PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE60029794T2 18.10.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001202798
Titel VERWENDUNG VON MIT POLYMER BESCHICHTETEM SORPTIONSMITTELKOMPOSIT ZUR TRENNUNG, REINIGUNG, ENTSALZUNG UND KONZENTRIERUNG VON BIOPOLYMEREN
Anmelder NExtTec GmbH, 51377 Leverkusen, DE
Erfinder LEISER, Robert-Matthias, D-42697 Solingen, DE;
PLOBNER, Lutz, D-40699 Erkrath, DE;
YAROSHEVSKAYA, Elena Markovna, D-50858 Köln, DE;
ZUBOV, Vitali Pavlovich, 121433 Moskva, RU;
KAPUSTIN, Dmitry Valerievich, 117321 Moskva, RU;
YAGUDAEVA, Elena Jurievna, 127018 Moskau, RU
Vertreter Patentanwälte von Kreisler, Selting, Werner et col., 50667 Köln
DE-Aktenzeichen 60029794
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 25.04.2000
EP-Aktenzeichen 009349606
WO-Anmeldetag 25.04.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/EP00/03674
WO-Veröffentlichungsnummer 2000064579
WO-Veröffentlichungsdatum 02.11.2000
EP-Offenlegungsdatum 08.05.2002
EP date of grant 02.08.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 18.10.2007
IPC-Hauptklasse B01J 20/30(2006.01)A, F, I, 20060323, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C07K 1/00(2006.01)A, L, I, 20060323, B, H, EP   B01D 15/08(2006.01)A, L, I, 20060323, B, H, EP   G01N 30/00(2006.01)A, L, I, 20060323, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines zusammengesetzten Sorbens, das einen Träger umfasst, der wenigstens partiell mit einem polymeren Film bedeckt ist, der auf primären aromatischen Aminen beruht [D. Sindhimeshram et al. "Transport Properties of Substituted Derivatives of Polyaniline", Electron Manuf. and Test", 260-267 (1995)]. Die innere Oberfläche der porösen Träger ist ebenfalls bedeckt. Das zusammengesetzte Sorbens der Erfindung wird unter Bedingungen hergestellt, die ebenfalls offenbart werden. Eine chromatographische Säule oder Kartusche wird ebenfalls offenbart.

Für die Trennung verschiedener Substanzen sind viele verschiedene chromatographische Materialien bekannt. Diese chromatographischen Träger können allein oder in Kombinationen verwendet werden, so dass fast alle spezifischen Bedürfnisse abgedeckt werden. Es ist jedoch noch notwendig, neue Sorbentien für die Trennung von Biomolekülen, wie Nucleinsäuren, mit anderen charakteristischen Merkmalen zu gewinnen.

US-A-5,225,495 offenbart ein Verfahren zur Bildung von Polyanilinfilmen auf einem Substrat sowie durch dieses Verfahren gebildete zusammengesetzte Artikel. Diese Materialien werden für Filme verwendet, die elektrisch leitend sind.

JP 02004446 offenbart ein Gasadorbens, das ein elektrisch leitendes Polymer mit konjugierten Doppelbindungen umfasst. Das leitfähige Polymer wird auf der Oberfläche eines Pulverträgers abgeschieden. Die Oberfläche umfasst Mikroporenwände. Als elektrisch leitendes Polymer wird Polyanilin verwendet.

Das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, besteht darin, ein Verfahren anzugeben, mit dem Proteine und andere Substanzen von Nucleinsäuren abgetrennt werden können und das daher besonders gut für die schnelle einstufige Probenvorbereitung von DNA, z.B. für PCR, geeignet ist. Ein Sorbens mit den erwähnten Eigenschaften ist Gegenstand von EP 99 100 416. Aber dieses Sorbens hat einen Nachteil: Die polymere Oberfläche ist hydrophob. Man möchte, dass die oben angesprochene Trennung in wässriger Umgebung durchgeführt werden kann.

WO-A-89/07265 offenbart ein chromatographisches Material für die stationäre Phase, bei dem ein mechanisch stabiles und chemisch inertes Substrat mit einem elektrisch leitenden Polymer, bei dem es sich um ein Polyanilin handeln kann, beschichtet wird. Die chromatographische Trennung wird durchgeführt, indem man ein elektrisches Potential an das Material der stationären Phase anlegt, so dass die Elution mittels Veränderungen in den chemischen Eigenschaften des Polymers, die von dem angelegten Potential abhängen, gesteuert wird.

Das technische Problem wird gelöst durch die Verwendung eines zusammengesetzten Sorbens, das eine wenigstens partielle Beschichtung auf einem Träger aufweist, wobei die Beschichtung im Wesentlichen Polyaniline oder Derivate von Polyanilinen umfasst, zur Isolierung oder Reinigung von DNA aus einer Lösung, die DNA und Proteine umfasst, im analytischen oder präparativen Maßstab, wobei die DNA im Durchfluss enthalten und das Protein an das Sorbens gebunden ist.

Vorzugsweise ist der Träger ein anorganisches Material, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die anorganischen Metalloxide umfasst, vorzugsweise mit einer porösen Struktur, wie Oxide von Aluminium, Titan, Zirconium, Silicium und/oder Eisen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Träger ein organisches Material, vorzugsweise mit einer porösen Struktur, wie Teilchen oder Oberflächen aus linearem oder vernetztem Polystyrol, Polyethylen, Polyacrylat.

Bei den Derivaten von Polyanilin handelt es sich vorzugsweise um substituierte oder unsubstituierte Alkylaniline, aromatische Systeme, Ethylanilin, Propylanilin und/oder Ethoxyanilin.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine chromatographische Säule, Kapillare oder Kartusche, die wenigstens teilweise mit einem zusammengesetzten Sorbens gefüllt ist, das einen Träger umfasst, der wenigstens partiell mit einer polymeren Beschichtung bedeckt ist, die im Wesentlichen Polyaniline oder Derivate von Polyanilinen umfasst.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen membranartigen Gegenstand, der ein zusammengesetztes Sorbens umfasst, das einen Träger umfasst, der wenigstens partiell mit einer polymeren Beschichtung bedeckt ist, die im Wesentlichen Polyaniline oder Derivate von Polyanilinen umfasst, wobei das zusammengesetzte Sorbens in eine poröse polymere oder anorganische Matrix eingebettet ist.

Gemäß der Erfindung lässt sich die Verwendung der Erfindung leicht mit einem Kit durchführen, der ein zusammengesetztes Sorbens umfasst, das einen Träger umfasst, der wenigstens partiell mit einer polymeren Beschichtung bedeckt ist, die im Wesentlichen Polyaniline oder Derivate von Polyanilinen umfasst, wobei das zusammengesetzte Sorbens in loser Form oder in chromatographische Säulen oder Kartuschen gemäß Anspruch 5 verpackt oder als membranartiger Gegenstand gemäß Anspruch 6 vorliegt, gegebenenfalls in Kombination mit Filtermaterialien, Reagentien und/oder Puffern oder anderen Vorrichtungen oder Chemikalien zur Durchführung von Probenvorbereitungen oder chromatographischen Trennungen.

Durch die Kombination der hohen Bindungskapazität für Proteine und der porösen Struktur des zusammengesetzten Sorbens kann DNA in einem Schritt von anderen Substanzen abgetrennt werden. Daneben ermöglicht die spezielle Eigenschaft von Polyanilinen, ihre Farbe unter bestimmten Bedingungen zu verändern [Hailin Hu et al. "Electrically Conducting Polyaniline – Poly(acrylic acid) Blends"; Polymer International, 45, 262-270 (1998); Ya. Kogan et al. "(NH4)2IrCl6 i drugie protoniruutshie agenty khimitcheskoj polimerizatcii anilina" Izvestiya Akademii Nauk. Ser. khim., 8, 1500-1502 (1994)], ihre Verwendung zum Nachweis der Wechselwirkung von getrennten Substanzen auf der Oberfläche des Sorbens.

Die Hauptvorteile der Verwendung des zusammengesetzten Sorbens, wie sie schon früher vorgeschlagen wurden [A. Syed et al. "Polyaniline: Reaction Stoichiometry and Use as an Ion-exchange Polymer and Acid/Base Indicator"; Synthetic Metals, 36, 209-215 (1990); US-Patent 5,281,363; 1/1994, Shacklette et al.; 252/500; US-Patent 5,232,631; 8/1993, Yong Cao et al.; 252/500; J. Nicolau "Characteristic of Polyaniline filled by Porous n+-type Silica by the Renthgene Photoelectrical Spectroscopy Method"; Synthetic Metals, 1-3, 2073-2074 (1995)], sind die leichte Handhabung, die Geschwindigkeit des Trennvorgangs und die Möglichkeit einer visuellen Kontrolle der Sorptions- und Trennungsvorgänge. DNA ist im Durchfluss enthalten (Kartuschenverfahren). Gebundene Proteine können bei Bedarf getrennt durch einen Gradienten eluiert und anschließend analysiert werden.

Das gemäß der Erfindung zu verwendende zusammengesetzte Sorbens, das einen Träger enthält, der wenigstens partiell mit einem chemisch stabilen polymeren Film mit hoher Affinität zur Oberfläche des Trägers bedeckt ist, wird durch ein Verfahren erhalten, das die folgenden Schritte umfasst:

  • • Herstellung einer Suspension durch In-Kontakt-Bringen eines Trägers mit dem Reaktionsgemisch, das wenigstens ein oder mehrere Monomere und ein oder mehrere Dotierungsmittel enthält (wie es in US-A-5,281,363 offenbart ist, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird);
  • • Zugabe eines Oxidationsmittels zu der hergestellten Suspension;
  • • Polymerisation von Monomeren auf der Oberfläche des Trägers.

Der chemisch stabile polymere Film ist ein solcher, wie er offenbart ist in [V. Kobryanski et al. "Izutchenie mechanizma reaktcii kondensatcii anilina na primere polutcheniya vodorastvorimogo polimera" Vysokomolekulyarnye soedineniya, A, 37, 35-38 (1995)] bzw. [Wu Shuizhu et al. "Diffusion-controlled Deposition of Polyaniline onto Poly(methylmethacrylate) Substrates"; Polymer International, 47, 335-339 (1998); E. Tassi et al. "A Conductive and Electroactive Elastomer: A Polyaniline – Nitrilic Rubber Composite"; J. Chem. Soc., Chem. Commun., 155-156 (1990); B. Vincent et al. "Colloidal Dispersions of Electrically-conducting, Spherical Polyaniline Particles"; J. Chem. Soc., Chem. Commun., 683-684 (1990); US-Patent 5,176,851; 1/1993, Barry et al.; 252/500; V. Shevchenko et al. "Electron Microscopy and X-Ray Diffraction Studies of Polyaniline Films"; Synthetic Metals, 37, 69-71 (1990)].

Poröse oder nichtporöse anorganische Materialien, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die anorganische Metalloxide, wie Oxide von Aluminium, Titan, Zirconium, Silicium und/oder Eisen, umfasst, sowie poröse oder nichtporöse organische Materialien, wie Teilchen oder Oberflächen aus linearem oder vernetztem Polystyrol, Polyethylen und Polyacrylat, können als Träger des in der Erfindung zu verwendenden zusammengesetzten Sorbens verwendet werden. Besonders bevorzugt ist poröses Glas, z.qB. Glas mit kontrollierter Porosität (CPG). Typischerweise wird CPG mit einer Porengröße im Bereich von 10 bis 200 nm verwendet.

Die Bildung des Polyanilinfilms auf der Trägeroberfläche erfolgt unter Bedingungen, die die Bildung einer festen [C. Fasomg et al. "Study on the Crystallinity of Polyaniline", Mol. Cryst. Liq. Cryst., 160, 175-184 (1988)], stabilen Schicht aus unverzweigten Polymermolekülen gewährleisten. Das Trägermaterial wird in ein Reaktionsgefäß gefüllt und vorzugsweise unter Vakuum gesetzt. Dann wird ein auf Wasser basierendes oder organische Lösungsmittel enthaltendes Reaktionsgemisch sukzessive in das Reaktionsgefäß eingeführt und mit dem Trägermaterial in Kontakt gebracht. Das Reaktionsgemisch kann ein oder mehrere substituierte oder unsubstituierte Anilinmonomere enthalten, die mit einem oder mehreren Dotierungsmitteln dotiert sind.

Zur Durchführung der Polymerisation wird vorzugsweise eine wässrige Lösung eines Oxidationsmittels, insbesondere Ammoniumpersulfat, Kaliumpersulfat, Natriumvanadat, Peroxodisulfat, Dicumylperoxid, Alkylhydroperoxid, hinzugefügt, und das System wird 1 bis 3 h lang bei –5°C bis 25°C inkubiert. Nach der Inkubation wird die innere und äußere Oberfläche des porösen anorganischen Materials mit Polyanilin oder Derivaten bedeckt. Nicht umgesetzte Komponenten werden durch Filtration entfernt, das Sorbens wird gewaschen und dann im Vakuum getrocknet.

Das gemäß der Erfindung zu verwendende zusammengesetzte Sorbens kann zur Abtrennung von DNA aus einer Lösung, die DNA und Proteine umfasst, verwendet werden. Daher wird eine chromatographische Säule oder Kartusche mit dem zusammengesetzten Sorbens gefüllt. Das zusammengesetzte Sorbens verhält sich ähnlich wie andere feste chromatographische Träger, so dass die Verfahren zum Befüllen von chromatographischen Säulen oder Kartuschen analog verwendet werden können. Das zusammengesetzte Sorbens kann auch in Form eines membranartigen Gegenstands hergestellt werden, der den Verbundstoff der Erfindung umfasst, wobei das zusammengesetzte Sorbens in eine poröse polymere oder anorganische Matrix eingebettet ist.

Zur leichten Verwendung ist es vorteilhaft, den erfundenen Verbundstoff in loser Form, in eine chromatographische Säule oder Kartusche vorgepackt oder als membranartigen Gegenstand in Kombination mit Filtermaterialien, Reagentien und/oder Puffern oder anderen Vorrichtungen oder Chemikalien, die zur Durchführung von Probenvorbereitungen und chromatographischen Trennungen benötigt werden, zum Beispiel in Form eines Kits, bereitzustellen.

Die chromatographische Trennung unterliegt keiner Einschränkung in Bezug auf den Maßstab. Sie kann bei jedem chromatographischen Arbeitsschritt für die Isolierung oder Reinigung von DNA aus einer Lösung, die DNA und Proteine enthält, im präparativen oder analytischen Maßstab verwendet werden.

Die Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen erläutert, die nicht einschränkend gemeint sind.

Beispiel 1

Eine Menge von 2,5 bis 15 g des porösen Trägers (z.B. Glas mit kontrollierter Porosität) mit einem mittleren Porendurchmesser von 10 bis 200 nm und einer mittleren spezifischen Oberfläche von 30 bis 130 m2/g wird in eine Glasampulle (Reaktionsgefäß) übergeführt. Die Ampulle wird mit einer Vakuumquelle und über ein Ventil mit einem Reservoir verbunden, das 30 ml einer wässrigen Lösung der Monomere (1-4 &mgr;l/m2 CPG-Oberfläche) und des Dotierungsmittels (HCl) in einem Stoffmengenverhältnis von 1:3 enthält. Ein Vakuum von 10 mbar wird an die Ampulle angelegt. Wenn die Trägerteilchen sich nicht mehr bewegen (nach ungefähr 20 min), wird die monomerhaltige Lösung von unten her in die Ampulle gefüllt, während die Leitung zur Vakuumquelle geschlossen ist. Während dieses Schritts benetzt die Monomerlösung den Träger und dringt in die Poren der Trägerteilchen ein. Dann wird das Ventil zum Monomerreservoir geschlossen. Der nächste Schritt muss so schnell wie möglich durchgeführt werden. Unter Atmosphärendruck werden 20 ml einer Oxidationsmittellösung (0,005 bis 0,008 g/m2 CPG-Oberfläche) unter Mischen in die Ampulle gegeben. Das Mischen wird 0,5-3 h lang bei 20°C fortgesetzt. Nach den ersten 10-15 min wird die Farbe der Suspension Dunkelblau. Am Ende des Vorgangs wechselt die Farbe der Suspension nach Dunkelgrün. Das Produkt wird aus der Ampulle entnommen und dann mit Wasser (40 ml pro Gramm) gewaschen und dann 3 h lang in 1 M Ammoniumhydroxid (20 ml pro Gramm) inkubiert. Die Farbe des zusammengesetzten Sorbens wird Dunkelblau. Danach wird das Sorbens gründlich mit 50-Vol.-%igem Methanol in Wasser (100 ml pro Gramm) gewaschen und 17 h lang in einem Vakuumofen bei 60°C getrocknet.

Beispiel 2

10 g NPO mit einer spezifischen Oberfläche von 33 m2/g ("GORKOVKIY Khimitcheskiy Zavod", Nigniy Novgorod, Russland) werden in eine Ampulle gefüllt und 20 min lang evakuiert. Dann wird zuerst eine wässrige Lösung von Monomeren mit Dotierungsmittel (HCl) (0,924 ml Anilin pro g Träger) und dann eine Lösung von Oxidationsmittel (0,226 g Ammoniumpersulfat pro g MPS-Träger) hinzugefügt. Alle Schritte werden wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Reaktion wird 2 h lang unter Rühren fortgesetzt.

Nach der Reaktion wird das Sorbens in einen Trichter mit einer Glasfilterscheibe übergeführt und mit 0,4 l Wasser gewaschen und 3 h lang in 0,2 l Ammoniumhydroxid inkubiert. Danach wird das Produkt auf dem Trichter mit der Glasfilterscheibe mit 0,8 l Wasser gewaschen und 17 h lang in einem Vakuumofen bei 60°C getrocknet. Die Farbe des Produkts ist Dunkelblau.

Beispiel 3

Die Beschichtung erfolgt analog zu dem Verfahren, das oben in Beispiel 2 beschrieben ist. Die Reaktionszeit beträgt 3 h.

  • Träger: 10 g MPS-2000 GC (mittlere Porengröße 200 nm, mittlere spezifische Oberfläche 33 m2/g, NPO ("GORKOVKIY Khimitcheskiy Zavod", Nigniy Novgorod, Russland).
  • Menge des Anilins in Wasser: 0,93 ml/g Träger.

Beispiel 4

Das Verfahren ist wie in Beispiel 3.

  • Träger: 10 g MPS-1150 GC (mittlere Porengröße 100 nm, mittlere spezifische Oberfläche 39 m2/g, NPO ("GORKOVKIY Khimitcheskiy Zavod", Nigniy Novgorod, Russland).
  • Menge des Anilins in Wasser: 1,1 ml/g Träger.

Beispiel 5

Das Verfahren ist wie in Beispiel 3.

  • Träger: 10 g MPS-250 GC (mittlere Porengröße 24 nm, mittlere spezifische Oberfläche 34 m2/g, NPO ("GORKOVKIY Khimitcheskiy Zavod", Nigniy Novgorod, Russland).
  • Menge des Anilins in Wasser: 0,95 ml/g Träger.

Beispiel 6

Das Verfahren ist wie in Beispiel 3.

  • Träger: 10 g CPG-10-240 (Fluka, mittlere Porengröße 24,2 nm, mittlere spezifische Oberfläche 88,1 m2/g.
  • Menge des Anilins in Wasser: 2,47 ml/g Träger.

Beispiel 7

Das Verfahren ist wie in Beispiel 3.

  • Träger: 10 g CPG-10-500 (Fluka, mittlere Porengröße 52 nm, mittlere spezifische Oberfläche 48,6 m2/g.
  • Menge des Anilins in Wasser: 1,36 ml/g Träger.

Beispiel 8

Das Verfahren ist wie in Beispiel 3.

  • Träger: 10 g CPG-10-1000 (Fluka, mittlere Porengröße 97,2 nm, mittlere spezifische Oberfläche 37,9 m2/g.
  • Menge des Anilins in Wasser: 1,06 ml/g Träger.

Beispiel 9

Eine Menge von 0,3-0,5 g Sorbens in TE-Puffer (0,02 M Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) wird 0,5 h lang entgast, und das Gemisch wird in eine Kartusche übergeführt und mit wenigstens 20 Vol. TE-Puffer äquilibriert. 200 &mgr;l einer Probe, die das Plasmid pBR322, RNA und Proteine in TE-Puffer enthält, werden in die Kartusche übergeführt. Die Kartusche wird mit TE-Puffer eluiert, und 200-&mgr;l-Fraktionen des Eluats werden aufgefangen. Die gereinigte DNA ist in der ersten Fraktion enthalten, wie spektrophotometrisch und durch Gel-Elektrophorese (0,8% Agarose-Gel) gezeigt werden kann. RNA und Proteine können mit 50% Methanol eluiert werden.

Beispiel 10

Das zusammengesetzte Sorbens wird wie in Beispiel 9 hergestellt und in eine Säule (Länge 10 cm, Innendurchmesser 4 mm) eingefüllt. Eine Probe von 200 &mgr;l, die 2 mg pBR 322, RNA und Proteine enthielt, wird auf die Säule übergeführt und chromatographisch aufgetrennt (Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min).

Der Eluent ist ein A-B-Gradient:

A: 10 mM Tris-HCl pH 7,5

B: A + Isopropanol

0-5 min: 100% A, 0% B

5-12,5 min: 80% A, 20% B

12,5-20 min: 0% A, 70% B

Die mechanische Stabilität des Sorbens bietet aufgrund der mechanischen Eigenschaften des anorganischen Trägers die Möglichkeit zur Verwendung als Füllungen in Kartuschen und Säulen und für Reinigungen in einem diskontinuierlichen Format (Teilchensuspension).

Prüfung der Sorbentien A. Quecksilberporometrie

Die Porogramme, die durch Testen der auf MPS-2000, MPS-1150 und MPS-250 beruhenden Sorbentien erhalten wurden, zeigen eine gleichmäßige Verteilung der Poren, die von der Porengröße des Ausgangsmaterials abhängt. Die mittlere Beschichtungsdicke der polymeren Schicht beträgt 50-75 Å

• Bestimmung der Hydrolysestabilität

Proben des auf polyanilinbeschichtetem MPS beruhenden Sorbens und eine Probe des unmodifizierten MPS wurden 16 h lang unter basischen Bedingungen (pH 11) inkubiert und zentrifugiert (3000 U/min, 1 min). Aliquote des Überstands wurden entnommen und mit einer Lösung von Ammoniummolybdat und Schwefelsäure gemischt. Spektren dieser Gemische wurden aufgenommen. Ein Peak bei &lgr; = 320 nm weist auf die Anwesenheit von Silicomolybdänsäure hin, die gebildet wird, wenn Siliciumionen unter basischen Bedingungen aus den Teilchen herausgelöst werden. Unmodifizierte Trägerteilchen zeigten den höchsten Peak. Die kleinsten Peaks bezogen sich auf diejenigen oberflächenmodifizierten Teilchen, die 3 h lang beschichtet worden waren. Die Hydrolysestabilität dieser Sorbentien war auf das 2,5- bis 21fache gestiegen.

Die beschriebenen modifizierten Sorbentien (auf der Grundlage von MPS-250 GC, MPS-1150 GC, MPS-2000 GC und CPG-10-500) wurden für die Reinigung von genomischer DNA aus Lysaten von Escherichia coli verwendet.

  • 1. Eine Übernachtkultur des Stammes E. coli JM 109 (50 &mgr;l Bakterienzellen, 10 ml Medium, 37°C) wurde durchgeführt.
  • 2. Von dieser Kultur wurde 1 ml in Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert.
  • 3. Nach der Entfernung des Überstands wurde das Bakteriensediment in 100 &mgr;l Puffer 1 (2 mg/ml Lysozym, 2 mM CaCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7,9, 4% Saccharose) suspendiert.
  • 4. Für die Zelllyse wurde die Suspension 8 min lang bei 60°C inkubiert.
  • 5. 100 &mgr;l Puffer 2 wurden hinzugefügt (1% MIRA Tensid-Mix, 1,5 mM EDTA), und es wurde auf Raumtemperatur abgekühlt.
  • 6. Das Gemisch wurde 10 min lang bei Raumtemperatur geschüttelt und weitere 5 min lang ohne Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert.
  • 7. Das Gemisch wurde 2 min lang mit 13 000 U/min zentrifugiert.
  • 8. Der Überstand wurde auf eine mit Sorbens gepackte Säule gegeben und mit TE-Puffer eluiert.

Herstellung und Verwendung des Sorbens

Das Sorbens wird anschließend in Methanol, 50% Methanol und Wasser benetzt und dann 0,5 h lang entgast. Der Überstand wird dekantiert, und das Sorbens wird viermal mit TE-Puffer gewaschen. Während das Sorbens in TE-Puffer gerührt wird, wird es im Vakuum in einem Exsikkator entgast. Mit dieser Suspension des Sorbens (120 mg/ml) werden Kartuschen gepackt.

Ein Bakterienlysat (siehe oben, Schritt 8) aus 1 ml Übernachtkultur wird hergestellt und auf die Kartusche pipettiert und mit TE-Puffer eluiert. Die Kartusche wird 5-10 min lang ohne Elution inkubiert. Fünf Fraktionen mit einem Volumen von 200 &mgr;l werden, unmittelbar nachdem die Kartusche zu tropfen beginnt, aufgefangen. Die Fraktionen werden weiterhin durch Agarose-Gel-Elektrophorese (0,8% Agarose in 89 mM Tris; 89 mM Borsäure; 2 mM EDTA) bei einer konstanten Stromstärke von 100 mA analysiert.

Die Gele werden mit Ethidiumbromid angefärbt. In der zweiten Fraktion findet man genomische DNA, aber keine RNA. Die DNA-haltige Fraktion wird in einem Spektrophotometer gemessen. Das Verhältnis der Extinktion A260:A280 dieser Fraktionen liegt im Bereich von 1,58 bis 1,78.


Anspruch[de]
Verwendung eines zusammengesetzten Sorbens zur Isolierung oder Reinigung von DNA aus einer Lösung, die DNA und Proteine umfasst, im analytischen oder präparativen Maßstab, wobei das Sorbens eine wenigstens partielle Beschichtung auf einem Träger aufweist, wobei die Beschichtung im Wesentlichen Polyaniline oder Derivate von Polyanilinen umfasst, die DNA im Durchfluss enthalten und das Protein an das Sorbens gebunden ist. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Träger ein anorganisches Material ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die anorganischen Metalloxide umfasst, vorzugsweise mit einer porösen Struktur, wie Oxide von Aluminium, Titan, Zirconium, Silicium und/oder Eisen. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Träger ein organisches Material ist, vorzugsweise mit einer porösen Struktur, wie Teilchen oder Oberflächen aus linearem oder vernetztem Polystyrol, Polyethylen, Polyacrylat. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei den Derivaten von Polyanilin um substituierte oder unsubstituierte Alkylaniline, aromatische Systeme, Ethylanilin, Propylanilin und/oder Ethoxyanilin handelt. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei eine chromatographische Säule, Kapillare oder Kartusche wenigstens teilweise mit dem zusammengesetzten Sorbens gemäß Anspruch 1 gefüllt wird. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei ein membranartiger Gegenstand ein zusammengesetztes Sorbens gemäß Anspruch 1 umfasst, wobei das zusammengesetzte Sorbens in eine poröse polymere oder anorganische Matrix eingebettet ist. Verwendung eines Kits, der ein zusammengesetztes Sorbens gemäß Anspruch 1 umfasst, wobei das zusammengesetzte Sorbens in loser Form oder in chromatographische Säulen oder Kartuschen gemäß Anspruch 5 verpackt oder als membranartiger Gegenstand gemäß Anspruch 6 vorliegt, gegebenenfalls in Kombination mit Filtermaterialien, Reagentien und/oder Puffern oder anderen Vorrichtungen oder Chemikalien zur Durchführung von Probenvorbereitungen oder chromatographischen Abtrennungen von DNA aus Lösungen, die DNA und Proteine umfassen.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com