PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69636739T2 18.10.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000943690
Titel VERFAHREN ZUR RÜCKFALTUNG VON MENSCHLICHEM ACTIVIN A
Anmelder Ajinomoto Co., Inc., Tokio/Tokyo, JP
Erfinder EJIMA, c/o Ajinomoto Co., Daisuke, Kawasaki-shi, Kanagawa-ken 210, JP;
ONO, c/o Ajinomoto Co., Kunio, Kawasaki-shi, Kanagawa-ken 210, JP;
SASAKI, c/o Ajinomoto Co., Michiro, Kawasaki-shi, Kanagawa-ken 210, JP;
ETO, c/o Ajinomoto Co., Yuzuru, Kawasaki-shi, Kanagawa-ken 210, JP;
TSUCHIYA, c/o Ajinomoto Co., Shigekatsu, Kawasaki-shi, Kanagawa-ken 210, JP
Vertreter Strehl, Schübel-Hopf & Partner, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69636739
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 19.12.1996
EP-Aktenzeichen 969425735
WO-Anmeldetag 19.12.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/JP96/03700
WO-Veröffentlichungsnummer 1997023638
WO-Veröffentlichungsdatum 03.07.1997
EP-Offenlegungsdatum 22.09.1999
EP date of grant 29.11.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 18.10.2007
IPC-Hauptklasse C12P 21/02(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Rückfalten von denaturiertem humanem Activin A zu humanem Activin A eines natürlichen Typs mit biologischer Aktivität. Humanes Activin vom Naturtyp ist ein nützliches Protein, von dem erwartet wird, dass es in pharmazeutischen Zubereitungen etc. ein gesetzt werden kann.

Hintergrund der Erfindung

Humanes Activin A ist ein Homodimerprotein, welches aus zwei Polypeptidketten besteht, die aus 116 Aminosäuren aufgebaut sind, isoliert aus einem Kulturüberstand von dem humanen Leukämiezellstamm THP-1 (IFO 50147). Das Molekulargewicht beträgt etwa 25000 Dalton, das Polypeptid enthält 9 Cys-Reste (d.h. 18 Cys-Reste in dem Dimer), und es gibt 9 intramolekulare und intermolekulare Disulfidbindungen (Biochemical and Biophysical Research Communications, 142, 1095–1103, 1987).

Humanes Activin A wird gereinigt und hergestellt durch wiederholtes Unterziehen eines Kulturüberstands, erhalten durch Stimulation von humanen myelozytischen Leukämiezellen THP-1 (IFO 50147) mit Phorbolester, einer Mehrstufenchromatographie, Ausfällung und einem Konzentrationsvorgang ("Saibo Kogaku" (Cell Engineering), oder eines Kulturüberstands von rekombinanten CHO-Zellen, die humanes Activin A stark produzieren, erhalten durch Einführen eines Expressionsvektors mit humaner Activin A-cDNA (Biochemical and Biophysical Research Communications, 151, 230–235, 1988). Es gibt jedoch viele Probleme, wo das Herstellungsverfahren, welches die Reinigung von Kulturüberständen als Ausgangsmaterial, abgeleitet von T-Zellen, beinhaltet, als industrielles Herstellungsverfahren eingesetzt wird.

Das heißt, (1) da Verunreinigungen, die durch Tierzellen als produzierendem Wirt ausgeschieden wurden, oder sich von fötalem Rinderserum etc. ableiten, die zuvor als Mediumbestandteile zugegeben wurden, hochgradig entfernt werden sollten, ist die Ausbeute an gereinigtem humanem Activin A extrem niedrig; (2) im Vergleich mit dem Fall, wo rekombinante Mikroorganismen als produzierender Wirt verwendet werden, ist die Produktivität extrem niedrig, und es sind hochgradig produktive Tierzellen oder Kulturvorrichtungen nötig, um das Ausgangsmaterial ausreichend zur Reinigung zuzuführen; und (3) um den produzierenden Wirt zu kultivieren, sollte eine hohe Konzentration an fötalem Rinderserum zugegeben werden, oder ein Serum-freies Medium, welches Wachstumsfaktoren etc. enthält, sollte verwendet werden. Diese sind jedoch sehr teuer, und es gibt ein Problem bezüglich der stabilen Erhältlichkeit einer konstanten Qualität, die zur Produktion notwendig ist. Wie oben beschrieben ist, gibt es Probleme bezüglich der geringen Produktivität etc., wenn humanes Activin A unter Verwendung von T-Zellen hergestellt wird, und es ist notwendig, diese Probleme zu lösen, um ein industrielles Herstellungsverfahren zu etablieren.

Herkömmlicherweise sind verschiedene Versuche zur Lösung dieser Probleme unternommen worden. Wenn ein Mikroorganismus, wie z.B. rekombinantes E. coli etc., als produzierender Wirt verwendet wird, ist dessen Proteinproduktivität im allgemeinen 100-fach oder mehr im Vergleich mit derjenigen von T-Zellen verbessert, so dass der Austausch von T-Zellen durch Mikroorganismen als produzierendem Wirt eine effektive Maßnahme zur Verbesserung der Produktivität ist. Die Produktion von humanem Activin A durch E. coli führt jedoch häufig zu denaturiertem humanem Activin A mit verschiedenen intramolekularen und/oder intermolekularen Disulfidbindungen im Vergleich zu denjenigen des natürlichen Typs (europäische Patentanmeldungs-Veröffentlichtung (EP 0222491), japanische offengelegte Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 119679/88).

In der Verwendung hier bezieht sich denaturiertes humanes Activin A auf Moleküle mit der Polypeptidkette von humanem Activin A, wobei jedoch dessen Tertiärstruktur und biologische Aktivität verloren gegangen sind, z.B. solche, bei denen intramolekulare und/oder intermolekulare Disulfidbindungen gespalten wurden, wodurch die Tertiärstruktur unter Bildung einer Monomerstruktur gelockert wurde, solche, bei denen die Disulfidbindungen in eine Struktur überführt wurden, die sich in vom natürlichen Typ unterscheidet, oder solche, die über zusätzliche intermolekulare Disulfidbindungen polymerisiert sind.

Da ein derartiges denaturiertes humanes Activin A keine biologische Aktivität aufweist, sollte das Molekül rekonstituiert (zurückgefaltet) werden, so dass es die gleiche Tertiärstruktur wie das Naturtypprotein aufweist. Es ist jedoch nicht einfach oder sogar unmöglich, einige Proteine rückzufalten, so dass es sehr schwierig ist, deren Rückfaltebedingungen zu bestimmen. Selbst nach Untersuchung ist es nicht immer möglich, geeignete Rückfaltebedingungen zu bestimmen, insbesondere für bestimmte polymere Proteine oder Proteine, die eine große Zahl von Disulfidbindungen enthalten, was die Bestimmung der Rückfaltungsbedingungen erschwert.

Humanes Activin A vom natürlichen Typ besitzt 9 intramolekulare und intermolekulare Disulfidbindungen, so dass es extrem schwierig ist, die Bedingungen für die Rückfaltung des denaturierten humanen Activins A zu bestimmen, und es gibt keinen Stand der Technik bezüglich des Verfahrens zur Rückfaltung von humanem Activin A. Derweil haben A. J. Mason et al. die Beziehung zwischen der Effizienz der sekretorischen Expression von Activin A durch Verwendung von T-Zellen und der Struktur eines Expressionsvektors dafür untersucht und berichtet, dass neben einer Region für die Aminosäuresequenz von Activin A eine Prosequenzregion zum Rückfalten und zur Sekretion von Activin A essentiell ist und nur die Region für die Aminosäuresequenz von Activin A alleine eine Rückfaltung oder Sekretion nicht bewirkt (Science, 247, 1328–1330, 1990). Dieser Bericht deutet darauf hin, dass die Rückfaltung von denaturiertem humanem Activin A, das durch Mikroorganismen als produzierendem Wirt exprimiert wird, sehr schwierig ist.

Buchner et al., in Analytical Biochemistry 205, 263–270 (1992) und EP 364 926 A2, offenbaren, dass Arginin bezüglich der Rückfaltung von Immunglobulinen und deren fragmentalen Polypeptiden und Fusionsproteinen sowie von tPA (Gewebeplasminogenaktivator) und tPA-bezogenen Proteinen wirksam ist.

D. Arora und N. Khanna, in Journal of Biotechnology 52 (1996), 127–133, offenbaren, dass die Rückfaltung von humanem gamma-Interferon unter Verwendung von 0,5 M Arginin effektiv unterstützt wird.

Orsini et al., The Journal of Biological Chemistry Vol. 253, Nr. 10, 25. Mai 1978, S. 3453–3458, offenbaren die Rückfaltung von Chymotrypsinogen A, worin ein denaturiertes Protein, welches in einem starken Proteindenaturierungsmittel extrahiert wird (Guanidinhydrochlorid, Harnstoff), mit einem moderaten Denaturierungsmittel bis auf eine bestimmte Konzentration verdünnt wird, wozu ein Thioldisulfidreagens zugegeben wird, um intramolekulare Disulfidbindungen zu bilden.

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Rückfalten von denaturiertem humanem Activin A, welches durch Mikroorganismen produziert wird, zu humanem Activin A vom natürlichen Typ mit biologischer Aktivität bereitzustellen, um eine industrielle Produktion von humanem Activin A zu ermöglichen.

Offenbarung der Erfindung

Als Ergebnis der Untersuchungen zur Lösung dieser Probleme haben die vorliegenden Erfinder ein Verfahren zum Rückfalten von denaturiertem humanem Activin A zu biologisch aktivem humanem Activin A vom Naturtyp bereitgestellt, welches die folgenden Schritte (a) und (b) beinhaltet:

  • (a) den Schritt des Schützens von Thiolgruppen in solubilisiertem, denaturiertem humanem Activin A, bei dem alle Thiolgruppen frei sind, mit Glutathion und/oder Natriumsulfit; und
  • (b) den Schritt des Durchführens einer Austauschreaktion von Disulfitbindungen durch Dialysieren der geschütztes, denaturiertes humanes Activin A enthaltenden Lösung gegen einen Rückfaltungspuffer und anschließend Zugeben einer Thiolverbindung dazu; oder
  • (a) den Schritt des Schützens von Thiolgruppen in solubilisiertem, denaturiertem humanem Activin A, bei dem alle Thiolgruppen frei sind, mit Glutathion und/oder Natriumsulfit; und
  • (b) den Schritt des Durchführens einer Austauschreaktion von Disulfitbindungen durch Austausch des Puffers für die geschütztes denaturiertes humanes Activin A enthaltenden Lösung durch einen Rückfaltungspuffer, enthaltend eine Diolverbindung,
worin der Rückfaltungspuffer unten definiert ist.

Spezifisch betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Rückfalten von denaturiertem, humanem Activin A zu humanem Activin A vom Naturtyp mit einer Differenzierungs-induzierenden Aktivität für Friend-Leukämiezellen, umfassend die folgenden Schritte:

  • (a) den Schritt des Schützens von Thiolgruppen in solubilisiertem denaturiertem humanem Activin A, bei dem alle Thiolgruppen frei sind, mit Glutathion und/oder Natriumsulfit;
  • (b) den Schritt des Durchführens einer Austauschreaktion von Disulfidbindungen durch Dialysieren der geschütztes denaturiertes humanes Activin-A enthaltenden Lösung gegen den Rückfaltungspuffer und anschließend Zugabe einer Thiolverbindung dazu,
oder
  • (a) den Schritt des Schützens von Thiolgruppen in solubilisiertem denaturiertem humanem Activin A, bei dem alle Thiolgruppen frei sind, mit Glutathion und/oder Natriumsulfit;
  • (b) den Schritt des Durchführens einer Austauschreaktion von Disulfidbindungen durch Austausch des Puffers für die geschütztes denaturiertes humanes Aktivin A enthaltende Lösung durch den Rückfaltungspuffer, enthaltend eine Thiolverbindung,
wobei der Rückfaltungspuffer a) ein Puffer ist, der ein Reagenz enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 0,53% TDCA/Na; 0,13% TDCA/Na, 9,8%, 2% oder 0,49% CHAPS, 10% oder 2,1% CHAPSO, 2,5 oder 0,6% CA/Na, 4,2%, 0,9 oder 0,2% DCA/Na, 1,6% oder 0,38% TCA/Na, 0,12% Digitonin, 4,0% NG, sowie 0,5- bis 2-fach höheren Konzentrationen als die angegebenen Prozentwerte, wobei dieser eine Pufferwirkung im Bereich von pH 7,5 bis 10,5 aufweist,

oder b) ein Puffer ist, der 0,13% TDCA/Na enthält und weiterhin ein Reagenz enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 1,0 M Argininhydrochlorid; 0,5 M Argininhydrochlorid, 1,0 M oder 0,5 M Magnesiumacetat, 1,0 M oder 0,5 M Lithiumchlorid, 1,0 M Natriumchlorid, 1,0 M Ammoniumchlorid, 1,0 M Lithiumbromid, und 0,5- bis 2-fach höheren Konzentrationen als die angegebenen Molwerte, wobei dieser eine Pufferwirkung im Bereich von pH 7,5 bis 10,5 aufweist,

wobei der Puffer a) oder b) 20 mT Tris-HCl, pH 8,5, und 0,1 bis 3 M Harnstoff oder 0,05 bis 2 M Guanidinhydrochlorid enthält.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die biologische Aktivität von denaturiertem humanem Activin A wirksam rückgebildet werden.

Beste Ausführungsform der Erfindung

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.

Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausgangsmaterial ist eine Kultur, die denaturiertes humanes Activin A enthält, erhalten durch Kultivieren eines Mikroorganismus mit einem darin integrierten humanen Activin A-Gen, z.B. rekombinantes E. coli. Wenn E. coli als produzierender Wirt verwendet wird, ist fast das gesamte humane Activin A als unlösliche Körnchen in dem Mikroorganismus angehäuft, und die Körnchen können so als Ausgangsmaterial verwendet werden.

Die unlöslichen Körnchen von humanem Activin A, welche auf übliche Weise gewonnen wurden, werden in einer wässerigen Lösung von EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) bei niedriger Konzentration (1 bis 10 mM) suspendiert und dann mit dem Proteindenaturierungsmittel Guanidinhydrochlorid und/oder Harnstoff solubilisiert. Die Konzentrationen an Guanidinhydrochlorid und Harnstoff sind jeweils 4 bis 7 M und 6 bis 10 M, was allgemein zur Denaturierung von Protein erforderlich ist. Die Konzentration von humanem Activin A ist nicht besonders eingeschränkt, eine so hohe Konzentration wie möglich ist jedoch für den nachfolgenden Vorgang bevorzugt. Weiterhin wird der pH-Wert bevorzugt bei 6 oder weniger gehalten, um eine Bildung von unnötigen Bindungen zu verhindern. Der Solubilisierungsvorgang wird durch Rühren bei Raumtemperatur für 2 bis 4 Stunden vervollständigt.

Anschließend wird ein Reduktionsmittel bei einer Konzentration von 1 bis 100 mM, bevorzugt 5 bis 40 mM, zu der Lösung von solubilisiertem humanem Activin A gegeben, und das Gemisch wird mit 20 mM Tris-HCl auf pH 8 bis 9 eingestellt und einer Reduktionsreaktion bei 20 bis 50°C für 15 bis 360 Minuten unterzogen, um dessen Thiolgruppen freizusetzen, welches Cys-Reste sind. Es ist möglich, als das Reduktionsmittel Verbindungen wie reduziertes Glutathion, DTT (Dithiothreitol), 2-Mercaptoethanol etc. zu verwenden, wovon DTT besonders bevorzugt ist. Die Menge an zugegebenem DTT beträgt bevorzugt 5 bis 40 mM. Wenn alle Thiolgruppen in durch Mikroorganismen erzeugtem humanem Activin A frei sind, ist diese Reduktionsreaktion nicht erforderlich.

Oxidiertes Glutathion wird in einer Menge von 0,05 bis 0,3 M, bevorzugt 0,08 bis 0,16 M, zu der Lösung von solubilisiertem humanem Activin A, bei dem alle Thiolgruppen frei sind, gegeben, und das Gemisch wird bei 0 bis 50°C für 2 bis 24 Stunden oder mehr stehengelassen, wodurch die Thiolgruppen geschützt werden. Alternativ kann Natriumsulfit anstelle von oxidiertem Glutathion bei der Sulfonierung zum Schützen der Thiolgruppen verwendet werden. In diesem Fall werden zu humanem Activin A, bei dem sämtlichen Thiolgruppen freigesetzt sind, Natriumsulfit mit einer Endkonzentration von 0,05 bis 0,5 M, bevorzugt 0,08 bis 0,16 M, und gleichzeitig Natriumtetrathionat bei einer Endkonzentration von 5 bis 30 mM, bevorzugt 8 bis 16 mM, gegeben, und das Gemisch wird bei 0 bis 50°C für 2 bis 24 Stunden stehengelassen. Alternativ kann auch ein Gemisch aus oxidiertem Glutathion und Natriumsulfit verwendet werden.

Der Schutzzustand von Thiolgruppen kann durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Silicagelsäule mit chemisch gebundenen Butylgruppen bestimmt werden, wie z.B. Vydac 214TP54 (4,6ϕ × 250 mm, Separations Group) (Biochemical and Biophysical Research Communications, 142, 1095–1103, 1987). Es ist bevorzugt, dass die in dem vorangegangenen Vorgang verwendeten Reagenzien in einem Lösungsmittel gelöst sind, welches zuvor vollständig entgast wurde, wobei ein Inertgas, wie Stickstoff, Helium etc. als Gasphase über die Reaktionslösung gefüllt wird, um eine Oxidation des Sauerstoffs in der Luft zu hemmen. Um die nachfolgenden Schritte durchzuführen, wird das nicht umgesetzte Schutzreagens für Thiolgruppen bevorzugt durch Dialyse etc. aus der resultierenden Lösung von humanem Activin A mit geschützten Diolgruppen entfernt.

Die Pufferlösung für humanes Activin A mit geschützten Thiolgruppen, erhalten durch das oben beschriebene Verfahren, wird dann durch einen Rückfaltepuffer, pH 7.5 bis 10,5, ausgetauscht. Der Rückfaltepuffer, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein Puffer, welcher es erlaubt, dass die Struktur von natürlichem humanem Activin A, welches bei 0,1 mg/ml in dem Rückfaltepuffer gelöst ist, wenn es durch Reduktion mit 0,2 mM Dithiothreitol (DTT) denaturiert worden war, stabil bei 20% oder mehr als bei einem Tris-Puffer (1,5 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) gehalten wird. Der Vorgang wird unten ausführlich beschrieben. Zum Austauschen der Pufferlösung für geschütztes humanes Activin A durch den Rückfaltepuffer gibt es ein Verfahren, bei dem humanes Activin A mit geschützten Thiolgruppen auf eine Gelfiltrationssäule aufgebracht wird, z.B. Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech), die zuvor mit dem ausreichend entgasten Rückfaltepuffer äquilibriert worden war, und die Proteinfraktion rückgewonnen wird. Alternativ ist es auch möglich, ein Verfahren einzusetzen, bei dem humanes Activin A mit geschützten Thiolgruppen in eine Dialysemembran eingeführt wird, z.B. Spectra/Por-Membran Nr. 1 (Spectrum Medical Industries, Inc.) und dann gegen ein 500-faches Überschussvolumen von ausreichend entgastem Rückfaltepuffer bei 0 bis 20°C für 3 bis 24 Stunden oder mehr dialysiert wird.

Anschließend wird die Bildung von Disulfidbindungen in humanem Activin A mit geschützten Thiolgruppen durch Zugabe einer Thiolverbindung erreicht. Die Thiolverbindung wird in einer Konzentration von 1 bis 10 mM, vorzugsweise 2 bis 5 mM, zu der humanes Activin A-enthaltenden Lösung in dem Puffer gegeben, der durch den Rückfaltepuffer wie oben beschrieben ausgetauscht worden war, und das Gemisch wird bei 0 bis 50°C für 0,5 bis 14 Tage stehengelassen. Die Beendigung der Rückfaltung und die Rückbildung der biologischen Aktivität kann durch die oben beschriebene Umkehrphasen-HPLC und Messung der biologischen Aktivität (z.B. Messung der Differenzierungs-induzierenden Aktivität für Friend-Leukämiezellen, Biochemical and Biophysical Research Communications, 142, 1095–1103, 1987) bestätigt werden. Die Thiolverbindung kann eine Thiolverbindung sein, wie z.B. Cystein, reduziertes Glutathion, DTT, 2-Mercaptoethanol etc., worunter Cystein oder reduziertes Glutathion besonders bevorzugt ist. Cystein oder reduziertes Glutathion wird bevorzugt bei einer Konzentration von 2 bis 5 mM zugegeben.

Die Bildung von Disulfidbindungen kann auch gleichzeitig mit dem Austausch durch den Rückfaltepuffer initiiert werden.

Chlorwasserstoffsäure wird zu dem humanen Activin A mit geschützten Thiolgruppen gegeben, bis der pH-Wert auf 2–4 vermindert wird, womit die Austauschreaktion von Disulfidbindungen beendet wird. Es wird bei 0 bis 20°C für 3 bis 24 Stunden gegen ein 500-faches Überschussvolumen von 1 bis 100 mM Chlorwasserstoffsäure, die ein Denaturierungsmittel, wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid enthält, dialysiert, wodurch das nicht umgesetzte Schutzreagens für Thiolgruppen entfernt wird. Es wird mit dem Rückfaltepuffer verdünnt, so dass die unten beschriebenen Bedingungen erfüllt werden und dann bei 0 bis 50°C für 0,5 bis 14 Tage stehengelassen. Die obige Thiolverbindung soll zuvor bei der gleichen Konzentration wie oben zu dem Rückfaltepuffer gegeben werden, um die Bildung von Disulfidbindungen zu unterstützen.

Die Bedingungen für den Rückfaltepuffer werden auf die folgende Weise bestimmt. Es wird angenommen, dass die Rückfaltung von humanem Activin A durch Gewährleisten der Umgebung des Lösungsmittels zur Stabilisierung der Tertiärstruktur von humanem Activin A erreicht wird anstatt der Bildung einer Mutante, die zum Rückfalten geeignet ist. Die Stabilität der Struktur höherer Ordnung kann durch Messung der chemischen Stabilität abgeschätzt werden, von der angenommen wird, dass sie damit korreliert. In der Verwendung hier bedeutet die chemische Stabilität, dass keine typische Änderung auftritt, wie z.B. eine molekulare Assoziierung, eine Aggregation oder Ausfällung, bewirkt durch Transfer von ursprünglich gebildeten Disulfidbindungen in dem Molekül.

Zunächst wird in 1 mM HCl gelöstes humanes Activin A vom Naturtyp in einem Puffer, pH 7,5 bis 10,5, bestehend aus einer Kombination eines Denaturierungsmittels, eines oberflächenaktiven Mittels, Salz, einer organischen Säure, Zucker, organischen Lösungsmittel etc., gelöst. Die Konzentration von natürlichem humanem Activin A wird auf etwa 0,1 mg/mg eingestellt. Ein Reduktionsmittel (z.B. DTT, 3-Mercaptoethanol oder reduziertes Glutathion), welches etwa 50 Äquivalente, bezogen auf das natürliche humane Activin A, beträgt, wird dazu gegeben, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur für etwa 12 Stunden stehen gelassen, und die Menge an verbleibendem natürlichem humanem Activin A wird durch Umkehrphasen-HPLC bestimmt. Als Kontrolle wurde Tris-Puffer (1,5 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) verwendet, die gleiche Reaktion wie oben wurde durchgeführt, und die Menge des verbleibenden Naturtyps wurde verglichen. Die Zunahme (%) in der verbleibenden Menge durch den Rückfaltepuffer im Vergleich mit der verbleibenden Menge, wenn der Tris-HCl-Puffer (1,5 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5)) verwendet wurde, wird als Verbesserung der verbleibenden Menge ausgedrückt. Die Pufferbedingungen, die eine größere Verbesserung der Menge an verbleibendem humanem Activin A mit sich bringen, sind für eine hohe chemische Stabilität bevorzugt, d.h. zur Stabilisierung der Tertiärstruktur von humanem Activin A sowie zur Unterstützung des Rückfaltens hiervon. Verschiedene Verbindungen wurden kombiniert, um Puffer herzustellen und experimentell gescreent, und als Ergebnis wurde gefunden, dass wenn ein Puffer erlaubt, dass die Struktur von natürlichem humanem Activin A, denaturiert durch Reduktion, stabil bei 20% oder mehr als durch Tris-Puffer (1,5 n-Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) gehalten wird, dieser Puffer dann als Rückfaltepuffer geeignet ist. D.h., ein diese Bedingung erfüllender Puffer (der erlaubt, dass die Struktur stabil bei 20% oder mehr als durch den Tris-Puffer (1,5 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) gehalten wird) kann als der Rückfaltepuffer in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Spezifisch ist ein diese Bedingung erfüllender Rückfaltepuffer wie folgt:

der Rückfaltepuffer ist a) ein Puffer, enthaltend ein Reagens, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 0,53% TDCA/Na; 0,13% TDCA/Na, 9,8%, 2% oder 0,49% CHAPS, 10% oder 2.1% CHAPSO, 2,5% oder 0,6% CA/Na, 4,2%, 0,9% oder 0,2% DCA/Na, 1,6% oder 0,38% TCA/Na, 0,12% Digitonin, 4,0% NG und 0,5- bis 2-fach höhere Konzentrationen als die genannten Prozentwerte, der eine Pufferwirkung im Bereich von pH 7,5 bis 10,5 aufweist,

oder b) ein Puffer, enthaltend 0,13% TDCA/Na und weiterhin enthaltend ein Reagens, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1,0 M Argininhydrochlorid; 0,5 M Argininhydrochlorid, 1,0 M oder 0,5 M Magnesiumacetat, 1,0 M oder 0,5 M Lithiumchlorid, 1,0 M Natriumchlorid, 1,0 M Ammoniumchlorid, 1,0 M Lithiumbromid und 0,5- bis 2-fach höhere Konzentrationen als die genannten Molwerte, und mit einer Pufferwirkung im Bereich von pH 7,5 bis 10,5,

worin der Puffer a) oder b) 20 mM Tris-HCl, pH 8,5, und 0,1 bis 3 M Harnstoff oder 0,05 bis 2 M Guanidinhydrochlorid enthält.

Beispiele

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung ausführlicher unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben. In den Beispielen sind Puffer gemäß den Klassen A und B erfindungsgemäß.

Beispiel 1

Natürliches humanes Activin A, erhalten durch wiederholtes Unterziehen eines Kulturüberstands, abgeleitet von rekombinanten CHO-Zellen, einer Chromatographie (Biochemical and Biophysical Research Communications, 151, 230–235, 1988) wurde bei einer Konzentration von 2 mg/ml in 1 mM HCl hergestellt und dann bei einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml mit 12 Arten von 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5), enthaltend eine Kombination von Harnstoff (1,5 M und 3,0 M), NaCl (1,0 M und 0 M) und CHAPS (2%, 0,5% und 0 M), verdünnt. DTT wurde bei einer Endkonzentration von 0,2 mM dazugegeben, und jedes Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 12 Stunden stehen gelassen, so dass die Reduktionsreaktion ablief, und die Menge an verbleibendem humanem Activin A wurde durch Umkehrphasen-HPLC (Vydac214TP54, 4,6ϕ × 250 mm, hergestellt von Separations Group) bestimmt.

Der Puffer, der die höchste verbleibende Menge anzeigte, war 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,5, enthaltend 1,5 M Harnstoff und 2% CHAPS.

Beispiel 2

Der in Beispiel 1 gescreente Rückfaltepuffer wurde zum Rückfalten von humanem Activin A verwendet.

E. coli, in welches für humanes Activin A kodierende DNA eingeführt worden war, wurde in einem synthetischen Medium (1 L) kultiviert, und der Tryptophan-Promoter wurde mit einer Säure induziert, wodurch humanes Activin A als unlösliche Körnchen/Granulate in dem Mikroorganismus angehäuft wurden (europäische Patentanmeldungsveröffentlichung (EP0222491) und japanische offengelegte Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 119,679/88). Eine Suspension der Körnchen (1 mM EDTA, pH 6 oder weniger) wurde auf übliche Weise hergestellt, und Harnstoff wurde bei einer Endkonzentration von 8 M zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt, wodurch es durch Denaturierung (20 ml) gelöst wurde. Es wurde in 20 mM Tris-HCl, pH 8,5 zubereitet und DTT wurde bei einer Endkonzentration von 20 mM zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten erhitzt.

Nachdem durch Umkehrphasen-HPLC bestätigt worden war, dass die intramolekularen und intermolekularen Disulfidbindungen in humanem Activin A vollständig reduziert waren, wurde oxidiertes Glutathion bei einer Endkonzentration von 0,1 M zugegeben, und das Gemisch wurde bei 5°C für 15 Stunden stehengelassen. Die Bildung von gemischten Bindungen zwischen humanem Activin A und Glutathion wurde durch Umkehrphasen-HPLC bestätigt, und die Konzentration an humanem Activin A wurde in einem Verdünnungspuffer (8 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) auf 0,1 mg/ml eingestellt. Es wurde in eine Dialysemembran überführt (Spectra/Por Membran, Nr. 1, hergestellt von Spectrum Medical Industries, Inc.) und bei 5°C für 15 Stunden gegen ein 500-faches Überschussvolumen des Rückfaltepuffers (1,5 M Harnstoff; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5; 2% CHAPS), das in Beispiel 1 gewählt worden war, dialysiert.

Cystein wurde bei einer Endkonzentration von 3 mM zu dem Dialysat gegeben, welches dann bei 5°C für 3 Tage stehen gelassen wurde. Eine Rekonstitution der Tertiärstruktur von humanem Activin A wurde durch Messung der biologischen Aktivität (Differenzierungs-induzierende Aktivität für Friend-Leukämiezellen) bestätigt. Als ein Ergebnis konnte bestätigt werden, dass 24% der eingeführten Masse an denaturiertem humanem Activin A die biologische Aktivität (Differenzierungs-induzierende Aktivität für Friend-Leukämiezellen) aufwies.

Es wurde mit 10% TFA (Trifluoressigsäure) auf pH 3 eingestellt und mittels Umkehrphasen-HPLC (Vydac214TP54, 4,6ϕ × 250 mm, hergestellt von Separations Group; Elution mit einem Acetonitrilgradienten) gereinigt, bis eine elektrophoretisch einzelne Komponente vorlag.

Beispiel 3

Die in Tabelle 1 gezeigten Reagenzien wurden mit den angegebenen Konzentrationen zu dem Tris-HCl-Puffer (1,5 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) gegeben, und diese wurden in einer Reduktionsreaktion bei Raumtemperatur für 12 Stunden anstelle des Tris-HCl-Puffer in Beispiel 1 verwendet, und die Menge des verbleibenden natürlichen, humanen Activin A wurde unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Zunahme (%) der verbleibenden Menge bei jedem Rückfaltepuffer im Vergleich mit der verbleibenden Menge bei dem Tris-HCl-Puffer alleine (1,5 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) bei Verwendung in der Reduktionsreaktion wird als die Verbesserung der verbleibenden Menge ausgedrückt. Als ein Ergebnis wurde ermittelt, dass in Abhängigkeit der Typen von verwendeten Reagenzien ein grosser Unterschied bezüglich der Verbesserung (%) der verbleibenden Menge besteht. D.h., es wurde ermittelt, dass die Zugabe der Reagenzien in Klasse A oder B zu einer Verbesserung der Menge des verbleibenden natürlichen humanen Activin A führte, und insbesondere die Zugabe von 0,53% TDCA/Na-Salz zu einer signifikanten Verbesserung der verbleibenden Menge führte. Die Puffer gemäß den Klassen A und B sind gemäß der Erfindung, während die anderen Puffer Referenzbeispiele sind.

Tabelle 1 Verbesserung der Menge an verbleibendem natürlichem humanem Activin A in der Reduktionsreaktion

Abkürzungen

  • CA/Na:
    Cholsäure-Natriumsalz
    CHAPS:
    3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylamino]-1-propansulfonat
    CHAPSO:
    3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylamino]-2-hydroxy-1-propansulfonat
    CTAC:
    Cethyltrimethylammoniumchlorid (Hexadecyltrimethylammoniumchlorid)
    DCA/Na:
    Deoxycholsäure-Natriumsalz
    NG:
    n-Nonyl-&bgr;-D-glucopyranosid
    OG:
    n-Octyl-&bgr;-D-glucopyranosid
    SB-12:
    N-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonium-1-propansulfonat
    SDS:
    Natriumdodecylsulfat (Natriumlaurylsulfat)
    Span 80:
    Sorbitanmonooleat
    TCA/Na:
    Taurocholsäure-Natriumsalz
    TDCA/Na:
    Taurodeoxycholsäure-Natriumsalz
    Triton X-100:
    Polyethylenglycol-mono-p-isooctylphenylether
    Tween 20:
    Polyoxyethylensorbitan-monolaurat
    Tween 80:
    Polyoxyethylensorbitan-monooleat
    Sarcosyl:
    N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz

Dann wurde Tris-HCl-Puffer (1,5 Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5), dem jedes in Tabelle 1 gezeigte Reagens zugegeben wurde, als der Rückfaltepuffer verwendet, und die Rückfaltung von in E. coli produziertem denaturiertem humanen Activin A wurde gemäß Beispiel 2 erreicht. Als Ergebnis wurde für den Fall, wo die Reagenzien (D, E), welche die Menge an verbleibendem natürlichem humanen Activin A nicht änderten oder verminderten, verwendet wurden, die Rückbildung der biologischen Aktivität (Differenzierungs-induzierende Aktivität für Friend-Leukämiezellen) überhaupt nicht beobachtet, wohingegen in dem Fall, wo die Reagenzien (A, B, C) verwendet wurden, welche die verbleibende Menge erhöhten, die Rückbildung der biologischen Aktivität mit der Verbesserung der verbleibenden Menge korrelierte, d.h. ein Fortschreiten der Rückfaltung wurde beobachtet (Tabelle 2). Insbesondere war der Puffer, dem Reagenzien in den Klassen A und B zugegeben worden waren, als Rückfaltepuffer wirksam. Es versteht sich also, dass wenn das natürliche humane Activin A durch Reduktion denaturiert wurde, dieses mit dem Puffer als Rückfaltepuffer wirksam rückgefaltet werden kann, der in der Lage ist, stabil 20% oder mehr dieser Struktur beizubehalten.

Diese Ergebnisse zeigten, dass ein zum Rückfalten geeigneter Puffer durch Untersuchung der verbleibenden Menge in der Reaktion der Reduktion und Denaturierung gescreent werden kann.

Tabelle 2 Biologische Aktivität nach Rückfalten

Beispiel 4

Die in Tabelle 3 gezeigten Reagenzien wurden zu dem Tris-HCl-Puffer (1,5 M Harnstoff, 0,13% TDCA/Na, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5), enthaltend 0,13% TDCA/Na, von dem in Beispiel 3 bestätigt wurde, dass er effektiv war, gegeben, und die resultierenden Puffer wurden in der Reduktionsreaktion bei Raumtemperatur für 12 Stunden anstelle des Tris-Puffers in Beispiel 3 verwendet, und die Menge des verbleibenden natürlichen, humanen Activin A wurde unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Zunahme (%) der verbleibenden Menge bei jedem Rückfaltepuffer im Vergleich mit der verbleibenden Menge, wenn der Tris-HCl-Puffer (1,5 M Harnstoff, 0,13% TDCA/Na, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) in der Reduktionsreaktion verwendet wurde, wird als die Verbesserung der verbleibenden Menge ausgedrückt. Als ein Ergebnis wurde ermittelt, dass in Abhängigkeit der Typen von verwendeten Reagenzien ein grosser Unterschied bezüglich der Verbesserung (%) der verbleibenden Menge vorliegt. D.h., es wurde ermittelt, dass die Zugabe der Reagenzien in den Klassen A, B oder C zu einer Verbesserung der Menge an verbleibendem natürlichem humanem Activin A führte, im Vergleich mit der Zughabe von nur TDCA/Na, und insbesondere führte die Zugabe von 1 M Argininhydrochlorid zu einer signifikanten Verbesserung der verbleibenden Menge.

Demgemäß werden die Puffer, denen die Reagenzien in Klasse A oder B in Tabelle 1 zugegeben worden waren, diejenigen in den Klassen A, B oder C in Tabelle 3 weiter zugegeben wurde, wirksamer als Rückfaltepuffer angesehen.

Tabelle 3 Verbesserung der Menge an verbleibendem natürlichem humanem Activin A in der Reduktionsreaktion

Abkürzungen

  • PEG:
    Polyethylenglycol
    TFE:
    Trifluorethanol

Beispiel 5

Natriumsulfit wurde bei einer Konzentration von 0,1 M zu reduziertem humanen Activin A gegeben, wie es in Beispiel 2 hergestellt worden war, und Natriumtetrathionat wurde bei einer Endkonzentration von 0,01 M dazugegeben, und das Gemisch wurde bei 5°C für 15 Stunden stehen gelassen. Die Bildung von gemischten Disulfidbindungen zwischen humanem Actinin A und Sulfitionen wurde durch Umkehrphasen-HPLC bestätigt, und die Konzentration von humanem Activin A wurde auf 0,1 mg/ml in einem Verdünnungspuffer (8 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) eingestellt. Dieses wurde in eine Dialysemembran eingeführt (Spectra/Por-Membran, Nr. 1 (Spectrum Medical Industries, Inc.)), und dann bei 5°C für drei Tage gegen ein 500-faches Überschussvolumen des Rückfaltepuffers (1 M Harnstoff; 0,53% TDCA/Na, 1 M Argininhydrochlorid, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5) dialysiert. Cystein wurde bei einer Endkonzentration von 3 mM zu dem Dialysat gegeben, welches dann bei 5°C für 3 Tage stehen gelassen wurde. Die Rekonstitution der Tertiärstruktur von humanem Activin A wurde durch Messung der biologischen Aktivität (Differenzierungs-induzierende Aktivität für Friend-Leukämiezellen) bestätigt. Es wurde mit 10% TFA auf pH 3 eingestellt und mittels Umkehrphasen-HPLC (Vydac214TP54, 22ϕ250 mm, hergestellt von Separations Group; Elution mit einem Acetonitril-Gradienten) gereinigt, bis elektrophoretisch eine einzige Komponente vorlag.

Beispiel 6

Die Bildung von gemischten Disulfidbindungen zwischen humanem Activin A und Glutathion wurde durch Umkehrphasen-HPLC wie in Beispiel 2 bestätigt, und Chlorwasserstoffsäure wurde zugegeben, um den pH auf 3,0 zu vermindern. Dieses wurde in eine Dialysemembran eingefügt (Spectra/Por-Membran, Nr. 1 (Spectrum Medical Industrien, Inc.) und gegen ein 500-faches Überschussvolumen von 8 M Harnstoff, enthaltend 40 mM Chlorwasserstoffsäure, bei 5°C für 15 Stunden dialysiert. Das Dialysat wurde mit einem Puffer verdünnt, welcher derart berechnet wurde, dass die Endkonzentration mit der Zusammensetzung des Rückfaltepuffers übereinstimmte (1,5 M Harnstoff, 0,13% TDCA/Na, 0,1 M Argininhydrochlorid, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5) und gleichzeitig die Konzentration an humanem Activin A 0,1 mg/ml annahm, und das Gemisch wurde dann bei 5°C für 3 Tage stehen gelassen. Die Rekonstitution der Tertiärstruktur von humanem Activin A wurde durch Messung der biologischen Aktivität (Differenzierungs-induzierende Aktivität für Friend-Leukämiezellen) bestätigt. Es wurde mit 10% TFA auf pH 3 eingestellt und mittels Umkehrphasen-HPLC (Vydac214TP54, 4,6ϕ × 250 mm, hergestellt von Separations Group; Elution mit einem Acetonitrilgradienten) gereinigt, bis elektrophoretisch eine einzelne Komponente vorlag.

Beispiel 7

Die nachfolgenden Rückfaltepuffer wurden jeweils anstelle des in Beispiel 6 verwendeten Rückfaltepuffers eingesetzt, und es wurde das gleiche Verfahren durchgeführt, wobei die Tertiärstruktur von humanem Activin A rekonstituiert wurde, und es wurde dann gereinigt, bis elektrophoretisch eine einzige Komponente vorlag.

Puffer 1: 1 M Harnstoff; 0,53% TDCA/Na; 0,5 M Argininhydrochlorid; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5

Puffer 2: 1 M Harnstoff; 0,53% TDCA/Na; 1 M Natriumchlorid; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5

Puffer 3: 1 M Harnstoff; 0,13% TDCA/Na; 1 M Argininhydrochlorid; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5

Puffer 4: 1 M Harnstoff; 0,13% TDCA/Na; 0,5 M Argininhydrochlorid; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5

Puffer 5: 1 M Harnstoff; 0,13% TDCA/Na; 0,5 M Calciumacetat; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5

Beispiel 8

Die nachfolgenden Rückfaltepuffer wurden jeweils anstelle des in Beispiel 6 verwendeten Rückfaltepuffers eingesetzt, und es wurde das gleiche Verfahren durchgeführt, wobei die Tertiärstruktur von humanem Activin A rekonstituiert wurde, und es wurde dann gereinigt, bis elektrophoretisch eine einzige Komponente vorlag.

Puffer 6: 0,5 M Guanidinhydrochlorid; 0,53% TDCA/Na; 0,5 M Argininhydrochlorid; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5

Puffer 7: 0,5 M Guanidinhydrochlorid; 0,53% TDCA/Na; 1 M Natriumchlorid; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5

Puffer 8: 0,5 M Guanidinhydrochlorid; 0,13% TDCA/Na; 1 M Argininhydrochlorid; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5

Puffer 9: 0,5 M Guanidinhydrochlorid; 0,13% TDCA/Na; 0,5 M Argininhydrochlorid; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5

Puffer 10: 0,5 M Guanidinhydrochlorid; 0,13% TDCA/Na; 0,5 M Calciumacetat; 20 mM Tris-HCl, pH 8,5

Gewerbliche Anwendbarkeit

Wie oben beschrieben, kann denaturiertes humanes Activin A zum ersten Mal durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu humanem Activin A vom Naturtyp rückgefaltet werden, und es wurde möglich, die biologische Aktivität von denaturiertem humanem Activin A in diesem einfachen Verfahren wiederherzustellen. D.h., natürliches humanes Activin A, welches herkömmlicherweise in eukaryotischen Zellen als produzierendem Wirt hergestellt werden sollte, konnte einfach und preiswert durch rekombinante Mikroorganismen als produzierendem Wirt hergestellt werden.


Anspruch[de]
Verfahren zum Rückfalten von denaturiertem humanem Activin A zu natürlichem humanem Activin A mit einer Differenzierungs-induzierenden Aktivität für Friend-Leukämiezellen, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) den Schritt des Schützens von Thiolgruppen in solubilisiertem denaturiertem humanem Activin A, bei dem alle Thiolgruppen frei sind, mit Glutathion und/oder Natriumsulfit;

(b) den Schritt des Durchführens einer Austauschreaktion von Disulfidbindungen durch Dialysieren der geschütztes denaturiertes humanes Activin-A enthaltenden Lösung gegen den Rückfaltungspuffer und anschließend Zugabe einer Thiolverbindung dazu,

wobei der Rückfaltungspuffer a) ein Puffer ist, der ein Reagenz enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 0,53% TDCA/Na; 0,13% TDCA/Na, 9,8%, 2% oder 0,49% CHAPS, 10% oder 2,1% CHAPSO, 2,5 oder 0,6% CA/Na, 4,2%, 0,9 oder 0,2% DCA/Na, 1,6% oder 0,38% TCA/Na, 0,12% Digitonin, 4,0% NG, sowie 0,5- bis 2-fach höheren Konzentrationen als die angegebenen Prozentwerte, wobei dieser eine Pufferwirkung im Bereich von pH 7,5 bis 10,5 aufweist,

oder b) ein Puffer ist, der 0,13% TDCA/Na enthält und weiterhin ein Reagenz enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 1,0 M Argininhydrochlorid; 0,5 M Argininhydrochlorid, 1,0 M oder 0,5 M Magnesiumacetat, 1,0 M oder 0,5 M Lithiumchlorid, 1,0 M Natriumchlorid, 1,0 M Ammoniumchlorid, 1,0 M Lithiumbromid, und 0,5- bis 2-fach höheren Konzentration als die angegebenen Molwerte, wobei dieser eine Pufferwirkung im Bereich von pH 7,5 bis 10,5 aufweist,

wobei der Puffer a) oder b) 20 mT Tris-HCl, pH 8,5, und 0,1 bis 3 M Harnstoff oder 0,05 bis 2 M Guanidinhydrochlorid enthält.
Verfahren zum Rückfalten von denaturiertem humanem Activin A zu natürlichem humanem Activin A mit einer Differenzierungs-induzierenden Aktivität für Friend-Leukämiezellen, welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) den Schritt des Schützens von Thiolgruppen in solubilisiertem denaturiertem humanem Activin A, bei dem alle Thiolgruppen frei sind, mit Glutathion und/oder Natriumsulfit;

(b) den Schritt des Durchführens einer Austauschreaktion von Disulfidbindungen durch Austausch des Puffers für die geschütztes denaturiertes humanes Aktivin A enthaltende Lösung durch den Rückfaltungspuffer, enthaltend eine Thiolverbindung,

wobei der Rückfaltungspuffer a) ein Puffer ist, der ein Reagenz enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 0,53% TDCA/Na; 0,13% TDCA/Na, 9,8%, 2% oder 0,49% CHAPS, 10% oder 2,1% CHAPSO, 2,5 oder 0,6% CA/Na, 4,2%, 0,9 oder 0,2% DCA/Na, 1,6% oder 0,38% TCA/Na, 0,12% Digitonin, 4,0% NG, sowie 0,5- bis 2-fach höheren Konzentrationen als die angegebenen Prozentwerte, wobei dieser eine Pufferwirkung im Bereich von pH 7,5 bis 10,5 aufweist,

oder b) ein Puffer ist, der 0,13% TDCA/Na enthält und weiterhin ein Reagenz enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 1,0 M Argininhydrochlorid; 0,5 M Argininhydrochlorid, 1,0 M oder 0,5 M Magnesiumacetat, 1,0 M oder 0,5 M Lithiumchlorid, 1,0 M Natriumchlorid, 1,0 M Ammoniumchlorid, 1,0 M Lithiumbromid, und 0,5- bis 2-fach höheren Konzentrationen als die angegebenen Molwerte, wobei dieser eine Pufferwirkung im Bereich von pH 7,5 bis 10,5 aufweist,

wobei der Puffer a) oder b) 20 mT Tris-HCl, pH 8,5, und 0,1 bis 3 M Harnstoff oder 0,05 bis 2 M Guanidinhydrochlorid enthält.
Rückfaltungsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das solubilisierte denaturierte humane Activin A, bei dem sämtliche Thiolgruppen frei sind, durch Solubilisierung von denaturiertem humanen Aktivin A mit Harnstoff, Guanidinhydrochlorid oder einem Gemisch davon und anschließende Reduktion seiner intramolekularen und/oder intermolekularen Disulfidbindungen mit einem Reduktionsmittel erhalten wird.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com