während das linke Auge nur mit Salzlösungstropfen (60 &mgr;l) behandelt wurde; (b) am dritten Tag wurde das Kaninchen durch Pentobarbital-Injektion (100 mg/kg Körpergewicht) getötet; c) die abgezogenen Hornhäute (115–120 mg) wurden entnommen und in 100 &mgr;M Phosphatpuffer, pH 7,5, in Gegenwart von 1000 E Collagenase und 5 &mgr;M CaCl2 für 20 Stunden bei 37°C inkubiert; anschließend: (d) Zentrifugation bei 3500 UpM bei 0°C für 10 Minuten und Waschen des Sediments mit Phosphatpuffer; (e) Homogenisierung des zellulären Sediments in 1 ml Puffer, pH 7,5; (f) Extraktion mit einer Chloroform/Methanol-Mischung und spektralphotometrische Bestimmung der konjugierten Diene. Die Versuchsergebnisse sind in 3 und in Tabelle 3 unten angegeben: Tabelle 3 (Konjugierte Diene (mmol/Hornhauthälfte) Augen mit Einträufelung von Salzlösung 1,85 ± 0,31 Augen mit Einträufelung von Pirenoxin 1,34* ± 0,2

  • Jeder Wert ± SEM repräsentiert den Mittelwert von mindestens 3 (× 2) Bestimmungen.
  • *:p < 0,05

Die in Tabelle 3 angegebenen Werte zeigen an, dass Pirenoxin, das topisch den Kaninchenaugen verabreicht wurde, in der Hornhaut eine solche Konzentration erreicht, um in vitro der Lipid-Peroxidationswirkung von ROS entgegenzuwirken. In der Tat war die Bildung von konjugierten Dienen in den Hornhäuten von Augen (rechts), die einer Einträufelung von 0,005 % Pirenoxin unterworfen worden waren, niedriger als in Augen (links), die nur mit Salzlösung behandelt worden waren.

In vivo-Wirkung von Pirenoxin auf Kaninchen-Hornhäute, die einer intrastromalen Injektion von UV-bestrahltem Ferritin unterworfen worden waren

Die in vivo-Wirkung von Pirenoxin wurde wie folgt beurteilt:

(a) Kaninchen wurden mit niedrigen Dosen Pentobarbital (20 mg/kg) betäubt; (b) 25 &mgr;l 50 &mgr;M Ferritin in 0,15 M NaCl wurden in das Stroma der Hornhaut durch eine Insulinspritze von 0,33 × 13 mm/29G injiziert, wohingegen die Kontrollen mit 25 &mgr;l physiologischer Lösung behandelt wurden; (c) in die Augen wurden jede Stunde 2 Tropfen (1 Tropfen = 30 &mgr;l) von 0,005 %igem Pirenoxin in 0,145 M NaCl 8 Mal am Tag im Verlauf von 4 Tagen eingeträufelt, wohingegen die Kontrollen nur mit dem Lösungsmittel in derselben Menge und Häufigkeit behandelt wurden; (d) am fünften Tag wurden die Tiere unter Verwendung einer Überdosis von Pentobarbital (100 mg/kg) getötet; (e) die Hornhäute wurden abgezogen und die Gewebezellen wurden nach dem bei dem ex vivo-Experiment beschriebenen Verfahren abgetrennt und gewonnen; (f) die konjugierten Diene und fluoreszierenden löslichen Lipide, die in geeigneten Homogenat-Aliquots enthalten waren, wurden bestimmt.

Die erhaltenen Daten, in Tabelle 4 angegeben, weisen auf eine Verringerung der Lipid-Peroxidation in den Hornhäuten von Pirenoxin-behandelten Augen hin, wie angezeigt durch die Abnahme konjugierter Diene und fluoreszierender lipidlöslicher Substanzen.

Tabelle 4

Bildung von konjugierten Dienen und lipidlöslichen fluoreszierenden Substanzen in vivo in den Hornhäuten 5 Tage nachdem die Kaninchenaugen der intrastromalen Injektion von UV-bestrahltem Ferritin und topischer Einträufelung von Pirenoxinlösung (2 Tropfen jede Stunde für 8 Stunden im Verlauf von 4 Tagen) unterworfen worden waren.


Anspruch[de]
Verwendung von 1-Hydroxy-5-oxo-5H-pyrido-[3,2-a]-phenoxazin-3-carbonsäure (Pirenoxin) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Herstellung eines topischen ophthalmischen Arzneimittels zum Schutz des Hornhautgewebes bei Photokeratektomie-Eingriffen. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel als Inhibitor der Wirkung von ROS (reaktiver Sauerstoffspezies) auf dem Niveau der Hornhautgewebe geeignet ist. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Arzneimittel als Inhibitor der Lipidperoxidation auf dem Niveau der Hornhautgewebe geeignet ist. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1–3, wobei die Photokeratektomie-Eingriffe Hornhaut-Photoablationseingriffe unter Verwendung eines Excimerlasers sind. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1–4, wobei das Arzneimittel 0,0001 bis 0,01 Gew.-% Pirenoxin, ausgedrückt als freie Säure, enthält. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Arzneimittel 0,001 bis 0,005 Gew.-% Pirenoxin, ausgedrückt als freie Säure, enthält. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1–6, wobei das Pirenoxin in Form des entsprechenden Natriumsalzes vorliegt. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1–7, wobei das topische ophthalmische Arzneimittel in Form einer wässerigen Lösung oder Suspension für ein Augenwasser oder in Form einer Emulsion, Salbe, eines Gels oder einer Creme vorliegt. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die wässerige Lösung erhalten wird durch Rekonstitution einer Zweikomponenten-Präparation, wobei eine erste Komponente gefriergetrocknetes Pirenoxin in Form von Natriumsalz zusammen mit einem für das Auge annehmbaren Träger umfasst und die zweite Komponente ein(en) für das Auge annehmbaren(s) wässerigen(s) Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.






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