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Dokumentenidentifikation DE102006018302A1 25.10.2007
Titel Laser-Scanning-Mikroskop und Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren
Anmelder Carl Zeiss MicroImaging GmbH, 07745 Jena, DE
Erfinder Winterot, Johannes, 07745 Jena, DE;
Huhse, Dieter, Dr., 12167 Berlin, DE;
Netz, Ralf, Dr., 07749 Jena, DE;
Pacholik, Jörg, 07749 Jena, DE
Vertreter GEYER, FEHNERS & PARTNER (G.b.R.), 80687 München
DE-Anmeldedatum 20.04.2006
DE-Aktenzeichen 102006018302
Offenlegungstag 25.10.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 25.10.2007
IPC-Hauptklasse G02B 21/00(2006.01)A, F, I, 20060420, B, H, DE
Zusammenfassung Es wird bereitgestellt ein Laser-Scanning-Mikroskop mit
einem Beleuchtungsmodul (BM), das eine Lasereinheit (1), die ein Laserstrahlenbündel (2) erzeugt, und eine Scanneinheit (8) enthält, die das Laserstrahlenbündel (2) in einen vorbestimmten Bereich einer zu untersuchenden Probe (14) fokussiert und über den Bereich führt, wobei dabei aufgrund einer Wechselwirkung zwischen dem fokussierten Laserstrahlenbündel und der Probe (14) Probenstrahlung erzeugt wird,
und einem Detektionsmodul (DM), das die erzeugte Probenstrahlung konfokal detektiert,
wobei das Beleuchtungs- und/oder Detektionsmodul (BM, DM) zumindest eine Linse (7, 3, 5) enthält, deren Brennweite verstellbar ist.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Laser-Scanning-Mikroskop und ein Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren.

In der Laser-Scanning-Mikroskopie gibt es Anwendungen, bei denen ein schnelles Detektieren in verschiedenen Objekttiefen der Probe erwünscht ist. Ein Beispiel hierfür ist die Untersuchung von Anregungszuständen der Nervenenden in der Hirnforschung.

Bekannten Systemen, bei der zur Beeinflussung der Fokuslage Linsen oder Linsengruppen bewegt werden, sind aufgrund der Massenträgheit im Bereich der hier gewünschten schnellen Änderungen nur bedingt einsetzbar. Ähnliche Schwierigkeiten existieren bei elektrisch angesteuerten Piezoschwingern des Mikroskopsystems.

Ausgehend hiervon ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Laser-Scanning-Mikroskop sowie ein Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren zur Verfügung zu stellen, bei denen eine schnelle Detektierung in verschiedenen Tiefen der Probe möglich ist.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Beleuchtungsmodul, das eine Lasereinheit, die ein Laserstrahlenbündel erzeugt, und eine Scanneinheit enthält, die das Laserstrahlenbündel in einem vorbestimmten Bereich einer zu untersuchenden Probe fokussiert und über diesen Bereich ablenkt, wobei dabei aufgrund einer Wechselwirkung zwischen dem fokussierten Laserstrahlenbündel und der Probe Probenstrahlung erzeugt wird, und einem Detektionsmodul, das die erzeugte Probenstrahlung detektiert, wobei das Beleuchtungs- und/oder das Detektionsmodul zumindest eine Linse enthält, deren Brennweite verstellbar ist.

Durch das Vorsehen einer Linse, deren Brennweite verstellbar ist, ist es nicht mehr notwendig, Linsen oder Linsengruppen mechanisch zu bewegen. Daher kann die Änderung der Fokuslage und somit eine Detektion in unterschiedlichen Probentiefen schnell durchgeführt werden.

Insbesondere ist die Linse als elektro-optische Linse ausgebildet, deren Brennweite durch Anlegen einer elektrischen Spannung ein- und verstellbar ist. Solche Linsen können sehr schnell ihre Brennweite ändern, so daß die gewünschte schnelle Detektion der unterschiedlichen Tiefen der Probe erfolgen kann.

Die Linse kann entweder als Flüssigkristgllinse ausgebildet sein, wobei nematische oder ferroelektrische Flüssigkristalle eingesetzt werden können. Es ist jedoch auch möglich, elektrooptische Linsen einzusetzen, wie sie von der Firma Varioptic SA aus Lyon in Frankreich vertrieben werden.

Die Linse kann, in Ausbreitungsrichtung des Laserstrahlenbündels gesehen, so vor der Scanneinheit angeordnet sein, daß das Laserstrahlenbündel zuerst durch die Linse läuft und danach auf die Scanneinheit trifft und daß die Probenstrahlung zuerst auf die Scanneinheit und dann auf die Linse trifft. Die Linse sitzt somit im sogenannten descannten Strahlengang, was den Aufbau des Laser-Scanning-Mikroskops zwischen Scanneinheit und Probe vereinfacht.

Das Detektionsmodul kann ein Objektivmodul umfassen, wobei die Linse in einer konjugierten Ebene zur Austrittspupille des Objektivmoduls in Detektionsrichtung angeordnet ist. Damit ist es sehr gut möglich, die gewünschte Fokusverstellung durchzuführen. Als Austrittspupille wird hier sowohl die unmittelbare Austrittspupille als auch die durch zumindest eine Zwischenabbildung übertragene Austrittspupille des Objektivmoduls verstanden. Das Objektivmodul kann z.B. als einzelnes Objektiv oder als Kombination eines Objektivs mit einer Tubuslinse ausgebildet sein.

Die elektro-optische Linse weist bevorzugt positive Brechkraft auf.

Ferner kann das Mikroskop einen Strahlteiler umfassen, der das Laserstrahlenbündel von der Lasereinheit zur Scanneinheit lenkt und die Probenstrahlung zum Detektionsmodul lenkt. Die Linse kann zwischen dem Strahlteiler und der Lasereinheit, zwischen dem Strahlteiler und der Scanneinheit und/oder zwischen dem Strahlteiler und dem Detektionsmodul angeordnet sein. Somit kann die Lage der Linse im Mikroskop so gewählt werden, daß optimale Ergebnisse für die gewünschte Anwendung erreicht werden.

Das Beleuchtungsmodul kann zwei hintereinander angeordnete Linsen, deren Brennweiten jeweils verstellbar sind, sowie ein Ansteuermodul aufweisen, das die Linsen so ansteuert, daß die Brennweiten stets so eingestellt sind, daß die zwischen den beiden Linsen liegenden Brennpunkte zusammenfallen. Damit ist es leicht möglich, eine Änderung des Strahlquerschnitts des Laserstrahlenbündels in gewünschter Art und Weise durchzuführen.

Ferner kann in einer Weiterbildung das Beleuchtungs- und/oder Detektionsmodul neben der zumindest einen Linse eine dieser nachgeordnete zweite Linse mit verstellbarer Brennweite und ein Steuermodul aufweisen, wobei die Brennweiten beider Linsen mittels des Steuermoduls so verstellbar sind, daß die zwischen beiden Linsen liegenden Brennpunkte stets zusammenfallen. Die beiden Linsen können somit als Strahlquerschnittswandler eingesetzt werden, wobei zur Änderung des Strahlquerschnitts keine mechanische Bewegung einer der beiden Linsen notwendig ist. Auch können die beiden Linsen beispielsweise in einem Objektiv des Mikroskops eingesetzt werden, so daß die Vergrößerung des Mikroskops elektrisch einstellbar ist, ohne daß dazu eine mechanische Bewegung oder Veränderung der Lage der beiden Linsen notwendig wird. Die beiden Linsen können elektro-optische Linsen mit verstellbarer Brennweite sein, deren Brennweite jeweils insbesondere durch Anlegen einer elektrischen Spannung ein- bzw. verstellbar ist.

Insbesondere können die beiden Linsen in einem Bereich des Mikroskops angeordnet sein, in dem die Laserstrahlung zur Beleuchtung und/oder die Probenstrahlung kollimiert ist/sind (also in einem Bereich, in dem die Strahlung als paralleles Strahlenbündel vorliegt).

Das Laser-Scanning-Mikroskop kann ferner eine Steuereinheit aufweisen, die die Steuerung des Mikroskops (beispielsweise der Scanneinheit) durchführt, so daß die gewünschten Bilder (z.B. optische Schnitte in unterschiedlichen Probentiefen) erzeugt werden können.

Die Probenstrahlung kann beispielsweise reflektierte, transmittierte Strahlung und/oder Fluoreszenzstrahlung sein.

Die Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Laser-Scanner-Mikroskopierverfahren, bei dem ein Laserstrahlenbündel erzeugt, in einem vorbestimmten Bereich einer zu untersuchenden Probe fokussiert und innerhalb des Bereiches so abgelenkt wird, daß aufgrund einer Wechselwirkung zwischen dem fokussierten Laserstrahlenbündel und der Probe Probenstrahlung erzeugt wird, die konfokal detektiert wird, wobei bei der Beleuchtung und/oder Detektion zumindest eine Linse verwendet wird, deren Brennweite verstellbar ist.

Damit ist es möglich, leicht und schnell die Fokustiefe bzw. -lage einzustellen.

Die Linse kann insbesondere eine elektro-optische Linse sein, deren Brennweite durch Anlegen einer elektrischen Spannung verstellbar ist.

Die Erfindung wird nachfolgend beispielshalber anhand der Figuren noch näher erläutert. Es zeigen:

1 eine schematische Ansicht, einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops;

2 eine Weiterbildung der Linsen 3, 5 von 1 als Querschnittswandler;

3 den Querschnittswandler von 2 in einer anderen Betriebsstellung, und

4 und 5 der Querschnittswandler von 2 zur Variation des Durchmessers des vom Querschnittswandler abgegebenen Strahlenbündels.

Bei der in 1 gezeigten Ausführungsform umfaßt das Laser-Scanning-Mikroskop LSM eine Lasereinheit 1, die ein Laserstrahlenbündel 2 abgibt, das mittels einer ersten Optik 3 in eine Fokusebene 4 fokussiert wird.

Das aus der Fokusebene 4 divergent austretende Laserstrahlenbündel wird über eine zweite Optik 5, einen Strahlteiler 6, eine elektro-optische Linse 7, einen Scanner 8 mit zwei Ablenkspiegeln 9 und 10, über ein Scannobjektiv 11 und ein Objektivmodul 13 auf bzw. in eine Probe 14 auf einem Probentisch 15 fokussiert. Die Elemente 1 bis 11 und 13 bilden ein Beleuchtungsmodul BM. Ab der Fokusebene 4 sind zur Vereinfachung der Darstellung nur noch die Ausbreitungsrichtung des Laserstrahlenbündels sowie der nachfolgend beschriebenen Probenstrahlung eingezeichnet.

Der Scanner 8 dient dazu, das fokussierte Laserstrahlenbündel in dem zu untersuchenden Bereich der Probe 14 so abzulenken, daß der gesamte Bereich mit dem fokussierten Laserstrahlenbündel überstrichen wird.

Aufgrund der Wechselwirkung des fokussierten Laserstrahlenbündels mit der Probe wird Probenstrahlung erzeugt (beispielsweise Fluoreszenzstrahlung). Die Probenstrahlung wird konfokal detektiert, indem die Probenstrahlung über das Objektivmodul 13 und das Scannobjektiv 11, den Scanner 8, die elektro-optische Linse 7 und den Strahlenteiler 6 bis zu einer dritten Optik 16 geführt wird, die die Probenstrahlung auf eine Lochblende 17 zur konfokalen Unterdrückung von unerwünschter Strahlung fokussiert. Die durch die Lochblende 17 hindurchtretende Probenstrahlung wird über eine vierte Optik 18 auf einen Detektor 19 gerichtet. Die Elemente 13, 11 bis 6 sowie 16 bis 19 bilden in dieser Reihenfolge ein Detektionsmodul DM.

Da es schwierig ist, ein Objektiv mit gewünschter Vergrößerung zu konstruieren, dessen Austrittspupille im Scanner 8 liegt und das gleichzeitig die notwendigen Abbildungseigenschaften aufweist, dient hier das Objektivmodul 13 dazu, eine Zwischenabbildung von der Probe 14 in eine zwischen Objektivmodul 13 und Scannobjektiv 11 liegende Ebene 12 vorzunehmen. Das Scannmodul 11 dient dazu, die Austrittspupille des Objektivmoduls 13 in den Scanner 8 zu übertragen. Das Objektivmodul 13 kann z.B. als einzelnes Objektiv oder als Kombination eines Objektivs mit einer Tubuslinse ausgebildet sein.

Um nun einen optischen Schnitt in einer vorbestimmten Tiefe in der Probe 14 zu untersuchen, wird das Laserstrahlenbündel 2 in die Tiefe fokussiert und wird mittels des Scanners 8 der gesamte Bereich rasterförmig beleuchtet. Die dabei erzeugte Probenstrahlung wird durch den Scanner 8 descannt und konfokal detektiert.

Zur schnellen Durchführung optischer Schnitte in unterschiedlichen Tiefen ist die elektrooptische Linse 7 vorgesehen, deren Brennweite mittels einer Steuereinheit 20 verstellbar ist. Die Verstellung wird durch Anlegen einer vorbestimmten Spannung an die elektro-optische Linse 7 durchgeführt. Damit ist es möglich, die Fokussierung bzw. die Fokustiefe oder Fokuslage des Laserstrahlenbündels 2 entlang der optischen Achse des Objektivs 11 schnell zu ändern und somit schnell optische Schnitte in unterschiedlichen Tiefen durchzuführen.

Die elektro-optische Linse 7 ist hier in einer zur Austrittspupille des Objektivmoduls 13 (bei der Detektion) konjugierten Ebene angeordnet. Ferner ist die Ebene, in der die elektro-optische Linse 7 angeordnet ist, auch konjugiert zur ebene des Scanners 8. Falls notwendig, kann noch eine entsprechende Zwischenabbildung (nicht gezeigt) vorgesehen sein. Die Linse kann natürlich auch an anderen Stellen zwischen Scanner 8 und Strahlteiler 6 angeordnet sein. Damit ist es möglich, sehr schnell und exakt die Fokussierung bzw. Fokustiefe mittels einer Änderung der Brennweite der elektro-optischen Linse 7 einzustellen bzw. zu verstellen.

Auch die zweite Optik 5 und/oder die dritte Optik 16 kann eine elektro-optische Linse enthalten.

In 2 ist eine Weiterbildung der Anordnung der Linsen 3 und 5 von 1 schematisch dargestellt. Die Linsen 3 und 5 können als Strahlquerschnittswandler ausgebildet sein, der ver- bzw. einstellbar ist. Dazu sind die Linsen 3, 5 als elektro-optische Linsen 3, 5 ausgebildet. Die Linsen 3 und 5 werden mittels eines Steuermoduls 21 so angesteuert, daß ihre Brennpunkte, die zwischen den beiden Linsen 3 und 5 liegen, stets zusammenfallen und daß das von der Linse 5 ausgehende Strahlenbündel den gewünschten Querschnitt des Laserstrahlenbündels 2 aufweist. Dies ist in 2 für ein erstes zugeführtes Strahlenbündel 22 gezeigt (der eingezeichnete Pfeil zeigt die Ausbreitungsrichtung). In 3 wird ein zweites Strahlenbündel 23 mit größerem Durchmesser als das erste Strahlenbündel 22 zugeführt. Jedoch sind die Brennweiten der Linsen 3 und 5 so eingestellt, daß das von der Linse 5 kommende Laserstrahlenbündel 2 wiederum den gewünschten Strahlenquerschnitt aufweist.

Zwischen der Lasereinheit 1 und der Fokusebene 4 kann auch eine Lichtleitfaser (nicht gezeigt) angeordnet sein, in deren der Lasereinheit 1 zugeordnetes Ende die Laserstrahlung eingekoppelt wird und deren entgegengesetztes Ende in der Fokusebene 4 liegt. In diesem Fall kann die Linse 3 weggelassen werden.

Es ist natürlich auch möglich, die Linse 3 mit einem Strahlenbündel mit konstantem Durchmesser zu beaufschlagen, so daß bei Veränderung der Lage der Brennpunkte, wie in 4 und 5 gezeigt ist, der Durchmesser des von der Linse 5 ausgehenden Strahlenbündels variierbar ist. Die Brennweiten der Linsen 3 und 5 können in einem weiten Bereich variiert werden. Beispielsweise können die Linsen 3 und 5 in einem Abstand von 15 cm zueinander aufgebaut werden. Wenn man dann beispielsweise bei der Linse 3 eine Brennweite von 5 cm und bei der Linse 5 eine Brennweite von 10 cm mittels des Steuermoduls 21 einstellt, wird der Durchmesser des einfallenden Strahlenbündels 24 im ausfallenden Strahlenbündel 25 verdoppelt. Zur Halbierung des Durchmessers des einfallenden Strahlenbündels 24 kann man bei der Linse 3 eine Brennweite von 10 cm und bei der Linse 5 eine Brennweite von 5 cm mittels des Steuermoduls 21 einstellen (5). Natürlich sind mittels des Steuermoduls auch sämtliche andere Variationen der Brennweiten einstellbar, bei denen die Summe der Brennweiten stets dem Abstand der Linsen 3 und 5 entspricht bzw. bei dem die beiden Brennpunkte der Linsen 3 und 5 stets zusammenfallen.

Der in Verbindung mit 2 bis 5 beschriebene Strahlquerschnittswandler kann in einer Weiterbildung zusätzlich oder anstatt der Linse 7 im Laser-Scanning-Mikroskop LSM vorgesehen sein. Insbesondere wird der Strahlquerschnittswandler in Bereichen des Laser-Scanning-Mikroskops LSM angeordnet, in dem die Laserstrahlung zur Beleuchtung und/oder die Probenstrahlung kollimiert ist/sind. Ferner kann der Strahlquerschnittswandler im Objektivmodul 13 vorgesehen sein, so daß die Vergrößerung des Laser-Scanning-Mikroskops LSM elektrisch einstellbar ist (ohne daß eine mechanische Verschiebung oder Bewegung von Linsen notwendig ist).


Anspruch[de]
Laser-Scanning-Mikroskop mit

einem Beleuchtungsmodul (BM), das eine Lasereinheit (1), die ein Laserstrahlenbündel (2) erzeugt, und eine Scanneinheit (8) enthält, die das Laserstrahlenbündel (2) in einen vorbestimmten Bereich einer zu untersuchenden Probe (14) fokussiert und über den Bereich führt, wobei dabei aufgrund einer Wechselwirkung zwischen dem fokussierten Laserstrahlenbündel und der Probe (14) Probenstrahlung erzeugt wird,

und einem Detektionsmodul (DM), das die erzeugte Probenstrahlung konfokal detektiert, wobei das Beleuchtungs- und/oder das Detektionsmodul (BM, DM) zumindest eine Linse (7, 3, 5) enthält, deren Brennweite verstellbar ist.
Mikroskop nach Anspruch 1, bei dem die Linse (7, 3, 5) eine elektro-optische Linse ist, deren Brennweite durch Anlegen einer elektrischen Spannung verstellbar ist. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem die Linse (7), in Ausbreitungsrichtung des Laserstrahlenbündels (2) gesehen, so vor der Scanneinheit (8) angeordnet ist, daß das Laserstrahlenbündel zuerst durch die Linse (7) läuft und danach auf die Scanneinheit (8) trifft und daß auch die Probenstrahlung durch die Linse (7) läuft. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Detektionsmodul (DM) ein Objektivmodul (13) aufweist, wobei die Linse (7) in einer zur Austrittspupille des Objektivmoduls (13) in Detektionsrichtung konjugierten Ebene angeordnet ist. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem ferner ein Strahlteiler (6) vorgesehen ist, der das Laserstrahlenbündel von der Lasereinheit (1) zur Scanneinheit (8) lenkt und der Probenstrahlung zum Detektionsmodul (DM) lenkt. Mikroskop nach Anspruch 5, bei dem die Linse (3, 5) zwischen dem Strahlteiler (6) und der Lasereinheit (1) angeordnet ist. Mikroskop nach Anspruch 5 oder 6, bei dem die Linse (7) zwischen dem Strahlteiler (6) und der Scanneinheit (8) angeordnet ist. Mikroskop nach einem der Ansprüche 5 bis 7, bei dem die Linse (7) zwischen dem Strahlteiler (6) und dem Detektionsmodul (DM) angeordnet ist. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem die Linse (7, 3, 5) zur Verstellung der Fokuslage in der Probe dient. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, bei dem das Beleuchtungs- und/oder Detektionsmodul (BM, DM) neben der zumindest einen Linse (3) eine dieser nachgeordnete zweite Linse (5) und ein Steuermodul (21) aufweist, wobei die Brennweiten beider Linsen (3, 5) mittels des Steuermoduls (21) so verstellbar sind, daß die zwischen beiden Linsen (3, 5) liegenden Brennpunkte stets zusammenfallen. Laser-Scanning-Mikroskopierverfahren, bei dem ein Laserstrahlenbündel erzeugt, in einen vorbestimmten Bereich einer zur untersuchenden Probe fokussiert und innerhalb des Bereichs so abgelenkt wird, daß dabei aufgrund einer Wechselwirkung zwischen dem fokussierten Laserstrahlenbündel und der Probe Probenstrahlung erzeugt wird, und bei dem die erzeugte Probenstrahlung konfokal detektiert wird, wobei zur Beleuchtung und/oder zur Detektion zumindest eine Linse verwendet wird, deren Brennweite verstellbar ist.






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