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Dokumentenidentifikation DE60029818T2 25.10.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001233072
Titel NEUE VERWENDUNG VON URIDINDIPHOSPHAT-GLUKOSE 4-EPIMERASE
Anmelder Yamasa Corp., Choshi, Chiba, JP
Erfinder HAMAMOTO, Tomoki, Choshi-shi, Chiba 288-0814, JP;
NOGUCHI, Toshitada, Choshi-shi, Chiba 288-0812, JP
Vertreter Jung, Schirdewahn, Grünberg, Schneider Patentanwälte, 80538 München
DE-Aktenzeichen 60029818
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 22.11.2000
EP-Aktenzeichen 009778697
WO-Anmeldetag 22.11.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/JP00/08245
WO-Veröffentlichungsnummer 2001038555
WO-Veröffentlichungsdatum 31.05.2001
EP-Offenlegungsdatum 21.08.2002
EP date of grant 02.08.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 25.10.2007
IPC-Hauptklasse C12P 19/30(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 9/90(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/09(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   
IPC additional class C12R 1/125  (2006.01)  A,  L,  N,  20051017,  B,  H,  EP

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Verwendung von Uridindiphosphat Glukose 4-Epimerase (auch Uridindiphosphat Galaktose-4-Epimerase genannt), und auf ein Verfahren zur Umwandlung von Uridindiphosphat N-acetylglukosamin (UDP GlcNAc) in Uridindiphosphat N-acetylgalaktosamin (UDP GalNAc) durch die Verwendung des oben genannten Enzyms.

Hintergrund der Erfindung

Die jüngst erfolgten bemerkenswerten Fortschritte von molekular und von biochemisch orientierten Untersuchungen haben einige der wichtigen molekularen Funktionen und Rollen von Zuckern aufgeklärt, so dass es nun möglich ist, Zuckerketten als Arzneimittel zu entwickeln und funktionelle Materialien auf der Basis von Zuckerketten (Oligosacchariden) mit physiologischer Aktivität zu entwickeln. Trotzdem sind die Oligosaccharide, die zur Zeit als Reagenzien kommerziell erhältlich sind, auf ein paar wenige Typen beschränkt und zudem ausgesprochen kostspielig im Erwerb. Zudem werden solche Oligosaccharide nur auf dem Niveau von Reagenzien produziert und können daher nicht in größeren Quantitäten erhältlich gemacht werden.

Konventionell sind Oligosaccharide durch das nachstehende Verfahren hergestellt worden: Extraktion aus natürlich vorkommenden Substanzen, chemische Synthese, enzymatische Synthese, und Kombinationen dieser Verfahren, wobei die enzymatische Synthese für die Darstellung von Oligosacchariden im großen Maßstab als medizinische oder funktionelle Materialien als das geeigneteste Verfahren angesehen worden ist.

Die enzymatische Synthese wird deshalb als den anderen Verfahren überlegen angesehen, weil (1) dieses Verfahren keine komplizierten Schritte für die Schützung und Entschützung funktioneller Gruppen benötigt, wie diese in den Verfahren der chemischen Synthese von Nöten sind, und zudem in der Lage ist, schnell das gewünschte Oligosaccharid zu synthetisieren, und (2) es mit diesem Verfahren möglich ist, Oligosaccharide zu synthetisieren, die aufgrund der Substratspezifität des verwendeten Enzyms eine hohe strukturelle Spezifität aufweisen. Weiterhin haben jüngste Entwicklungen in der Biotechnologie wie zum Beispiel die Technologie der rekombinanten DNA es möglich gemacht, verschiedene Typen von Enzymen wirtschaftlich in großem Umfang zu produzieren, was ebenfalls einen Beitrag zur Etablierung der Überlegenheit der enzymatischen Synthese leistet.

Für die Synthese von Oligosacchariden durch enzymatische Synthese sind zwei Verfahren verfügbar: (1) die Rückreaktion der Hydrolase eines Oligosaccharids wird verwendet, und (2) eine Glykosyltransferase wird verwendet. Das vorstehende Verfahren hat den Vorteil, dass kostengünstige Monosaccharide als Substrat eingesetzt werden können, aber da es die Rückreaktion zur Hydrolyse ausnutzt, ist seine praktische Anwendung sehr schwierig hinsichtlich der Ausbeute bei der Synthese und hinsichtlich der Anwendbarkeit auf die Synthese von Oligosacchariden, die sich durch eine komplizierte Struktur auszeichnen.

Auf der anderen Seite wird das zweite Verfahren, welches eine spezifische Glykosyltransferase verwendet, als dem ersten Verfahren überlegen angesehen, weil dieses Verfahren auf die Produktion von Oligosacchariden angewandt werden kann, die sich durch eine komplizierte Struktur auszeichnen, und weil es hohe Ausbeuten in der Synthese liefert. Weiterhin trägt die Darstellung von verschiedenen Glykosyltransferasen in großem Umfang, die durch die jüngsten Entwicklungen in der Biotechnologie wie zum Beispiel die Technologie der rekombinanten DNA möglich gemacht wurde, dazu bei, die praktische Anwendung des genannten Verfahrens zu realisieren.

Dennoch sind die Zuckernukleotide, die üblicherweise als Zuckerdonoren verwendet werden, mit Ausnahme einiger weniger Typen noch immer sehr kostspielig, und tatsächlich nur in kleinen Mengen auf Reagenz-Niveau verfügbar. Betrachtet man zum Beispiel UDP GalNAc, welches einen Donor für N-Acetylgalaktosamin darstellt, welches wiederum in der Kernregion der Zuckerketten von O-gebundenen Glykoproteinen oder Sphingoglykolipiden enthalten ist, so wurde über ein Verfahren berichtet, nach dem diese Verbindung aus UDP GlcNAc unter Zuhilfenahme von Uridindiphosphat N-acetylglykosamin 4-Epimerase (UDP GlcNRc 4-Epimerase), welche aus tierischem Gewebe oder aus Bacillus subtilis gewonnen wurde, synthetisiert wurde. (Analytical Biochemistry, 127, 171–177 (1982); J. Biol. Chem., 234 (11), 2801–2805 (1959); JP-A-7-79792).

Wenngleich UDP GlcNAc ein Zuckernukleotid darstellt, welches relativ einfach in großer Menge herstellbar ist, so existiert UDP GlcNAc 4-Epimerase doch nur in kleinen Mengen in tierischem Gewebe oder in den Zellen von Bakterien. Zudem ist kein Bericht bekannt geworden, in dem die Darstellung dieses Enzyms durch die Technologie der rekombinanten DNA unter Verwendung eines UDP GlcNAc 4-Epimerase-Gens beschrieben wird. Daher ist es praktisch schwierig UDP GalNAc unter Verwendung des genannten Enzyms herzustellen, oder auch das Enzym selbst in großer Menge herzustellen.

Offenbarung der Erfindung

Als ein Resultat aus intensiven Studien zur Eliminierung der oben beschriebenen Probleme haben die vorliegenden Erfinder gefunden, dass die aus einem Bacillus subtilis stammende Uridindiphosphat Glukose 4-Epimerase (UDP Glukose 4-Epimerase) nicht nur Aktivität zur Katalyse der essentiellen gegenseitigen Umwandlung nach Formel (1) aufweist, sondern ziemlich überraschend auch Aktivität zur Katalyse der gegenseitigen Umwandlung nach Formel (2) aufweist.

  • (1) UDP Glukose ↔ UDP Galaktose
  • (2) UDP GlcNAc ↔ UDP GalNAc

UDP Glukose 4-Epimerase besitzt beides, eine Aktivität zur Katalyse der gegenseitigen Umwandlungsreaktion in Formel (1) wie auch eine Aktivität zur Katalyse der gegenseitigen Umwandlungsreaktion in Formel (2). (The Journal of Biological Chemistry, Vol. 258, No. 17, 10774–10778 (1983); Am. J. Hum. Genet. 61, 590–598 (1997)).

Das Verfahren unter Verwendung des besagten Enzyms ist unpraktikabel aus den Gründen, dass zum Beispiel die Herstellung von UDP Glukose 4-Epimerase aus tierischem Gewebe unzureichend ist, und dass es schwierig ist, dieses Enzym zu präparieren, und dass für die Durchführung der gegenseitigen Umwandlungsreaktion unter Verwendung des besagten Enzyms das teuere Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) als Co-enzym eingesetzt werden muss.

Auf der anderen Seite ist berichtet worden, dass eine aus Escherichia coli und aus Hefe gewonnene UDP Glukose 4-Epimerase keine Aktivität in der Katalyse der Umwandlungsreaktion von UDP GlcNAc in UDP GalNAc besitzt (J. Biol. Chem., 244, 2132–2136 (1969); Biochemistry, 7, 1645–1654 (1968); The Journal of Biological Chemistry, Vol. 258, No. 17, 10774–10778 (1983); Am. J. Hum. Genet., 61, 590–598 (1997)), und dass die UDP Glukose 4-Epimerase aus Bacillus subtilis ein völlig anderes Enzym ist als UDP GlcNAc 4-Epimerase aus Bacillus subtilis (J. Biol. Chem., 234 (11), 2801–2805 (1959); Chemistry, Vol. 258, No. 17, 10774–10778 (1983)), weshalb es ziemlich unerwartet war, zu der Erkenntnis zu gelangen, dass eine aus Bacillus subtilis gewonnene UDP Glukose 4-Epimerase Aktivität in der Katalyse von nicht nur der Umwandlungsreaktion von UDP Glukose in UDP Galaktose besitzt, sondern auch Aktivität in der Umwandlungsreaktion von UDP GlcNAc in UDP GalNAc zeigt.

Unsere weitere Forschung, die auf den oben genannten Befunden basiert, hat zur Aufdeckung der Tatsache geführt, dass nicht nur die aus Bacillus subtilis stammende UDP Glukose 4-Epimerase sondern auch solche aus anderen Bakterien, die sporenbildende Eigenschaften haben, Aktivität in der Katalyse der Umwandlungsreaktionen von UDP Glukose in UDP Galaktose und von UDP GlcNAc in UDP GalNAc besitzen. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser neuen Entdeckung erreicht.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch ein Verfahren zur Umwandlung von UDP GlcNAc in UDP GalNAc unter Verwendung einer Epimerase, wobei die genannte Epimerase eine UDP Glukose 4-Epimerase darstellt, die aus einem sporenbildenden Bakterium gewonnen worden ist.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein UDP GalNRc Zufuhrsystem bestehend aus UDP GlcNAc und einer UDP Glukose 4-Epimerase, die aus einem sporenbildenden Bakterium gewonnen worden ist.

Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von UDP GalNAc durch die Einwirkung einer Epimerase auf UDP GlcNAc, wobei besagte Epimerase eine UDP Glukose 4-Epimerase darstellt, die aus einem sporenbildenden Bakterium gewonnen worden ist.

Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Umwandlung von UDP GlcNAc in UDP GalNAc durch die Verwendung einer Epimerase, wobei besagte Epimerase eine solche ist, die eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie durch SEQ ID NO:1 in dem Sequenzprotokoll angezeigt ist, oder eine Epimerase, die eine Aminosäuresequenz wie durch SEQ ID NO:1 bezeichnet aufweist, und die eine Deletion, Substitution und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste erfahren hat und die gleiche enzymatische Aktivität aufweist wie die Epimerase, die die in SEQ ID NO:1 angezeigte Aminosäuresequenz besitzt.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein UDP GalNAc Zufuhrsystem bestehend aus UDP GlcNRc und einer Epimerase, die eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie durch SEQ ID NO:1 in dem Sequenzprotokoll angezeigt ist, oder eine Epimerase, die eine Aminosäuresequenz wie durch SEQ ID NO:1 bezeichnet aufweist, und die eine Deletion, Substitution und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste erfahren hat und die gleiche enzymatische Aktivität aufweist wie die Epimerase, die die in SEQ ID NO:1 angezeigte Aminosäuresequenz besitzt.

Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von UDP GalNAc durch die Einwirkung einer Epimerase auf UDP GlcNAc, wobei besagte Epimerase eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie durch SEQ ID NO:1 in dem Sequenzprotokoll angezeigt ist, oder eine Epimerase, die eine Aminosäuresequenz wie durch SEQ ID NO:1 bezeichnet aufweist, und die eine Deletion, Substitution und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste erfahren hat und die gleiche enzymatische Aktivität aufweist wie die Epimerase, die die in SEQ ID NO:1 angezeigte Aminosäuresequenz besitzt.

Beste Art zur die Durchführung der Erfindung

Die UDP Glukose 4-Epimerase, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht Gegenstand zu irgendwelchen Einschränkungen, solange als sie ein Enzym darstellt, das aus sporenbildenden Bakterien gewonnen wird und das in der Lage ist, die folgenden gegenseitigen Umwandlungsreaktionen (1) und (2) zu katalysieren:

  • (1) UDP Glukose ↔ UDP Galaktose
  • (2) UDP GlcNAc ↔ UDP GalNAc

Eine solche UDP Glukose 4-Epimerase kann aus sporenbildenden Bakterien wie jenen, die zum Genus Bacillus gehören, hergestellt werden.

Typische Beispiel von Bakterien, die zum Genus Bacillus gehören und die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind B. subtilis, B. halodurans, B. megaterium, B. cereus und B. stearothermophilus. Es ist besonders zu bemerken, dass das UDP Glukose 4-Epimerase-Gen (galE), das aus B. subtilis gewonnen werden kann, bereits geklont worden ist, und dass die DNA-Sequenz dieses Gens berichtet wurde (Gene Bank, Accession Nr. X99339).

Bevorzugt wird in der vorliegenden Erfindung eine aus B. subtilis gewonnene UDP Glukose 4-Epimerase verwendet, die durch die übliche Technologie der rekombinanten DNA auf der Basis der veröffentlichten DNA-Sequenz des besagten, geklonten Gens hergestellt wird. Dieses Enzym, wie es durch die DNA-Sequenz seines geklonten Gens verschlüsselt ist, besitzt eine Aminosäuresequenz, die als SEQ ID NO:1 in dem Sequenzprotokoll vermerkt ist. Dieses Enzym ist nicht das einzige Enzym, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann; es ist auch möglich ein Enzym zu verwenden, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 aufweist, die eine Deletion, Substitution und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste erfahren hat, und das gleiche enzymatische Aktivität aufweist wie das Enzym, das die in SEQ ID NO:1 angezeigte Aminosäuresequenz besitzt.

Ein aus B. subtilis gewonnenes UDP Glukose 4-Epimerase-Gen kann zum Beispiel dadurch erhalten werden, dass auf der Basis der berichteten DNA-Sequenz eine Sonde hergestellt wird, und dann ein DNA-Fragment aus der chromosomalen DNA von B. subtilis geklont wird, welches ein Gen beinhaltet, das UDP Glukose 4-Epimerase kodiert. Der Wirt für die Klonierung ist hier nicht spezifiziert, aber es ist zweckmäßig, hierfür aus Gründen der Vorteile bei der Handhabung und der einfachen Zugänglichkeit E. coli als Wirt zu verwenden. Ein Gen von einem Enzym, welches eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 aufweist, die eine Deletion, Substitution und/oder Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste erfahren hat, und das gleiche enzymatische Aktivität aufweist wie das Enzym, das die in SEQ ID NO:1 angezeigte Aminosäuresequenz besitzt, kann leicht durch ein brauchbares Verfahren wie zum Beispiel das Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese, das Verfahren der PCR oder das gewöhnliche Verfahren der Hybridisierung, auf der Basis der Verwendung des Gens galE erhalten werden.

Um ein System für die Hochexpression des geklonten Gens zu etablieren wird die DNA-Sequenz des DNA-Fragments, welches durch die Anwendung des Verfahrens nach Maxam-Gilbert (Methods in Enzymology, 65, 499, (1983)), des Verfahrens der Dideoxy-Kettentermination (Methods in Enzymology, 101, 20 (1983)) oder nach einem anderen Verfahren, das geeignet ist, die kodierende Region des besagten Gens zu spezifizieren, und ein Signal zur Expressionskontrolle (initiierende Signale der Transkription und der Translation) oberhalb der besagten Region eingebaut, um das besagte Gen in die Lage zu versetzen, in den mikrobiellen Zellen, die zum Mikroorganismus des Wirts gehören, die Expression durchzuführen, wodurch ein rekombinanter Expressionsvektor eingerichtet wird.

Als das Signal für die Expressionskontrolle zur Produktion von UDP Glukose 4-Epimerase in E. coli in großer Menge werden vorzugsweise leistungsstarke Initiationssignale der Transkription und der Translation verwendet, die nach Intention kontrolliert werden können und in der Lage sind, die Ausbeute bei der Produktion von UDP Glukose 4-Epimerase drastisch zu steigern. Ein solches leistungsstarkes Initiationssignal der Transkription liegt zum Beispiel im lac Promoter, im trp Promoter, im tac Promoter (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80, 21 (1983); Gene, 20, 231 (1982)) und im trc Promoter vor (J. Biol. Chem., 260, 3539 (1985)).

Als Vektor können verschieden Arten von Plasmidvektoren, Phagenvektoren u.s.w. verwendet werden, wobei bevorzugt ein Plasmidvektor benutzt wird, der eine hohe Kopienzahl in der bakteriellen Zelle hat, der in den Zellen von E. coli kopiert werden kann, und der einen passenden Marker für Arzneimittelresistenz sowie eine spezifische Spaltungsstelle für ein Restriktionsenzym aufweist. Typische Beispiele solcher Plasmidvektoren sind pBR322 (Gene, 2, 95 (1975)), pUC18 und pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)).

E. coli wird durch die Verwendung des zuvor präparierten rekombinanten Vektors transformiert. Mit E. coli als Wirtszelle kann die K12 Zelllinie, die C600 Zelllinie, die JM105 Zelllinie oder die JM109 Zelllinie, die für Experimente mit rekombinanter DNA herangezogen wird (Gene, 33, 103–119 (1985)), verwendet werden.

Viele Verfahren für die Transformation von E. coli sind bislang beschrieben worden, wie zum Beispiel ein Verfahren, in dem das Plasmid nach Behandlung mit Calciumchlorid bei einer tiefen Temperatur in die bakteriellen Zellen eingeführt worden ist (J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).

Der so erhaltene Transformant wird in einem Medium kultiviert, in dem dieser Mikroorganismus wachsen kann, und wird solange kultiviert, bis sich durch die Induktion der Expression der entsprechenden Gene große Mengen von UDP Glukose 4-Epimerase in den bakteriellen Zellen angehäuft haben. Die Kultivierung des Transformanten kann nach einem konventionellen Verfahren unter Verwendung eines Mediums, das Nährstoffe enthält, die für das Wachstum des besagten Mikroorganismus notwendig sind wie zum Beispiel Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die Kultivierung bei 20 bis 50 °C für etwa 10 bis 50 Stunden und wenn notwendig unter Belüftung und mit Rühren durchgeführt werden, wobei ein Medium verwendet wird, das üblicherweise für die Kultivierung von E. coli eingesetzt wird, wie zum Beispiel das Bouillon Medium, das LB Medium (1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt und 1 % übliches Salz), oder das 2 × YT Medium (1,6 % Trypton, 1 % Hefeextrakt und 0,5 % übliches Salz). Sofern das Plasmid als Vektor eingesetzt wird, wird eine passende Menge eines relevanten Antibiotikums (Ampicillin, Kanamycin, usw., abhängig vom Arzneimittelresistenzmarker des Plasmids) zu der Kultur zugesetzt, um ein Dropout des Plasmids während der Kultivierung zu verhindern.

Sofern die Expression des UDP Glukose 4-Epimerase-Gens induziert werden muss kann die Expression durch herkömmliche Verfahren induziert werden, die konventionell für den Promoter, der als Signal für die Expressionskontrolle verwendet wird, sind. Zum Beispiel kann im mittleren Stadium Isopropyl-&bgr;-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) als ein die Expression induzierendes Reagenz dem Medium in einer passenden Menge zugesetzt werden, wenn lac Promoter, tac Promoter und Ähnliches verwendet worden sind. Wenn der verwendete Promoter eine konstitutionelle Aktivität zur Transkription aufweist, wird der Zusatz eines solchen Reagenz nicht notwendig sein.

Das aus den sporenbildenden Bakterien mit Ausnahme von Bacillus subtilis gewonnene UDP Glukose 4-Epimerase Gen kann durch die Darstellung eines Primers mit Referenz zu der DNA-Sequenz des besagten, aus B. subtilis gewonnenen UDP Glukose 4-Epimerase Gens galE, suchen nach einem DNA-Fragment mit hoher Homologie mit galE in der chromosomalen DNA des sporenbildenden Bakteriums mit Ausnahme von B. subtilis, wobei der synthetisierte Primer als Sonde eingesetzt wird, und Klonierung dieses DNA-Fragments erhalten werden. Im Falle von B. Halodurans, welches ebenfalls ein Bakterium darstellt, das zum Genus Bacillus gehört, ist die gesamte Sequenz des Genoms bereits aufgeklärt worden (Extremophiles, 3(1), 21–28 (1999)), so dass die Klonierung hiervon mit Bezug auf die besagte und andere Informationen relativ einfach durchgeführt werden kann. Es ist möglich, für die Darstellung von UDP Glukose 4-Epimerase, die aus einem sporenbildenden Bakterium mit Ausnahme von B. subtilis durch die Anwendung der Technologie der rekombinanten DNA unter Verwendung eines geklonten DNA-Fragments gewonnen wird, der gleichen Prozedur zu folgen, wie sie für die Präparation des oben beschriebenen und aus B. subtilis gewonnenen UDP Glukose 4-Epimerase Gens galE verwendet wird.

Alternativ kann eine UDP Glukose 4-Epimerase, die aus einem sporenbildenden Bakterium mit Ausnahme von B. subtilis gewonnen wird, durch die Kultivierung des Bakteriums auf dem üblichen Wege und Reinigung der Kulturen dargestellt werden. Im Besonderen wird das Bakterium in einem SCD, einem Standard Agar oder in einem Nährstoff Agar Medium kultiviert. Die Kultivierung kann mittels eines konventionellen Verfahrens der Flüssigkultivierung bei einer Temperatur, die für das Wachstum des zu kultivierenden Bakteriums geeignet ist, wie zum Beispiel 25 bis 65 °C und, wenn notwendig, unter Belüftung und mit Rühren durchgeführt werden. Aus den so erhaltenen Kulturen werden die bakteriellen Zellen durch geeignete Verfahren wie zum Beispiel Membranfiltration oder Zentrifugieren gewonnen, und die gesammelten bakteriellen Zellen werden durch Behandlung mit Ultraschall oder anderen geeigneten Verfahren zerstört und danach einer oder einer Kombination von verschiedenen Behandlungen unterzogen, wie zum Beispiel Behandlung mit Hitze, Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, Dialyse, Verfahren der Chromatographie (Ionenaustausch, Gelfiltration usw.), um die gewünschte UDP Glukose 4-Epimerase zu erhalten. Der Nachweis und die Bestätigung der Präsenz von UDP Glukose 4-Epimerase kann bei den Schritten der Reinigung zum Beispiel durch das Verfahren der Messung der Aktivität der UDP Glukose 4-Epimerase durchgeführt werden, welches in den Beispielen der vorliegenden Beschreibung beschrieben ist.

Hinsichtlich der Art der Verwendung der so erhaltenen UDP Glukose 4-Epimerase in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es für den Fall der UDP Glukose 4-Epimerase, die durch die Technologie der rekombinanten DNA erhalten wurde, möglich, den besagten Transformanten direkt im Verfahren einzusetzen, oder aber der Transformant kann in der Form eines behandelten Produkts des Transformanten eingesetzt werden, oder in Form eines Enzyms, welches durch Reinigung des behandelten Produkts erhalten wird. Im Fall der UDP Glukose 4-Epimerase, die nach dem konventionellen Verfahren der Reinigung und ohne Nutzung der Technologie der rekombinanten DNA dargestellt wurde, kann diese in der vorliegenden Form eingesetzt werden.

Im Falle der Verwendung eines Transformanten als UDP Glukose 4-Epimerase ist es möglich, zum Beispiel die mikrobiellen Zellen, die aus den Kulturen des Transformanten durch Verfahren der fest/flüssig Separation wie zum Beispiel Zentrifugieren oder Membranfiltration gewonnen wurden, zu verwenden. Beispiele von behandelten Zellprodukten des Transformanten beinhalten zerstörte Zellprodukte ebenso wie modifizierte Produkte der Zellwand oder der zellulären Plasmamembranen, die von den besagten gewonnenen mikrobiellen Zellen durch gewöhnliche Behandlung wie zum Beispiel mechanische Zerstörung (zerstört durch Waring blender, French press, Homogenisator, Mörser usw.), Einfrieren und Wiederauftauen, Autolyse, Trocknung (Lyophilisierung, Lufttrocknung usw.), enzymatische Behandlung (Behandlung mit Lysozym usw.), Behandlung mit Ultraschall und chemische Behandlungen (Behandlungen mit Säure, einer Base usw.) erhalten wurden. Unter den Enzymen, die durch die Reinigung der besagten behandelten Produkte erhalten werden, befinden sich rohe oder gereinigte Enzyme, die aus den besagten Produkten der behandelten mikrobiellen Zellen erhalten werden können, indem die Fraktionen, die die gewünschte enzymatische Aktivität aufweisen, einer gewöhnlichen Reinigungsbehandlung für Enzyme unterworfen werden (Aussalzen, isoelektrische Fällung, Fällung durch Zugabe von organischen Solventien, Dialyse, Chromatographie usw.).

Die Umwandlungsreaktion von UDP GlcNAc in UDP GalNRc unter Verwendung einer solchen UDP Glukose 4-Epimerase, oder die Epimerisierung von UDP GlcNAc in UDP GalNAc kann zum Beispiel unter den folgenden Bedingungen durchgeführt werden.

Das UDP GlcNAc, das für diese Reaktion eingesetzt wird, ist bereits kommerziell erhältlich, und das kommerzielle Produkt kann in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Die Konzentration des UDP GlcNAc kann richtig eingestellt werden, zum Beispiel im Bereich von 1 bis 5 000 mM, vorzugsweise 10 bis 1 000 mM. Die Konzentration der UDP Glukose 4-Epimerase, die zu der Reaktionslösung zugesetzt wird, kann ebenfalls richtig eingestellt werden, zum Beispiel im Bereich von 0,001 bis 100 Einheiten/ml.

Die obige Reaktion kann in einem passenden Puffer wie zum Beispiel Tris – Chlorwasserstoffsäure oder Kaliumphosphat (pH 7–9, bevorzugt 7,5–8,5) bei 60 °C oder darunter, bevorzugt 15 bis 50 °C, über einen Zeitraum von etwa 1 bis 50 Stunden durchgeführt werden, falls notwendig mit Rühren.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird Magnesium nach Wunsch zu der obigen Reaktionslösung gegeben. Als Magnesium können Magnesiumsalze anorganischer Säuren wie zum Beispiel Magnesiumsulfat, Magnesiumnitrat und Magnesiumchlorid und Magnesiumsalze organischer Säuren wie zum Beispiel Magnesiumcitrat verwendet werden. Die Konzentration an Magnesium kann richtig eingestellt werden im Bereich von 5 bis 50 mM.

In dem Fall, in dem das produzierte UDP GalNAc aus der Mischung mit UDP GlcNAc isoliert werden muss, können die gewöhnlich verwendeten Verfahren zur Reinigung von Zuckernukleotiden (zum Beispiel verschiedene chromatographische Techniken wie zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie, Adsorptionschromatographie, Affinitätschromatographie und Gelfiltration, Verfahren, die die Verteilung zwischen zwei flüssigen Phasen ausnutzen wie zum Beispiel Gegenstromverteilung und Gegenstromextraktion, Verfahren, die die Unterschiede in der Löslichkeit ausnutzen wie zum Beispiel Auf konzentrieren, Kühlen und die Zugabe von organischen Solventien, und Aussalzen) unabhängig voneinander oder in einer passenden Kombination verwendet werden.

Das UDP GalNAc Zufuhrsystem besteht in der vorliegenden Erfindung aus UDP GlcNAc und UDP Glukose 4-Epimerase, die aus einem sporenbildendem Bakterium gewonnen wurde. Dieses Zufuhrsystem kann, wenn es zum Beispiel an eine Glykosyltransferase (GalNAc Transferase) allein oder an eine Kombination von letzterer mit einem UDP GlcNAc Regenerationssystem gekoppelt ist, zur Darstellung von Oligosacchariden verwendet werden, die N-Acetylgalaktosamin enthalten (JP-A-7-79792).

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird in genaueren Einzelheiten mit Verweis auf ein Beispiel erklärt, aber soll offensichtlich sein, dass die vorliegende Erfindung nicht auf dieses Beispiel beschränkt ist. In dem Beispiel, das im folgenden beschrieben ist, wurde die Bestimmung von UDP GalNAc in der Reaktionslösung durchgeführt mittels HPLC, wobei ODS-AQ312 Säulen von YMC Corp. für die Trennung und eine 1 mM Tetrabutuylammonium- und eine 50 mM Magnesiumacetat Lösung als Eluens verwendet wurden. Die Herstellung von DNA, die Spaltung durch ein Restriktionsenzym, die DNA Ligation durch die T4DNA Ligase und die Transformation von E. coli wurden alle entsprechend zu den Verfahren durchgeführt, wie sie in Sambrook et al; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989) beschrieben sind. Die Restriktionsenzyme AmpliTaqDNA Polymerase und T4DNA Ligase wurden von Takara Co., Ltd. erhalten.

Beispiel 1 (1) Klonen des UDP Glukose 4-Epimerase Gens

Chromosomale DNA von B. subtilis 168M (ATCC 27370) wurde durch das Saito-Miura Verfahren (Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)) hergestellt. Das B. subtilis UDP Glukose 4-Epimerase (galE) Gen wurde durch PCR vervielfältigt, wobei diese DNA maßvoll vervielfältigt wird und die folgenden zwei Arten von Primer DNA (SEQ ID NO: 2 und 3 in dem Sequenzprotokoll) verwendet wurden.

Primer (A): 5'-GATCTAGAAACCTCTATCGAATTGCTGG-3'

Primer (B): 5'-AACTGCAGGCCTCCATTCTTATTCCGCACT-3'

Die Amplifizierung des galE Gens durch PCR wurde durchgeführt, indem 25 mal die Schritte der thermischen Denaturierung (94 °C, 1 min), des Temperns (57 °C, 15 min) und der Polymerisation der Reaktionslösung [bestehend in 100 ⎕1 davon aus 50 mM Kaliumchlorid, 10 mM Tris – Chlorwasserstoffsäure (pH 8,3), 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0.001 % Gelatine, 0,2 mM dNTP, 0.1 &mgr;g temperierte DNA, Primer DNAs (A) und (B) (jeweils 0,2 &mgr;M) und 2,5 Einheiten von AmpliTag DNA-Polymerase] (72 °C, 3 min) unter Verwendung des DNA Thermal Cycler von Perkin-Elmer Cetus Instrument Co., Ltd. wiederholt wurden.

Nach der Gen Amplifizierung wurde die Reaktionslösung mit einer aus Phenol/Chloroform (1:1) gemischten Lösung behandelt und zu der wasserlöslichen Fraktion wurde Ethanol in einer Menge dazu gegeben, die doppelt so groß ist, um damit DNA auszufällen. Die ausgefallene und wiedergewonnene DNA wurde durch Agarose Gel Elektrophorese entsprechend den Verfahren in der Literatur (molecular Cloning, wie oben erwähnt) getrennt, um die DNA Fragmente von 1,2 kb zu reinigen. Diese DNA wurde durch die Restriktionsenzyme YbaI und PstI gespalten und dann mit dem Plasmid pTrc99A (erhalten von Pharmacia Biotech) unter Verwendung von T4DNA Ligase abgebunden, die das Plasmid abgebunden hat mit diesen Restriktionsenzymen YbaI und PstI. E. coli JM109 Ketten (erhalten von Takara Co. Ltd.) wurden unter Verwendung der Ligations-Reaktionslösung transformiert und das Plasmid pTrc-galE-1 wurde aus der erhaltenen Ampicillin resistenten Transformierung isoliert. Dieses Plasmid pTrc-galE-1 ist ein Produkt, das erhalten wurde durch Insertion in pTrc99A bei den XbaI PstI Spaltungsstellen unterhalb von dem trc Promoter, einem XbaI PstI DNA Fragment, das den Promoter und das strukturelle Gen von B. subtilis galE Gen enthält.

(2) Herstellung von UDP Glukose 4-Epimerase

Mit E. coli JM109 Ketten, die das Plasmid pTrc-galE-1 beherbergen, wurde ein 500 ml von 2 × YT Medium beimpft, das 100 &mgr;g/ml von Ampicillin enthält, und diese wurde einer schüttelnden Kultur bei 37 °C ausgesetzt. Wenn die bakterielle Zellenkultur 4 × 108 Zellen/ml erreichte, wurde IPTG zu der Kulturlösung zugegeben, so dass es eine endgültige Konzentration von 1 mM haben würde, und die schüttelnde Kultur wurde für 5 weitere Stunden bei 37 °C gehalten. Nach der Kultivierung wurden die bakteriellen Zellen durch Zentrifugieren (9 000 × g, 10 Min) gesammelt und in 50 ml von einer gepufferten Lösung (20 mM Tris – Chlorwasserstoffsäure (pH 8,0) und 2 mM EDTA) suspendiert. Die bakteriellen Zellen wurden durch Ultraschall zerstört und weiter zentrifugiert (20 000 × g, 10 Min), um den zellulären Rest zu entfernen.

Die so erhaltene überstehende Fraktion wurde für die Enzymherstellung bereit gestellt und die UDP Glukose 4-Epimerase Aktivität und die UDP GlcNAc 4-Epimerase Aktivität wurden in diesem Enzym Präparat bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammen mit den Ergebnissen des Kontrollbakteriums (E. coli MJM109 Ketten, die pTrc99A beherbergen) zu sehen. Die Einheit der Epimerase Aktivität in der vorliegenden Erfindung wurde wie folgt berechnet.

i) Bestimmung von UDP Glukose 4-Epimerase Aktivität und Verfahren der Bestimmung der Einheit der Aktivität

Das Enzym Präparat wurde zu einem 50 mM Tris – Chlorwasserstoffsäure Puffer (pH 8,0), der 2,5 mM Magnesiumchlorid und 10 mM UDP Glukose enthält, gegeben und auf 37 °C erwärmt, um die Reaktion durchzuführen, gefolgt von einem 5-minütigem Kochen, um das Enzym zu inaktivieren. Die UDP Galaktose in der Reaktionslösung wurde durch HPLC bestimmt. Die Aktivität, die 1 &mgr;mol von UDP Galaktose bei 37 °C in einer Minute bildet, wird als eine Einheit definiert.

ii) Bestimmung von UDP GlcNAc 4Epimerase Aktivität und Verfahren der Bestimmung der Einheit der Aktivität

Das Enzym Präparat wurde zu einem 50 mM Tris – Chlorwasserstoffsäure Puffer (pH 8,0), der 2,5 mM Magnesiumchlorid und 10 mM UDP GlcNAc enthält, gegeben und auf 37 °C erwärmt, um die Reaktion durchzuführen, gefolgt von einem 5-minütigem Kochen, um das Enzym zu inaktivieren. Die UDP GalNAc in der Reaktionslösung wurde durch HPLC bestimmt. Die Aktivität, die 1 &mgr;mol von UDP GalNAc bei 37 °C in einer Minute bildet, wird als eine Einheit definiert.

Tabelle 1

(3) Darstellung von partiell gereinigtem UDP Glukose 4-Epimerase Produkt

Zu dem Enzympräparat, die nach (2) oben erhalten wurde, wurde Ammoniumsulfat in einer solchen Menge gegeben, dass eine 40 %ige Sättigung erreicht wurde, und die Mischung wurde über Nacht bei 4 °C gerührt und dann zentrifugiert (20 000 × g, 10 Min), um den Niederschlag zu entfernen. Ammoniumsulfat wurde wieder zu der überstehenden Fraktion gegeben, um eine 80 %ige Sättigung zu erreichen, und die Mischung wurde über Nacht bei 4 °C gerührt und dann zentrifugiert (20 000 × g, 10 Min). Die ausgefallene Fraktion wurde in 5 ml eines 20 mM Tris – Chlorwasserstoffsäure-Puffers (pH 8,0) gelöst und zweimal in 1 Liter der genannten Pufferlösung dialysiert. Die so erhaltene Probe wurde als die Enzymlösung verwendet und in der Synthesereaktion eingesetzt, die unten unter (4) beschrieben ist. Die Aktivität der UDP GlcNAc 4-Epimerase in dieser Enzymlösung betrug 4,38 Einheiten/mg Protein.

(4) Darstellung von UDP GalNAc

0,212 Einheiten der nach (3) oben erhaltenen Enzymlösung wurden zu 500 &mgr;l eines 100 mM Tris – Chlorwasserstoffsäure-Puffers (pH 8,0) gegeben, der 180 mM UDP GlcNAc und 10 mM Magnesiumchlorid enthält, und bei 37 °C für 21 Stunden reagieren gelassen. Die HPLC-Analyse der Reaktionslösung zeigte die Bildung von 50,38 mM UDP GalNAc an.

Gewerbliche Anwendbarkeit

Aus Gründen wie der unzureichenden Produktion des Enzyms im tierischen Gewebe und in den bakteriellen Zellen war jede der bislang berichteten Verfahren für die Darstellung von UDP GalNAc mittels UDP GlcNAc 4-Epimerase weit von jeglichem praktischen Wert.

Die vorliegenden Erfinder fanden heraus, dass eine aus sporenbildenden Bakterien gewonnene UDP Glukose 4-Epimerase nicht nur in der Lage ist, eine Reaktion der Umwandlung von UDP Glukose in UDP Galaktose zu induzieren, sondern auch eine Aktivität für die Katalyse der Umwandlungsreaktion von UDP GlcNAc in UDP GalNAc aufweist. Diese Offenbarung hat es zum ersten Mal möglich gemacht, die Umwandlungsreaktion von UDP GlcNAc in UDP GalNRc für praktische Anwendungen zu verwenden.

SEQUENZPROTOKOLL


Anspruch[de]
Verfahren zum Umwandeln von Uridindiphosphat-N-acetylglucosamin in Uridindiphosphat-N-acetylgalactosamin unter Verwendung einer Epimerase, wobei die Epimerase Uridindiphosphatglucose-4-epimerase ist, die aus einem sporenbildenden Bakterium gewinnbar ist. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das sporenbildende Bakterium ein Bakterium ist, das der Gattung Bacillus angehört. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das sporenbildende Bakterium Bacillus subtilis ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Uridindiphosphatglucose-4-epimerase eine ist, die nach der rekombinanten DNA-Technologie unter Verwendung eines Uridindiphosphatglucose-4-epimerasegens (galE) hergestellt wird, das aus Bacillus subtilis gewinnbar ist. Verfahren zum Umwandeln von Uridindiphosphat-N-acetylglucosamin in Uridindiphosphat-N-acetylgalactosamin unter Verwendung einer Epimerase, wobei die Epimerase die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:1 oder die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 hat, die einer Deletion, einer Substitution und/oder einer Addition eines bis mehrerer Aminosäurereste unterzogen wurde, und auch die gleiche Enzymaktivität wie die Epimerase hat, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:1 hat. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Epimerase nach der rekombinanten DNA-Technologie hergestellt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das das Isolieren der Uridindiphosphat-N-acetylgalactosamin umfasst. Uridindiphosphat-N-acetylgalactosamin-Zufuhrsystem, umfassend Uridindiphosphat-N-acetylglycosamin und eine Uridindiphosphatglucose-4-epimerase, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert.






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