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Dokumentenidentifikation DE102006019480A1 31.10.2007
Titel Verfahren zur in-vitro Überwachung postoperativer Veränderungen nach Lebertransplantation
Anmelder SIRS-Lab GmbH, 07745 Jena, DE
Erfinder Rußwurm, Stefan, Dr.med., 07743 Jena, DE
Vertreter WINTER, BRANDL, FÜRNISS, HÜBNER, RÖSS, KAISER, POLTE, Partnerschaft, 85354 Freising
DE-Anmeldedatum 26.04.2006
DE-Aktenzeichen 102006019480
Offenlegungstag 31.10.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 31.10.2007
IPC-Hauptklasse C07H 21/00(2006.01)A, F, I, 20060426, B, H, DE
IPC-Nebenklasse C12Q 1/68(2006.01)A, L, I, 20060426, B, H, DE   C40B 40/06(2006.01)A, L, I, 20060426, B, H, DE   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen für die Erfassung etwaiger postoperativ auftretender Gewebeunverträglichkeitsreaktionen nach einer erfolgten Lebertransplantation, wobei man in Patienten die Genaktivität einer Mehrzahl von bestimmten, mit einer Lebertransplantation in Zusammenhang stehenden Genen in einer Patientenprobe bestimmt und die für die Überwachung der postoperativen Zustände spezifischen Gene und/oder Genfragmente ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus: SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 532, wobei diese bevorzugt in mehrere Cluster unterteilt werden.

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen für die Erfassung etwaiger postoperativ auftretendere Gewebeunverträglichkeitsreaktionen nach einer erfolgten Lebertransplantation gemäß Anspruch 1, ein Verfahren zur in vitro Messung derartiger Genexpressionsprofile gemäß Anspruch 13. Die Erfindung betrifft ferner eine Verwendung der Genexpressionsprofile und/oder von den hierfür verwendeten Sonden zum Ausschalten und/oder zur Aktivitätsveränderung von Zielgenen und/oder zur Bestimmung der Genaktivität für die Bestimmung des Abstoßungsrisikos eines Patienten, der ein Transplantat erhalten hat, gemäß Anspruch 27, einen Kit gemäß Anspruch 30 sowie Cluster von Polynucleotiden gemäß den Ansprüchen 31 bis 34.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neue Möglichkeiten der Überwachung postoperativer Veränderungen nach Lebertransplantationen, um ein etwaiges Abstoßungsrisiko frühzeitig zu erkennen.

Die Leber zählt zu den wichtigsten und größten inneren Organen im menschlichen Körper. Sie ist an fast allen Stoffwechselvorgängen wesentlich beteiligt (Jecklin, 2004). Die Leber gilt dabei nicht nur als wichtigstes Stoffwechselorgan, sondern ist auch die Entgiftungszentrale im menschlichen Körper (Jecklin, 2004; Trebsdorf et al., 1998). Jedoch, ist die Leber einer Vielzahl von Erkrankungen ausgesetzt. Hauptursachen sind neben übermäßigen Alkoholkonsum auch Bakterien- bzw. Virusinfektionen (z.B. Hepaptitis) oder hereditäre Faktoren. Häufig werden Anzeichen einer Leberkrankheit als Alltagsbeschwerden diagnostiziert und zu spät therapiert (www.leber-info.de). Bestimmte Grunderkrankungen (Tab. 1) führen dabei schließlich zu irreversiblen Schäden der Leber. Fast alle Formen der irreversiblen Leberinsuffizienz mit drohendem Organversagen stellen potentielle Indikatoren zur Lebertransplantation dar (Penko and Tirbaso., 1999).

Tabelle. 1: Typische Erkrankungen, welche die Notwendigkeit einer Lebertransplantation bedingen. Hervorgehobene Begriffe stellen die häufigsten Indikatoren für eine Lebertransplantation dar (Penko and Tirbaso., 1999).

Schäden durch Lebererkrankungen sowie eine späte Diagnose können zu Leberversagen führen. Leberversagen haben eine hohe Sterblichkeit und beeinflussen eine Vielzahl andere Organe (Bauer et al., 2005). Trotz einer hohen Sterblichkeit durch Leberversagen sind Lebertransplantation immer noch die Behandlungsmethode der Wahl, falls spezifische Indizes, wie beispielsweise King's College oder Clichy Kriterium, einen ungünstigen Verlauf der Erkrankung prognostizieren (Bauer et al., 2005). Im Jahre 2003 gab es allein in Deutschland 11.797 Patienten, die auf ein Spenderorgan warteten, darunter 1266 Menschen mit der dringlichen Notwendigkeit für eine Lebertransplantation (www.dso.de). Die Problematik der langen Wartelisten bedingt durch das Fehlen einer genügend großen Anzahl von geeigneten Spenderorganen ist trotz vielseitiger Anstrengungen und des Aufbaus einer Europa-weiten Spenderorganvermittlung noch keineswegs gelöst. Die allogene Transplantation wird dabei von einer lebenslangen Immunsuppressionstherapie begleitet, die hyperakute, akute oder chronische Abstoßungsreaktionen unterdrückt. Zusätzlich sind die Betroffenen oft mit einer Re-Infektion, insbesondere mit viralen Erregern wie Epstein-Barr- oder Zytomegalievirus (CVM) belastet (Gao and Zheng, 2004). Hinzu kommen schwere Komplikationen vorwiegend im frühen postoperativen Verlauf, besonders Fehlfunktionen der transplantierten Leber und akute Abstoßungskrisen. Die postoperative Abstoßungsrate liegt bei Lebertransplantationen bei ca. 36 % (Shimizu et al., 2003). Initiale intensivmedizinische Überwachung und engmaschige Nachsorge sind deshalb von besonderer Wichtigkeit für die betroffenen Patienten (Müller und Neuhaus, 2004).

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Möglichkeiten zur in-vitro Diagnose bereitzustellen, die eine postoperative Aussage erlauben, ob die einem Patienten transplantierte Spenderleber angenommen wird oder nicht und gegebenfalls Prognosen für das Auftreten von Abstoßungsreaktionen zu erstellen und frühzeitig therapeutische Maßnahmen zu ergreifen.

Die obige Aufgabe wird durch eine Verwendung gemäß Anspruch 1 und Anspruch 27 gelöst.

Verfahrenstechnisch wird die Aufgabe durch Anspruch 13 gelöst.

Ein Kit gemäß Anspruch 30 sowie Cluster von Polynucleotiden gemäß den Ansprüchen 31 bis 34 lösen die Aufgabe ebenfalls.

Insbesondere wird die Aufgabe gelöst durch eine Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen für die Erfassung etwaiger postoperativ auftretender Gewebeunverträglichkeitsreaktionen nach einer erfolgten Lebertransplantation.

Ferner dient die vorliegende Erfindung der therapiebegleitenden Verlaufsbeurteilung von Patienten, die ein Lebertransplantation hatten. Weiterhin ermöglicht die Erfindung die Verwendung der Genexpressionsprofile für die Bestimmung des Abstoßungsrisikos eines Patienten, der ein Transplantat erhalten hat.

Die vorliegende Erfindung kann auch zur Herstellung von „in silico" Expertensystemen und/oder zur „in silico" – Modellierung von zelluläreren Signalübertragungswegen verwendet werden.

Zur Erstellung des Genexpressionsprofiles gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Mehrzahl von spezifischen Genen und/oder Genfragmenten verwendet, welche ausgewählt werden aus der Gruppe in Tabellen 6-9 bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 532 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

Diese Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 532 sind durch den Umfang der vorliegenden Erfindung mit umfaßt und sind dem angefügten, 532 Sequenzen umfassenden, Sequenzprotokoll, das somit Bestandteil der Beschreibung der vorliegenden Erfindung ist, im Einzelnen offenbart und ist somit ebenfalls Bestandteil der Offenbarung der Erfindung.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen und/oder von den hierfür verwendeten Sonden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 532 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden, zum Ausschalten und/oder zur Aktivitätsveränderung von Zielgenen und/oder zur Bestimmung der Genaktivität zur Überwachung postoperativer Veränderungen nach Lebertransplantation und/oder zur Bestimmung der Genaktivität zur Bestimmung des Abstoßungsrisikos eines Patienten, der ein Lebertransplantat erhalten hat.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in der Generierung von Genaktivitätsclustern, wobei in den jeweiligen Clustern mindestens zwei Genen und/oder Genfragmente aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 532 gruppiert werden, deren Expressionsverhalten sich in den verschiedenen Patientenproben ähneln. In einer weiteren Ausführungsform werden diese Genaktivitätscluster miteinander verglichen und ermöglichen so eine Aussage über die postoperativen Veränderungen von Patienten mit Lebertransplantationen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß ein spezifisches Gen und/oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 532 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche Sequenzen verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche Sequenzen verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 unterschiedliche Sequenzen verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die in Anspruch 3 aufgelisteten Gene oder Genfragmente und/oder von deren RNA abgeleiteten Sequenzen ersetzt werden durch synthetische Analoga, Aptamere sowie Peptidonukleinsäuren.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die synthetischen Analoga der Gene 5-100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Genaktivitäten mittels Hybridisierungsverfahren bestimmt wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Genaktivität mittels Microarrays bestimmt wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Genaktivität durch Hybridisierungs-unabhängige Verfahren, insbesondere enzymatische und/oder chemische Hydrolyse und/oder Amplifikationsverfahren, vorzugsweise PCR, anschließende Quantifizierung der Nukleinsäuren und/oder von Derivaten und/oder Fragmenten derselben, bestimmt wird.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.

Es ist dem Fachmann klar, daß die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.

Als Markergene im Sinne der Erfindung werden alte abgeleiteten DNA-Sequenzen, Partialsequenzen und synthetischen Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren, PNA) verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.

Die auf Blut bezogene Beschreibung der Erfindung stellt nur eine beispielhafte Anwendung der Erfindung dar. Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten des Menschen verstanden.

Für die Zwecke einer vollständigen Offenbarung der vorliegenden Lehre wird festgestellt, dass mit den ursprünglich eingereichten Ansprüchen auch sämtliche und/oder -Kombinationen der Ansprüche für den Fachmann mit offenbart sind. Insbesondere ist beipielsweise auch eine Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 26 und/oder zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 13 bis 26 offenbart.

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung eines Ausführungsbeispiels sowie anhand der Zeichnung.

Es zeigt:

1: eine farbige Darstellung von Ähnlichkeiten des Expressionsverhaltens bestimmter Gene zugeordneten Gencluster; und

2: typische Repräsentanten von 4 Genaktivitätsclustern mit spezifischen Expressionsverläufen.

Ausführungsbeispiel

Für die Messung der differentiellen Genexpression zur Überwachung postoperativer Veränderungen nach Lebertransplantation wurden Untersuchungen von Vollblutproben von insgesamt 22 Patienten, welche auf operativen Intensivstationen behandelt wurden, durchgeführt.

Das Ausführungsbeispiel wird anhand folgender Abbildungen erläutert:

1 betrifft die Darstellung des zugehörigen Gencluster zu Ähnlichkeiten des Expressionsverhaltens bestimmter Gene zwischen einzelnen Proben.

Jeder Punkt der Farbmatrix repräsentiert die relative Expression eines Gens in einer Blutprobe im Verhältnis zu einer Kontrolle, im Beispielsfalle Sig-M5, (vertikal: Patientenproben mit aufsteigender Identifikationsnummer; horizontal: 532 untersuchte Gene). Die jeweiligen Farben repräsentieren die Expression der individuellen Gene, wobei Rot relative Expression größer als Mittelwert und Grün relative Expression kleiner als Mittelwert markieren; graue Felder weisen auf fehlende Werte.

2 betrifft typische Repräsentanten der 4 Genaktivitätscluster mit spezifischen Expressionsverläufen.

Das erste Genaktivitätscluster ist repräsentiert durch das Gen PPBP (Sequenz No. 112) (A); das zweite Genaktivitätscluster durch das Gen MKNK1 (Sequenz No. 220) (B), das dritte Genaktivitätscluster durch das Gen IL22RA2 (Sequenz No. 379) (C) und das vierte Genaktivitätscluster durch das Gen IL2RB (Sequenz No. 477) (D). Die mit einer gestrichelten Linie verbundenen Punkte stellen den Gruppenmittelwert dar. Die grauen senkrechten Linien markieren den mittleren Streubereich innerhalb der Patientengruppe.

Die erste Blutprobe wurde unmittelbar vor dem chirurgischen Eingriff entnommen (t0). Direkt nach der intraoperativen Phase (t0 post) bzw. nach drei (t3 post), sieben (t7 post) und vierzehn Tagen (t14 post) wurden weitere postoperative Blutproben von allen Patienten sichergestellt. Nach Abnahme des Vollblutes wurde die Gesamt-RNA der Proben unter Anwendung des PAXGene Blood RNA Kit gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert.

Als Referenzproben dienten die Gesamt-RNA aus der kommerziell erhältlichen Monoblastenleukämie-Zelllinie Sig-M5.

Je nach verwendeter Methode zur Erfassung des Genexpressionsprofils können auch andere Kontrollen/Referenzproben/Kalibrierungskontrollen, z.B. Housekeeping- oder Spikesequenzen verwendet werden.

Zellkultivierung

Für die Zellkultivierung (Kontrollproben) wurden 19 Kryozellkulturen (SIG-M5) (eingefroren in flüssigem Stickstoff) genutzt. Die Zellen wurden jeweils mit 2 ml Iscove's Medium (Biochrom AG) beimpft und mit 20% fetalen Kälber Serum (FCS) ergänzt. Die Zellkulturen wurden anschliessend für 24 Stunden bei 37° C unter 5% CO2 in 12-well Platten inkubiert. Danach wurde der Inhalt von 18 Wells in 2 Teile mit jeweils dem gleichen Volumen geteilt, sodass schliesslich 3 Platten des gleichen Formats (insgesamt 36 Wells) zur Verfügung standen. Die Kultivierung wurde anschliessend für 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen fortgeführt. Im Anschluss daran wurden die resultierenden Kulturen von 11 Wells jeder Platte vereint und zentrifugiert (1000 × g, 5 min, Raumtemperatur). Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 40 ml des o.g. Mediums gelöst. Diese 40 ml gelöste Zellen wurden in zwei 250 ml Kolben zu gleichen Teilen aufgeteilt und nach 48 Stunden Inkubation und Zugabe von 5 ml des o.g. Mediums wiederum inkubiert. Von den restlichen 2 ml der zwei verbleibendenden Platten wurden 80 &mgr;l in leere Wells der gleichen Platten gegeben, welche bereits vorher mit 1 ml des o.g. Mediums präpariert waren. Nach 48 Stunden Inkubation wurde nur eine der 12 Well-Platten wie folgt prozessiert: Aus jedem Well wurden 500 &mgr;l entnommen und vereint. Die daraus resultierenden 6 ml wurden in einen 250 ml Kolben gegeben, welcher ca. 10 ml frisches Medium enthielt. Dieses Gemisch wurde mit 1000 × g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und in 10 ml des o.g. Mediums gelöst. Die anschliessende Zellzählung ergab folgendes Ergebnis: 1,5 × 107 Zellen pro ml, 10 ml Gesamtvolumen, Gesamtzahl der Zellen: 1,5 × 108. Da die Zellzahl noch nicht ausreichend war, wurden 2,5 ml des o.g. Zellsuspension in 30 ml des o.g. Mediums in einen 250 ml (75 cm2) Kolben gegeben (insgesamt 4 Kolben). Nach 72 Sunden Inkubationszeit wurden jeweils 20 ml frischen Mediums in die Kolben gegeben. Nach folgender 24-stündiger Inkubation erfolgte die Zellzählung wie oben beschrieben, die eine Gesamtzellzahl von 3,8 × 108 Zellen ergab. Um die gewünschte Zellzahl von 2 × 106 Zellen zu errreichen wurden die Zellen in 47,5 ml des o.g. Mediums in 4 Kolben resuspendiert. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die Zellen zentrifugiert und zweimal mit Phosphatpuffer ohne Ca2+ und Mg2+ (Biochrom AG) gewaschen.

Die Isolation der Gesamt-RNA erfolgt mittels des NucleoSpin RNA L Kits (Machery&Nagel) entsprechend den Angaben des Herstellers. Die oben beschriebene Prozedur wurde wiederholt bis die erforderliche Zellzahl erreicht wurde. Dies war nötig, um die erforderliche Menge von 6 mg Gesamt-RNA zu erreichen, was etwa einer Effizienz von 600 &mgr;g RNA pro 108 Zellen entspricht.

Die allgemeinen Daten der Patienten können aus der Tabelle 2 entnommen werden und die prä-operativen Daten aus Tabelle 3.

Tabelle 2: Allgemeine klinische Daten.
Tab. 3: Prä-operative Patientendaten
  • 1Angabe als Medianwerte und die Werte in Klammern stellen die Differenz der 75 %und 25 %-Perzentile dar.

Die intra-operativen und post-operativen Daten der Transplantierten werden in den nachstehenden Tabellen (Tabelle 4; Tabelle 5) veranschaulicht.

Tab. 4: Intraoperative Daten der Patientenkohorte
Tab. 5: Postoperative Charakterisierung der Patientenkohorte.

Alle Patientenproben wurden mit der Referenzprobe jeweils auf einem Microarray ko-hybridisiert.

Reverse Transkription/Markierung/Hybridisierung

Nach Abnahme des Vollblutes wurde die Gesamt-RNA der Proben unter Verwendung des PAXGene Blood RNA Kits (PreAnalytiX) gemäss den Vorgaben des Herstellers isoliert und auf ihre Qualität geprüft. Von jeder Probe wurden 8 &mgr;g Gesamt-RNA aliquotiert und zusammen mit 10 &mgr;g Gesamt-RNA aus SIGM5-Zellen als Referenz-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der reversen Transkriptase Superscript II (Invitrogen) umgeschrieben und die RNA anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt. Im Reaktionsansatz wurde ein Teil des dTTP durch Aminoallyl-dUTP (AA-dUTP) ersetzt, um später die Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes an die cDNA zu ermöglichen.

Nach der Aufreinigung des Reaktionsansatzes wurden die cDNA der Proben und Kontrollen mit den Fluoreszenzfarbstoffen DY-547 und DY-647 der Firma Dyomics kovalent markiert (Dye swap) und auf einem Microarray der Firma SIRS-Lab hybridisiert. Auf dem verwendeten Microarray befinden sich 5308 immobilisierte Polynukleotide mit einer Länge von 55-70 Basenpaaren, die jeweils ein humanes Gen repräsentieren und Kontrollspots zur Qualitätssicherung. Ein Microarray unterteilt sich in 28 Subarrays mit einem Raster von 15 × 15 Spots.

Die Hybridisierung und das anschliessende Waschen bzw. Trocknen wurde in der Hybridisierungsstation HS 400 (Tecan) nach Angaben des Herstellers über 10,5 Stunden bei 42 °C durchgeführt. Die verwendete Hybrididierungslösung besteht aus den jeweiligen gelabelten cDNA-Proben, 3,5 × SSC (1 × SSC enthält 150 mM Natriumchlorid und 15 mM Natriumcitrat), 0,3% Natriumdodecylsulfat (V/V) 25% Formamid (V/V) und je 0,8 &mgr;g &mgr;l-1 cot-1 DNA, Hefe t-RNA und poly-A RNA. Das anschliessende Waschen der Mikroarrays wurde mit nachfolgendem Programm bei Raumtemperatur wie folgt durchgeführt: je 90 Sekunden spülen mit Waschpuffer 1 (2 × SSC, 0,03% Natriumdodecylsulfat), mit Waschpuffer 2 (1 × SSC) und abschließend mit Waschpuffer 3 (0,2 × SSC). Danach wurden die Mikroarrays unter einem Stickstoffstrom mit einem Druck von 2,5 bar bei 30 °C über 150 Sekunden getrocknet.

Auswertung

Nach der Hybridisierung wurden die Hybridisierungssignale der Microarrays mit einem GenePix 4000B Scanner (Axon) ausgelesen und die Expressionsverhältnisse der differenziert exprimierten Gene mit der Software GenePix Pro 4.0 (Axon) bestimmt. Für die Auswertung wurde die mittlere Intensität eines Spots als der Medianwert der zugehörigen Spotpixel bestimmt.

Korrektur systematischer Fehler:

Die Korrektur systematischer Fehler erfolgte nach dem Ansatz von Huber u a. (Huber et al., 2003). Dabei wurden der additive und der multiplikative Bias innerhalb eines Mikroarrays aus 70% der vorhandenen Genproben geschätzt. Für alle weiteren Berechnungen wurden die Signale mittels arcus sinus hyperbolicus transformiert.

Biostatistische Auswertung der Microarrays:

Ziel der Datenanalyse war die Extraktion von Genexpressionsmustern, welche für den operativen Eingriff bei einer Lebertransplantation charakteristisch sind. In Anlehnung an die Arbeit von Tomic u.a. (Tomic V., et. al.,2005) wurde die Analyse in drei Schritten durchgeführt:

  • 1. Schritt: In die Datenanalyse wurden Gensonden eingeschlossen, deren Signale in ausreichender Intensität gemessen wurden. Hierbei wurde die mittlere Spotqualität im Gesamtexperiment bewertet. Demnach wurden 4176 Sonden in der Analyse betrachtet. Die resultierende Datenmatrix enthielt ca. 2,3% fehlende Werte, die durch Schätzwerte ersetzt wurden (vgl. Troyanskaya u. a. (Troyanskaya, et al., 2001)).
  • 2. Schritt: Unter Hinzuziehung eines geeigneten statistischen Tests wurden Gene identifiziert, welche sich aufgrund der Transplantation bei allen Patienten in gleicher Weise verändert haben. Dafür wurde, Gen für Gen, der multivariate Einstichproben-PC-Test nach Läuter (Läuter, 1996) angewandt, der eine Verallgemeinerung des einfachen t-Tests bildet. Als Ergebnis wurde jedem Gen ein p-Wert zugewiesen, der den statistischen Unterschied in der zeitlichen Variation der Expression des jeweiligen Gens widerspiegelt. Um eine Signifikanzschwelle zu bestimmen, die eine Auswahl von differenziert exprimierten Genen ermöglicht, wurde das Konzept von Storey und Tibshirani gewählt (Storey und Tibshirani, 2003). Dabei wird der Anteil der falsch positiven Entscheidungen (engl. False Discovery Rate) mit Hilfe des sogenannten q-Wertes geschätzt. 532 Sonden mit einem q-Wert kleiner als 0,05 waren Einschlusskriterien für die endgültige Genliste. Die Schwelle wurde so festgelegt, dass ein optimales Verhältnis der gefundenen signifikanten Gene zum zugehörigen Anteil der falsch positiven erreicht wurde. Nach dieser Schätzung enthält die finale Liste ca. 5 % (~ 26 von 532) falsch positive Gensonden.
  • 3. Schritt: Im statistischen Vergleich wurden Gene identifiziert, die sich in Folge der Transplantation signifikant bei allen Patienten in gleicher Weise verändert haben. Um charakteristische Muster der Genexpression zu erhalten, wurden Verläufe der ausgewählten 532 exprimierten Gene mit Hilfe des hierarchischen Clusteralgorithmus angeordnet und in einem entsprechenden Muster dargestellt. In dem Clusteralgorithmus wurde die Korrelation als Abstandsmaß gewählt. Die „average linkage" – Methode diente als Grundlage für die Erstellung des zugehörigen Dendrogramms. In der Darstellung des zugehörigen Gencluster werden Ähnlichkeiten des Expressionsverhaltens bestimmter Gene zwischen einzelnen Proben angezeigt 1. Die geordnete Liste der Gene mit den entsprechenden mittleren Expressionswerten werden in der Tabelle 6-9 zusammengefasst.

Im Gencluster wurde eine Verteilung der Gene in vier ähnliche Gengruppen mit differenziert exprimierten Genverläufen aufgedeckt, die folgende biologisch interpretierbare Expressionsveränderungen aufwiesen:

Die erste Gruppe von 132 Gensonden, welche nicht oder nur geringfügig auf die Operation ansprachen, aber bereits nach dem 3. bzw. nach dem 7. postoperativen Tag überexprimiert waren (Tabelle 6).

Die zweite Gruppe der 221 Gensonden, die mit frühzeitig-postoperativ erhöhten Genexpressionen reagierten, kehrten nach 14 Tagen fast vollkommen auf das ursprüngliche Genexpressionsplateau zurück (Tabelle 7).

Die dritte Gruppe von 57 Gensonden, die erst am 3. postoperativen Tag auf die Transplantation mit einem geringeren Expressionsausmaß reagiert (Tabelle 8).

Das vierte Cluster fasste insgesamt 122 Gene zusammen, die sich gegenläufig zum zweiten Cluster verhielten und eine reduzierte Expression nach dem 1. postoperativen Tag zeigten. Danach war wieder eine ansteigende Genaktivität zu erkennen, der pre-operative Wert wird jedoch nach 14 Tagen nicht erreicht (Tabelle 9).

Typische Repräsentanten mit spezifischen Expressionsverläufen werden in der 2 dargestellt.

Tabelle 6: Cluster 1
Tabelle 7: Cluster 2
Tabelle 8: Cluster 3
Tabelle 9: Cluster 4

Die erfindungsgemäß ermittelten Genaktivitäten und die Einteilung in spezifische Gencluster sind somit für operativen Eingriff bei einer Lebertransplantation charakteristisch und für die in-vitro Überwachung von Lebertransplantationen anwendbar.

LITERATURVERZEICHNIS

  • 1. Jecklin, E., Arbeitsbuch Anatomie und Physiologie, (2004), Elsevier Urban und Fisher Verlag München, 12. Auflage, S. 294-299.
  • 2. Trebsdorf, M., Gebhardt P., Biologie, Anatomie, Physiologie, Lehrbuch und Atlas, Lauverlag, 4. Auflage, S250-251.
  • 3. Penko, M. E., Tirbaso D., (1999), An overview of liver transplantation, AACN clinical issues, 10 (2), 176-184.
  • 4. Bauer, M., Winning J.; Kortgen A., (2005), Liver failure, Curr Opin Anaesthesiol., 18, 11-116.
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  • 6. Shimizu T, Tajiri T, Akimaru K, Yoshida H, Yokomuro S, Mamada Y, Taniai N, Kawano Y, Mizuguchi Y, Takahashi T, Mizuta K, Kawarasaki N., (2003), Postoperative management and complications in livingrelated liver transplantation, J. Nippon Med. School, 70 (6), 522-527.
  • 7. Müller A. R., Neuhaus P., (2004), Dünndarmtransplantation, Deutsches Ärtzeblatt, Jg.101, Heft 1-2, A38-A43.
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  • 10. Troyanskaya O., et. al., Missing value estimation methods for DNA Microarrays. Bioinformatics 2001, 17 (6): 520-525.
  • 11. Läuter J., Exact t and F tests for analyzing studies with multiple endpoints. Biometrics 1996, 52: 964-970.

    Storey J. D., Tibshirani R., Statistical Significance for Genome-Wide Experiments. PNAS 2003, 100 (16): 9440-9445.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.


Anspruch[de]
Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen für die Erfassung etwaiger postoperativ auftretender Gewebeunverträglichkeitsreaktionen nach einer erfolgten Lebertransplantation. Verwendung nach Anspruch 1 zur Bestimmung eines Abstoßungsrisikos als Gewebeunverträglichkeitsreaktion für einen Patienten, der ein Lebertransplantat erhalten hat. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Expressionsprofile von wenigstens 4 Polynucleotiden, ausgewählt aus den SEQ-IDs 1 bis 532 aufgenommen werden. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die in ihrem Expressionsverhalten vergleichbaren Genaktivitäten der Polynucleotide mit den SEQ-IDs No 1 bis 532 zu Genaktivitätsclustern zusammengefaßt werden. Verwendung nach Anspruch 4, wobei sich einzelne Cluster wie folgt zusammensetzen:

Cluster 1: Genaktivitäten der SEQ-IDs No. 1 bis 132;

Cluster 2: Genaktivitätsdaten der SEQ-IDs No. 133 bis 353;

Cluster 3: Genaktivitätsdaten der SEQ-IDs No. 354 bis 410; und

Cluster 4: Genaktivitätsdaten der SEQ-IDs No 411 bis 532.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Ein- oder Ausschlußkriterium von Patienten mit Lebertransplantationen in klinische Studien der Phasen 2-4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Erstellung von Genaktivitätsdaten für die elektronische Weiterverarbeitung. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung der individuellen Prognose eines Patienten, für Diagnosezwecke und/oder Patientendatenmangementsysteme, eingesetzt werden. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die in-vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen zur Herstellung von klinischen Expertensystemen und/oder zur Modellierung von zelluläreren Signalübertragungswegen eingesetzt werden. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei zur Erstellung des Genexpressionsprofiles ein spezifisches Gen und/oder Genfragment verwendet wird, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 532 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000 Nukleotiden. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Genfragmente 20-200, vorzugsweise 20-80 Nukleotide umfassen. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Genexpressionsprofile mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays, ermittelt werden. Verfahren zur in-vitro Messung von Genexpressionsprofilen und/oder mindestens einem Genaktivitätscluster zur Verwendung gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, dass man in Patienten die Genaktivität einer Mehrzahl von bestimmten, mit einer Lebertransplantation in Zusammenhang stehenden Genen in einer Patientenprobe bestimmt, wobei die für die Überwachung der postoperativen Zustände spezifischen Gene und/oder Genfragmente ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 532 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000 Nukleotiden. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Genfragmente 20-200, vorzugsweise 20-80 Nukleotide umfassen. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 4 bis 100 unterschiedliche Gene und Genfragmente verwendet werden. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche Gene und/oder Genfragmente verwendet werden. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche Gene und/oder Genfragmente verwendet werden. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche Gene und Genfragmente verwendet werden. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche Gene und Genfragmente verwendet werden. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die in Anspruch 13 aufgelisteten Gene oder Genfragmente und/oder von deren RNA abgeleiteten Sequenzen ersetzt werden durch: synthetische Analoga, Aptamere, Spiegelmere sowie Peptido- und Morpholinonukleinsäuren. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die synthetischen Analoga der Gene 5-100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen. Verfahren nach Anspruch 13 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Genaktivitäten mittels Hybridisierungsverfahren bestimmt wird. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität mittels Microarrays bestimmt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität durch Hybridisierungsunabhängige Verfahren, insbesondere enzymatische und/oder chemische Hydrolyse und/oder Amplifikationsverfahren, vorzugsweise PCR, anschließende Quantifizierung der Nukleinsäuren und/oder von Derivaten und/oder Fragmenten derselben, bestimmt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß Proben, insbesondere Zellproben, einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen. Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen und/oder von den hierfür verwendeten Sonden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 532 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000 Nukleotiden, zum Ausschalten und/oder zur Aktivitätsveränderung von Zielgenen und/oder zur Bestimmung der Genaktivität oder den davon abgeleiteten Proteinprodukten zum Screening von Wirkstoffen gegen Abstoßungsreaktionen von Patienten mit Lebertransplantationen und/oder zur Beurteilung der Therapieeffekte von Wirkstoffen gegen Abstoßungsreaktionen von Patienten mit Lebertransplantationen Verwendung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass hybridisierungsfähige synthetische Analoga der in Anspruch 27 aufgelisteten Sonden verwendet werden. Verwendung nach einem der Ansprüche 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Genfragmente 20-200, vorzugsweise 20-80 Nukleotide umfassen. Kit, enthaltend eine Auswahl von wenigstens 4 Polynucleotiden mit Sequenzen gemäß SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 532 und/oder Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000 Nukleotiden zur Bestimmung von Genexpressionsprofilen in vitro in einer Patientenprobe, für die Erfassung etwaiger postoperativ auftretender Gewebeunverträglich-keitsreaktionen nach einer erfolgten Lebertransplantation. Cluster aus wenigstens einem Polynucleotid, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynucleotide ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ-IDs No. 1 bis 132. Cluster aus wenigstens einem Polynucleotid, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynucleotide ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ-IDs No. 133 bis 353. Cluster aus wenigstens einem Polynucleotid, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynucleotide ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ-IDs No. 354 bis 410. Cluster aus wenigstens einem Polynucleotid, dadurch gekennzeichnet, dass die Polynucleotide ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus den SEQ-IDs No. 411 bis 532.






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