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Dokumentenidentifikation DE102006017841A1 25.10.2007
Titel Laser-Scanning-Mikroskop mit Hauptstrahlteiler zur räumlichen Trennung von Beleuchtungs- und Detektionsstrahlung
Anmelder Carl Zeiss MicroImaging GmbH, 07745 Jena, DE
Erfinder Wolleschensky, Ralf, Dipl.-Phys., 99510 Apolda, DE
Vertreter GEYER, FEHNERS & PARTNER (G.b.R.), 80687 München
DE-Anmeldedatum 18.04.2006
DE-Aktenzeichen 102006017841
Offenlegungstag 25.10.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 25.10.2007
IPC-Hauptklasse G02B 21/00(2006.01)A, F, I, 20060418, B, H, DE
Zusammenfassung Es wird bereitgestellt ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle (5) und einem Detektionsstrahlengang (2), der in einer Probe angeregte (3) und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse (OA) zu einer Detektoreinrichtung (4) leitet und in dem ein Strahlteiler (13) vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle (5) abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang (B) auf die Probe (3) gerichtet ist, wobei der Strahlteiler (13) an der Probe (3) spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung (4) passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges (B) angeordnet sowie teilverspiegelt ist, wobei der Strahlteiler (13) eine im Detektionsstrahlengang (2) liegende Strahlteilerfläche (22) aufweist, die zumindest an drei Punkten (23a-d) für die Beleuchtungsstrahlung verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche (22) auf einem Kreis um den Durchstoßpunkt (25) der optischen Achse (OA) liegen, und die Beleuchtungsstrahlquelle (5) eine der Punktzahl entsprechende Anzahl von Teilstrahlen (Sa-d) erzeugt und diese auf die drei Punkte (23a-d) des Strahlteilers (13) derart fokussiert, daß in der Probe (3) ein Interferenzmuster (28) in Form periodisch über die Probe (3) verteilter Beleuchtungsflecke (26) entsteht.

Beschreibung[de]

Die Erfindung bezieht sich auf ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle und einem Detektionsstrahlengang, der in einer Probe angeregte und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse zu einer Detektoreinrichtung leitet und in dem ein Strahlteiler vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang auf die Probe gerichtet ist, wobei der Strahlteiler an der Probe spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges angeordnet sowie teilverspiegelt ist

Für Laser-Scanning-Mikroskope, die, wie beispielsweise in der DE 19702753A1 beschrieben ist, eine Probe durch Abrastern einer konfokalen Abbildung erfassen, ist die Untersuchung biologischer Präparate mittels Fluoreszenzmikroskopie eine verbreitete Anwendung. Dabei wird in einer Probe Fluoreszenz angeregt, wodurch gegenüber der Anregungsstrahlung spektral Stokes-verschobene Fluoreszenzstrahlung entsteht, die dann mit dem Laser-Scanning-Mikroskop konfokal detektiert wird. Anstelle einer konfokalen Detektion kann auch eine Weitfelddetektion erfolgen, beispielsweise im Falle einer Multi-Photonen-Anregung.

Grundsätzlich stellt sich bei einem Laser-Scanning-Mikroskop die Aufgabe, daß die Beleuchtungsstrahlung, die im erwähnten Fall der Fluoreszenzmikroskopie Anregungsstrahlung ist, von der zu detektierenden Strahlung getrennt werden muß, da zumeist die Beleuchtungsstrahlung und die Detektionsstrahlung über ein gemeinsames Objektiv geführt werden, d.h. die Beleuchtungsstrahlung fällt über das Objektiv ein, mit dem auch die Detektionsstrahlung zum Detektor geleitet wird. Es ist deshalb üblich, die Beleuchtungsstrahlung über einen Strahlteiler einzukoppeln, der dafür sorgt, daß an der Probe rückreflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht oder zu einem möglichst geringen Anteil zum Detektor passiert.

In der Fluoreszenzmikroskopie macht man sich die Stokes-bedingte Wellenlängenverschiebung zwischen Detektions- und Anregungsstrahlung zunutze und verwendet für den Strahlteiler geeignete dichroitische Elemente, weshalb sich für den Strahlteiler auch der Begriff Farbteiler oder Hauptfarbteiler eingebürgert hat. Unterscheiden sich Beleuchtungs- und Detektionsstrahlung jedoch spektral nicht, hilft dieser Ansatz nicht weiter. Auch ist die Trennschärfe eines dichroitischen Strahlteilers begrenzt, was entweder dazu führt, daß im Detektionsstrahlengang nach dem Strahlteiler immer noch an der Probe rückreflektierte Anregungsstrahlung verbleibt oder daß die Detektionsstrahlung beim Durchgang durch den Strahlteiler unnötig abgeschwächt wird.

Einen spektral unabhängigen Ansatz stellt die DE 10257237A1 vor. Das dort beschriebene Laser-Scanning-Mikroskop der eingangs genannten Art verwendet die Tatsache, daß von der Probe kommende Strahlung in der Regel inkohärent, d.h. nicht gerichtet an der Probe emittiert wird, wohingegen spiegelnd reflektierte Anregungs- oder Beleuchtungsstrahlung gerichtet in den Detektionsstrahlengang einkoppelt. Die DE 10257237A1 schlägt deshalb vor, in eine Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs einen Strahlteiler einzufügen, der am Durchstoßpunkt der optischen Achse transparent und ansonsten verspiegelt ist. Zugleich wird die Beleuchtungsstrahlung genau auf diesen transparenten Fleck fokussiert. Im Ergebnis erhält man damit eine flächige Beleuchtung der Probe und zugleich gelangt an der Probe spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung wieder auf die Spiegelfläche des Strahlteilers und wird dadurch aus dem nachfolgenden Teil des Detektionsstrahlengangs aufgespiegelt. Die diffus in der Probe erzeugte Detektionsstrahlung hingegen wird nicht fokussiert, füllt die ganze Pupille und wird fast vollständig transmittiert. Der als Auskoppelgrad der Beleuchtungsstrahlung zu verstehende Wirkungsgrad dieses Strahlteilers ist also nur durch das Flächenverhältnis von Pupille zu transparentem Fleck gegeben. Er kann bei geeigneter Fokussierung der Beleuchtungsstrahlung weit über 90% liegen. Der derart durch die DE 10257237A1 erreichte Strahlteiler ist spektral unempfindlich und erlaubt eine hohe Ausbeute der Detektionsstrahlung.

Die Laser-Scanning-Mikroskopie eignet sich, wie bereits erwähnt, besonders zur Untersuchung biologischer Proben. Die Zeitdauer, die für die Aufnahme eines Bildes benötigt wird, ist bei biologischen Proben naturgemäß ein bedeutender Faktor, insbesondere wenn man lebende Proben untersuchen oder schnell ablaufende Vorgänge analysieren möchte. Es ist deshalb stetes Bestreben in der Laser-Scanning-Mikroskopie, die Bildaufnahmegeschwindigkeit zu steigern. Hierzu sind in letzter Zeit vermehrt Mikroskopsysteme beschrieben worden, die eine Probe nicht mit einem punkt-artigen Lichtfleck (d.h. mit nicht einem konfokalen Punkt-Scanner) abtasten, sondern mit einer zeilenförmigen Beleuchtung und Abtastung (d.h. eine konfokale Schlitzblende) verwenden. Auch hierfür stellt die DE 10257237A1 einen geeigneten Strahlteiler bereit, bei dem dann ein zeilenförmiger Bereich in Form eines schmalen Rechteckes auf dem Strahlteiler verspiegelt ist.

Zwar erreichen zeilen-scannende Systeme eine hohe Bildaufnahmegeschwindigkeit, jedoch ist die Tiefenschärfeauflösung gegenüber einem punkt-scannenden System vermindert, da es in der konfokalen Abbildung mit der Schlitzblende prinzipbedingt zu einem gewissen Übersprechen längs der Schlitzblendenrichtung kommt.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde ein Laser-Scanning-Mikroskop der eingangs genannten Art so weiterzubilden, daß eine schnelle Bildaufnahme möglich ist, ohne die mit einer Schlitzblende einhergehende Tiefenauflösungseinschränkung.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle und einem Detektionsstrahlengang, der in einer Probe angeregte und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse zu einer Detektoreinrichtung leitet und in dem ein Strahlteiler vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang auf die Probe gerichtet ist, wobei der Strahlteiler an der Probe spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges angeordnet sowie teilverspiegelt ist, gelöst, bei dem der Strahlteiler eine im Detektionsstrahlengang liegende Strahlteilerfläche aufweist, die an drei Punkten verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche auf einen Kreis um den Durchstoßpunkt der optischen Achse liegen, und bei dem die Beleuchtungsstrahlquelle eine der Punktzahl entsprechende Anzahl an Teilstrahlen erzeugt und diese auf die Punkte des Strahlteilers derart fokussiert, daß in der Probe ein Interferenzmuster in Form periodisch über die Probe verteilter Beleuchtungsflecke entsteht.

Die erfindungsgemäße Lösung läßt sich natürlich auch invertieren, indem der Strahlteiler die Detektionsstrahlung ausspiegelt und spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung passieren läßt. Dazu ist vorgesehen, ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle und einem Detektionsstrahlengang, der in einer Probe angeregte und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse zu einer Detektoreinrichtung leitet und in dem ein Strahlteiler vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang auf die Probe gerichtet ist, wobei der Strahlteiler an der Probe spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges angeordnet sowie teilverspiegelt ist, wobei der Strahlteiler eine im Detektionsstrahlengang liegende reflektierende Strahlteilerfläche aufweist, die zumindest an drei Punkten für die Beleuchtungsstrahlung nicht verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche auf einem Kreis um den Durchstoßpunkt der optischen Achse liegen, und die Beleuchtungsstrahlquelle eine der Punktzahl entsprechende Anzahl von Teilstrahlen erzeugt und diese auf die drei Punkte des Strahlteilers derart fokussiert, daß in der Probe ein Interferenzmuster in Form periodisch über die Probe verteilter Beleuchtungsflecke entsteht.

Die Erfindung erzielt eine hocheffiziente Punktgruppenerzeugung mittels eines einfachen Aufbaus.

Erfindungsgemäß wird der Strahlteiler so ausgebildet, daß die Probe mit einer Punktgruppe in Form eines durch Interferenz erzeugten Musters beleuchtet wird. Dies erlaubt eine parallele Beleuchtung mehrerer Punkte und auch ein paralleles Abtasten dieser gleichzeitig beleuchteten Punkte, wenn die Detektoreinrichtung eine Multipunktdetektion an den beleuchteten Flecken vornimmt. Im Ergebnis erhält man gegenüber einer Einzelpunktbeleuchtung eine um die Punktanzahl vervielfachte Abtastgeschwindigkeit, ohne daß die Tiefenauflösung beeinträchtigt wäre. Die Beleuchtung (in der Fluoreszenzmikroskopie, Anregung) der Probe mit dem regelmäßigen Punktgruppenmuster erfolgt erfindungsgemäß unter Ausnutzung eines Interterenzeffektes, so daß die Anzahl an Beleuchtungsstrahlen, welche die Beleuchtungsquelle bereitstellt, sehr viel geringer ist, als die Anzahlen an Beleuchtungsflecken im regelmäßigen Muster. Der Interferenzeffekt benötigt lediglich mindestens drei reflektierende Punkte/transmittierende Löcher am Strahlteiler, auf die die Beleuchtungsstrahlung fokussiert wird, so daß man mindestens drei Beleuchtungsstrahlen am Strahlteiler einkoppelt. Diese Anzahl an Beleuchtungsstrahlen (in dieser Beschreibung wird der Begriff "Strahl" synonym für ein entsprechendes Strahlbündel verwendet) läßt sich einfach erzeugen. Z.B. werden bei einem Ausgangsstrahl lediglich zwei Tellerelemente benötigt. Es ist deshalb bevorzugt, daß die Beleuchtungsstrahlquelle einen Laser, der einen Laserstrahl abgibt, und eine Tellereinrichtung, die den Laserstrahl in die mindestens drei Teilstrahlen aufteilt und mittels einer Optikeinrichtung auf die Punkte/Löcher fokussiert, aufweist.

Die Anzahl an reflektierenden bzw. transmittierenden Punkten ist nicht auf drei begrenzt. Es können auch mehr Punkte verwendet werden, die auf dem Kreis symmetrisch bzw. entlang der Kreislinie möglichst gleich verteilt oder äquidistant liegen sollten, aber disjunkt sein müssen. Bei vier Punkten können diese z.B. an den Ecken eines Quadrates liegen, in dessen Zentrum sich der Durchstoßpunkt befindet.

Das erfindungsgemäße Mikroskop mit dem die Beleuchtung unter Ausnutzung der Interferenz bewirkenden Strahlteiler erzielt, wie bereits erwähnt, eine hohe Scangeschwindigkeit durch Parallelisierung der Beleuchtung und gegebenenfalls Detektion. Zugleich können in einer vorteilhaften Ausgestaltung die Anforderungen an den zum Scannen erforderlichen Scanmechanismus drastisch reduziert werden, da es zum Abrastern der Bildfläche nur noch erforderlich ist, eine Verschiebung innerhalb einer Periode des periodischen Punktgruppenmusters auszuführen. Die Scaneinrichtung muß also, wenn sie beispielsweise als optischer im Strahlengang wirkender Scanner ausgebildet ist, nur noch einen vergleichsweise geringen Ablenkwinkel erreichen. Dies kommt der Scangeschwindigkeit wie apparativen Vereinfachungen gleichermaßen entgegen. Es ist deshalb in einer Weiterbildung zu bevorzugen, daß in Beleuchtungsrichtung dem Strahlteiler nachgeordnet eine Scaneinrichtung vorgesehen ist, die eine Verschiebung des Punktgruppenmusters über der Probe innerhalb einer Periode des Punktgruppenmusters bewirkt. Neben einer strahlablenkend arbeitenden Scaneinrichtung kann dabei natürlich auch eine Bewegung der Probe, z.B. durch einen sogenannten Tischscanner, verwendet werden.

Die interferenzbedingte Erzeugung des Beleuchtungs-Punktgruppenmusters erlaubt es, die Helligkeit der Lichtflecke gegenüber den die Lichtflecke umgebenden Dunkelbereichen einfach zu verstellen, indem nämlich die Intensität jeweils diagonal gegenüberliegend fokussierter Teilstrahlen variiert wird. Es sind deshalb in einer Weiterbildung der Erfindung geeignete Mittel zur Variation vorgesehen, die dem Strahlteiler in Beleuchtungsrichtung vorgeordnet sind, und beispielsweise in Form einstellbarer Abschwächelemente ausgebildet sind.

Die Anzahl an hellen Flecken im Punktgruppenmuster hängt ausschließlich von dem ausgeleuchteten Bereich auf der Probe ab, wenn im Beleuchtungsstrahlengang im wesentlichen eine Abbildung der Pupille, in welcher der Strahlteiler angeordnet ist, auf die Probe erfolgt. Der beleuchtete Bereich der Probe und damit die Anzahl an Probenpunkten läßt sich dann einfach durch Mittel zur Brennweitenvariation der Abbildung zwischen Strahlteiler und Probe bewirken. Mit anderen Worten, Mittel zur Veränderung der von der optischen Abbildung erfaßten Bildfeldgröße variieren automatisch auch die Anzahl an Beleuchtungspunkten, die auf der Probe durch die Interferenz entstehen.

Eine parallele Detektion der gleichzeitig beleuchteten Flecken auf der Probe erhöht, wie bereits erwähnt, die Bildaufnahmegeschwindigkeit. Besonders einfach kann eine solche parallele Abtastung erreicht werden, wenn der Detektionsstrahlengang in einem Matrixdetektor endet, dem optional noch eine auf das Beleuchtungsmuster abgestimmte Pinholemaske vorgeordnet werden kann. Natürlich können aber auch die ortsauflösenden Elemente des Matrixdetektors die Funktion der Pinholemaske übernehmen.

Die reflektierenden Elemente des Strahlteilers müssen nur für Beleuchtungsstrahlung reflektieren, nicht für Detektionsstrahlung. Der Strahlteiler kann also auch dichroitisch ausgebildet werden.

Der Punktabstand im Punktgruppenmuster kann über den Abstand der Foki auf den Strahlteiler, also über den Kreisradius, verstellt werden.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielshalber noch näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:

1 eine Schemadarstellung eines Laser-Scanning-Mikroskops,

2 eine alternative Ausgestaltung einer Beleuchtungsquelle für das Mikroskop der 1,

3 eine Draufsicht auf einen Strahlteiler des Mikroskops der 1 und

4 ein vom Mikroskop der 1 bewirktes Beleuchtungsmuster auf der Probe.

1 zeigt ein Laser-Scanning-Mikroskop 1 in schematischer Darstellung. Die durchgezogenen Linien stellen den Beleuchtungsstrahlengang B dar; die gestrichelten Linien den Detektionsstrahlengang 2. Das Laser-Scanning-Mikroskop bildet eine Probe 3 rasternd auf einen Detektor 4 ab, wobei die Probe mittels einer Beleuchtungsquelle 5 beleuchtet wird.

Der Detektionsstrahlengang 2 weist von der Probe 3 zum Detektor 4 längs einer optischen Achse OA ein Objektiv 6 sowie eine Tubuslinse 7 auf, der ein Scanobjektiv 8a folgt, nach der ein Scanner 9 vorgesehen ist. Nach einer Relaisoptik 8b, 10 sowie einer Pinholeoptik 11 passiert die Strahlung einen Strahlteiler 13 und gelangt zu einem Detektor 4, der hier als Matrixdetektor ausgebildet ist, und dem ein Filter 12 zum Abblocken letzter Anteile der Beleuchtungsstrahlung vorgeordnet ist. Natürlich kann der Detektionsstrahlengang 2 auch anders ausgestaltet sein, beispielsweise kann man auf den Filter 12 sowie auf das in der Bauweise der 2 zwischen den Elementen 8a und 7 vorgesehene Zwischenbild, das durch eine gestrichelte Linie symbolisiert ist, verzichten.

Im in 1 gezeigten Mikroskop 1 sind die Pupillenebenen, in denen der Scanner 9 sowie der noch zu erläuternde Strahlteiler 13 liegen, zueinander und zur rückwärtigen Brennebene des Objektives 6, die zwischen den Elementen 6 und 7 als durchgezogene Linie eingezeichnet ist, konjugiert.

Die Beleuchtungsquelle 5 weist einen Laser 14 auf, der durch eine Tellereinrichtung 16, die noch näher erläutert wird, vier Teilstrahlen Sa, Sb, Sc, Sd erzeugt, wobei in 1 nur die Mittelstrahlen eingezeichnet sind. Die Teilereinrichtung 16 fokussiert diese vier Teilstrahlen Sa–d, von denen in der schematischen Darstellung der 1 nur zwei zu sehen sind (die anderen zwei liegen senkrecht zur Zeichenebene übereinander) auf den Strahlteiler 13.

Im einzelnen weist die Teilereinrichtung 16 zwei Teiler 17 und 18 und einen Umlenkspiegel 19 auf, die aus dem einen vom Laser 14 abgegebenen Strahl S vier parallele Teilstrahlen Sa, Sb sowie Sc und Sd erzeugen. In der Darstellung der 1 liegen die Teilstrahlen Sa und Sb übereinander, wie auch die Teilstrahlen Sc und Sd. Linsen 20 und 21 in der Teilereinrichtung 16 bewirken die Fokussierung derart, daß die Teilstrahlen Sa–c auf vier Punkte auf der Fläche des Strahlteilers 13 fokussiert werden.

Die Erzeugung der vier Teilstrahlen Sa–c kann natürlich auch durch eine andersartig ausgebildete Teilereinrichtung 16 oder grundsätzlich anders erfolgen, beispielsweise in dem vier Laser 14 verwendet werden. Eine mögliche weitere Ausgestaltung für die Teilereinrichtung 16 ist in 2 gezeigt, in der der Teiler 18 und der Spiegel 19 mit dem Teiler 17 vertauscht sind.

3 zeigt den Strahlteiler 13 in Draufsicht auf dessen Strahlteilerfläche 22. Auf der Strahlteilerfläche 22 sind vier reflektierende Spiegelflächenelemente 23a, 23b, 23c und 23d angeordnet, die an den Eckpunkten eines gedachten Quadrates 24 liegen, dessen Zentrum der Durchstoßpunkt 25 der optischen Achse OA bildet. Nur dort ist die Strahlteilerfläche 25 reflektierend, im übrigen Bereich ist sie transmittierend zumindest für Detektionsstrahlung.

Die Beleuchtungsquelle 5 fokussiert die vier Teilstrahlen Sa–d auf die vier Spiegelflächenelemente 23a–d. In der Probe 3 gelangen die derart in die Pupille fokussiert und reflektierten Teilstrahlen zur Interferenz, wodurch das in 4 dargestellte Multispot-Muster 28 in der Probe entsteht. Das Multispot-Muster 28 ist eine regelmäßige Anordnung von Lichtflecken 26, die von einem Dunkelbereich 27 umgeben sind. Die Intensitätsdifferenz zwischen den Lichtflecken 26 und dem Dunkelbereich 27, also die Tiefe der Nullstellen, kann durch Änderung der Intensitäten der jeweils gegenüberliegenden Teilstrahlen Sa, Sd und Sb, Sc variiert werden. Dabei werden diagonal (bezogen auf die optische Achse) gegenüberliegende Teilstrahlen oder jeweils durch einen dazwischenliegenden Teilstrahl getrennte Teilstrahlen vorzugsweise gleichsinnig eingestellt. Bei drei Teilstrahlen wird einer gegenüber zwei verstellt (oder umgekehrt).

Die räumliche Ausdehnung des Musters 28 kann durch Variation des Vergrößerungsmaßstabes des Mikroskops (z.B. Variation der Brennweite bei 10 und 8b) angepaßt werden, indem das Bildfeld in der Probe, das das Muster 28 überdeckt, verändert wird. Alternativ kann die Brennweite der Linsen 10, 21 dazu eingestellt werden.

Die Wirkung des Strahlteilers 13 ist wie folgt:

Durch die geometrische Anordnung der Spiegelflächenelemente 23a–d und die darauf fokussierten Teilstrahlen Sa–d entsteht das Punkt-Muster 28 mit regelmäßig angeordneten Lichtflecken 26 auf der Probe 3. Bei einer Anwendung in der Fluoreszenzmikroskopie wird somit an den Lichtflecken 26 Fluoreszenz angeregt. Diese entsteht räumlich inkohärent und füllt somit homogen die rückwärtige Brennebene des Mikroskops 6 (zwischen den Elementen 6 und 7 als durchgezogene Linie eingezeichnet). Analoges gilt für diffuse Reflektion, die ebenfalls zur Bildgewinnung herangezogen werden kann.

Da die rückwärtige Brennebene mit der Pupille, in welcher der Strahlteiler 13 angeordnet ist, konjugiert ist, füllt die zu detektierende inkohärente Strahlung auch die gesamte Pupille, in der der Strahlteiler 13 angeordnet ist und leuchtet somit die gesamte Strahlteilerfläche 22 aus. Spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung wird dagegen auf die Spiegelflächenelemente 23a–d fokussiert und somit zur Beleuchtungsquelle 5 zurückgeworfen.

Im Ergebnis passiert den Strahlteiler 13 nur die zu detektierende Strahlung, die räumlich inkohärent, d.h. ungerichtet in der Probe 3 entstand. Der Strahlteiler 13 bewirkt damit eine Trennung von Detektionsstrahlung und spiegelnd reflektierter Beleuchtungsstrahlung ohne daß eine chromatische Einstellung vorgenommen werden müßte. Dies hatte den Vorteil, daß nicht nur eine höhere Ausbeute erreicht wird, auch kann der Strahlteiler 13 für verschiedenste Beleuchtungswellenlängen und Detektionswellenlängen verwendet werden. Die üblicherweise bei Farbteilern vorgesehenen Austauschmechanismen bzw. Wechselräder sind nicht nötig.

Die Detektion (in 1 ist der Pupillenstrahlengang gestrichelt gezeichnet) erfolgt beispielshalber mit dem als Matrixdetektor ausgebildeten Detektor 4, dem optional eine Pinholemaske vorgeordnet sein kann. Dabei werden die beleuchteten Spots konfokal abgebildet. Diese Maske kann in einer Zwischenbildebene des Beobachtungsstrahlenganges vor dem Detektor liegen oder alternativ in die Relaisoptik (zwischen 10 und 8b) gestellt werden. Letzteres verbessert das Strahlprofil auch beleuchtungsseitig.

Das Abtasten der Probe 3 erfolgt durch Wirkung des Scanners 9. Dabei ist eine sehr viel geringere Verschiebung der beleuchtenden Lichtflecke auf der Probe 3 nötig, als dies bei einem Einzelpunktscanner erforderlich ist. Die einzelnen Lichtflecke 26 werden vom Scanner 9 simultan verschoben, da sie durch Interferenz in der Probe entstehen. Es genügt deshalb eine Bewegung mittels des Scanners 9, die den Dunkelbereich 27 zwischen benachbarten Lichtflecken 26 abtastet. Die scannende Verschiebung der Lichtflecke erfolgt also vorzugsweise nur innerhalb einer Periodenlänge des periodischen regelmäßigen Musters 28.

Der in 1 gezeigte Aufbau kann auch dahingehend invertiert werden, daß der Detektionsstrahlengang ab dem Strahlteiler 13 und die Beleuchtungsquelle 5 vertauscht werden. Der Strahlteiler 13 ist dann bezüglich der Verspiegelung negativ zu der in 3 gezeigten Bauweise, d.h. die Spiegelflächenelemente 23a–d sind Löcher in einer Spiegelfläche.


Anspruch[de]
Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle (5) und einem Detektionsstrahlengang (2), der in einer Probe angeregte (3) und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse (OA) zu einer Detektoreinrichtung (4) leitet und in dem ein Strahlteiler (13) vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle (5) abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang (B) auf die Probe (3) gerichtet ist, wobei der Strahlteiler (13) an der Probe (3) spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung (4) passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges (B) angeordnet sowie teilverspiegelt ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlteiler (13) eine im Detektionsstrahlengang (2) liegende Strahlteilerfläche (22) aufweist, die zumindest an drei Punkten (23a–d) für die Beleuchtungsstrahlung verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche (22) auf einem Kreis um den Durchstoßpunkt (25) der optischen Achse (OA) liegen, und die Beleuchtungsstrahlquelle (5) eine der Punktzahl entsprechende Anzahl von Teilstrahlen (Sa–d) erzeugt und diese auf die drei Punkte (23a–d) des Strahlteilers (13) derart fokussiert, daß in der Probe (3) ein Interferenzmuster (28) in Form periodisch über die Probe (13) verteilter Beleuchtungsflecke (26) entsteht. Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Beleuchtungsstrahlquelle (5) und einem Detektionsstrahlengang (2), der in einer Probe angeregte (3) und/oder rückgestreute Strahlung längs einer optischen Achse (OA) zu einer Detektoreinrichtung (4) leitet und in dem ein Strahlteiler (13) vorgesehen ist, über den von der Beleuchtungsstrahlquelle (5) abgegebene Beleuchtungsstrahlung in einem Beleuchtungsstrahlengang (B) auf die Probe (3) gerichtet ist, wobei der Strahlteiler (13) an der Probe (3) spiegelnd reflektierte Beleuchtungsstrahlung nicht zur Detektoreinrichtung (4) passieren läßt und dazu in einer Pupille des Beleuchtungsstrahlenganges (B) angeordnet sowie teilverspiegelt ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Strahlteiler (13) eine im Detektionsstrahlengang (2) liegende reflektierende Strahlteilerfläche (22) aufweist, die zumindest an drei Punkten (23a–d) für die Beleuchtungsstrahlung nicht verspiegelt ist, welche auf der Strahlteilerfläche (22) auf einem Kreis um den Durchstoßpunkt (25) der optischen Achse (OA) liegen, und die Beleuchtungsstrahlquelle (5) eine der Punktzahl entsprechende Anzahl von Teilstrahlen (Sa–d) erzeugt und diese auf die drei Punkte (23a–d) des Strahlteilers (13) derart fokussiert, daß in der Probe (3) ein Interferenzmuster (28) in Form periodisch über die Probe (13) verteilter Beleuchtungsflecke (26) entsteht. Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungsstrahlquelle (5) einen Laser (14), der einen Laserstrahl (S) abgibt, und eine Tellereinrichtung (16), die den Laserstrahl (S) in die Teilstrahlen (Sa–d) aufteilt und mittels einer Optikeinrichtung (20, 21) auf die Punkte (23a–d) fokussiert, aufweist. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Scanneinrichtung (8), die in Beleuchtungsrichtung dem Strahlteiler (13) nachgeordnet ist und ein Abscannen durch Verschieben des Interferenzmusters (28) auf die Probe (3) bewirkt, wobei die Verschiebung innerhalb einer Periode der periodisch verteilten Beleuchtungsflecke (26) erfolgt. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch Mittel zur Variation der Intensität jeweils diagonal gegenüberliegend fokussierter Teilstrahlen (Sa, Sc; Sb, Sd). Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektionsstrahlengang in einem Matrixdetektor (4) endet. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch Mittel zur Brennweitenvariation (10, 8a, 8b) zwischen Strahlteiler (13) und Probe (3).






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