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Dokumentenidentifikation DE102006030835B3 18.10.2007
Titel Hochporöses magnetisches temporäres Festbett
Anmelder Forschungszentrum Karlsruhe GmbH, 76133 Karlsruhe, DE;
Universität Karlsruhe (TH), 76131 Karlsruhe, DE
Erfinder Hausmann, Rudolf, 76149 Karlsruhe, DE;
Matthias, Franzreb, 76185 Karlsruhe, DE
Vertreter Müller-Boré & Partner, Patentanwälte, European Patent Attorneys, 81671 München
DE-Anmeldedatum 04.07.2006
DE-Aktenzeichen 102006030835
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 18.10.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 18.10.2007
IPC-Hauptklasse B03C 1/08(2006.01)A, F, I, 20060704, B, H, DE
IPC-Nebenklasse B01D 53/00(2006.01)A, L, I, 20060704, B, H, DE   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Festbett, beispielsweise zum Isolieren und/oder Aufreinigen von aus einem biologischen System stammenden Bestandteilen, welches magnetische Partikel und ein zumindest teilweise im Festbett angeordnetes, magnetisierbares Gewebe umfasst, ein Wirbelschichtfestbett, welches das erfindungsgemäße Festbett nach Anlegen eines magnetischen Wechselfelds umfasst, sowie ein Verfahren zum Isolieren und/oder Aufreinigen von aus einem biologischen System stammenden Bestandteilen.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Festbett, beispielsweise zum Isolieren und/oder Aufreinigen von aus einem biologischen System stammenden Bestandteilen, welches magnetische Partikel und ein zumindest teilweise im Festbett angeordnetes, magnetisierbares Gewebe umfasst, einen temporären Festbett-/Wirbelschichtreaktor, welcher das erfindungsgemäße Festbett nach Anlegen eines magnetischen Wechselfelds umfasst, sowie ein Verfahren zum Isolieren und/oder Aufreinigen von aus einem biologischen System stammenden Bestandteilen.

Ein wesentlicher Aspekt der pharmazeutischen Biotechnologie ist die Isolierung bzw. Aufreinigung von aus biologischen Systemen stammenden Bestandteilen wie beispielsweise Proteinen. Diese Isolierung bzw. Aufreinigung erfolgt üblicherweise durch Chromatographie- bzw. Festbettadsorptionsverfahren, bei denen die zu isolierenden bzw. aufzureinigenden Bestandteile an in geeigneter Weise funktionalisierten Partikeln gebunden werden. Die Sorptionsgeschwindigkeit und damit die Effizienz des Verfahrens hängt unter anderem von der verwendeten Partikelgröße sowie der Strömungsgeschwindigkeit der mobilen Phase durch das Festbett ab.

Zwar weisen die im Festbettadsorptionsverfahren üblicherweise verwendeten Partikel mit 35 bis 50 &mgr;m eine geeignete Größe für eine schnelle Adsorption der aus biologischen Systemen stammenden Bestandteile auf, jedoch ist die Kapazität solcher Systeme aufgrund der vergleichsweise geringen Strömungsgeschwindigkeiten der mobilen Phase durch das Festbett stark begrenzt. Ferner erfordern Festbettadsorptionsverfahren eine meist aufwändige Vorbehandlung (Filtration, Zentrifugation oder Sedimentation) der das Produkt enthaltenden Suspension, um eine feststofffreie Lösung zu erhalten, da sonst eine Blockierung des Festbetts erfolgt.

Die aufwändige Vorbehandlung der das Produkt enthaltenden Suspension kann dagegen durch den Einsatz von Adsorbern auf Wirbelschichtbasis vermieden werden („expanded bed adsorption", „EBA"), da Wirbelschichten im Gegensatz zu Festbetten nicht durch in der Suspension vorliegende Feststoffteilchen wie beispielsweise Zellbruchstücke blockiert werden. Allerdings ist die Ausbildung von Wirbelschichten nur mit vergleichsweise großen Partikeln im Bereich von 150 bis 250 &mgr;m möglich. Aufgrund der geringen Sorptionsgeschwindigkeiten von Biomolekülen wie beispielsweise Proteinen erfolgt daher nur eine oberflächliche Beladung der Partikel, was zu einer geringen Effizienz dieses Verfahrens führt. Ein weiterer Nachteil von Wirbelschichten liegt in der axialen Durchmischung des Fluids und der Partikel. Ferner können inhomogene, partikelfreie Bereiche zu Umsatzverschlechterungen führen.

Durch die Verwendung von magnetischen Partikeln in magnetisch stabilisierten Wirbelschichten („magnetically stabilized fluidized bed", „MSFB") kann das Wirbelschichtverfahren deutlich verbessert werden. Magnetische Partikel („magnetic beads") sind Mikropartikel, die einen magnetischen Kern und eine funktionalisierte Oberfläche aufweisen.

Bei dem MSFB werden magnetische Partikel in einer Kolonne durch einen aufwärts gerichteten Flüssigkeitsstrom fluidisiert. Dabei werden die magnetischen Partikel durch ein magnetisches Feld ortsfest innerhalb der Wirbelschicht in magnetischen Partikelketten gehalten. Bei starken Magnetkräften bildet sich ein magnetisches Festbett aus. Durch die magnetische Stabilisierung gelingt es, die durch die Partikelbewegung hervorgerufene axiale Durchmischung im Wesentlichen zu unterdrücken. Dadurch sind höhere Strömungsgeschwindigkeiten im Vergleich zu gewöhnlichen Wirbelschichten möglich, was zu einer höheren Effizienz des Systems führt.

Durch das MSFB lässt sich eine geringe axiale Durchmischung, ein geringer Druckverlust, ein gutes Stoftübertragungsverhalten, hohe Durchsätze und eine kontinuierliche Betriebsführung realisieren. Allerdings besteht bei dem MSFB eine Tendenz zur Kanalbildung, wodurch die Effizienz des Systems verringert wird. Ferner kann aufgrund des festbettartigen Charakters bei hohen Magnetfeldstärken auch das Problem der Blockierung der Partikel durch in der mobilen Phase vorliegende Feststoffe auftreten.

Neben dem MSFB sind auch Wirbelschichten magnetischer Partikel im magnetischen Wechselfeld bekannt („magnetically stirred reactor", „MSR"). Dabei wird durch das magnetische Wechselfeld eine starke Durchwirbelung der magnetischen Partikel erzielt. Es resultiert eine Wirbelschicht, die auch ohne einen Fluidstrom aufrecht erhalten werden kann.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neues System zum Isolieren und/oder Aufreinigen von aus einem biologischen System stammenden Bestandteilen unter Verwendung von magnetische Partikeln bereitzustellen, welches die Vorteile von einem Wirbelschichtsystem mit denen eines Festbettsystems vereint, und welches insbesondere eine geringe axiale Durchmischung, einen geringen Druckverlust, ein gutes Stoffübertragungsverhalten, hohe Durchsätze und eine kontinuierliche Betriebsführung ohne eine Vorbehandlung des biologischen Systems durch Filtration oder Ähnliches ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.

Insbesondere wird ein Festbett, beispielsweise zum Isolieren und/oder Aufreinigen von aus einem biologischen System stammenden Bestandteilen, bereitgestellt, umfassend magnetische Partikel mit einer Teilchengröße im Bereich von etwa 10 bis etwa 100 &mgr;m, welche zur Bindung bzw. Adsorption von beispielsweise aus einem biologischen System stammenden Bestandteilen befähigt sind, und ein zumindest teilweise im Festbett angeordnetes, magnetisierbares Gewebe mit einer Maschenweite, welche dem Teilchengrößenbereich der jeweilig vorhandenen magnetischen Partikel im Festbett entspricht.

Dabei kann das System ein geeignetes biologisches System sein. Beispielsweise handelt es sich bei dem biologischen System um einen von prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen stammenden Aufschluss, einen Zellkulturüberstand, eine Zellkultur, eine biologische Flüssigkeit oder Suspension, oder ein Protein- oder Nukleinsäuregemisch.

Die aus dem biologischen System stammenden Bestandteile, die isoliert und/oder aufgereinigt werden sollen, können alle Bestandteile sein, die biotechnologisch von Interesse sind und durch in geeigneter Weise modifizierte magnetische Partikel gebunden werden können. Beispielsweise handelt es sich bei den Bestandteilen um Biomoleküle wie Enzyme, Proteine, (Poly)Peptide, Lipide, zuckerhaltige Verbindungen oder Nukleinsäuren. Diese Biomoleküle können auch eine Markierung aufweisen, welche unter anderem eine höhere Selektivität und/oder Affinität zu den eine entsprechende Oberflächenmodifikation aufweisenden magnetischen Partikeln zeigen. Beispiele hierfür sind sogenannte Fusionsproteine mit „His-tags".

Als magnetische Partikel können im Stand der Technik bekannte magnetische Partikel verwendet werden, die zur Bindung der aus dem biologischen System stammenden Bestandteile befähigt sind. Dazu sind die magnetischen Partikel in geeigneter Weise oberflächenbehandelt, d.h. die Oberfläche der magnetischen Partikel ist mit Gruppen mit einer Affinität zu den zu isolierenden bzw. aufzureinigenden Bestandteilen versehen. Derartige Gruppen sind im Stand der Technik bekannt. Ferner ist im Stand der Technik bekannt, auf welche Weise magnetische Partikel oberflächenbehandelt werden müssen, um einen bestimmten Bestandteil aus einem biologischen System selektiv zu binden.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten magnetischen Partikel weisen eine Teilchengröße im Bereich von etwa 10 bis etwa 100 &mgr;m auf, vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis etwa 50 &mgr;m. Durch diese Teilchengröße kann erreicht werden, dass die Bindung bzw. Adsorption der aus dem biologischen System stammenden Bestandteile mit einer hohen Geschwindigkeit erfolgt, was die Effektivität des Isolierungs- bzw. Aufreinigungssystems deutlich verbessert.

Das magnetisierbare Gewebe dient der magnetischen Fixierung der magnetischen Partikel. Vorzugsweise ist das magnetisierbare Gewebe ein metallhaltiges Drahtgewebe. Das magnetisierbare Gewebe kann das Festbett durchsetzen und/oder als äußere Begrenzung des Festbettes angeordnet sein. Damit das magnetisierbare Gewebe wirksam die magnetischen Teilchen fixiert, ist es vorteilhaft, dass die Maschenweise des Gewebes im Wesentlichen der Teilchengröße der magnetischen Partikel entspricht. Das magnetisierbare Gewebe kann dabei in einem beliebigen Winkel, vorzugsweise senkrecht, zur Strömungsrichtung angeordnet sein.

Das erfindungsgemäße Festbett ist vorzugsweise in einem geeigneten Behältnis bzw. Gehäuse angeordnet. Derartige Gehäuse sind im Stand der Technik bekannt und liegen vorzugsweise in Form einer Säule vor. Das Gehäuse besteht beispielsweise aus einem geeigneten Material wie Glas oder Kunststoff.

Durch Anlegen eines magnetischen Wechselfelds mit einer Frequenz im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 20 Hz, vorzugsweise mit einer Frequenz im Bereich von etwa 0,05 bis etwa 10 Hz, wird aus dem erfindungsgemäßen Festbett eine temporäre Wirbelschicht bzw. ein Wirbelschichttestbett. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter einer temporären Wirbelschicht ein System verstanden, worin die positiven Eigenschaften einer Wirbelschicht mit denen eines Festbettes in synergistischer Weise kombiniert werden.

Durch das magnetische Wechselfeld werden die magnetischen Partikel regelmäßig neu angeordnet, wodurch eine regelmäßige Neustrukturierung des Bettes erreicht wird. Dies führt zu einem Bett mit Wirbelschichtcharakter, welches eine hohe Porosität und einen geringen Druckverlust aufweist, bei dem die Verblockung durch Feststoffe wie beispielsweise Zellbruchstücke vermieden werden kann, und welches hohe Strömungsgeschwindigkeiten ermöglicht.

Auf der anderen Seite können durch die magnetische Fixierung der magnetischen Partikel erfindungsgemäß Partikel mit einer Größe von etwa 10 bis etwa 100 &mgr;m in dem Bett eingesetzt werden. Dadurch weist das erfindungsgemäße Bett ebenfalls Festbettcharakter auf, was eine hohe Beladung der magnetischen Partikel sowie die Realisierung mehrerer theoretischer Trennstufen ermöglicht. Ferner ist durch die magnetische Fixierung eine Gegenstromführung wesentlich einfacher zu realisieren als in einer Wirbelschicht oder in einem Festbett.

Mit dem erfindungsgemäßen Wirbelschichttestbett bzw. temporären Festbett-/Wirbelschichtreaktor ist es möglich, die Vorteile einer Wirbelschicht mit den reaktionskinetischen Vorteilen kleiner Partikel mit einer Größe von etwa 10 bis etwa 100 &mgr;m zu kombinieren. Insbesondere ermöglicht diese Kombination neben einem hohen konvektiven Stofftransport gleichzeitig eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit aufgrund des günstigen Oberfläche/Volumen-Verhältnisses der magnetischen Partikel. Ferner erhöht sich durch die magnetische Fixierung der Partikel die einsetzbare Strömungsgeschwindigkeit auf ein Vielfaches der Austragsgeschwindigkeit in einer herkömmlichen Wirbelschicht. Durch die Anordnung der Partikel entlang der magnetischen Feldlinien kommt es ferner zu einer guten Durchströmbarkeit des Bettes. Dieser Effekt wird durch das magnetisierbare Gewebe in dem Bett noch verstärkt.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, beispielsweise zum Isolieren und/oder Aufreinigen von aus einem biologischen System stammenden Bestandteilen, welches den vorstehend definierten temporären Festbett-/Wirbelschichtreaktor zum Adsorbieren bzw. Binden der aus einem biologischen System stammenden Bestandteile an die magnetischen Partikel verwendet.

Dabei wird vorzugsweise ein Gemisch, welches die aus einem biologischen System stammenden Bestandteile enthält, dem erfindungsgemäßen temporären Festbett-/Wirbelschichtreaktor zugeführt. Nach dem Binden bzw. Adsorbieren der aus einem biologischen System stammenden Bestandteile an die magnetische Partikel in dem erfindungsgemäßen temporären Festbett-/Wirbelschichtreaktor können die magnetischen Partikel mit den daran gebundenen bzw. adsorbierten Bestandteilen abgetrennt werden. Für den Fall einer kontinuierlichen Betriebsführung im Gegenstrom sind geeignete Verfahren zur Abtrennung der magnetischen Partikel aus dem temporären Festbett-/Wirbelschichtreaktor im Stand der Technik bekannt und machen vorzugsweise von der magnetischen Eigenschaft der Partikel Gebrauch. Nach dem Abtrennen der magnetischen Partikel aus dem temporären Festbett-/Wirbelschichtreaktor können die an die magnetischen Partikel gebundenen Bestandteile durch geeignete Verfahren eluiert werden. Die Elution kann auch innerhalb des temporären Festbett-/Wirbelschichtreaktors erfolgen. Dadurch werden die entsprechenden Bestandteile isoliert bzw. aufgereinigt erhalten. Das Zuführen des Gemisches, welches die aus einem biologischen System stammenden Bestandteile enthält, erfolgt vorzugsweise über eine Gegenstromführung. Auf diese Weise kann eine effizientere Isolierung bzw. Aufreinigung erfolgen.

1 zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen temporären Festbett-/Wirbelschichtreaktors.

Die vorliegende Erfindung soll im Folgenden anhand eines Beispiels näher erläutert werden, ohne jedoch durch dieses beschränkt zu sein.

Beispiel: Versuchsaufbau:

Die Versuchsanlage bestand im Wesentlichen aus dem Reaktor, dem Magnetspulensystem sowie einem hier nicht weiter aufgeführtem Messdatenerfassungssystem. zeigt eine schematische Skizze des Aufbaus.

Säule:

Der Reaktor bestand aus einer Plexiglassäule (Innendurchmesser 18 mm, Länge 107 mm), Die Verbindung beider Zulaufstutzen wurde über Schraubgewinde realisiert und gleichzeitig dazu genutzt, das magnetisierbare Drahtgewebe, mit einer nominellen Maschenweite von 100 &mgr;m, zu fixieren. Die Temperatur der Lösungen entsprach der Umgebungstemperatur. Im Reaktorablauf wurde der Durchfluss über einen Rotameter eingestellt. Der Durchfluss wurde über einen adäquaten Zeitraum mit Hilfe eines Standzylinders überprüft.

Spulensysteme zur Erzeugung des Magnetfelds:

Die Säule wurde inmitten eines koaxial angeordneten zylindrischen Spulensystems aus zwei oder vier Spulen (M) plaziert. Zur Erzeugung eines homogenen magnetischen Feldes wurden die Spulen im Abstand ihres Radius montiert (vereinfachte HELMHOLTZ-Anordnung). Zur Erzeugung des magnetischen Wechselfeldes wurde ein Verstärker mit einem analogen Frequenzgenerator gekoppelt. Dabei konnte die Flussdichte zwischen 0 und 7 mT und die Frequenz zwischen 0 und 1000 Hz variiert werden.

Magnetische Partikel:

Die eingesetzten magnetischen Partikel bestanden aus einer Polyvinylalkohol-Acrylsäure-Matrix mit eingeschlossenen Maghemitpartikeln (gamma-Fe2O3). Die Remanenz betrug 21 A·m2/kg. Der Partikeldurchmesser lag bei etwa 125 &mgr;m und die Dichte bei 1,23 g/mL. Die Oberfläche der Partikel wurde durch Imidodiessigsäure (IDA) funktionalisiert.

Mit der vorstehend beschriebenen Vorrichtung wurde „HIS-getagtes" eGFP aus einem E.coli-Zellaufschluss aufgereinigt bzw. isoliert.


Anspruch[de]
Festbett, umfassend magnetische Partikel mit einer Teilchengröße im Bereich von 10 bis 100 &mgr;m und ein zumindest teilweise im Festbett angeordnetes, magnetisierbares Gewebe mit einer Maschenweite, welche dem Teilchengrößenbereich der jeweilig vorhandenen magnetisierbaren Partikel im Festbett entspricht. Festbett nach Anspruch 1, wobei die magnetischen Partikel eine Teilchengröße im Bereich von 10 bis 50 &mgr;m aufweisen. Festbett nach Anspruch 1 oder 2, wobei die magnetischen Partikel zur Adsorption von aus einem biologischen System stammenden Bestandteilen befähigt sind. Festbett nach Anspruch 3, wobei die aus biologischen Systemen stammenden Bestandteile Biomoleküle wie Enzyme, Proteine, (Poly)Peptide, Lipide, zuckerhaltige Verbindungen oder Nukleinsäuren sind. Festbett nach Anspruch 3 oder 4, wobei das biologische System ein von prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen stammender Aufschluss, ein Zellkulturüberstand, eine Zellkultur, eine biologische Flüssigkeit oder Suspension, oder ein Protein- oder Nukleinsäuregemisch ist. Festbett nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das magnetisierbare Gewebe ein metallhaltiges Drahtgewebe ist. Temporärer Festbett-/Wirbelschichtreaktor, umfassend das Festbett nach einem der Ansprüche 1 bis 6 nach Anlegen eines magnetischen Wechselfelds mit einer Frequenz im Bereich von 0,01 bis 20 Hz. Temporärer Festbett-/Wirbelschichtreaktor nach Anspruch 7, wobei das magnetische Wechselfeld eine Frequenz im Bereich von 0,05 bis 10 Hz aufweist. Verfahren zum Isolieren und/oder Aufreinigen von aus einem biologischen System stammenden Bestandteilen, umfassend den Schritt des Adsorbierens der aus einem biologischen System stammenden Bestandteile an die magnetischen Partikel in dem temporären Festbett-/Wirbelschichtreaktor nach Anspruch 7 oder 8.






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