PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69836976T2 08.11.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001032416
Titel NEOSPORA IMPSTOFF
Anmelder Bayer Corp., Pittsburgh, Pa., US
Erfinder CHOROMANSKI, Leszek, Lenexa, KS 66215, US;
BROWN, K., Karen, Parkville, MO 64152, US
Vertreter Köhler, F., Dipl.-Biol. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 40723 Hilden
DE-Aktenzeichen 69836976
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, FR, GB, IT, LI, NL
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 13.10.1998
EP-Aktenzeichen 989510458
WO-Anmeldetag 13.10.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/US98/21515
WO-Veröffentlichungsnummer 1999020303
WO-Veröffentlichungsdatum 29.04.1999
EP-Offenlegungsdatum 06.09.2000
EP date of grant 24.01.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.11.2007
IPC-Hauptklasse A61K 39/002(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 1/20(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung:

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vakzine zum Schutz von Säugetieren vor der durch Neospora caninum hervorgerufenen Erkrankung. Genauer gesagt betrifft die Erfindung sichere und immunogen wirksame Vakzinen zum Schutz von Rindern und Hunden vor durch Neospora caninum hervorgerufenen Fehlgeburten.

Kurze Beschreibung des Stands der Technik:

Über Neospora caninum wurde erstmals von Dubey et al. (JAVMA, Band 192, Nr. 9 (1. Mai 1988)) als eine toxoplasmoseähnliche Erkrankung berichtet, die Hunde betraf. Man fand heraus, dass sich Neospora caninum strukturell von Toxoplasma gondii unterschied und in einem Immunperoxidasetest nicht mit dem Anti-T.-gondii-Antiserum reagierte. Dubey et al. beschrieben die Hauptläsionen, die mit dem Organismus assoziiert waren, als Meningoenzephalomyelitis und Myositis. Während der letzten Jahre wurde Neosporose als eine der Hauptreproduktionserkrankungen bei Rindern erkannt (Anderson et al., Food Animal Practice 10, 439–461 (1994)), wobei in Nord- und Südamerika, Europa, Afrika, den Anrainerstaaten des Pazifiks sowie in den Vereinigten Staaten von Fällen berichtet wurde. Die wichtigsten klinischen Symptome von boviner Neosporose sind fötale Fehlbildungen mit fokaler nicht eitriger nekrotisierender Enzephalitis, nicht eitriger Myokarditis und Myositis beim Fötus (Anderson et al., Journal of the American Veterinary Medical Association 198, 241–244 (1991)). Gemäß Anderson et al., Journal of the Veterinary Medical Association 210, 1169–1172 (1997), deuten retrospektive Studien an Rindern in Kalifornien darauf hin, dass Neosporose zumindest seit dem Jahr 1985 endemisch ist. Diese Autoren geben an, dass 18 bis 19% aller fehlgeborenen Rinderföten, die dem California Veterinary Diagnostic Laboratory System übermittelt wurden, eine Neospora-Spezies-Infektion aufweisen. Im Rahmen einer zukünftigen Studie ausgewählter Molkereien in Kalifornien war die Anzahl an auf Neospora-Spezies-Infektionen zurückzuführender Fehlgeburten sogar noch höher (42,5%).

Ho et al. (J. Parasitol. 83 (3) (1997)) berichteten vor kurzem über die erfolgreiche Reproduktion einer bovinen Fehlgeburt und einer fötalen Infektion durch das Infizieren von trächtigen Kühen mit Tachyzoiten von Neospora caninum. Diese Publikation deutet darauf hin, dass es eine Korrelation zwischen dem serologischen Titer, wie durch indirekte fluoreszierende Antikörper-(IFA-)Tests gemessen, und dem Schutz vor Fehlgeburten, die durch Neospora caninum hervorgerufen wurden, bei Kühen geben könnte. Bei Kühen mit IFA-Titern von 320 und 640 kam es nach der Infektion mit Tachyzoiten dieses Organismus nicht zu einer Fehlgeburt.

Wie zuvor bereits erwähnt, wurde Neosporose auch bei Welpen und bei Hunden im fortgeschrittenen Alter von 15 Jahren festgestellt. Der Prozentsatz der infizierten Hunde, die klinische Symptome aufweisen, ist unbekannt. Bei Hunden kann Neospora caninum jedes beliebige Gewebe infizieren, obwohl eine Infektion am häufigsten im Zentralnervensystem und in den Spinalnervenwurzeln zu finden ist. Die schwerwiegendsten Infektionen sind bei Welpen zu beobachten, die im Uterus infiziert wurden. Diese Welpen zeigen eine aufsteigende Paralyse. Eine Fehlgeburt kann in einer experimentellen Infektion von trächtigen Hündinnen während des frühen Stadiums der Trächtigkeit reproduziert werden. Sulfonamide, Pyrimethamin und Clindamycin wurden verwendet, um Neosporose bei Hunden zu behandeln.

Neospora caninum kann auch bei experimentell geimpften Katzen zu einer tödlichen Infektion führen. Es wurde bis jetzt jedoch noch nicht vom natürlichen Auftreten dieser Erkrankung bei Katzen berichtet.

Beobachtungen zufolge führte Neosporose zu Fehlgeburten bei Schafen und Ziegen, jedoch in einem geringeren Ausmaß, wie dies bei Rindern der Fall ist. Eine experimentelle Infektion ist bei Schafen und Ziegen durch eine subkutane Injektion von Tachyzoiten leicht herbeizuführen.

Obwohl Neosporose, besonders bei Rindern, zunehmend ein ernstes Problem darzustellen scheint und es mit Sicherheit eine bereits seit langem vorhandene Notwendigkeit der Lösung dieses Problems durch den Schutz von Säugetieren unter Verwendung einer Vakzine gibt, offenbart WO 9525541 Neospora-caninum-Vakzinen, die einen Rohextrakt von Neospora-Tachyzoiten, -Bradyzoiten oder anderer Stadien oder chemisch fixierter Parasiten umfassen. Die Vakzinen können ebenso ein Adjuvans enthalten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist ein Fokus dieser Erfindung, eine Vakzinen-Zusammensetzung zum Schutz von Säugetieren vor der durch Neospora caninum hervorgerufenen Erkrankung zu beschreiben, umfassend inaktivierte, in Gewebskultur gezüchtete Neospora-caninum-Tachyzoiten als gesamte Kultur oder in Form eines Extrakts oder als schützende Untereinheiten-Antigene, die daraus enthalten werden, ein Adjuvans und als ein inaktivierendes Agens &bgr;-Propiolacton (BPL) oder binäres Ethylenimin (BEI). Ein Verfahren zur Herstellung einer Vakzine zum Schutz von Säugetieren vor der durch Neospora caninum hervorgerufenen Erkrankung umfasst folgende Schritte: 1) das Züchten von Neospora caninum in einer Kultur von anfälligem Gewebe, bis ein CPE erzielt wird; 2) das Ernten der in der Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum; 3) das Inaktivieren der geernteten, in der Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum mit einem Inaktivierungsmittel, das BPL oder BEI ist; und 4) das Versetzen der inaktivierten, geernteten, in Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum mit Adjuvans zur Herstellung einer Vakzine. Ein weiteres Verfahren zur Herstellung einer Vakzine zum Schutz von Säugetieren vor der durch Neospora caninum hervorgerufenen Erkrankung umfasst folgende Schritte: 1) das Züchten von Neospora caninum in einer Kultur von anfälligem Gewebe, bis ein CPE erzielt wird; 2) das Ernten der in der Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum; 3) das Extrahieren schützender Antigene aus den geernteten, in der Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum zur Herstellung von Untereinheiten; 4) das Inaktivieren der Untereinheiten mit einem Inaktivierungsmittel, das BPL oder BEI ist; und 5) das Versetzen der Untereinheiten mit Adjuvans zur Herstellung einer Vakzine. Es ist im Umfang dieser Erfindung enthalten, Neospora caninum vor der Extraktion der schützenden Antigen-Untereinheiten zu inaktivieren.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie oben stehend dargelegt, richtet sich die vorliegende Erfindung auf Vakzinen-Zusammensetzungen, umfassend inaktivierte, mit Adjuvans versetzte Neospora caninum, gezüchtet in einer Kultur von anfälligem Gewebe, oder Untereinheiten, die von Neospora caninum abstammen. Das Verfahren zur Herstellung der oben genannten Vakzinen-Zusammensetzungen umfasst das Züchten von Neospora caninum unter künstlichen Bedingungen, in Gewebekultur, um Parasiten-Antigene zur Verwendung in Vakzinen zu erhalten. Neospora caninum kann aus einer beliebigen Quelle erhalten werden. Es wird bevorzugt, dass eine Vakzine für Rinder Neospora caninum enthält, das aus einem fehlgeborenen Rinderfötus isoliert wurde. Zusätzlich wird bevorzugt, dass eine für Hunde gedachte Vakzine Neospora caninum enthält, das aus einem Hund isoliert wurde. Zur Veranschaulichung wird das Gehirn eines infizierten Fötus geerntet, in einem Wachstumsmedium, wie z.B. Minimal Essential Media (MEM), oder einem Verdünnungsmittel, wie z.B. phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), ergänzt mit Antibiotika, um das Kontaminierungspotential zu minimieren, homogenisiert. Dieses Homogenisat wird zentrifugiert, um große Teilchen zu entfernen, und der Überstand wird auf verschiedene Gewebekulturen geimpft und, falls notwendig, in Gewebekulturen passagiert, bis ein zytopathischer Effekt (CPE) auf zumindest einer Gewebekultur produziert wird. Die Gewebekultur ist vorzugsweise eine Zelllinie, in dem der Parasit auf einen hohen Titerwert heranwächst, so dass ein Master-Impfgut hergestellt werden kann. Ein hoher Titer bedeutet, dass die Parasiten-Tachyzoiten heranwachsen, um einen unter dem Mikroskop festgestellten Zählwert oder, wenn sie wieder zurück in die Gewebekultur platziert werden, einen Titer von zumindest 1 × 104 infektiöse Gewebekultur-Dosis50/ml (TCID50/ml) produzieren. Vorzugsweise werden 1 × 105 TCID50/ml produziert und noch bevorzugter werden 1 × 106 TCID50/ml produziert. Ein Master-Impfgut bedeutet, dass die in Gewebekultur gezüchtete Neospora-Spezies bis auf einen hohen Titer herangezüchtet wird, in Gefrierphiolen in gleiche Volumenanteile aliquotiert und eingefroren wird, wonach sie auf die Abwesenheit von Kontaminanten (Bakterien, Pilze und Viren) getestet wird und danach verwendet wird, um Arbeits- und Produktionsimpfgut-Einheiten herzustellen. Arbeits- und Produktionsimpfgut-Einheiten bedeuten ein weiteres Passagieren des Master-Impfguts in einer Kultur von anfälligem Gewebe, das Aliquotieren, Einfrieren und wiederholte Testen, so dass die Vakzinen aus den Produktionsimpfgut-Einheiten anstatt unter Verwendung des Master-Imfguts hergestellt werden können und alle Vakzinen aus demselben Ausgangsmaterial hergestellt werden. Eine Kultur von anfälligem Gewebe bedeutet eine Gewebekultur, die, wenn sie mit Neospora-Spezies inokuliert wird, fähig ist, die Parasiten-Tachyzoiten zu produzieren und einen CPE zu erzeugen.

Verschiedene Arten an Vakzinen können gemäß dieser Erfindung hergestellt werden, eine inaktivierte Vakzine oder eine Vakzine aus einer schützenden Untereinheit.

Das Verfahren zur Herstellung einer inaktivierten Neospora-caninum-Vakzine erfordert, dass der Organismus auf höhere Titerwerte heranwachsen gelassen wird, und umfasst die Schritte des Züchtens von Neospora caninum in einer Kultur von anfälligem Gewebe, bis ein CPE produziert wird, des Erntens des in Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum, des Inaktivierens des geernteten, in Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum mit einem inaktivierenden Agens, das BPL oder BEI ist, und des Versetzens der inaktivierten, geernteten, in Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum mit Adjuvans zur Herstellung einer Vakzine.

Das Verfahren zur Herstellung einer Neospora-caninum-Untereinheit-Vakzine umfasst folgende Schritte: das Züchten von Neospora caninum in einer Kultur von anfälligem Gewebe, bis ein CPE erzielt wird; das Ernten der in der Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum; das Extrahieren schützender Antigene aus den geernteten, in der Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum zur Herstellung von Untereinheiten der schützenden Antigene; das Inaktivieren der Untereinheiten mit einem Inaktivierungsmittel, das BPL oder BEI ist; und das Versetzen der Untereinheiten mit Adjuvans zur Herstellung einer Vakzine. Es ist im Umfang dieser Erfindung enthalten, Neospora caninum vor der Extraktion der schützenden Antigen-Untereinheiten zu inaktivieren, um eine Untereinheitsvakzine herzustellen.

Inaktivierende Agenzien können aus der aus &bgr;-Propiolacton (BPL) oder binärem Ethylenimin (BEI) bestehenden Gruppe ausgewählt werden.

Adjuvanzien, die verwendet werden, um die Immunogenität der Neospora-Vakzinen dieser Erfindung zu erhöhen, können aus der aus Polymeren, wie z.B. Carbopol, HAVLOGEN® und POLYGEN®, Öl-in-Wasser, wie z.B. EMULSIGEN® und EMULSIGEN PLUS®, Wasser-in-Öl-in-Wasser, Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat, Immunmodulatoren, wie z.B. BAYPAMUN®, auf Lipiden basierenden Adjuvanzien, wie z.B. Bay R-1005, sowie Liposomen und Kombinationen daraus bestehenden Gruppe ausgewählt werden.

Die inaktivierten Neospora-Vakzinen dieser Erfindung können Stabilisatoren umfassen, die vor oder nach dem Versetzen mit Adjuvans hinzugefügt werden, um den Antigengehalt über lange Zeitspannen und unter nachteiligen Bedingungen hoher oder niedriger Temperaturen beizubehalten. Stabilisatoren werden aus der aus Proteaseinhibitoren, Zuckern, wie z.B. Saccharose und Glycerin, einkapselnden Polymeren, Chelatbildnern, wie z.B. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Proteinen und Polypeptiden, wie z.B. Gelatine und Polyglycinn und Kombinationen daraus bestehenden Gruppe ausgewählt.

Die folgenden Beispiele stellen Zusammensetzungen von Neospora-caninum-Vakzinen dar und beschreiben ihre Produktionsverfahren, umfassend das Züchten der Tachyzoiten dieses Organismus in so verschiedenen Zelllinien wie einer Equinen Dermalzelllinie (ATCC Nr. CCL-57), einer Vero-Zelllinie und einer Nierenzelllinie einer Afrikanischen Grünen Meerkatze (BIOWHITTAKER Nr. 75-104), die von der Bayer Corporation kloniert wurde, um eine Zelllinie zu produzieren, die MA 104 Klon B genannt wurde, sowie das Beschreiben ihrer Verwendung bei der Impfung von Rindern, um indirekt fluoreszierende schützende Antikörper-(IFA-)Titer herzustellen.

Die Erfindung wird weiter veranschaulicht durch die folgenden Beispiele, in denen alle Teile und Prozentangaben das Gewicht betreffen, falls nicht anders spezifiziert, und soll dadurch keineswegs eingeschränkt werden.

BEISPIELE BEISPIEL 1:

Um zu bestimmen, ob Neospora-caninum-Vakzine in einem nach dem Stand der Technik bekannten Modell (Ho et al. (1997) Schutz gegen Fehlgeburten bei trächtigen Kühen bieten können, erzeugten die Erfinder durch das Züchten der Neospora caninum auf einer Vero-Zelllinie in 850-cm2-Rollflaschen Neospora-caninum-Vakzinen. Eine Phiole an Arbeitszellen der Vero-Zelllinie wurde aus dem Flüssigstickstoff-Speicher entfernt, schnell aufgetaut, verdünnt und in 850-cm2-Rollflaschen platziert, die 250 ml DMEM (hoher Glukosegehalt) enthielten, hiernach DMEMH benannt, und zwar bei einer Rate von 4 × 107 Zellen pro Rollflasche. Das Medium wurde mit 1 ml/l Neomycinsulfat und mit 5 Vol.-% Pferdeserum ergänzt. Die Zellen wurden bei 36 bis 38°C für eine Zeitspanne von 5 bis 7 Tagen inkubiert, bis die Zellen zwischen 95 und 100% konfluent waren. Die Arbeitszellen wurden durch Spülen des Zelllagen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) aus den Rollflaschen entfernt, wobei anschließend 10 ml einer Trypsin-Ethylen-Diamintetraessigsäure-Dinatriumsalz-(EDTA-)Lösung (2,5 g/l Trypsin + 1 g/l EDTA) zu jeder Rollflasche hinzugefügt wurde, die Flaschen zumindest 10 Minuten lang leicht geschüttelt wurden, bis sich die Zellen von der Oberfläche lösten, und danach wurde die Flaschenoberfläche mit DMEMH gespült und der Inhalt aller Flaschen gepoolt. Die Zellen aus diesen Flaschen (Produktionszellen) wurden mit 4,5 × 107 Zellen pro Rollflasche erneut in neue 850-cm2-Rollflaschen geimpft. Die Produktionszellen wurden 24 Stunden lang bei 36 bis 38°C inkubiert, wonach sie mit frisch passagierten Neospora-caninum-Tachyzoiten des Stamms BPA-1 (3 × 108 bis 4,5 × 108/850-cm2-Rollflasche) infiziert wurden. Zur Zeit der Infektion waren die Produktionszellen zumindest zu 50% konfluent. Die infizierten Rollflaschen wurden 120 bis 168 Stunden lang bei 36 bis 38°C auf rotierenden Rollständern inkubiert, die auf zwischen 0,2 und 0,4 Umdrehungen pro Minute eingestellt waren. Zu dieser Zeit zeigte die Zelllage den typischen CPE, der zumindest 80% der Zelllage betraf. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Neospora-Flüssigkeiten durch das Poolen des Inhalts aus allen Rollflaschen in ein steriles Gefäß geerntet, und es wurde eine Probe zur Lebend-Neospora-Titration entnommen. Annehmbare Ernteflüssigkeiten müssen einen Titer von zumindest 3 × 105/ml aufweisen. Der Erntetiter für die vorliegende Charge lag bei 3 × 105/ml. Die Ernteflüssigkeiten wurden durch das Halten der Ernteflüssigkeiten bei –70°C und das schnelle Auftauen bei Temperaturen, die nicht höher als 37°C waren, zwei Mal gefroren und aufgetaut. Nach dieser Behandlung wurden die Ernteflüssigkeiten über eine Zeitspanne von 48 Stunden bei 4°C mit 0,2 M binärem Ethylenimin (BEI) inaktiviert. Nach der Inaktivierung wurde BEI mit 3,16 M Natriumthiosulfat neutralisiert. Die inaktivierten Ernteflüssigkeiten wurden mittels 15-minütiger Zentrifugierung bei 3500 Umdrehungen pro Minute konzentriert, und das Pellet wurde in PBS erneut auf eine Konzentration von 3,0 × 107, basierend auf einer mikroskopischen Zählung, suspendiert. Aliquote Anteile dieser inaktivierten und konzentrierten Ernteflüssigkeiten wurden mit zwei verschiedenen Typen Adjuvans versetzt, um zwei verschiedene Vakzinen-Formulierungen herzustellen. Eine Hälfte der inaktivierten und konzentrierten Ernteflüssigkeiten wurde mit 10 Vol.-% des Adjuvans HAVLOGEN® versetzt, während der Rest der inaktivierten konzentrierten Ernteflüssigkeit mit 15 Vol.-% des Adjuvans EMULSIGEN® versetzt wurde. HAVLOGEN® ist ein Carbopol enthaltendes, auf Polymer basierendes Adjuvans, während EMULSIGEN® ein Adjuvans auf Öl-in-Wasser-Basis ist.

Die beiden Vakzinen-Formulierungen wurden verwendet, um junge Kühe im Alter von zwei bis zweieinhalb Jahren zu impfen. Alle jungen Kühe wurden herangezogen, und als die Trächtigkeit nach 30 ± 5 Tagen bestätigt wurde, wurden diese Tiere in vier Gruppen geteilt, die wie folgt behandelt wurden: Die jungen Kühe aus Gruppe 1 (Nr. 21, 30, 39 und 20) erhielten zwei Mal im Abstand von 4 Wochen eine subkutane Injektion einer Neospora-Vakzine, die 10% HAVLOGEN®-Adjuvans enthielt.

Die jungen Kühe aus Gruppe 2 (Nr. 18, 37, 40 und 431) erhielten zwei Mal im Abstand von 4 Wochen eine subkutane Injektion einer Neospora-Vakzine, die 15% EMULSIGEN® enthielt.

Die jungen Kühe aus Gruppe 3 (Nr. 429, 25, 28 und 2) dienten als Kontrollgruppe und erhielten zwei Mal im Abstand von 4 Wochen eine subkutane Injektion eines Kontrollpräparats, das nur uninfizierte Vero-Zellkulturen enthielt, die 15 EMULSIGEN® enthielten.

Die jungen Kühe aus Gruppe 4 (Nr. 19, 10, 4 und 14) dienten als Kontakt-Kontrollgruppe und wurden weder geimpft noch exponiert.

Zumindest eine Woche vor der Impfung (P.V.), am Tag der ersten Impfung (Tag 0) und in den Wochen 5, 6 und 7 nach der Impfung, am Tag der Boosterdosis (Boost), am Tag der Exposition (zwischen Woche 11 und 12 und danach wöchentlich bis Woche 16 nach der Impfung) wurden Serumproben von allen jungen Kühen entnommen. Alle jungen Kühe waren zu Beginn der Studie seronegativ. In Tabelle 1 werden nur die Titer aufgelistet, die am Tag der Exposition gemessen wurden, da dies die höchsten Titer für diese Studie umfasst.

Die jungen Kühe aus den Gruppen 1–3 wurden mit 8 × 107 virulenten Neospora-caninum-Tachyzoiten des Stamms BPA-1, gezüchtet in Vero-Zellen, exponiert. Die Exposition fand 85 ± 5 Tage nach Beginn der Trächtigkeit statt. Die Föten wurden an Tag 40 ± 6 (114 bis 120 Tage) der Trächtigkeit mittels Kaiserschnitt aus den Kühen entfernt und durch grobe Untersuchung bewertet. Das Auftreten toter Föten wurde dahingehend interpretiert, dass die Vakzine die Föten nicht schützte und zu einer Fehlgeburt der Föten geführt hätte. Die Gegenwart lebender Föten wurde als Demonstration des Schutzes der Föten interpretiert und dahingehend, dass es wahrscheinlich nicht zu einer Fehlgeburt gekommen wäre.

Tabelle 1 zeigt die Resultate der Evaluierung der Daten der Föten und listet die serologischen Titer der jungen Kühe am Tag des Immunitätstests auf. Die in dieser Tabelle gezeigten Resultate zeigen, dass es bei den jungen Kühen in Gruppe 1 zwei lebende Föten und zwei tote Föten gab, was darauf hindeutet, dass die mit HAVLOGEN®-Adjuvans versetzte Neospora-Vakzine 50% Schutz vor einer Fehlgeburt bot. Es ist anzumerken, dass die beiden geschützten jungen Kühe bei der Exposition Titer von 320 bzw. 640 aufwiesen. Bei den jungen Kühen in Gruppe 2, die mit EMULSIGEN®-Adjuvans versetzte Neospora-Vakzine erhalten hatten, gab es einen lebenden Fötus einer jungen Kuh mit einem serologischen Titer von 320. Bei den verbleibenden jungen Kühen in dieser Vakzinen-Gruppe gab es tote Föten und Titer, die bei der Exposition unter 320 lagen. Die ersten zwei jungen Kühe in Gruppe 3 (Kontrollgruppe, die mit Adjuvans versetzte Vero-Zellen ohne Neospora erhielten) hatten tote Föten und Titer < 80. Die verbleibenden zwei jungen Kühe in dieser Gruppe wurden zu einem späteren Zeitpunkt als alle anderen der jungen Kühe exponiert, und es wird davon ausgegangen, dass sie keine ausreichend hohe Expositions-Dosis erhielten und daher lebende Föten hatten. Ihre Titer lagen bei < 80 am Tag der Exposition, und bei einer späteren histologischen Untersuchung wurde gezeigt, dass diese jungen Kühe nicht infiziert waren. Die jungen Kühe aus Gruppe 4 entwickelten keine Antikörper-Titer während der Studie, was darauf hindeutete, dass die anderen Gruppen keine Neospora-Organismen abgaben. Bei dieser letzten Gruppe wurde keine Exposition durchgeführt, da sie nur als Kontakt-Kontrollgruppe diente.

Dieses Experiment unterstützt die Auslegung des Erfinders bezüglich der Daten von Ho et al., worin die Erfinder annahmen, dass ein 320-IFA-Titer als Indikator für Schutz vor fötalen Fehlgeburten dienen könnte.

BEISPIEL 2:

Dieses Experiment wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob ein Neospora-caninum-Organismus in einer anderen Gewebekultur-Zelllinie gezüchtet werden könnte, inaktiviert und formuliert werden könnte, um eine Vakzine herzustellen, die Antikörper-Titer bei Rindern produziert könnte, die jenen ähneln würden, die in Beispiel 1 mit Neospora-Vakzinen beobachtet wurden, die auf einer Vero-Zelllinie erzeugt wurden.

Eine equine Dermalzelllinie, Master-Zellpassage 11, von ATCC Nr. CCL-57 abstammend, wurde auf eine Zellzählung von 2 × 107 Zellen pro Rollflasche in einem DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) verdünnt, das 10% Pferdeserum enthielt, und in 850-cm2-Rollflaschen mit einem Volumen von 250 ml pro Rollflasche beimpft. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz gezüchtet, wonach sie mit 2,4 × 107 Neospora-caninum-Tachyzoiten in 14,1 ml DMEM infiziert wurden. Jede Rollflasche enthielt 264 ml DMEM plus 10% Pferdeserum. Die neospora-infizierten Gewebekulturen wurden bei 37°C inkubiert, bis zumindest 50% der Zellen einen CPE aufwiesen (etwa 7 bis 9 Tage). Die Flüssigkeiten wurden geerntet, und die Tachyzoiten wurden 30 Minuten lang bei 3500 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um das geerntete Antigen zu konzentrieren. Das pelletierte, konzentrierte Neospora-caninum-Antigen wurde in 200 ml dekantiertem DMEM-Überstand von den zentrifugierten Tachyzoiten resuspendiert. Dieses konzentrierte Präparat, das 8 × 106 Tachyzoiten pro ml enthielt, wurde 16 Stunden lang bei –70°C eingefroren und anschließend bei Raumtemperatur aufgetaut. Das Präparat wurde danach unter Verwendung von 0,05 M binärem Ethylenimin (BEI) bei 4°C 48 Stunden lang inaktiviert. Das inaktivierte Präparat wurde unter Verwendung von 3,16 M Natriumthiosulfat neutralisiert. Es wurden anschließend zwei gleiche aliquote Teile des inaktivierten neutralisierten Neospora-caninum-Antigenpräparats mit verschiedenen Adjuvanzien versetzt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Eine Hälfte des Präparats wurde mit HAVLOGEN® als Adjuvans versetzt, einem auf Carbopol basierenden Polymer-Adjuvans, und zwar durch Hinzufügen des Adjuvans bis zu einer Konzentration von 10 Vol.-%. Die andere Hälfte des Präparats wurde mit EMULSIGEN® als Adjuvans versetzt, einem auf Öl basierenden Adjuvans, und zwar durch Hinzufügen des Adjuvans bis zu einer Konzentration von 15 Vol.-%.

Die auf equinen Dermalzelllinien produzierten, mit Adjuvans versetzten Neospora-caninum-Vakzinen wurden Kälbern im Alter von 9 bis 12 Monaten subkutan injiziert. Ein Kalb (Nr. 954) erhielt eine 5,0-ml-Dosis der mit dem Adjuvans HAVLOGEN® versetzten Vakzine, während ein zweites Kalb (Nr. 955) eine 5,0-ml-Dosis der mit dem Adjuvans EMULSIGEN® versetzten Vakzine erhielt. Jedes Kalb erhielt eine Boosterdosis der homologen Vakzine 10 Tage später. Den Kälbern wurde bei jeder Impfung sowie 10 Tage nach der Booster-Impfung Blut abgenommen. Das Serum wurde unter Verwendung eines indirekt fluoreszierenden Antikörper-(IFA-)Tests auf Titer untersucht. Die serologischen Titer dieser Kälber werden in Tabelle 2 dargestellt. Diese Resultate deuten darauf hin, dass die mit dem Adjuvans EMULSIGEN® versetzte Neospora-Vakzine schützende Titer produzierte, während die mit dem Adjuvans HAVLOGEN® versetzte Neospora-Vakzine einen niedrigeren Titer produzierte, der beinahe schützend war.

Tabelle 2: Antikörper-Titer von Kälbern, die mit inaktivierten, mit Adjuvans versetzten Neospora-caninum-Vakzinen geimpft wurden, die in equinen Dermalzellen gezüchtet wurden

BEISPIEL 3:

Wie aus den Beispielen 1 und 2 hervorging, dass eine in einer kontinuierlichen Zelllinie hergestellte Neospora-caninum-Vakzine schützende Antikörper-Titer bei Rindern produzieren konnte, was mit einem Schutz vor Fehlgeburten korrelierte, war es das Ziel dieses Experimentes, die Wirkung des Züchtens von Neospora caninum in einer vollkommen unterschiedlichen, klonierten Zelllinie, die aus den Nieren der Afrikanischen Grünen Meerkatze (MA-104 Klon B) stammt, zu evaluieren sowie auch die Wirkungen mehrerer verschiedener Typen an Adjuvans auf die Produktion der Antikörper-Titer bei Rindern zu evaluieren.

Eine Neospora-caninum-Vakzine wurde wie folgt hergestellt. Eine Phiole an Arbeitszellen (MA-104-Klon-B-Pferdeserum) wurde aus dem Flüssigstickstoff-Speicher entfernt, schnell aufgetaut, verdünnt und in 850-cm2-Rollflaschen geimpft, die 250 ml DMEM (hoher Glukosegehalt) enthielten, hiernach DMEMH benannt, und zwar bei einer Konzentration von 4 × 107 Zellen pro Rollflasche. Das Medium wurde mit 1 ml/l Neomycinsulfat und mit 5 Vol.-% Pferdeserum ergänzt. Die Zellen wurden bei 36 bis 38°C für eine Zeitspanne von 5 bis 7 Tage inkubiert, bis die Zellen zwischen 95 und 100% konfluent waren. Die Arbeitszellen wurden durch Spülen der Zelllagen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) aus den Rollflaschen entfernt, wobei anschließend 10 ml einer Trypsin-EDTA-Lösung (2,5 g/l Trypsin + 1 g/l EDTA) zu jeder Rollflasche hinzugefügt wurden und die Flaschen zumindest 10 Minuten lang leicht geschüttelt wurden, bis sich die Zellen von der Oberfläche lösten, und danach wurde die Flaschenoberfläche mit DMEMH gespült und der Inhalt aller Flaschen gepoolt. Die Zellen aus diesen Flaschen (Produktionszellen) wurden mit 4,5 × 107 Zellen pro Rollflasche erneut in neue 850-cm2-Rollflaschen geimpft. Die Produktionszellen wurden 24 Stunden lang bei 36 bis 38°C inkubiert, wonach sie mit frisch passagierten Neospora-caninum-Tachyzoiten (1,2 × 107/850-cm2-Rollflasche) infiziert wurden. Zur Zeit der Infektion waren die Produktionszellen zumindest zu 50% konfluent. Die infizierten Rollflaschen wurden 120 bis 168 Stunden lang bei 36 bis 38°C auf rotierenden Rollständern inkubiert, die auf zwischen 0,2 und 0,4 Umdrehungen pro Minute eingestellt waren. Zu dieser Zeit zeigte die Zelllage den typischen CPE, der zumindest 50% der Zelllage betraf. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Neospora-Flüssigkeiten durch das Poolen des Inhalts aus allen Rollflaschen in ein steriles Gefäß geerntet, aus dem eine Probe zur Lebend-Neospora-Titration entnommen wurde. Annehmbare Ernteflüssigkeiten müssen einen Titer von zumindest 3 × 105/ml aufweisen. Der Erntetiter für die vorliegende Charge lag bei 2,3 × 106. In diesem Fall wurden die Ernteflüssigkeiten durch Zentrifugieren konzentriert, um 2,4 × 107 Tachyzoiten/ml zu erhalten. Andere Konzentrationsverfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Ultrafiltration und Säulenchromatographie. Die Ernteflüssigkeiten wurden durch die Zugabe von 0,2 M binärem Ethylenimin (BEI) bis zu einer Endkonzentration von 0,01 M und eine Inkubation bei 2 bis 7°C für eine Zeitspanne von zumindest 96 Stunden inaktiviert. Nach dieser Inkubierung wurde BEI durch die Zugabe von 3,16 M Natriumthiosulfat neutralisiert.

Nach der Inaktivierung und Neutralisierung wurden die Flüssigkeiten in vier aliquote Teile geteilt. Jeder aliquote Teil wurde, wie folgt, mit einem unterschiedlichen Adjuvans versetzt:

Formel A: 1,0 ml inaktivierte Ernteflüssigkeiten plus 3,5 ml PBS plus 0,5 ml eines auf Carbopol basierenden Polymer-Adjuvans, das HAVLOGEN® genannt wird.

Formel B: 1,0 ml inaktivierte Ernteflüssigkeiten plus 3,25 ml PBS plus 0,75 ml eines auf Polymer basierenden Adjuvans, das POLYGEN® genannt wird.

Formel C: 1,0 ml inaktivierte Ernteflüssigkeiten plus 0,5 ml HAVLOGEN® plus 3,5 ml auf Lipid basierenden Adjuvans, das Bay R-1005 genannt wird.

Formel D: 1,0 ml inaktivierte Ernteflüssigkeiten plus 0,5 ml PBS plus 3,5 ml MONTANIDE® 773.

Achtzehn junge Kühe im Alter von 1,5 bis 2,0 Jahren wurden nach dem Zufallsprinzip in sechs Gruppen geteilt. Die jungen Kühe der Gruppe 1 (Nr. U148, S85 und A184) erhielten keine Neospora-caninum-Vakzine. Sie dienten als Kontakt-Kontrollgruppe und erhielten uninfizierte MA104-Klon-B-Zellen. Die jungen Kühe der Gruppe 2 (Nr. A29, 13 und Z55) dienten als positive Kontrolltiere und erhielten lebende Neospora-Tachyzoiten (3 × 107 intravenös und 8 × 107 intramuskulär). Die jungen Kühe der Gruppe 3 (Nr. 40, 1851 und A71) wurden mit drei 5,0-ml-Dosen von Formel A geimpft, die subkutan im Abstand von 4 Wochen verabreicht wurden. Die jungen Kühe der Gruppe 4 (Nr. 237, Y21 und U93) wurden mit drei 5,0-ml-Dosen von Formel B geimpft, die subkutan im Abstand von 4 Wochen verabreicht wurden. Die jungen Kühe der Gruppe 5 (Nr. Y6, X7 und 800) wurden mit drei 5,0-ml-Dosen von Formel C geimpft, die subkutan im Abstand von 4 Wochen verabreicht wurden. Die jungen Kühe der Gruppe 6 (Nr. A144, S74 und 5212) wurden mit drei 5,0-ml-Dosen von Formel D geimpft, die subkutan im Abstand von 4 Wochen verabreicht wurden. Allen Tieren wurde am Tag 0 und danach im Abstand von 2 Wochen Blut abgenommen.

Die Serumproben wurden auf die Umwandlung zu neospora-spezifischen Titern durch die Verwendung eines indirekt fluoreszierenden Antikörper-(IFA-)Tests analysiert. Tabelle 3 zeigt die serologischen Resultate. Alle der Vakzinen-Präparate erzeugten schützende Titerwerte (> 320) bei den jungen Kühen. Die auf Polymer basierenden Adjuvanzien scheinen jedoch eine bessere Titerreaktion zu erzeugen als die auf Öl basierenden Adjuvans-Formulierungen. Da die Kontakt-Kontrollrinder für die Dauer des Experiments serologisch negativ blieben (innerhalb der Testvariation), ist klar, dass die in den geimpften Tieren produzierten Titer nicht durch ein Abgeben von jenen jungen Kühen produziert wurden, denen lebende Neospora-Tachyzoiten injiziert wurden, sondern ein Resultat der Impfung waren.

BEISPIEL 4:

Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Wirkung der Menge des Neospora-caninum-Antigens in den Vakzinen zu bestimmen und um eine Neospora-Vakzine zu evaluieren, die Untereinheit-Antigene umfasst. In dieses Vakzinen-Produktionsverfahren wurde ebenso die Verwendung eines „Soft-Kill"-Verfahrens inkorporiert, das als ein Inaktivierungsverfahren definiert ist, das reduzierte Mengen an inaktivierenden Agenzien enthält sowie niedrigere Inkubationstemperaturen und kürzere Inaktivierungszeiten aufweist. Für dieses Experiment wurde Neospora caninum auf eine ähnliche Art und Weise gezüchtet und verarbeitet, wie sie in Beispiel 3 beschrieben wird. Das Inaktivierungsverfahren wurde wie folgt modifiziert. Es wurde binäres Ethylenimin zu den geernteten Neospora caninum bis zu einer Endkonzentration von 0,01 M hinzugefügt, jedoch bei Raumtemperatur nur 24 Stunden lang inkubiert, wonach es durch die Zugabe von Natriumthiosulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,01 M neutralisiert wurde. Untereinheiten wurden durch das Entfernen der aliquoten Teile der inaktivierten Tachyzoiten-Flüssigkeiten, durch das Zentrifugieren bei 3500 Umdrehungen pro Minute für eine Zeitspanne von 15 Minuten und das Abdekantieren der Überstandsflüssigkeiten erhalten. Die Neospora-Tachyzoiten-Pellets wurden in phosphatgepufferter Dulbecco-Salzlösung (DPBS) resuspendiert, um eine Untereinheit-Vakzine zu produzieren, die nur die Tachyzoiten-Antigene enthält und nicht die Exoantigene, die durch die Tachyzoiten in das Medium ausgeschieden werden. Eine zweite Neospora-Vakzine wurde durch Resuspendieren des Neospora-Tachyzoiten-Pellets in den Überstandsflüssigkeiten hergestellt, die entfernt und aufgehoben worden waren. Es wurden drei Chargen an resuspendierten Untereinheit-DPBS-Neospora-caninum formuliert, um 1,2 × 107, 2,4 × 107 bzw. 3,6 × 107 Tachyzoiten pro Dosis zu enthalten. Es wurden drei Chargen an resuspendierten Überstand-Neospora-caninum formuliert, um äquivalente Anzahlen an Tachyzoiten pro Dosis zu enthalten (1,2 × 107, 2,4 × 107 und 3,6 × 107). Alle Formulierungen wurden mit HAVLOGEN®-Adjuvans versetzt und durch die Zugabe von DPBS (zu der Untereinheit-Vakzine) bzw. Überstandsflüssigkeit auf einen Endwert von 5,0 ml/Dosiskonzentration gebracht.

Diese Formulierungen wurden Neospora-seronegativen jungen Kühen im Alter von 7 bis 9 Monaten verabreicht. Sechs Vakzinen-Gruppen bestanden je aus fünf jungen Kühen (n = 5), und zwei Kontrollgruppen bestanden je aus drei jungen Kühen (n = 3). Den jungen Kühen in den experimentellen Vakzinen-Gruppen wurden je 5,0 ml einer der Neospora-Tachyzoiten-Vakzinen-Präparate subkutan (SC) injiziert, und sie wurden vier Wochen später erneut geimpft. Die Vakzinengruppen erhielten die folgenden Vakzinen:

Gruppe 1: Untereinheit-Neospora-Vakzine, die 1,2 × 107 Neospora-Tachyzoiten mit 10% HAVLOGEN® enthält.

Gruppe 2: Untereinheit-Neospora-Vakzine, die 2,4 × 107 Neospora-Tachyzoiten mit 10% HAVLOGEN® enthält.

Gruppe 3: Untereinheit-Neospora-Vakzine, die 3,6 × 107 Neospora-Tachyzoiten mit 10% HAVLOGEN® enthält.

Gruppe 4: Neospora-Vakzine, die 1,2 × 107 Neospora-Tachyzoiten mit 10 HAVLOGEN® und Überstands-Verdünnungsmittel enthält.

Gruppe 5: Neospora-Vakzine, die 2,4 × 107 Neospora-Tachyzoiten mit 10 HAVLOGEN® und Überstands-Verdünnungsmittel enthält.

Gruppe 6: Neospora-Vakzine, die 3,6 × 107 Neospora-Tachyzoiten mit 10 HAVLOGEN® und Überstands-Verdünnungsmittel enthält.

Gruppe 7: Kontakt-Kontrolltiere – Diese jungen Kühe erhielten keine Vakzine.

Gruppe 8: Positive Kontrolltiere – Diese jungen Kühe erhielten eine Exposition, enthaltend 5 × 106 lebende Neospora-Tachyzoiten, die intravenös in einer 5,0-ml-Dosis verabreicht wurden, und 3 × 106 lebende Neospora-Tachyzoiten, die intramuskulär in einer 5,0-ml-Dosis verabreicht wurden.

Alle jungen Kühe wurden auf demselben Stück Land untergebracht, und es wurde ihnen wöchentlich für einen Zeitraum von 7 Wochen Blut abgenommen, alle Serumproben wurden unter Verwendung von IFA auf Antikörper-Titer getestet, der für Neospora caninum spezifisch ist. Zusätzlich dazu wurden die Vakzinen durch Beobachtung der Impfstellen auf ihre lokale Reaktivität evaluiert. Alle lokalen Reaktionen wurden in Zentimetern gemessen und festgehalten. Die serologischen Titerreaktionen der jungen Kühe werden in Tabelle 4 dargestellt.

Die in Tabelle 4 aufgelisteten Resultate deuten darauf hin, dass die Vakzinen, die die Überstands-Füssigkeiten enthielten, die dem Neospora-Pellet erneut zugeführt wurden, eine geringfügig höhere Antikörper-Reaktion hervorrufen als die Neospora-Untereinheit-Vakzinen. Die Antikörper-Reaktionen, die durch die Neospora-caninum-Vakzinen produziert wurden, die den erneut zugeführten Überstand enthielten, produzierten ebenso Antikörper-Reaktionen, die auf eine bestimmte Art und Weise mit der Dosis in Verbindung zu stehen scheinen. Alle der Vakzinen waren jedoch wirksam in der Produktion schützender Antikörper-Level bei Rindern.

Keine der Vakzinen produzierte signifikante lokale Reaktionen nach der Impfung. Daher konnten alte der Formulierungen als annehmbare kommerzielle Vakzinen-Kandidaten angesehen werden.


Anspruch[de]
Neospora-caninum-Vakzine, die inaktivierte, in Gewebekultur gezüchtete Neospora caninum oder deren schützende Untereinheiten, ein Adjuvans und als Inaktivierungsmittel &bgr;-Propiolacton (BPL) oder binäres Ethylenimin (BEI) umfasst. Neospora-caninum-Vakzine nach Anspruch 1, worin die Inaktivierung durch Einfrieren/Auftauen, gefolgt vom Zusatz des Inaktivierungsmittels, d.h. von binärem Ethylenimin (BEI), herbeigeführt ist. Neospora-caninum-Vakzine nach Anspruch 1 und 2, worin die in Gewebekultur gezüchteten Neospora ein Antigen umfassen, das aus der aus einer inaktivierten Gewebekultur von Neospora tachyzoites, einem inaktivierten Extrakt von Neospora tachyzoites und einer oder mehreren aus inaktivierten Neospora tachyzoites erhaltenen schützenden Untereinheiten bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Neospora-caninum-Vakzine nach Anspruch 1 und 2, worin das Adjuvans aus der aus Polymeren, Öl-in-Wasser, Wasser-in-Öl, Lipiden, Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat, Immunmodulatoren und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Neospora-caninum-Vakzine nach Anspruch 4, worin das Polymer-Adjuvans aus der aus Carbopol, HAVLOGENO® und POLYGEN® bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Neospora-caninum-Vakzine nach Anspruch 4, worin das Öl-in-Wasser-Adjuvans aus der aus EMULSIGENO® und EMULSIGEN PLUS® bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Verfahren zur Herstellung einer Neospora-Vakzine nach Anspruch 1, folgende Schritte umfassend:

a) Züchten von Neospora caninum in einer Kultur von anfälligem Gewebe, bis ein zytopathischer Effekt erzielt wird;

b) Ernten der in der Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum;

c) Inaktivieren der geernteten, in der Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum mit einem Inaktivierungsmittel, das &bgr;-Propiolacton (BPL) oder binäres Ethylenimin (BEI) ist; und

d) Versetzen der inaktivierten, geernteten, in Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum mit Adjuvans zur Herstellung einer Vakzine.
Verfahren zur Herstellung einer Neospora-Untereinheits-Vakzine nach Anspruch 1, folgende Schritte umfassend:

a) Züchten von Neospora caninum in einer Kultur von anfälligem Gewebe, bis ein zytopathischer Effekt erzielt wird;

b) Ernten der in der Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum;

c) Extrahieren eines oder mehrer schützender Antigene aus den geernteten, in der Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum zur Herstellung einer schützenden Untereinheit;

d) Inaktivieren des/der schützenden Untereinheit(en) mit einem Inaktivierungsmittel, das &bgr;-Propiolacton (BPL) oder binäres Ethylenimin (BEI) ist; und

e) Versetzen des/der schützenden Untereinheit(en) mit Adjuvans zur Herstellung einer Vakzine.
Verfahren zur Herstellung einer Neospora-Untereinheits-Vakzine nach Anspruch 1, folgenden Schritte umfassend:

a) Züchten von Neospora caninum in einer Kultur von anfälligem Gewebe, bis ein zytopathischer Effekt erzielt wird;

b) Ernten der in der Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum;

c) Inaktivieren der Neospora-caninum-Ernte mit einem Inaktivierungsmittel, das &bgr;-Propiolacton (BPL) oder binäres Ethylenimin (BEI) ist;

d) Extrahieren eines oder mehrerer schützender Antigene aus den geernteten, inaktivierten, in der Gewebekultur gezüchteten Neospora caninum zur Herstellung einer oder mehrerer schützenden Untereinheit(en); und

e) Versetzen der schützenden Untereinheit(en) mit Adjuvans zur Herstellung einer Vakzine.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com