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Dokumentenidentifikation DE60310738T2 11.10.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001543136
Titel MIKROBIELLE HERSTELLUNG VON VITAMIN C
Anmelder DSM IP Assets B.V., TE Heerlen, NL
Erfinder HOSHINO, Tatsuo, Kamakura-shi, Kanagawa-ken 248-0027, JP;
SUGISAWA, Teruhide, CH-4125 Riehen, CH
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 60310738
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, RO, SE, SI, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 22.09.2003
EP-Aktenzeichen 037505914
WO-Anmeldetag 22.09.2003
PCT-Aktenzeichen PCT/EP03/10494
WO-Veröffentlichungsnummer 2004029268
WO-Veröffentlichungsdatum 08.04.2004
EP-Offenlegungsdatum 22.06.2005
EP date of grant 27.12.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 11.10.2007
IPC-Hauptklasse C12P 17/04(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12P 7/60(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft die mikrobielle Produktion von L-Ascorbinsäure (Vitamin C).

Vitamin C, ein sehr wichtiger und unentbehrlicher Nährfaktor für den Menschen, wird durch das sogenannte "Reichstein-Verfahren" hergestellt, das als technologisch bewährtes Verfahren bekannt ist. Dieses Verfahren umfasst jedoch eine Reihe komplexer Schritte, und eine Verbesserung der Gesamt-Ausbeute ist schwer ausführbar. Daher gibt es eine Reihe von Vorschlägen, die eine Reduktion der Anzahl von Schritten und/oder eine Verbesserung der Gesamtausbeute vorschlagen.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin C aus D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose bereit, indem ein Mikroorganismus gezüchtet wird, der ausgewählt ist aus dem Stamm Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), einem Mikroorganismus, der zur Gattung Gluconobacter gehört und der die Identifizierungseigenschaften von G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) hat, und dessen Mutanten, in einem wässrigen Nährmedium, das D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose enthält, und Isolieren und Reinigen von Vitamin C aus dem Fermentationsmedium.

Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin C aus D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose bereit, bei dem man:

  • (a) einen Mikroorganismus in einem wässrigen Nährmedium züchtet, das D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose enthält, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), einem Mikroorganismus, der zur Gattung Gluconobacter gehört und der die Identifizierungseigenschaften von G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) aufweist, und dessen Mutanten, und
  • (b) das Vitamin C aus dem Fermentationsmedium isoliert und reinigt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird Vitamin C aus L-Gulose oder L-Sorboson durch das vorstehend definierte Verfahren produziert. Eine stärker bevorzugte Ausführungsform ist ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin C aus L-Gulose, bei dem man:

  • (a) einen Mikroorganismus in einem wässrigen Nährmedium züchtet, das L-Gulose enthält, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), einem Mikroorganismus, der zur Gattung Gluconobacter gehört und der die Identifizierungseigenschaften von G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) aufweist, und dessen Mutanten, und
  • (b) das Vitamin C aus dem Fermentationsmedium isoliert und reinigt.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin C aus D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose bereit, bei dem man einen Mikroorganismus, der ausgewählt ist aus dem Stamm G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), einem Stamm, der zur Gattung Gluconobacter gehört und der die Identifizierungseigenschaften von G. Oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) aufweist, und dessen Mutanten mit D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose in einem Reaktionsgemisch zusammenbringt, und das Vitamin C aus dem Reaktionsgemisch isoliert und reinigt.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin C aus D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose, bei dem man einen Mikroorganismus, der ausgewählt ist aus dem Stamm Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), einem Mikroorganismus, der zur Gattung Gluconobacter gehört und der die Identifizierungseigenschaften von G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) hat, und dessen Mutanten mit D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose in einem Reaktionsgemisch zusammenbringt und das Vitamin C aus dem Reaktionsgemisch isoliert und reinigt.

G. oxydans DSM 4025 wurde am 17. März 1987 auf der Grundlage der Bestimmungen des Budapester Vertrags unter der DSM-Nr. 4025 an der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Göttingen (Deutschland) hinterlegt. Der Deponent war The Oriental Scientific Instruments Import and Export Corporation for Institute of Microbiology, Academia Sinica, 52 San-Li-He Rd., Peking, Volksrepublik China. Der geltende Deponent war dieses Institut, dessen vollständige Addresse wie folgt lautet: The Institute of Microbiology, Academy of China, Haidian, Zhongguancun, Peking 100080, Volksrepublik China.

Darüber hinaus wurde am 30. März 1992 auch auf der Basis der Bestimmungen des Budapester Vertrags eine Subkultur des Stammes auch am National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3812 hinterlegt. Der Deponent ist die Nippon Roche K.K., 6-1, Shiba 2-chome, Minato-ku, Tokyo 105-8532 Japan. Diese Subkultur kann ebenfalls erfindungsgemäß verwendet werden.

Mutanten von G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) oder einem Mikroorganismus, der zur Gattung Gluconobacter gehört und der die Identifizierungseigenschaften von G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) aufweist, können erhalten werden, indem die Zellen mit Hilfe von beispielsweise Ultraviolett- oder Röntgenstrahlung oder einem chemischen Mutagen, wie Stickstoffsenf oder N-Methyl-n-nitro-N-nitrosoguanidin, behandelt werden.

Es versteht sich, dass "Gluconobacter oxydans" ebenfalls Synonyme oder Basonyme dieser Arten mit den gleichen physikalisch-chemischen Eigenschaften beinhaltet, wie definiert durch den Internationalen Nomenklatur-Code für Prokaryoten.

Es kann ein beliebiger Typ Mikroorganismus verwendet werden, beispielsweise ruhende Zellen, acetonbehandelte Zellen, lyophilisierte Zellen, immobilisierte Zellen und dergleichen, die direkt auf das Substrat einwirken. Jegliche Maßnahme, die an sich als Verfahren im Zusammenhang mit der Inkubationstechnik bekannt ist, kann durch die Verwendung von Belüftung angepasst werden, und gerührte Tauchfermenter sind besonders bevorzugt. Der bevorzugte Zellkonzentrationsbereich zum Durchführen der Reaktion reicht von etwa 0,01 g Feuchtzellgewicht pro ml bis etwa 0,7 g Feuchtzelle pro ml, vorzugsweise von etwa 0,03 g Feuchtzelle pro ml bis etwa 0,5 g Feuchtzelle pro ml.

Die Anzucht kann bei einem pH-Wert von 4,0 bis 9,0 erfolgen, wobei ein pH-Wert von etwa 5,0 bis 8,0 bevorzugt ist. Die Anzuchtperiode variiert je nach dem pH-Wert, der Temperatur, und dem zu verwendenden Nährmedium, und reicht vorzugsweise von etwa 1 bis 5 Tage, am stärksten bevorzugt etwa 1 bis 3 Tage. Der bevorzugte Temperaturenbereich zum Durchführen der Anzucht ist von etwa 13°C bis etwa 36°C, stärker bevorzugt von 18°C bis 33°C. Ein bevorzugtes Ergebnis ist durch eine Inkubation erhältlich, die ein flüssiges Brühemedium verwendet.

Somit ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Produktion von Vitamin C aus D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose, bei dem man:

  • (a) einen Mikroorganismus in einem wässrigen Nährmedium züchtet, das D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose enthält, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), einem Mikroorganismus, der zur Gattung Gluconobacter gehört und der die Identifizierungseigenschaften von G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) aufweist, und dessen Mutanten, und
  • (b) das Vitamin C aus dem Fermentationsmedium isoliert und reinigt;
wobei das Verfahren bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 9,0 und in einem Temperaturenbereich von etwa 13°C bis etwa 36°C für 1 bis 5 Tage durchgeführt wird.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5,0 bis etwa 8,0 und bei einem Temperaturenbereich von etwa 18°C bis etwa 33°C für etwa 1 bis 3 Tage durchgeführt.

Als Nährmedium für die Inkubation des Mikroorganismus wird im Allgemeinen jegliches wässrige Nährmedium verwendet, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, andere anorganische Salze, kleine Mengen anderer Nährstoffe und dergleichen enthält, wie u.a. Mineralien und Vitamine, die von dem Mikroorganismus verwendet werden können. Verschiedene Nährmaterialien, die im Allgemeinen für das bessere Wachstum von Mikroorganismen verwendet werden, können geeignet in dem Medium aufgenommen werden.

Das Kulturmedium muss gewöhnlich zusätzlich zu den Kohlenstoffquellen, die zu Vitamin C umgewandelt werden, solche Nährstoffe enthalten, wie assimilierbare Kohlenstoffquellen, beispielsweise Glycerin, D-Mannitol, Erythritol, Ribitol, Xylitol, Arabitol, Inositol, Dulcitol, D-Ribose, D-Fructose, D-Glucose und Saccharose; und spaltbare Stickstoffquellen, wie organische Substanzen, beispielsweise Pepton, Hefeextrakt, Beckerhefe, Harnstoff, Aminosäuren und Maisquellwasser. Verschiedene anorganische Substanzen können ebenfalls als Stickstoffquellen verwendet werden, beispielsweise Nitrate und Ammoniumsalze. Das Kulturmedium enthält gewöhnlich anorganische Salze, beispielsweise Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat und Calciumcarbonat.

Für die vorteilhafte Leistung der Inkubation kann ein geeigneter Faktor, der die Bildung des Endproduktes fördern kann, zu dem Medium gegeben werden. Solche Faktoren umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Lösungsmittel, Detergenzien, Antischaum-, Belüftungs-Bedingungen, wie die Sauerstoffkonzentration, die der Reaktion zugeführt wird.

Die Konzentration von D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose kann zwar ebenfalls mit den Anzuchtbedingungen variiert werden, jedoch ist gewöhnlich eine Konzentration von etwa 2 bis 120 g/l anwendbar. Eine Konzentration von 4 bis 100 g/l ist bevorzugt.

Das so produzierte und im Medium oder Reaktionsgemisch angereicherte Vitamin C kann abgetrennt und durch ein an sich bekanntes herkömmliches Verfahren gereinigt werden, das geeigneterweise die Eigenschaft des Produktes ausnutzt, und es kann als freie Säure oder als Salz von Natrium, Kalium, Calcium, Ammonium oder dergleichen getrennt werden.

Die Trennung kann spezifisch durch eine geeignete Kombination oder Wiederholung der folgenden Schritte durchgeführt werden: durch die Bildung eines Salzes, durch Ausnutzen von Unterschieden der Eigenschaften zwischen dem Produkt und den umgebenden Verunreinigungen, wie Löslichkeit, Absorbierbarkeit und Verteilungskoeffizient zwischen den Lösungsmitteln, durch Absorption beispielsweise auf einem Ionenaustauschharz. Jedes dieser Verfahren allein oder in Kombination stellt eine geeignete Maßnahme zur Isolation des Produktes bereit. Das so erhaltene Produkt kann weiter auf herkömmliche Weise, beispielsweise durch Umkristallisation oder Chromatographie gereinigt werden.

Die Identifikation von Vitamin C, das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wird, kann beispielsweise durchgeführt werden durch Elementaranalyse sowie die Messung physikalisch-chemischer Eigenschaften, wie das Infrarot-Absorptionsspektrum, Massenspektrum, NMR und dergleichen.

Erfindungsgemäß ist die Verbesserung in Bezug auf die Reduktion der Anzahl der Schritte sehr signifikant, weil sie zu einem Ein-Schritt-Weg führt, der auf die Produktion von Vitamin C aus einem der Substrate D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose gerichtet ist.

In den folgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren eingehender veranschaulicht.

Beispiel 1: Umwandlung von D-Sorbitol in Vitamin C

Eine Impföse mit G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), der auf Agarmedium gezüchtet wurde, das 5,0% D-Mannitol, 0,25% MgSO4·7H2O, 1,75% Maisquellwasser, 5,0% Bäckerhefe, 0,5% Harnstoff, 0,5% CaCO3 und 2,0% Agar enthielt, und das für 4 Tage bei 27°C gezüchtet wurde, wurde in 5 ml Impfkulturmedium, das 8,0% D-Sorbitol, 5,0% Bäckerhefe, 0,05% Glycerin, 0,25% MgSO4 7H2O, 1,75% Maisquellwasser, 0,5% Harnstoff, 1,5% CaCO3 und einen Tropfen Antischäumungsmittel enthielt, in einem Teströhrchen überimpft und dann bei 30°C mit 240 U/min für 20 Std. auf einem Umkehrschüttler gezüchtet.

3 ml der Impfkultur wurden in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben überführt, die 50 ml des Produktionsmediums enthielten, das 8,0% D-Sorbitol, 5,0% Bäckerhefe, 0,05% Glycerin, 0,25% MgSO4·7H2O, 3,0% Maisquellwasser, 1,5% CaCO3 und 0,15% Antischäumungsmittel enthielt. Die Anzucht erfolgte bei 30°C mit 180 U/min für 45 Std. auf einem Rotationsschüttler. Dann wurde die Konzentration des produzierten Vitamin C mittels HPLC bei einer Wellenlänge von 264 nm mit dem System gemessen, das aus einem UV-Detektor (TOSOH UV8000; TOSOH Co., Kyobashi 3-2-4, Chuo-ku, Tokyo, Japan), einer Doppelpumpe (TOSOH CCPE; TOSOH Co.), einem Integrator (Shimadzu C-R6A; Shimadzu Co., Kuwahara-cho 1, Nishinokyo, Chukyo-ku, Kyoto, Japan) und einer Säule (YMC-Pack Polyamine II; YMC, Inc., 3233 Burnt Mill Drive Wilmington, NC 28403, USA) bestand. Als Ergebnis wurden 118,1 mg/l Vitamin C produziert.

Beispiel 2: Umwandlung von L-Sorbose in Vitamin C

Eine Impföse mit G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), der auf Agarmedium gezüchtet wurde, das 5,0% D-Mannitol, 0,25% MgSO4·7H2O, 1,75% Maisquellwasser, 5,0% Bäckerhefe, 0,5% Harnstoff, 0,5% CaCO3 und 2,0% Agar enthielt, und das für 4 Tage bei 27°C gezüchtet wurde, wurde in 5 ml Impfkulturmedium, das 8,0% L-Sorbose, 5,0% Bäckerhefe, 0,05% Glycerin, 0,25% MgSO4 7H2O, 1,75 Maisquellwasser, 0,5% Harnstoff, 1,5% CaCO3 und einen Tropfen Antischäumungsmittel enthielt, in einem Teströhrchen überimpft, und dann bei 30°C mit 240 U/min für 20 Std. auf einem Umkehrschüttler gezüchtet.

3 ml der Impfkultur wurden in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben überführt, die 50 ml des Produktionsmediums enthielten, das 8,0% L-Sorbose, 5,0% Bäckerhefe, 0,05% Glycerin, 0,25% MgSO4·7H2O, 3,0% Maisquellwasser, 1,5% CaCO3 und 0,15% Antischäumungsmittel enthielt. Die Anzucht erfolgte bei 30°C mit 180 U/min für 20 Std. auf einem Rotationsschüttler. Als Ergebnis wurden 407,1 mg/l Vitamin C produziert.

Beispiel 3: Produktion von Vitamin C aus D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson und L-Gulose mit dem ruhenden Zellsystem

G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) wurde auf Agarmedium gezüchtet, das aus 8,0% L-Sorbose, 0,25% MgSO4·7H2O, 1,75% Maisquellwasser, 5,0% Bäckerhefe, 0,5% Harnstoff, 0,5% CaCO3 und 2,0% Agar bestand, bei 27°C für 4 Tage gezüchtet. Die auf dem vorstehenden Medium gezüchteten Zellen von G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) wurden in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,0) überführt und zweimal mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die optische Dichte der Zellsuspension bei 600 nm betrug 21,9. Sie enthielt 0,057 g Feuchtzellgewicht pro ml.

Das Reaktionsgemisch (5 ml im Teströhrchen) enthielt die Zellsuspension und 8,0% D-Sorbitol, 8,0% L-Sorbose, 0,5% L-Sorboson oder 1,0% L-Gulose in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,0). Die Reaktion wurde durch die Animpfung der Zellsuspension begonnen und bei 30°C und mit 180 U/min in einem Umkehrschüttler durchgeführt. Der Vitamin C-Gehalt wurde bei der Reaktionszeit von 4, 20 und 24 Std. mit HPLC gemessen. Die Tabelle 1 zeigt die Menge an Vitamin C, die aus jedem Substrat durch G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) produziert wurde.

Tabelle 1: Vitamin C-Produktion aus D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose


Anspruch[de]
Verfahren zur Herstellung von Vitamin C aus D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose, umfassend die Schritte:

(a) Züchten eines Mikroorganismus in einem wässrigen Nährmedium, das D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose enthält, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), einem Mikroorganismus, der zur Gattung Gluconobacter gehört und der die Identifizierungseigenschaften von G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) aufweist, und dessen Mutanten, und

(b) Isolieren und Reinigen des mikrobiell hergestellten Vitamin C direkt aus dem Fermentationsmedium.
Verfahren zur Herstellung von Vitamin C aus D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose, wobei ein Mikroorganismus in einem wässrigen Nährmedium gezüchtet wird, das D-Sorbitol, L-Sorbose, L-Sorboson oder L-Gulose enthält, und das mikrobiell hergestellte Vitamin C direkt aus der Fermentationsbrühe isoliert wird und durch herkömmliche Verfahren gereinigt wird, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812), einem Mikroorganismus, der zur Gattung Gluconobacter gehört und der die Identifizierungseigenschaften von G. oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) aufweist, und dessen Mutanten. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Mikroorganismus Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) ist. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Vitamin C aus L-Gulose hergestellt wird. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 9,0 und in einem Temperaturenbereich von etwa 13°C bis etwa 36°C für 1 bis 5 Tage durchgeführt wird. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5,0 bis etwa 8,0 und in einem Temperaturenbereich von etwa 18°C bis etwa 33°C für 1 bis 3 Tage durchgeführt wird.






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