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Dokumentenidentifikation DE69935338T2 08.11.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001104777
Titel Verwendung von mit Pepsin behandelter Gelatine als Stabilisator für einspritzbare Stoffe enthaltend Proteinenspuren
Anmelder Nippi Inc., Tokyo, JP
Erfinder Ebihara, Tetsuya, Adachi-ku, Tokyo, JP;
Hattori, Shunji, Adachi-ku, Tokyo, JP;
Matsubara, Youco, Adachi-ku, Tokyo, JP;
Irie, Shinkichi, Adachi-ku, Tokyo, JP
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69935338
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 01.12.1999
EP-Aktenzeichen 993096452
EP-Offenlegungsdatum 06.06.2001
EP date of grant 28.02.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.11.2007
IPC-Hauptklasse C08H 1/06(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 47/42(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung betrifft hydrolysierte Gelatine, spezieller mit Pepsin zersetzte Gelatine, die als Stabilisator für injizierbare Trace-Protein-Stoffe wie Impfstoffe verwendet werden kann.

Wirksame Trace-Protein-Stoffe wie injizierbare Impfstoffherstellungen und Erythropoietin enthalten Gelatine in Form eines Extraktes aus Rinder- oder Schweinegeweben als Stabilisator. Gelatine wirkt nicht nur als Stabilisator wirksamer Trace-Protein-Stoffe, sondern auch zum Verhindern der Koagulation von Proteinen in den Herstellungen und der Adsorption der wirksamen Trace-Protein-Stoffe an Glasoberflächen und anderen Wandoberflächen von Behältern.

Gelatine ist der Heißwasserextrakt von Kollagen, welches im lebenden Organismus reichlich in Bindegeweben vorkommt und weist im Allgemeinen ein geringeres Molekulargewicht als Kollagen auf. Kollagen weist im Allgemeinen einen hohen Homologiegrad der Aminosäuresequenz zwischen Tierarten auf, mindestens 90 % bei Rind, Schwein und Mensch. Daher weist aus Kollagen gewonnene Gelatine nur geringe allergene Wirkung auf und wird seit langem als ein Stabilisator von Injektionen verwendet.

Kürzlich wurden Fälle berichtet, wenn auch sehr wenige, bei denen allergische Reaktionen bei Kleinkindern nach Inokulation von Impfstoffen beobachtet wurden, und es wurde gezeigt, dass es sich bei dem Allergen um die in den Impfstoffherstellungen enthaltene Gelatine handelt. Da ein anti-Gelatine-Immunglobulin E-Antikörper (IgE) in den Seren allergischer Patienten nachgewiesen wurde, wurde gezeigt, dass die Allergie gegen Gelatine eine allergische Reaktion vom Typ I darstellt. Menschliches Serumalbumin ist bekannt als Protein mit dem gleichen Effekt wie Gelatine, aber bedenkt man das potentielle Risiko einer Kontamination mit AIDS oder Hepatitis-Viren, so wird angenommen, dass die bestehende Praxis der Verwendung von Gelatine sicherer ist. Gelatine wird auch aus ökonomischen Gesichtspunkten bevorzugt, da es für ziemlich niedrige Kosten verfügbar ist.

In der Ungeprüften Veröffentlichten Japanischen Patentanmeldung (kokai) Nr. 82299/1995 wurde über eine weniger allergene Gelatine berichtet. Das heißt, wenn ein Ausgangsmaterial, welches eine Kollagenkomponente oder eine Gelatinekomponente enthält, die deren modifiziertes Produkt ist, spezifisch mit einer bakteriellen Kollagenase zersetzt wurde, dann wurde eine Peptidzusammensetzung mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als 1.000 erhalten, welche keine Antigenität aufwies und mindestens 70 % Peptide mit der Aminosäuresequenz (Gly-X-Y)n (n = 1–3) enthielt. Die Gelatine, welche also durch das Kollagenase-abhängige Verfahren hergestellt wird, könnte in Lebensmitteln wirksam sein, aber ist mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als 1.000 sicherlich nicht als Impfstoffstabilisator geeignet.

In der Ungeprüften Veröffentlichten Japanischen Patentanmeldung (kokai) Nr. 229932/1997 wird berichtet, dass ein Mensch, der allergisch gegen Gelatine war, empfindlich auf die &agr;2-Kette in Rindergelatine reagierte und dass Gelatinen aus anderen Tieren in Impfstoffen verwendet werden könnten. Das Patent lehrt allerdings nichts über das Herstellen weniger allergener Gelatine aus Rindergelatinen im allgemeinen.

Bei einer allgemeinen Tagung der Japanese Society for Immunology haben die hier genannten Erfinder eine detaillierte Arbeit vorgestellt, um zu zeigen, dass Patienten mit einer ausgeprägten allergischen Reaktion gegen Gelatine empfindlich auf die &agr;2-Kette in Kollagen oder Gelatine waren (27. Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology, 29.–31.Oktober, 1997).

Daher besteht immer noch die große Notwendigkeit einer Gelatine, die als ein Stabilisator für Impfstoffe verwendet werden kann und die Patienten mit ausgeprägten allergischen Reaktionen gegen Gealtine sicher verabreicht werden kann.

Die vorliegende Erfindung wurde unter diesen Umständen vollendet und hat die Aufgabe, eine weniger allergene, hydrolysierte Gelatine bereitzustellen, die als ein Stabilisator für injizierbare Trace-Protein-Stoffe wie Impfstoffe verwendet werden kann.

Um die genannte Aufgabe zu erreichen, haben die hier genannten Erfinder intensive Studien durchgeführt und herausgefunden, dass ein Gelatine-Hydrolysat oder mit Pepsin zersetzte Gelatine einen geringeren Grad an Allergenität aufwies. Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf diesem Befund vollendet.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von mit Pepsin behandelter, gering allergener Gelatine als Stabilisator für injizierbare Trace-Protein-Stoffe, wobei die Gelatine ein durchschnittliches Molekulargewicht von 3.500–20.000, gemessen durch Hochleistungsgelpermeationschromatographie, und ein Trennmuster mit charakteristischen Banden bei 15 kd, 17 kd, 36 kd und 60 kd in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese hat.

Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Injektion, umfassend einen injizierbaren Trace-Protein-Stoff, einen Stabilisator, der mit Pepsin behandelte, gering allergene Gelatine umfasst, die ein durchschnittliches Molekulargewicht von 3.500–20.000, gemessen durch Hochleistungsgelpermeationschromatographie, und ein Trennmuster mit charakteristischen Banden bei 15 kd, 17 kd, 36 kd und 60 kd in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese hat, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger bereit.

Typischerweise umfasst der injizierbare Trace-Protein-Stoff einen Impfstoff und der Träger umfasst Wasser.

1 zeigt anhand von Banden die Position hydrophober Aminosäuren (z.B. Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Phenylalanin und Tryptophan) in den Sequenzen der &agr;1- und &agr;2-Ketten in Rinderkollagen;

2 zeigt das Trennmuster von nichtzersetzter Gelatine (hitzedenaturierte SCE) in der Hochleistungsflüssigchromatographie;

3 zeigt das Trennmuster von mit Pepsin zersetzter Gelatine in der Hochleistungsflüssigchromatographie;

4 ist ein Foto, welches das Ergebnis einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Gelatine nach Zersetzung mit verschiedenen Enzymen zeigt, wobei die Reaktivität mit IgE qualitativ unter den entsprechenden Banden gezeigt ist, und

5a und 5b sind Fotos, welche die Ergebnisse einer 10 % SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und einer 15 % SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese zeigen, die mit der nicht antigenen Kollagen &agr;1-Kette bzw. mit der antigenen Kollagen &agr;2-Kette, welche durch eine CM-Cellulose Säule getrennt und später mit Pepsin zersetzt wurden, durchgeführt wurden.

Die Erfindung wird nachstehend detaillierter beschrieben.

Für die vernünftige Entwicklung weniger allergener Gelatine, die einen breiten Bereich von Anwendungen findet, würde es nötig sein, die Seren von möglichst vielen Patienten, die allergisch gegen Gelatine sind, zu verwenden und das Epitop für Serum-IgE in der Gelatine zu identifizieren. Die hier genannten Erfinder haben deshalb versucht, das Epitop für IgE in Patienten mit einer Gelatineallergie zu identifizieren und den IgE-reaktiven Bereich in Gelatine mit einem spezifischen Enzym zu zerstören, wodurch ein Gelatine-Hydrolysat bereitgestellt wurde, welches niedrige Allergenität aufwies und das hochtauglich war, injizierbare Trace-Proteine wie Impfstoffe zu stabilisieren.

Zu Anfang sammelten die hier genannten Erfinder die Seren von Patienten, welche eine allergische Reaktion gegen Gelatine zeigten und verwendeten ein Fluoreszenz-ELISA-Verfahren, um die Sensitivität von IgE gegenüber Gelatine und deren Hydrolysat, welche durch verschiedene bekannte Verfahren hergestellt wurden, zu beurteilen. Die Allergenität von Gelatine kann beurteilt werden durch die Kenntnis, wie das Serum-IgE der Patienten auf Gelatine reagieren würde. Kollagen ist an sich aus zwei verschiedenen Polypeptiden zusammengesetzt, &agr;1- und &agr;2-Ketten, die ein Molekulargewicht von 100.000 aufweisen: also ist Gelatine ein Gemisch dieser beiden aus Kollagen gewonnenen Polypeptide. Wie nachstehend in Tabelle 1 gezeigt, reagierten die Seren von drei Patienten mit der aus Kollagen gereinigten &agr;2-Kette, aber nicht mit der gereinigten &agr;1-Kette (Details dieses unterschiedlichen Verhaltens wurden in den Abstracts zu den Arbeiten, welche beim 27. Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology vorgetragen wurden, berichtet, siehe oben).

Tabelle 1

Von den beiden Polypeptiden in Rinderkollagen, welches als Gelatinequelle verwendet wurde, weist die &agr;2-Kette Antigenität auf und deren vollständige Aminosäuresequenz wurde kürzlich von den hier genannten Erfindern basierend auf ihrer cDNA-Sequenz identifiziert (siehe Sirai, T. et al. „The complete cDNA coding sequence for the bovine pro&agr;2(I) chain of type I Procollagen", Matrix Biol. 1998; DNA-Datenbank EMBL/GenBank AB008683).

Gelatine ist ein Protein mit einem sehr geringen Gehalt an hydrophoben Aminosäuren. Allerdings zeigte ein Vergleich der kürzlich identifizierten Aminosäuresequenz der &agr;2-Kette mit der bereits bekannten Sequenz der &agr;1-Kette, dass die erstgenannte etwa zweimal soviele hydrophobe Aminosäurereste enthielt (62 der 1014 Reste waren von der &agr;1-Kette besetzt und 104 von der &agr;2-Kette). Es wurde auch aufgedeckt, dass die &agr;2-Kette charakteristische Cluster hydrophober Aminosäuren nahe den N- und C-Termini aufwies (siehe 1). Ein Peptidfragment der &agr;2-Kette wurde getrennt, gereinigt und auf Reaktivität mit Patienten-IgE getestet; Antigenität wurde in den Peptiden nahe Rest Nr. 750 in der C-terminalen Aminosäuresequenz der &agr;2-Kette gefunden, offensichtlich in Übereinstimmung mit der Position des Clusters hydrophober Aminosäuren nahe dem C-Terminus.

Von diesen Beobachtungen schlossen die Erfinder, dass ein weniger allergenes Gelatine-Hydrolysat durch Unterbrechen des antigenen Bereiches auf der &agr;2-Kette erhalten werden würde; deshalb haben die Erfinder eine Auswahl Gelatinezersetzender Enzyme getestet.

Überraschenderweise wurde unter verschiedenen zersetzenden Enzymen nur die Gelatine, die mit Pepsin zersetzt wurde, als optimal für die Verwendung als Stabilisator injizierbarer Trace-Proteine wie Impfstoffe befunden. Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf dieser Feststellung vollendet. Speziell anzuführen ist, dass die Gelatineproben, welche mit Pepsin, Kollagenase (sowohl aus C. histricum als auch aus dem Pankreas der Krabbe), Chymotrypsin, Elastase, Bromelain, Ficin und alkalische Protease behandelt waren, verringerte Reaktivität mit IgE allergischer Patienten zeigten. Allerdings wiesen die Gelatineproben, welche mit Nicht-Pepsin-Enzymen behandelt waren, namentlich Kollagenase (sowohl aus C. histricum als auch aus dem Pankreas der Krabbe), Chymotrypsin, Elastase, Bromelain, Ficin und alkalische Protease, geringere Molekulargewichte auf als 3.500, welches notwendig war, um Trace-Proteine zu stabilisieren, und waren daher ungeeignet zum Stabilisieren von Trace-Proteinen. Dagegen wiesen die Gelatineproben, welche mit Pepsin behandelt waren, ein durchschnittliches Molekulargewicht von 7.600, deutlich über 3.500, was der benötigte Wert zum Stabilisieren von Trace-Proteinen war, auf. Andere Enzyme konnten keine zufriedenstellende Verringerung der Reaktivität mit IgE erreichen, unabhängig vom Molekulargewicht der behandelten Gelatine. Wenn Peptide mit niedrigem Molekulargewicht durch Fraktionierung mittels Gelpermeationschromatographie oder Mikrofiltration entfernt werden, kann man erfindungsgemäße, weniger allergene Peptide mit höheren durchschnittlichen Molekulargewichten, etwa 20.000, erhalten.

Die Gelatine, welche als Ausgangsmaterial zum Herstellen des erfindungsgemäßen Gelatine-Hydrolysats verwendet werden kann, ist in keiner Weise beschränkt und entweder die mit dem Säureverfahren gewonnene Gelatine oder die mit dem alkalischen Verfahren gewonnene Gelatine kann verwendet werden. Auch die Gelatine, welche aus der thermischen Denaturierung von solubilisiertem Kollagen resultiert, ist verwendbar. Das solubilisierte Kollagen kann das auf dem Fachgebiet bekannte, mit Essigsäure solubilisierte Kollagen (S.C.A) sein oder Kollagen, welches mit einer von einem Organismus hergestellten Protease („PROCTASE", Meiji Seika Kaisha, Ltd.) oder einer aus einem Tier gewonnenen Protease wie Pepsin solubilisiert wurde.

Jedes käufliche Pepsin kann verwendet werden, um Gelatine zu zersetzen und ein Beispiel ist eine aus der Schleimhaut von Schweinemagen, die bei Sigma erhältlich ist.

Zum Zersetzen von Gelatine mit Pepsin werden die folgenden Bedingungen bevorzugt. Die Konzentration von Pepsin relativ zu Gelatine ist nicht kritisch und der geschulte Fachmann kann leicht einen geeigneten Wert aus dem üblichen Bereich von Proteasekonzentrationen, die ausreichen Proteine abzubauen, auswählen. Zum Beispiel reicht des Gewichtsverhältnis von Substrat zu Enzym von 10.000:1 bis 10:1, vorzugsweise von 200:1 bis 50:1, stärker bevorzugt 100:1.

Gelatine wird vorzugsweise in 5–500 mMol Essigsäure oder Salzsäure gelöst, wobei die Gelatinekonzentration vorzugsweise von 0,01 bis zu einigen zehn Prozent reicht. Die Zersetzungstemperatur reicht vorzugsweise von 37°C bis 60°C und die Zersetzungszeit reicht vorzugsweise von einigen Stunden bis zu einigen Tagen, bis die &agr;-Kette mit einem Molekulargewicht von 100.000 nicht mehr in der Elektrophorese nachgewiesen wird. Jede Fraktion der &agr;-Kette mit einem Molekulargewicht von 100.000, die unzersetzt bleibt, kann durch Gelpermeationschromatographie und Ultrafiltration abgesondert werden.

Das Pepsin, welches zum Zersetzen von Gelatine verwendet wird, kann durch Behandlung mit einem Ionenaustauschharz oder einem Harz mit einem immobilisierten anti-Pepsin Antikörper entfernt werden. Wenn gewünscht, kann mit Harz immobilisiertes Pepsin verwendet werden, um Gelatine zu zersetzen, um so eine Pepsinkontamination zu vermeiden.

Das so erhaltene Gelatine-Hydrolysat hat ein durchschnittliches Molekulargewicht von 3.500–20.000, vorzugsweise 4.000–10.000, stärker bevorzugt etwa 7.600, wie gemessen durch Hochleistungsgelpermeationschromatographie. Es zeigt außerdem ein Trennmuster mit charakteristischen Banden bei 15 kd, 17 kd, 36 kd und 60 kd in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und es wird keine Komponente nachgewiesen, die von der Kollagen &agr;2-Kette stammt.

Der erfahrene Fachmann kann leicht bestimmen, wie viel Gelatine-Hydrolysat als Stabilisator injizierbarer Trace-Protein-Stoffe verwendet werden sollte.

Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen, sollen aber nicht als einschränkend betrachtet werden.

Beispiel

Typ I-Rinderkollagen (Handelsname: SCE), welches durch Behandlung mit Protease, die von Aspergillus hergestellt wird (erhältlich von Meiji Seika Kaisha, Ltd. unter dem Handelsnamen „PROCTASE"), solubilisiert wurde, wurde durch Behandlung bei 100°C für 2 Minuten thermisch denaturiert, um Gelatine herzustellen, welche mit verschiedenen Enzymen, z.B. Pepsin, bakterieller Kollagenase (C. histricum), Kollagenase (aus dem Pankreas der Krabbe), Chymotrypsin, Elastase, Bromelain, Ficin, alkalischer Protease, Actinase, V8-Protease, bakterieller Kollagenase (Vibrio sp.), Trypsin und Papain, zersetzt wurde. Das Pepsin wurde von Sigma als ein aus der Schleimhaut von Schweinemagen gewonnenes Produkt bezogen und die anderen Enzyme wurden entweder von Sigma oder Wako Pure Chemical Industries, Ltd. bezogen. Die Zersetzungsbedingungen waren wie folgt: durch Vorbehandlung bei 100°C für 2 Minuten wurde SCE thermisch denaturiert, um Gelatine zu ergeben; zu 0,1 % Gelatine (in 0,5 M Essigsäurelösung) wurde Pepsin in einer Endkonzentration von 0,001 % zugegeben; die Lösung wurde dann für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Für die anderen Enzyme wurden auf dem Fachgebiet als optimal bekannte Lösungsmittel verwendet, die anderen Verdauungsbedingungen waren die gleichen, wie vorstehend festgelegt.

Prüfung von IgE-Antikörper gegen Gelatine: mit Enzym behandelte Gelatineproben wurden auf einer ELISA-Platte adsorbiert und der IgE Antikörpertiter in den Seren von Patienten, die mit jeder Gelatineprobe reagierten, wurde gemessen. Als Kontrolle wurde der IgE Antikörper gegen die unbehandelte Gelatine geprüft.

Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichtes: Die durchschnittlichen Molekulargewichte der mit Enzym behandelten Gelatineproben wurden durch Hochleistungsflüssigchromatographie bestimmt. Die Trennsäule bestand aus Shodex OHpak SB803, seriell verbunden mit Shodex OHpak SB802,5 (beide hergestellt von Showa Denko K.K.). Das Lösungsmittel war eine Calciumphosphat-Pufferlösung (pH 6,9), die Durchflussrate war 1 ml/min, die Säulentemperatur betrug 40°C. Der Molekulargewichtsmarker für Polyethylenoxid wurde als Standard verwendet. Wie im Falle der Prüfung von IgE-Antikörper gegen Gelatine wurde auch das Molekulargewicht der unbehandelten Gelatine bestimmt.

Tabelle 2 zeigt die Reaktivitäten der mit Enzym behandelten Gelatineproben mit IgE in den Seren von Patienten, die allergisch gegen Gelatine waren.

Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, zeigten die Gelatineproben, welche mit Pepsin, Kollagenase (C. histricum und eine aus dem Pankreas der Krabbe gewonnene), Chymotrypsin, Elastase, Bromelain, Ficin und alkalischer Protease behandelt waren, geringere Reaktivität mit dem IgE in den allergischen Patienten. Allerdings waren diese Gelatineproben, außer denen, welche mit Pepsin und Elastase behandelt wurden, nicht geeignet für die Verwendung zum Stabilisieren von Trace-Proteinen, da ihre Molekulargewichte niedriger waren als der benötigte Wert von 3.500. Die mit Pepsin behandelte Gelatine hatte ein durchschnittliches Molekulargewicht von 7.600, deutlich über 3.500. Die anderen getesteten Enzyme waren nicht in der Lage, die Reaktivität von Gelatine mit IgE angemessen zu verringern, unabhängig davon, ob das Molekulargewicht der zersetzten Gelatine größer war als 3.500 oder nicht.

Die unbehandelte Gelatine (d.h. thermisch denaturiertes SCE) und die mit Pepsin zersetzten Gelatineproben wurden einer Hochleistungsflüssigchromatographie unterworfen und die erhaltenen Trennmuster sind in 2 und 3 gezeigt. Der Bandenpeak, welcher bei der unbehandelten Gelatine bei einer Retentionszeit (RT) von 20,63 Minuten auftrat, wurde den Gelatineketten mit einem Molekulargewicht von mehr als 200.000 zugeordnet und der Peak bei einer RT von 21,95 Minuten wurde der Gelatinekette mit einem Molekulargewicht von 100.000 zugeordnet (2). Die mit Pepsin behandelte Gelatine zeigte Peaks über einen breiten Molekulargewichtsbereich von weniger als einigen zehntausend. Ein Maximalpeak erschien bei einer RT von 28,6 Minuten und das berechnete durchschnittliche Molekulargewicht betrug 7.600 (3).

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese:

Die mit Enzym behandelten Gelatineproben wurden in einem 10%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und die resultierenden Proteinbanden wurden mit Coomassie-Brilliantblau sichtbar gemacht (siehe 4, worin die Reaktivität mit IgE qualitativ unter jeder Bande angezeigt ist). Wie aus 4 ersichtlich ist, wiesen die Gelatineproben, welche mit Kollagenase (C. histricum und eine aus dem Pankreas der Krabbe gewonnene), Bromelain, Ficin, alkalischer Protease und anderen Enzymen (außer Pepsin) behandelt waren und verringerte Reaktivität mit IgE aufwiesen, derart geringe Molekulargewichte auf, dass sie aus dem Polyacrylamidgel liefen und in der Elektrophorese kaum Banden nachgewiesen werden konnten. Die mit Trypsin und Papain behandelten Gelatineproben waren in solchem Maße aufgebrochen, dass keine Banden nachgewiesen werden konnten und dennoch hielten sie die Reaktivität mit IgE aufrecht. Die mit V8-Protease und Kollagenase (Vibrio sp.) zersetzten Gelatineproben wiesen ausreichend große Molekulargewichte auf, um in der Elektrophorese klar sichtbare Banden zu zeigen, aber ihre Reaktivität mit IgE viel nicht ab. Die mit Pepsin behandelte Gelatine zeigte ein Trennmuster, umfassend Hauptbanden bei 15 kd, 17 kd, 36 kd und 60 kd plus geringere Anteile von Peptidbanden mit Molekulargewichten größer als 10.000.

Andere Gelatineproben wurden mit einer aus Kaulquappen gewonnenen Matrix-Metalloprotease behandelt, welche Kollagen ohne Verlust der Antigenität nur an einer Stelle durchtrennen konnte, und wurden später in einer CM-Cellulose-Säule (Pharmacia) in zwei Gruppen von Peptiden getrennt. Die erste Gruppe bestand aus den aus der &agr;1-Kette gewonnenen Peptiden (&agr;1TCa und &agr;1TCb) und die zweite Gruppe bestand aus den aus der &agr;2-Kette gewonnenen Peptiden (&agr;2TCa und &agr;2TCb). Diese Peptide wurden bei 37°C für 24 Stunden mit Pepsin (Sigma) in einem Substrat:Enzym-Gewichtsverhältnis von 10:1 in 0,1 M Essigsäure behandelt. Danach wurden die entsprechenden Proben durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert, wobei die Gelkonzentration zwischen 10% und 15% variierte (siehe 5). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt; Spur 1 ist ein Molekulargewichtsmarker, der von oben nach unten Banden für 103 kd, 77 kd, 48 kd, 34 kd, 28 kd und 20 kd zeigt, Spur 2 ist eine Fraktion der Kollagen &agr;1-Kette, die in 75 kd und 25 kd getrennt wurde; Spur 3 ist eine Fraktion der Kollagen &agr;2-Kette, die in 75 kd und 25 kd getrennt wurde; Spur 4 ist die mit Pepsin behandelte &agr;1-Kette von Kollagen und Spur 5 ist die mit Pepsin behandelte &agr;2-Kette von Kollagen. 5 zeigt deutlich, dass das Trennmuster der mit Pepsin behandelten Gelatine mit Hauptbanden bei 15 kd, 17 kd, 36 kd und 60 kd aufweist und einem geringeren Anteil von Peptidbanden mit Molekulargewichten über 10.000 (siehe 4) von der &agr;1-Kette stammt (Spur 4 in 5). Andererseits wurde die antigene &agr;2-Kette mit Pepsin vollständig zersetzt und es wurden keine sichtbaren Banden nachgewiesen (Spur 5 in 5).

Die mit Pepsin zersetzte, erfindungsgemäße Gelatine weist ein ausreichendes Molekulargewicht auf, um Trace-Protein-Stoffe zu stabilisieren, und ist dennoch ein schwaches Allergen. Daher ist sie als ein Stabilisator für Medikamente, Lebensmittel, Kosmetika und vor allem für injizierbare Trace-Protein-Stoffe wie Impfstoffe verwendbar.


Anspruch[de]
Verwendung von mit Pepsin behandelter, gering allergener Gelatine als Stabilisator für injizierbare Trace-Protein-Stoffe, wobei die Gelatine ein durchschnittliches Molekulargewicht von 3.500–20.000, gemessen durch Hochleistungsgelpermeationschromatographie, und ein Trennmuster mit charakteristischen Banden bei 15 kd, 17 kd, 36 kd und 60 kd in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese hat. Injektion, umfassend einen injizierbaren Trace-Protein-Stoff, einen Stabilisator, der mit Pepsin behandelte, gering allergene Gelatine umfasst, die ein durchschnittliches Molekulargewicht von 3.500–20.000, gemessen durch Hochleistungsgelpermeationschromatographie, und ein Trennmuster mit charakteristischen Banden bei 15 kd, 17 kd, 36 kd und 60 kd in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese hat, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Injektion nach Anspruch 2, wobei der injizierbare Trace-Protein-Stoff einen Impfstoff umfasst und der Träger Wasser umfasst.






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