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Dokumentenidentifikation DE69526442T3 31.10.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0000783514
Titel STERIN ZUSAMMENSETZUNGEN AUS HOLZAUFSCHLUSSSEIFE
Anmelder The University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, CA
Erfinder NOVAK, Egon, Richmond, CA;
KUTNEY, James P., Vancouver, CA;
JONES, Peter J., Ste. Anne-de-Bellevue, CA
Vertreter Barz, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 80803 München
DE-Aktenzeichen 69526442
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 29.09.1995
EP-Aktenzeichen 959325937
WO-Anmeldetag 29.09.1995
PCT-Aktenzeichen PCT/CA95/00555
WO-Veröffentlichungsnummer 1996010033
WO-Veröffentlichungsdatum 04.04.1996
EP-Offenlegungsdatum 16.07.1997
EP date of grant 17.04.2002
EPO date of publication of amended patent 01.08.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 31.10.2007
IPC-Hauptklasse C07J 9/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 31/575(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Sterolzusammensetzungen, die von Holzseifen abgeleitet sind, als Mittel zur Verringerung der Plasmakonzentration an Lipoprotein geringer Dichte-Cholesterol.

Hintergrund der Erfindung

Die direkte Ursache von Herzattacken und Angina ist ein degenerativer Prozess, der als Arteriosklerose bekannt ist. Arteriosklerose resultiert aus einer Anzahl von integrierten angeborenen (genetischen) und Umweltfaktoren. Das Wechselspiel dieser Faktoren, von denen die Ernährung in unserer Zivilisation der wichtigste zu sein scheint, führt zur Entwicklung von Arteriosklerose. Das Wachstum von Cholesterolgefüllten Arteriosklerose-Plaques schneidet schließlich die Blutzufuhr zum Herzmuskel oder alternativ zum Gehirn oder den Beinen, abhängig vom Ort der Plaques im arteriellen Baum, ab.

Einer der Hauptrisikofaktoren für Arteriosklerose, der im Prinzip beeinflussbar ist, ist der Blutcholesterolspiegel. Eine Anzahl von gut dokumentierten Studien haben gezeigt, dass der Blutcholesterolspiegel in der Tat ein wichtiger Faktor für die Vorhersage des Risikos einer Herzattacke und auch von Schlaganfällen ist. Die Beziehung zwischen der Blutkonzentration an Cholesterol und dem Risiko für diese Störungen ist kontinuierlich (erstreckt sich über alle Cholesterolspiegel) eingeteilt (je höher der Spiegel, um so wahrscheinlicher die Erkrankung), ohne erkennbaren Grenzwert (selbst durch Verringerung sog. niedriger Spiegel kann man das Risiko für die Erkrankung weiter verringern). Zum Beispiel stellt bei Menschen in einem Alter über 40 Jahre ein Blutcholesterolspiegel von 7,0 mmol/l ein Risiko für eine koronare Arterienkrankheit dar, das 3- bis 4-mal dem Risiko entspricht, das mit Spiegeln unter 5,0 mmol/l verbunden ist. Die Abhängigkeit wird besonders steil bei Spiegeln über 5,2 mmol/l. Zum Beispiel entsprach die Todesrate unter Männern mit Cholesterolspiegeln von 8,0 mmol/l fast dem 6-fachen der Rate unter Männern mit Spiegeln von 4,0 mmol/l. Diese neueren Befunde sind konsistent mit früheren Studien.

Weitere große klinische Studien haben klar gezeigt, dass man durch Verringerung hoher Cholesterolspiegel das Risiko für tödliche oder nicht-tödliche Myokardinfarkte, Angina, Veränderungen in Elektrokardiogrammen und in der koronaren Arterien-Bypass-Chirurgie verringern kann. Die am besten bekannte und die erste dieser Studien fand an den Lipid Research Clinics statt, wobei Coronary Primary Prevention Trials zeigten, dass mit jeder Verringerung von 1 % beim Gesamtblutcholesterolspiegel eine Verringerung um 2 % beim Risiko einer koronaren Arterienkrankheit verbunden war.

Damit eine Langzeitpräventionstherapie von Hypercholesterolämie erfolgreich sein kann, muss sie in einem relativ frühen Stadium beginnen und unbegrenzt andauern. Eine Ernährung mit niedrigem Fettgehalt ist zwar der Eckpfeiler einer derartigen Langzeittherapie; nach 6 Monaten wird sie jedoch von bis zu 60 % der Patienten nicht befolgt. Die Schwierigkeit der Nichtbefolgung wird in westlichen Ländern durch eine allgemeine Ernährung, die einen hohen Fettgehalt aufweist, verschärft. Ein schlechtes Cholesterolprofil für viele Patienten wird durch das Vorherrschen zusätzlicher Risikofaktoren für eine kardiovaskuläre Erkrankung, wie hoher Blutdruck, Diabetes, Fettleibigkeit und Rauchen, verschlimmert.

Veränderungen der Ernährung als eine Therapie für Arteriosklerose und andere kardiovaskuläre Erkrankungen sind innerhalb der letzten 10 bis 15 Jahre erheblich verfeinert worden. Insbesondere ist von Forschern erkannt worden, dass pflanzliche Sterole (Phytosterole) wirksam hinsichtlich der Verringerung der Plasmacholesterolspiegel sind: Lees et al., Atherosclerosis, 28 (1977) 325-338; Kudehodkar et al., Atherosclerosis, 23 (1976) 239; Day, Artery, 18(3):125-132 (1991).

Phytosterole sind sterolartige, in Pflanzen synthetisierte Verbindungen ohne Ernährungswert für Menschen. In Pflanzen sind sie für die Zellfunktion in ähnlicher Weise erforderlich, in der Cholesterol bei Menschen erforderlich ist. Die durchschnittliche westliche Ernährung enthält bis zu 360 mg Phytosterole pro Tag. In jüngster Zeit haben diese in der Ernährung enthaltenen Pflanzensterole aufgrund ihrer möglichen Antikrebseigenschaften und ihrer Fähigkeit zur Verringerung von Cholesterolspiegeln, wenn sie einer Anzahl von Säugerspezies unter Einschluss von Menschen mit der Nahrung gegeben werden, große Aufmerksamkeit auf sich gezogen.

Chemisch ähneln Phytosterole in der Struktur stark dem Cholesterol. Die hauptsächlichen Phytosterole sind beta-Sitosterol, Campesterol und Stigmasterol. Weitere umfassend Stigmastanol (beta-Sitostanol), Sitostanol, Desmosterol, Chalinasterol, Poriferasterol, Clionasterol und Brassicasterol. Die chemischen Strukturen von beta-Sitosterol, Campesterol und Stigmastanol sind nachstehend gezeigt:

Der Mechanismus, durch den Phytosterole das Blutcholesterol in Tieren senken, ist unklar, scheint jedoch die Hemmung der Cholesterolresorption aus dem proximalen Jejunum durch Konkurrenz mit Cholesterol um spezifische Aufnahmestellen zu beinhalten. Forschungsdaten deuten auch darauf hin, dass einige Phytosterole überhaupt nicht im proximalen Jejunum resorbiert werden (Sitostanol), und wenn es zu einer Resorption kommt (beta-Sitosterol), sie nur in sehr begrenzten Mengen erfolgt.

Auf der Basis dieser Forschungsergebnisse ist die Verwendung von Phytosterolen als Nahrungsmittelergänzung zur Verringerung der Cholesterolresorption vielfach untersucht worden; Lees et al., a.a.O.; Pollak, Pharmac. Ther., 31 (1985) 177-208; Raicht et al., Biochimica et Biophysica Acta, 388 (1975) 374-384.

In Lees et al., a.a.O., wurde ein Vergleich zwischen in Wirkungen von Siterosterolpräparaten aus zwei Quellen, nämlich Sojasterole und Tallölsterole, auf Plasmacholesterol angestellt. Es wurde festgestellt, dass Pflanzensterolpräparate wirksam bei der Behandlung von Patienten mit Hypercholesterolämie sind. Pollak, a.a.O., ist ein Übersichtsartikel über Phytosterole und deren Wirkung auf Serumlipide. Raicht, a.a.O., beschreibt die Wirkung von beta-Sitosteral auf das Sterolgleichgewicht und geschwindigkeitsbestimmende Enzyme des Sterolmetabolismus.

Es ist allgemein akzeptiert, dass Phytosterole eine einzigartige Kombination von Langzeitsicherheit, Wirksamkeit und Vielseitigkeit bei der Behandlung von Menschen bieten. Eine weiterhin bestehende Herausforderung im Hinblick auf Phytosterole ist deren Isolierung und Reinigung aus pflanzlichen Quellen und die Bestimmung zusätzlicher Quellen, die kostengünstig sind, die im Großmaßstab handhabbar sind und die Cholesterol-senkende Wirkungen zeigen.

Traditionell werden Phytosterole aus Quellen, wie Maisöl, Weizenkeimöl, Sojabohnenpech und Maisölpech, isoliert. Entsprechend wird Tallölpech, das während des Verfahrens der Herstellung von Papier aus Holz, insbesondere Kiefernholz, erhalten wird, als eine Phytosterolquelle verwendet. Im allgemeinen werden bei diesem Verfahren Holzschnitzel mit kaustischem Soda aufgeschlossen, um einen Holzbrei oder "Seife" herzustellen. Die Seife wird dann destilliert, um die flüchtigen Materialien zu entfernen, wobei ein "Pech" als Rückstand verbleibt. Es ist dieses Pech, aus dem Forscher Phytosterole isolieren.

Es gibt einige wesentliche Nachteile bei diesen herkömmlichen Quellen für Phytosterole. Das Tallölpech ist ein extrem komplexes Material, das Harze, Fettsäuren, Oxidationsprodukte, veresterte Materialien und Phytosterole umfasst. Das Pech ist zwar billig, da es der letzte Rückstand aus verschiedenen Herstellungsverfahren ist; es ist jedoch sehr schwierig, Sterole mit hohem Molekulargewicht daraus in guten Ausbeuten und gleichzeitig Reinheiten, die für pharmazeutische Anwendungen erforderlich sind, zu gewinnen.

US-Patent 3 840 570 (Julian) stellt ein Verfahren zur Herstellung von Sterolen aus Tallölpech durch Extraktion in Wasser-Alkohol-Kohlenwasserstoffgemischen, gefolgt von Verseifung und anschließender Reinigung, bereit. Das Ausgangsmaterial bei diesem Verfahren ist Tallölpech, aus dem Phytosterole und verschiedene Verunreinigungen extrahiert werden. Es ist darauf hinzuweisen, dass bei jedem Tallölpech-Reinigungsverfahren die langkettigen Alkohol- und Säureverunreinigungen besonders schwierig von den Sterolen (die selbst Alkohole mit hohem Molekulargewicht sind) zu trennen sind.

Andere Forscher sind die Sterolreinigung aus Tallölpech angegangen: US-Patent 2 835 682 (Steiner und Fritz); US-Patent 2 573 891 (Christenson). Es ist wichtig, festzustellen, dass bei jedem der bekannten Reinigungsverfahren das Ausgangsmaterial Tallölpech war, bei dem die vorstehend erörterten Probleme der Gewinnung bestehen.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die vorstehenden Nachteile zu beseitigen oder abzumildern.

In US-A-3 965 085 wird eine Seife, die aus dem Aufschluss von Holzprodukten gebildet wird, zur Entfernung nicht-verseifbarer neutraler Verbindungen durch Mischen der Seife mit Keton und dann mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Petroleumkohlenwasserstoffen, behandelt. Die Lösungsmittelphase wird abgetrennt, und das Lösungsmittel wird daraus gewonnen, wobei man ein Gemisch aus neutralen Verbindungen, wie Sterolen, erhält.

Zusammenfassung der Erfindung

Das offenbarte Verfahren stellt die Verwendung eines Produkts bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung bei einem Verfahren zur Verringerung der Plasmakonzentration an Lipoprotein geringer Dichte-Cholesterol bereit, wobei das Produkt eine Phytosterol-Zusammensetzung ist, die nach einem Verfahren zur Reinigung und Herstellung von Phytosterol-Zusammensetzungen aus Holzseifen erhältlich ist, das folgendes umfasst:

in einer ersten Phase: Mischen der Holzseife ("pulping soap") mit einem Lösungsmittelgemisch, das ein Keton, das aus der Gruppe mit der allgemeinen Struktur RCOR1 ausgewählt ist, worin R und R1 für Alkylgruppen stehen, einen aliphatischen Kohlenwasserstoff, ausgewählt unter C5-C10-Kohlenwasserstoften, und Wasser, jedoch keinen Alkohol, umfasst, bei einer Temperatur im allgemeinen von 25 °C bis 150 °C unter Bildung eines breiigen Niederschlags; und

in einer zweiten Phase: Reinigen einer Phytosterol-Zusammensetzung aus dem breiigen Niederschlag.

Die vorliegende Erfindung wie in Anspruch 1 und Anspruch 7 beansprucht stellt auch einzigartige Zusammensetzungen bereit, die wirksam bei der Prävention oder Behandlung von Dyslipidämien sind und die beta-Sitosterol, Campesterol und Stigmastanol enthalten, wobei Campesterol und Stigmastanol zusammen mindestens 50 % der Konzentration an beta-Sitosterol ausmachen. Die hier bereitgestellten Phytosterol-Zusammensetzungen unterscheiden sich signifikant von denen, die in Pflanzen, Lebensmitteln und Ölen gefunden werden. Insbesondere scheint die Bereitstellung von Stigmastanol die Wirksamkeit zu verstärken. Diese Zusammensetzungen können zusätzlich verschiedene gemeinsam auftretende Verbindungen umfassen, die Phytosterole sein können oder nicht. Insbesondere können diese gemeinsam auftretenden Verbindungen Triterpene, langkettige Alkohole und andere alkohollösliche organische Verbindungen einschließen.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung von Zusammensetzungen, die hier beschrieben werden, bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung bei einem Verfahren zur Verringerung der Plasmakonzentration an Lipoprotein geringer Dichte-Cholesterol bereit, z. B. zur Prävention oder Behandlung primärer oder sekundärer Dyslipidämien und Arteriosklerose unter Einschluss von koronarer Herzkrankheit, peripherer Gefäßkrankheit und Schlaganfällen bei Menschen und Tieren.

Die einzigartigen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zeigten hervorragende Ergebnisse bei der Verringerung von Gesamtcholesterol (TC) und Lipoprotein geringer Dichte (LDL)-Cholesterol im Blut. Außerdem wurde recht überraschend festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in verschiedenen Tierspezies die Plasmaspiegel an Lipoprotein hoher Dichte (HDL)-Cholesterol im Blut erhalten oder erhöhen. Dieses Merkmal der vorliegenden Erfindung ist von kritischer Bedeutung, wenn man die Tatsache berücksichtigt, dass Forschungen gezeigt haben, dass unabhängig von den TC-Spiegeln das Risiko für Arteriosklerose zunimmt, wenn der Plasma-HDL-Spiegel abnimmt. Phytosterole, die aus Tallölpech, Sojabohnen und anderen Quellen isoliert werden, zeigen nach Kenntnis der Erfinder der vorliegenden Anmeldung diese einzigartige HDL-Wirkung nicht.

Es wird angenommen, dass die überraschende Wirkung der Zusammensetzungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zumindest zum Teil ihre Ursache in der Verwendung von Holzseife als Ausgangsmaterial und in dem einzigartigen Trennverfahren hat.

Kurze Bezugnahme auf die Zeichnungen

Verschiedene Aspekte der Erfindung werden durch die folgenden nichtbeschränkenden Zeichnungen erläutert, worin gilt:

1 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen von Forbes-1 und Forbes-2 auf die TC-Konzentrationen bei Ratten veranschaulicht;

2 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen von Forbes-1 und Forbes-2 auf die LDL-Cholesterol-Konzentrationen bei Ratten veranschaulicht;

3 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen von Forbes-1 und Forbes-2 auf die HDL-Cholesterol-Konzentrationen bei Ratten veranschaulicht;

4 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen von Forbes-3 auf Serum-TC bei Hamstern veranschaulicht;

5 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen von Forbes-3 auf Serum-LDL-Cholesterol bei Hamstern veranschaulicht;

6 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen von Forbes-3 auf Serum-HDL-Cholesterol bei Hamstern veranschaulicht;

7 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen der Behandlung mit verschiedenen Ernährungen auf die Cholesterolspiegel bei männlichen und weiblichen Hamstern veranschaulicht;

8 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen der Behandlung mit verschiedenen Ernährungen auf die Plasmacholesterolspiegel bei männlichen Hamstern veranschaulicht;

9 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkung der Behandlung mit verschiedenen Ernährungen auf die Plasmacholesterolspiegel bei weiblichen Hamstern veranschaulicht;

10 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen der Behandlung mit verschiedenen Ernährungen auf die Plasmatriglyceridspiegel bei männlichen und weiblichen Hamstern veranschaulicht;

11 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen der Behandlung mit verschiedenen Ernährungen auf die HDL/apo-B-Verhältnisse bei männlichen und weiblichen Hamstern veranschaulicht;

12 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen der Behandlung mit Ernährungen auf das Gesamtcholesterol bei Hamstern in einer 45 Tage-Studie veranschaulicht;

13 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen der Behandlung mit Ernährungen auf die Cholesterolkorrelation mit Sitostanol veranschaulicht;

14 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen der Behandlung mit Ernährungen auf die HDL-Spiegel bei Hamstern über 45 Tage veranschaulicht;

15 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen der Behandlung mit Ernährungen auf die Non-apo-A/apo-A-Verhältnisse bei Hamstern über 45 Tage veranschaulicht; und

16 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Wirkungen der Behandlung mit Ernährungen auf die Non-apo-A-Sterole bei Hamstern über 45 Tage veranschaulicht.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

Ein Verfahren, um die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zusammensetzungen zu erhalten, umfasst die folgenden Stufen:

  • (A) Das Ausgangsmaterial, eine aus Pflanzen stammende Holzseife, wird erhalten oder hergestellt;
  • (B) aus der Seife wird ein breiiger Niederschlag unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels extrahiert; und
  • (C) aus dem breiigen Niederschlag wird eine Phytosterol-Zusammensetzung gereinigt.

Es gibt zahlreiche mögliche Quellen für aus Pflanzen stammende Holzseife. Im allgemeinen werden in einem bekannten Verfahren (dem "Kraft"-Verfahren) Holzschnitzel mit kaustischem Soda unter Bildung einer Seife behandelt. Die Holzschnitzel können aus einer beliebigen Hartholz- oder Weichholzart von Bäumen, unter Einschluss von, jedoch ohne Beschränkung hierauf, Tanne, Zeder, Kiefer, Fichte, Eiche, Hemlocktanne und Pappel, abgeleitet werden. Insbesondere werden die Schnitzel aus beliebigen Waldarten von Gehölzen des pazifischen Nordwestamerikas oder Europas abgeleitet.

In der Extraktionsphase wird die Seife mit einer Keton- und Wasserlösung gemischt. Ein Kohlenwasserstofflösungsmittel wird verwendet, um die Sterole zu extrahieren. Diese Stufe wird bei Temperaturen im allgemeinen von etwa 25 °C bis etwa 150 °C, jedoch insbesondere von etwa 50 °C bis etwa 100 °C, durchgeführt. Besonders bevorzugt wird diese Extraktionsphase über 15 bis 24 Stunden fortgesetzt. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Verwendung von Alkohol während der Extraktionsphase weder erforderlich ist noch vorgeschlagen wird. Das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren wird unter Verwendung eines Keton-Wasser-Kohlenwasserstoff-Lösungsmittels durchgeführt.

Das Keton ist aus der Gruppe mit der allgemeinen Struktur RCOR1, worin R und R1 für Alkylgruppen stehen, ausgewählt. Vorzugsweise sind die Alkylgruppen C1-C6-Gruppen. Insbesondere handelt es sich bei dem Keton um 2-Propanon (Aceton). Der Kohlenwasserstoff wird aus der Gruppe ausgewählt, die alle C5-C10-Kohlenwasserstoffe umfasst. Insbesondere handelt es sich bei dem Kohlenwasserstoff um Hexan.

Wie in 1 dargestellt ist, handelt es sich bei dem Produkt der Extraktionsphase um einen breiigen Niederschlag oder Rückstand, aus dem die Phytosterol-Zusammensetzung gereinigt wird. Diese Reinigungsphase kann durch Kristallisation, chromatographische Trennung oder nach beliebigen anderen geeigneten Verfahren durchgeführt werden. Es ist besonders bevorzugt, wenn der breiige Niederschlag in Alkohol gelöst, langsam abgekühlt, dann filtriert und mit kaltem Alkohol gewaschen wird. Der Rückstand wird getrocknet, und das resultierende Produkt ist eine Phytosterol-Zusammensetzung.

Gemäß einer bevorzugten Form wird der Alkohol, der in der Reinigungsphase verwendet wird, aus dem Gruppe mit den allgemeinen Strukturen R-CHOHR, R-CH2OH und RCOH, worin R für eine C1-C4-Alkylgruppe steht, ausgewählt. Insbesondere handelt es sich bei dem Alkohol um Methanol. Die Abkühlungsphase kann bei Temperaturen von 10 °C bis 0 °C und insbesondere bei 3 bis 4 °C für 24 Stunden durchgeführt werden.

Die Phytosterol-Zusammensetzungen, die aus dem hier beschriebenen Verfahren resultieren, können direkt in Nahrungsmittelergänzungen und Vitaminformulierungen sowie in Arzneistoffe für die laufende und präventive Behandlung von Arteriosklerose und deren Konsequenzen, nämlich Schlaganfällen, Herzattacken und peripherer vaskulärer Erkrankung, eingeführt werden. Außerdem wird es gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen, dass die hier beschriebenen Phytosterol-Zusammensetzungen in Form von Medikamenten mit geeigneten Adjuvanzien oder Trägern bereitgestellt werden. Zum Beispiel können diese Zusammensetzungen gleichzeitig mit ausgewählten lipidsenkenden Mitteln, um die erforderliche Dosis und damit die Toxizität dieser letztgenannten Verbindungen zu verringern, eingeführt oder verschrieben werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Phytosterol-Zusammensetzungen weisen eine ausgeprägte Fähigkeit zur Modifizierung von Lipoproteinen selbst bei geringeren Phytosterol-Konzentrationen als in bekannten Formulierungen auf. Stärker überraschend ist jedoch die Wirkung dieser Zusammensetzungen auf die Erhöhung von Plasmaspiegeln von Lipoproteinen hoher Dichte (HDL), eine Wirkung, die bisher nicht mit irgendeiner anderen aus Tallöl abgeleiteten Phytosterol-Zusammensetzung in Verbindung gebracht wurde. Es wird angenommen, dass diese einzigartige Wirkung ihre Ursache in der Verwendung von Holzseifen als Ausgangsmaterial oder der Bereitstellung von Stigmastanol als einem Element der Zusammensetzung haben mag.

Erfindungsgemäß umfassen die hier verwendeten Zusammensetzungen ein Verhältnis von Phytosterolen, so dass Campesterol und Stigmastanol zusammen wenigstens 50 % der Gesamtkonzentration an beta-Sitosterol darstellen; und mit dem folgenden Verhältnis: beta-Sitosterol (1 ); Campesterol (0,2-0,4) und Stigmastanol (0,2-0,5). Die neuen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen die folgenden Anteile von Phytosterolen im Vergleich mit aus Sojabohnen abgeleiteten Phytosterolen:

Die Zusammensetzung und die Reinheit von zwei weiteren Extrakten innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung lauten wie folgt:

In jeder hier beschriebenen Zusammensetzung können zusätzliche Verbindungen vorhanden sein, die Phytosterole sein können oder nicht. Zum Beispiel ist festgestellt worden, dass Campestanol, ein weiteres Phytosterol, in relativ kleiner Menge vorhanden sein kann. Außerdem können geradkettige Fettalkohole, wie Behenyl (C22)- und Lignoceryl (C24)-Alkohol, vorhanden sein. Um die Beschaffenheit dieser gemeinsam vorliegenden Verbindungen zu bestimmen, wurde eine Gas-Flüssig-Chromatographieanalyse für jede der am stärksten bevorzugten erfindungsgemäßen Zusammensetzungen durchgeführt.

Eine hier offenbarte Zusammensetzung außerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Komponenten: Campesterol 14,1 % Campestanol 3,5 % B-Sitosterol 62,8 % Stigmastanol 16,9 %
für eine Gesamtphytosterol-Konzentration von 97,3 %.

Beispiel 1 – Extraktion und Reinigung

Ein Ansatz von 3 kg Holzseife wurde von B. C. Chemicals Inc. erhalten. Ein Gemisch von 3 l Aceton in 1,5 l Wasser wurde hergestellt, und die Seife wurde zugegeben. Das Gemisch wurde kontinuierlich mit 4,5 l Hexan bei 50 °C für 24 Stunden unter Verwendung eines 18 l-Verdampfers extrahiert. Das resultierende Extraktionsprodukt wurde dann über Natriumsulfat getrocknet, und man ließ es verdampfen. Dies ergab 460 g Rückstand oder breiigen Niederschlag.

Der breiige Niederschlag wurde erwärmt und unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt, und 460 ml Methanol wurden langsam zugegeben. Das Gemisch wurde unter Rückfluss und Rühren für 15 Minuten erwärmt und langsam für 3-5 Stunden abgekühlt. Das Gemisch wurde bei 3-4 °C über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt und dann filtriert und mit 150 ml kaltem Methanol gewaschen (2-mal). Schließlich wurde das Gemisch für 2 Tage unter Vakuum gehalten, wobei man 100 g Gemisch mit einer Reinheit von 82 % (d. h. 82 g Phytosterole) erhielt.

Beispiel 2 – Bewertung der Wirkungen der Phytosterol-Zusammensetzungen bei Ratten

90 männliche Wistar-Ratten (80-100 g) wurden in 3 experimentelle Module eingeteilt: Zusammensetzung Forbes-1, Zusammensetzung Forbes-2 und Sojabohnen. Die 30 Ratten innerhalb jedes Moduls wurden weiter auf 5 Ernährungspläne aufgeteilt, wie in Tabelle 2 angegeben. Die Ratten wurden unter einem reversen Beleuchtungszyklus gehalten und für 10 Tage mit einer halb gereinigten Grundernährung gefüttert (Tabelle 1), angereichert mit verschiedenen Mengen an Cholesterol und Phytosterol (Tabelle 2). Innerhalb jeder der 5 Ernährungsgruppen wurde 2 Ratten die Zusammensetzung Forbes-1 verabreicht, 2 Ratten wurde die Zusammensetzung Forbes-2 verabreicht, und 2 Ratten wurde aus Sojabohnen abgeleitetes Phytosterol (Sigma) verabreicht.

Tabelle 1.
  • * Saffloröl und Schweinefett gemischt in einem Verhältnis von 1:3.
Tabelle 2.

Am Ende der Fütterungsperiode wurde den Ratten intraperitoneal Deuteriumoxid (0,4 ml) injiziert, und sie wurden für mindestens 2 Stunden von Futter und Wasser ferngehalten. Die Ratten wurden dann mit Halothan betäubt. Blutproben wurden aus dem Herzen entnommen. Proben aus Leber, Dünndarm und Muskel wurden rasch entnommen, gewogen, in flüssigen Stickstoff gegeben und bei -80 °C bis zur Bestimmung der Cholesterolsynthese gelagert. Gesamtcholesterol, LDL- und HDL-Cholesterol wurden mit einem handelsüblichen Kit (Biopacific Diagnostic Inc.) bestimmt.

Die Ergebnisse der Wirkungen der Phytosterol-Zusammensetzungen auf Gesamtcholesterol, LDL und HDL sind in den 1, 2 bzw. 3 dargestellt. Die Wirksamkeit von Forbes-1 und Forbes-2 ist aus der Verringerung von LDL-Cholesterol, die in 2 gezeigt ist, und dem Anstieg an HDL-Cholesterol, der in 3 gezeigt ist, insbesondere für Forbes-1 ersichtlich. In 1 führte die Zugabe von Cholesterol (Ernährungsgruppe 2) zur Grundernährung (Gruppe 1) zu einem Anstieg der zirkulierenden Cholesterolkonzentrationen. Die Zugabe von steigenden Mengen an Phytosterolen (Gruppen 3 bis 5) führte zu einer Normalisierung der Cholesterolspiegel in den Gruppen, die mit Forbes-2 und Forbes-1 gefüttert wurden, nicht jedoch bei Sojabohnen-Phytosterolen, wie durch Regressionsanalyse bestimmt wurde. 2 zeigt, dass Forbes-2- und Forbes-1-Phytosterole eine bessere cholesterolsenkende Wirksamkeit als die Sojabohnen-Phytosterole für LDL besitzen. 3 zeigt die größere HDL-erhöhende Wirkung der bevorzugten erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, insbesondere von Forbes-1, im Vergleich mit Sojabohnen-Phytosterolen.

Beispiel 3 – Bewertung der Wirkungen von Phytosterol-Zusammensetzungen bei Hamstern

Die vorliegende Studie diente der Untersuchung der Wirkung von erfindungsgemäßen Phytosterol-Zusammensetzungen in der Nahrung auf die Nahrungscholesterolinduzierte Erhöhung von Serumcholesterolkonzentrationen bei Hamstern.

Insgesamt 40 männliche Hamster (80-100 g), die individuell in Käfigen aus rostfreiem Stahlgitter gehalten wurden, wurden mit Nagerfutter gefüttert und für 3 Tage in einem Raum mit Klimaanlage (20-22 °C, Licht an 17:00-05:00) akklimatisiert. Die Hamster wurden dann in 5 Gruppen von 8 Tieren je Gruppe eingeteilt und für 34 Tage mit einer halb gereinigten Grundernährung (Tabelle 3), angereichert mit verschiedenen Mengen an Cholesterol und einer der erfindungsgemäßen Phytosterol-Zusammensetzungen (Forbes-3) (Tabelle 4), gefüttert.

Tabelle 3.
Tabelle 4.

Am Ende der Fütterungsperiode wurde den Tieren intraperitoneal Deuteriumoxid (0,4 ml) injiziert, und sie wurden für mindestens 2 Stunden von Futter und Wasser ferngehalten. Die Hamster wurden dann mit Halothan betäubt. Blutproben wurden aus dem Herzen entnommen. Andere Gewebeproben unter Einschluss von Leber, Dünndarm und Muskel wurden rasch entnommen, gewogen, in flüssigen Stickstoff gegeben und bei -80 °C bis zur Bestimmung der Cholesterolsynthese gelagert. Gesamtcholesterol, HDL- und LDL-Cholesterol wurden unter Verwendung eines kommerziellen Kits bestimmt. Die Ergebnisse wurden statistisch durch ONEWAY-Analyse des Varianzverfahrens (SYSTAT) bewertet.

Hamster, die mit einer Ernährung mit hohem Cholesterolgehalt gefüttert wurden, hatten signifikant höheres Serum-Gesamtcholesterol und LDL-Cholesterol als die Hamster hatten, die mit der Ernährung mit normalem Cholesterolgehalt (0,025 %) gefüttert wurden. Die Anreicherung von Phytosterol auf Konzentrationen von 0,5 % und 1 % beendete in bemerkenswerter Weise diese Anstiege, die durch hohe Cholesterolaufnahme induziert wurden (4 und 5). Die LDL-Cholesterolkonzentration in Gruppe 5 war niedriger im Vergleich mit den Spiegeln bei Hamstern, die mit normalen Cholesterol enthaltenden Ernährungen gefüttert wurden (5). Ferner gab es eine negative Regression von Gesamtcholesterol und LDL-Cholesterol in Bezug auf die Konzentration an Phytosterol, die der Ernährung zugesetzt wurde (6).

Die Anreicherung mit Phytosterol führte zu einem geringen Anstieg an HDL, jedoch ohne dass sich ein signifikanter Unterschied ergab (6).

Beispiel 4 – Bewertung der Wirkung von Phytosterol-Zusammensetzungen bei Hamstern – 90 Tage-Studie

Sechs Gruppen von 20 Hamstern (10 männliche, 10 weibliche) wurden mit halb gereinigten Ernährungen mit einem Gehalt an 30 % Fett (Verhältnis mehrfach ungesättigtes/gesättigtes Fett = 0,3) für 90 Tage gefüttert. Ernährung 1 war cholesterolfrei. Die Ernährungen 2 bis 6 enthielten 0,25 % (Gew./Gew.) Nahrungscholesterol. Die Ernährungen 3 und 4 enthielten Forbes-Phytosterole (mehr als 90 % Reinheit) mit 0,5 bzw. 1 %. Die Ernährungen wurden aus den primären Bestandteilen jede Woche hergestellt. Fett-, Phytosterol- und Cholesterolkonzentrationen wurden durch Gas-Flüssig-Chromatographie bestimmt. Alle Tiere hatten freien Zugang zu Wasser und Ernährung während der gesamten Versuchsdauer. Die Tiere wurden wöchentlich gewogen. Außerdem wurde die Nahrungsaufnahme jeden Tag bestimmt, indem die Futterbehälter vor und nach jeder Fütterungsperiode von 24 Stunden gewogen wurden, und Mittelwerte wurden pro Woche gebildet. Nach 90 Tagen Fütterung wurden die Tiere unter Verwendung von Halothan getötet, und Blut wurde für die Lipoprotein-Profilanalysen gesammelt. Zirkulierende Gesamtspiegel, apo-B-enthaltende Partikel und HDL-Cholesterol- sowie Triglyceridspiegel wurden bestimmt. Außerdem wurden unmittelbar vor der Tötung die Cholesterolresorptions- und Syntheseraten unter Verwendung von 14C-Cholesterolentfernung aus dem Darm bzw. Deuteriumeinbau in Gewebecholesterol bestimmt. Die Aufnahme von Phytosterolen in Dünndarm und anderen Geweben wurde ebenfalls untersucht. Außerdem wurden Proben von Dünndarm und Leber gelagert, um sie Bio-Research Laboratories of Senneville, Quebec, für histopathologische, Karzinogenizitäts- und Enzymfunktionsanalysen zur Verfügung zu stellen.

Ergebnisse:

Ergebnisse sind in den 7 bis 11 gezeigt. In diesen Figuren wird auf Gruppen oftmals durch Zahlen Bezug genommen, die denen entsprechen, die beim Versuchsaufbau beschrieben wurden. Buchstaben oberhalb von Balken in Balkendiagrammen identifizieren signifikante Unterschiede zwischen Gruppen. Wo Buchstaben gegeben sind, sind Balken, die den gleichen Buchstaben teilen, nicht signifikant verschieden, während die mit verschiedenen Buchstaben in einem statistischen Grad von p<0,05 verschieden sind.

In den 7 bis 9 gezeigt sind Daten für zirkulierendes Cholesterol bei männlichen und weiblichen Hamstern, die die Testernährung für 90 Tage zu sich nahmen. Signifikante Einflüsse des Geschlechts wurden bei den Gesamtspiegeln für zirkulierendes Cholesterol für Tiere, die Ernährung 2, die Grundernährung, der lediglich Cholesterol zugesetzt wurde, und Ernährung 5, die Cholesterol plus Sojabohnen-Phytosterole enthielt, zu sich nahmen, beobachtet. Weibchen zeigten, obwohl nicht verschieden von Männchen hinsichtlich Cholesterolspiegeln bei der Grundernährung (Gruppe 1), ein stärkeres Ansprechen auf zugesetztes Cholesterol im Vergleich mit Männchen. Der Zusatz von Phytosterolen hob diesen Unterschied auf, mit Ausnahme von Gruppe 5.

Nach Geschlechtern aufgegliederte Cholesterolspiegel sind in den 8 und 9 gezeigt. Für Männchen (8) führte der Zusatz von Cholesterol allein zur Grundernährung zu einem signifikanten Anstieg der Gesamtspiegel an zirkulierendem Cholesterol. Der Zusatz von Forbes-Phytosterolen bei 0,5 % resultierte in einem Trend hin zu einer Abnahme des Cholesterolspiegels; der Zusatz von Forbes-Phytosterolen bei 1 % rief eine statistisch signifikante Verringerung beim Cholesterol auf ungefähr die gleichen Spiegel wie bei der Kontrollgruppe ohne zugesetztes Cholesterol hervor. Bei Zusatz von Sojabohnen-Phytosterolen zu der Ernährung bei 0,5 oder 1 % gab es keine signifikante Abnahme der Gesamtspiegel an zirkulierendem Cholesterol bei Männchen. Für HDL wurde eine verschiedene Wirkung von Forbes gegenüber Sojabohnen beobachtet, wobei die Forbes-Fütterung keine Änderung der HDL-Spiegel der Gruppe, der allein Cholesterol gegeben wurde (Gruppe 2) ergab, dass Füttern von Sojabohnen jedoch in einer signifikanten Abnahme der HDL-Werte bei beiden untersuchten Konzentrationen resultierte (Gruppen 5 und 6). Es gab keine signifikanten Unterschiede bei apo-B-enthaltenden Cholesterolpartikeln; es gab jedoch einen Trend hin zu niedrigeren Spiegeln beim Füttern von Cholesterol-Forbes bei 1 % im Vergleich mit anderen Gruppen.

Daten für Weibchen sind in 9 gezeigt. Für Gesamt- und HDL-Cholesterol gab es einen ausgeprägten Einfluss der Zugabe von Ernährungscholesterol allein. Die Zugabe jedes Typs der Phytosterolquelle bei 1 % resultierte in signifikanten und ähnlichen Abnahmen bei Gesamt- und HDL-Cholesterolkonzentrationen. Spiegel an apo-B-enthaltenden Teilchen wurden durch die Ernährung nicht beeinflusst.

Spiegel an zirkulierenden Triglyceriden bei Hamstern, die die Testernährung für 90 Tage zu sich nahmen, sind in 10 gezeigt. Es gab eine Zunahme bei den Spiegeln zirkulierender Triglyceride bei weiblichen Tieren, denen die Grundernährung mit Cholesterol und Forbes 0,5 % gegeben wurde, und zwar im Vergleich mit der Grundernährung allein; bei beiden Geschlechtern wurden jedoch keine Unterschiede zwischen den Gruppen beobachtet. Bei Männchen gab es keine Wirkung und keinen Trend der Ernährung auf die Triglyceridkonzentrationen.

In zusammengefasster Form lautet eine Rangeinteilung der Ergebnisse bei Männchen hinsichtlich der Testernährungen wie folgt:

Tabelle 5:

Der Vorteil der Forbes-Zusammensetzungen (die der vorliegenden Erfindung) ist klar ersichtlich. Außerdem wurden ähnliche Rangeinteilungen für das HDL-apo-B-Verhältnis bei Männchen gefunden (11):

Es wurde auch festgestellt, dass das HDL:LDL-Verhältnis für die Forbes-Zusammensetzungen fast dem Doppelten dessen für beta-Sitosterol allein entsprach.

Beispiel 5 – Wirkungen von Phytosterol-Zusammensetzungen auf Kaninchen

In dieser Studie wurden zwei Kaninchen über 43 Tage im Hinblich auf die Wirkungen einer der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen (Forbes 1 % in der Ernährung) auf deren Gesamtcholesterolprofile bewertet. Die Ergebnisse sind nachstehend angegeben:

Tabelle 6:

Eine Abnahme im Gesamtcholesterol ist bei sowohl Kaninchen A als auch B während der zwei Wochen der Verabreichung der Phytosterol-Zusammensetzung (Forbes 1 %) ersichtlich. Diese Wirkung dauerte selbst nach Beendigung von Forbes 1 % an. Die Wirkungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auf die Gesamtcholesterolverringerung dauern über die anfängliche Verabreichungsphase hinaus an.

Beispiel 6 – Wirkungen von Phytosterol-Zusammensetzungen auf Mäuse mit apo-E-Mangel (Referenz)

Tiere: Neunzehn 5 Wochen alte männliche Mäuse mit apo-E-Mangel wurden von Jackson Laboratory, USA, bezogen. Tiere wurden statistisch in 2 Gruppen eingeteilt, und zwar 9 Tiere in die Kontrollgruppe und 10 Mäuse in die experimentelle Forbes-Gruppe. Nach 5 Tagen als eine Anpassungszeit wurde den Mäusen Blut aus dem Schwanz in Kapillarröhrchen entnommen, und Plasma wurde durch Zentrifugation des Blutes abgetrennt. Die Maus-Plasmalipide wurden bestimmt.

Ernährung: Mausfutter mit geringem Fettanteil und geringem Cholesterolanteil wurden von Jamieson's Pet Food Distributors Ltd., Vancouver, B. C., bezogen. Aus Tallöl abgeleitete Phytosterole wurden aus Tallölseife unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens extrahiert. Die Reinheit und der Prozentsatz der einzelnen Phytosterole in dem Gemisch des Endprodukts wurden durch Gas-Flüssig-Chromatographie bestimmt. Das Endprodukt zeigte bis zu 95 % Reinheit und enthielt 69 % Sitosterol, 15 % Campesterol und 16% Stigmastanol. Das Mausfutter wurde zu einem feinen Pulver gemahlen. Zu diesem Pulver wurden 0,15 % (Gew./Gew.) Cholesterol (Sigma) gegeben, und es wurde gut gemischt. Ein Anteil dieser Cholesterol-Ergänzungsernährung wurde wieder pelletiert, getrocknet und zum Füttern der Kontrollgruppe der Mäuse verwendet; ein anderer Anteil wurde mit 2 % (Gew./Gew.) Tallöl-extrahierten Phytosterolen angereichert, erneut pelletiert, getrocknet und zum Füttern der experimentellen Gruppe der Mäuse verwendet.

Biochemische Assays: Plasma-Gesamtcholesterol und Triglycerid wurden unter Verwendung eines enzymatischen Kits (Boehringer Mannheim) gemessen, und HDL-Cholesterol wurde nach einem zuvor veröffentlichten Präzipitationsverfahren unter Verwendung von Polyethylenglykol 6000 bestimmt.

Körpergewicht und Futteraufnahme: Mauskörpergewicht und Futteraufnahme wurden wöchentlich gemessen.

Tabelle 7:
  • * p<0,05
Tabelle 8:
  • * p<0,05

Weitere Befunde: Es wurden keine Nebenwirkungen im Hinblick auf die neuen Ernährungen beobachtet. Alle Tiere aus beiden Gruppen sahen normal aus, bei normalem Verhalten unter Einschluss normaler Verdauung. Eine Maus der Kontrollgruppe wurde am 11.07.95 tot aufgefunden. Da der Mäusekörper nicht aufbewahrt wurde, wurde keine Autopsie durchgeführt. Bei einer Maus aus der Forbes-Gruppe wurde ein Flüssigkeitsverlust mit Körpergewichtverlust festgestellt. Das Tier wurde getötet, und es wurde festgestellt, dass der Grund für seine Krankheit eine Malokklusion (Zahnüberwachstum) war.

Statistische Analyse: Die Ergebnisse wurden unter Anwendung eines Zweistichproben-t-Tests unter Annahme gleicher Varianzen analysiert.

Ergebnisse:

Ergebnisse bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind in den nachstehenden Tabellen angegeben.

Tabelle 9:
  • * p<0,0001
Tabelle 10:
Tabelle 11:
  • *p<0,001

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Forbes-Zusammensetzungsgruppe eine signifikante Abnahme (33 %) bei Gesamtcholesterol, einen nicht-signifikanten Anstieg bei Triglyceriden und einen signifikanten Anstieg bei HDL-Cholesterol (> 100 %) zeigte.

Beispiel 7 – Wirkung von Phytosterol-Zusammensetzungen auf Hamster – 45 Tage-Studie

Fünfzig GS-Hamster wurden für 2 Wochen in einer Tierhaltungseinrichtung untergebracht, bevor sie mit halb gereinigter Ernährung für 45 Tage gefüttert wurden. Sie wurden in 5 Gruppen eingeteilt, denen 0,25 % Cholesterol zusammen mit einem von vier Gemischen von Pflanzensterolen gefüttert wurden: Sojabohnen, Tallöl, reines Sitostanol und künstliches Gemisch, das Tallöl-Phytosterole darstellt. Die Kontrollgruppe erhielt nur 0,25 % Cholesterol. Ihre Futteraufnahme wurde während des Studienzeitraums alle 3 Tage überwacht. Ihr Körpergewicht wurde jede Woche und zum Zeitpunkt der Gewebeentnahme gemessen. Drei Tage vor der Tötung der GS-Hamster wurden sie leicht mit Diethylether betäubt, und ihnen wurde intravenös durch die Jugularvene 0,4 ml Intralipid mit einem Gehalt an 0,18 mg 13C-Cholesterol injiziert. Direkt nach der Injektion wurden die Tiere durch eine Schlundsonde mit 0,6 ml Lipidgemisch (Kokosnuss-, Oliven- und Saffloröle) mit einem Gehalt an 0,44 mg18O-Cholesterol gefüttert. Die GS-Hamster wurden in ihren Drahtkäfigen für 72 Stunden gehalten und mit Wasser und Futter ad libitum versorgt.

Am Tag der Tötung wurde jedem GS-Hamster i. p. 1 ml deuteriertes Wasser injiziert, und die Tiere wurden für 1 Stunde vor der Tötung belassen. Die Tiere wurden mit Diethylether betäubt, und Blutproben wurden durch Kardiopunktur gewonnen. Leber, Gallenblase, Dünndarm, Dickdarm und Herz wurden gewonnen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem Gefriergerät bei -80 °C gelagert. Die Karkassen und Ausscheidungen wurden bei -20 °C für weitere Gesamtlipid- und Sterolanalysen gelagert.

Futteraufnahme, Körper- und Lebergewichtsmessungen:

Die Futteraufnahme der GS-Hamster wurde alle 3 Tage gemessen. Die statistische Analyse zeigte keinen signifikanten Unterschied unter den 5 Gruppen in ihrem Futterverbrauch. Die mittlere tägliche Aufnahme in den 5 Gruppen variierte von 8,84 bis 9,34 g pro Tag (p-Wert = 0,4). Die Tiere zeigten eine signifikante Zunahme ihres Körpergewichts von etwa 25 bis 40 g während der Studiendauer (p-Wert <0,05; t-Test für verbundene Stichproben). Die schließliche Messung der Körpergewichte reichte von 112,5 bis 154,3 g. Keine statistische Signifikanz wurde unter den verschiedenen Behandlungsgruppen festgestellt (p-Wert = 0,43).

Die Lebergewichte variierten signifikant unter den verschiedenen Abteilungen. Die mit Sitostanol behandelte Gruppe zeigte die geringsten Lebergewichte im Vergleich mit der Kontrolle und den anderen Gruppen, die mit 0,25 % Cholesterol und verschiedenen Phytosterolen gefüttert wurden. Außerdem zeigte die Sojabohnenbehandelte Gruppe einen ähnlichen signifikanten Unterschied im Vergleich mit der Sitostanol-behandelten, wenn die Daten statistisch unter Anwendung des Newman-Keuls-Tests analysiert wurden. Im allgemeinen zeigten alle Gruppen, denen Pflanzensterole gefüttert wurden, geringere Lebergewichte im Vergleich mit der Kontrolle, der 0,25 % Cholesterol gefüttert wurde (p-Wert = 0,01). Die mit Tallöl-Sterolen und die mit Sitostanol gefütterten GS-Hamster wiesen ein mittleres Lebergewicht 15 % bzw. 20 % niedriger als die Kontrolle auf. Das natürliche Tallöl und das künstlich hergestellte Tallöl zeigten ähnliche Werte der Lebergewichte, was darauf hinweist, dass die fehlende Verbindung im Sojabohnenpflanzensterol, nämlich Sitostanol, eine wesentliche Rolle bei der Senkung des Sterolgehalts in der Leber spielt.

Lipidanalyse: I. Gesamtcholesterol:

Die Gesamtcholesterolwerte wurden unter Verwendung eines kommerziellen enzymatischen Reagenzkits mit einem VP-Autonalysator bestimmt. Blutproben wurden 2-mal gemessen, und der Mittelwert der beiden Werte wurde in der anschließenden statistischen Analyse verwendet. Einweg-ANOVA mit Newman-Keuls- und Bonferroni-Methoden wurden für die verschiedenen Lipidanalysen angewandt. Sitostanol senkte signifikant den Gesamtcholesterolspiegel bei GS-Hamster-Plasma um 34 % im Vergleich zur Kontrolle. Der Mittelwert für die Kontrollgruppe war 226,9 mg/dl, und der für die mit Sitostanol behandelte Gruppe war 151,2 mg/dl (p-Wert = 0,007). Tallöl-Phytosterole und die künstlichen Tallölgemische zeigten eine ähnliche Abnahme im Plasmacholesterol (17,5 %), nämlich 118,4 mg/dl bzw. 186,1 mg/dl. Die Tallöl-Phytosterole (Forties) zeigten jedoch eine signifikante Abnahme im Gesamtcholesterolwert (175,2 mg/dl), wenn ein Ausreißer-Probenwert von der Analyse ausgeschlossen wurde, (p-Wert<0,02) in der Tallölgruppe im Vergleich mit der Kontrollgruppe (nur 0,25 % Cholesterol). Die Korrelation zwischen dem Vorhandensein von Sitostanol und dem geringeren Plasmaspiegel war signifikant (p-Wert <0,0001 und r = 0,46).

II. HDL-Cholesterol:

Der apo-A-Anteil der Lipoproteine, die im HDL-Cholesterol vorhanden sind, zeigte keine signifikanten Änderungen in den Werten unter den 5 verschiedenen Gruppen (p-Wert = 0,18). Eine nicht-signifikante Abnahme von 15 % im mittleren HDL-Wert in der mit Sitostanol behandelten Gruppe wurde beobachtet. Dieses Element beeinflusste jedoch nicht die signifikante Abnahme im Gesamtcholesterol, die 34 betrug. Das Verhältnis von nicht-apo-A-Lipoproteinen zu apo-A (HDL)-Lipoproteinen variierte nicht signifikant unter den Gruppen. Die überraschende Wirkung der nicht-signifikant geringeren Werte von HDL in den Sitostanol- und Tallölgruppen trug dazu bei, ein nicht-signifikantes Ergebnis bei den nicht-apo-A/apo-A (HDL)-Werten zu erzeugen. Im allgemeinen variierten die verschiedenen Arten von Phytosterolen die HDL-Cholesterol-Spiegel in GS-Hamster-Plasma nicht.

III. LDL und/oder nicht-apo-A-Sterole:

Sitostanol war wirksam bei der Verringerung der nicht-apo-A-Sterole im Plasma. Eine 55%ige Verringerung der nicht-apo-A-Lipoproteine wurde gezeigt (p-Wert = 0,02). Entsprechend ihrer Wirkung auf Gesamtcholesterol verringerten Tallöl und das künstliche Tallölgemisch die nicht-apo-A-Sterole um 21 %, was erneut darauf hindeutet, dass eine starke Korrelation zwischen dem Sitostanolgehalt in den Phytosterolen und deren vorteilhaften Wirkungen hinsichtlich der Verringerung der Cholesterolspiegel in GS-Hamster-Plasma besteht. Diese Verringerung war jedoch aufgrund der Variabilität in den Triglyceridwerten nicht statistisch signifikant.

IV. Triglyceride:

Bei Anwendung der Einweg-ANOVA-Methode auf die TG-Werte bestanden diese nicht den Normalitätstest. GS-Hamster wurden im nicht-nüchternen Zustand (wichtig für die zukünftige Cholesterolsynthese, Kinetik und Resorptionsanalyse) getötet. Aufgrund dieser Situation waren verschiedene Werte Ausreißer. Mit ANOVA auf Rangeinteilung zeigten die TG-Werte keine statistischen Unterschiede unter den Gruppen. Pflanzensterole beeinflussten die Plasma-TG-Spiegel bei GS-Hamstern nicht.

Tabelle 12:

Als Schlussfolgerung zeigte die Verwendung der aus Tallölseife abgeleiteten Zusammensetzung entsprechend der vorliegenden Erfindung das günstigste Profil aufgrund der Zunahme im HDL-Cholesterol und der Abnahme im Gesamtcholesterol. Diese HDL-Wirkung war bei der künstlichen Tallölzusammensetzung nicht zu sehen. Entsprechend war die Gesamtwirkung von Sitostanol aufgrund der signifikanten Abnahme bei HDL nicht günstig.

Obwohl dies nicht völlig klar ist, scheint es, dass im Hinblick auf Pflanzensterole die relativ hydrophoben Sterole die Gesamt-Cholesterolresorption stärker inhibieren, während die relativ hydrophilen Sterole einen stärkeren Einfluss auf den Spiegel an HDL haben. Die erfindungsgemäßen Phytosterol-Zusammensetzungen sind einzigartig, indem diese beiden Wirkungen erhalten bleiben.


Anspruch[de]
Verwendung einer Cholesterol senkenden Zusammensetzung umfassend beta-Sitosterol, Campesterol und ferner umfassend Stigmastanol, worin Campesterol und Stigmastanol zusammen mindestens 50 % der Konzentration an beta-Sitosterol ausmachen und wobei der Anteil von beta-Sitosterol 1,0 beträgt, der von Campesterol zwischen 0,2 und 0,4 liegt und der von Stigmastanol zwischen 0,2 und 0,5 liegt, bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung bei einem Verfahren zur Senkung der Plasmakonzentration von Lipoprotein geringer Dichte-Cholesterol. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Anteil von beta-Sitosterol 1,0 beträgt und entweder

(a) der von Campesterol 0,354 beträgt und der von Stigmastanol 0,414 beträgt oder

(b) der von Campesterol 0,330 beträgt und der von Stigmastanol 0,203 beträgt, oder

(c) der von Campesterol 0,268 beträgt und der von Stigmastanol 0,299 beträgt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Verfahren der Prävention oder Behandlung von primärer und sekundärer Dyslipidämie und Arteriosklerose dient. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zusammensetzung Phytosterole und zusammen damit vorkommende Verbindungen, ausgewählt unter Triterpenen, langkettigen Alkoholen und anderen alkohollöslichen organischen Verbindungen, enthält. Medikament, umfassend beta-Sitosterol, Campesterol und ferner umfassend Stigmastanol, wobei Campesterol und Stigmastanol zusammen mindestens 50 % der Konzentration an beta-Sitosterol ausmachen, und wobei der Anteil von beta-Sitosterol 1,0 beträgt, der von Campesterol zwischen 0,2 und 0,4 liegt und der von Stigmastanol zwischen 0,2 und 0,5 liegt; und einen pharmazeutisch wirksamen Träger dafür. Medikament nach Anspruch 5, wobei der Anteil von beta-Sitosterol 1,0 beträgt und entweder

(a) der von Campesterol 0,354 beträgt und der von Stigmastanol 0,414 beträgt oder

(b) der von Campesterol 0,330 beträgt und der von Stigmastanol 0,203 beträgt, oder

(c) der von Campesterol 0,268 beträgt und der von Stigmastanol 0,299 beträgt.
Zusammensetzung, umfassend beta-Sitosterol, Campesterol und ferner umfassend Stigmastanol, wobei Campesterol und Stigmastanol zusammen mindestens 50 % der Konzentration an beta-Sitosterol ausmachen und wobei der Anteil von beta-Sitosterol 1,0 beträgt und entweder

(a) der von Campesterol 0,354 beträgt und der von Stigmastanol 0,414 beträgt oder

(b) der von Campesterol 0,330 beträgt und der von Stigmastanol 0,203 beträgt, oder

(c) der von Campesterol 0,268 beträgt und der von Stigmastanol 0,299 beträgt.






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