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Dokumentenidentifikation DE60216762T2 15.11.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001404853
Titel VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON ALLICIN
Anmelder Neem Biotech Ltd., Rhiwbina, Cardiff, GB
Erfinder WILLIAMS, David Michael, Rhiwbina, Cardiff CF14 6HR, GB;
PANT, Mohen, Chandra, Heath, Cardiff CF14 4EF, GB
Vertreter Haseltine Lake Partners GbR, 80333 München
DE-Aktenzeichen 60216762
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 04.07.2002
EP-Aktenzeichen 027409374
WO-Anmeldetag 04.07.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/GB02/03083
WO-Veröffentlichungsnummer 2003004668
WO-Veröffentlichungsdatum 16.01.2003
EP-Offenlegungsdatum 07.04.2004
EP date of grant 13.12.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 15.11.2007
IPC-Hauptklasse C12P 11/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A23L 1/20(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 31/255(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61P 9/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61P 31/04(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61P 31/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Allicin aus Alliin, und ein Verfahren zur Herstellung von reinem Allicin.

Knoblauch und Zwiebeln sind Mitglieder der Familie der Liliengewächse. Knoblauch und Zwiebeln haben viele medizinische Eigenschaften, und sie werden seit Tausenden Jahren in der Volksmedizin eingesetzt.

Auf Knoblauch, Allium sativum, wird ein großes Spektrum an medizinischen Eigenschaften zurückgeführt (Block E 1985) Sci. Am. 252 (3): 114–119). In der Neuzeit lebt das Interesse an den therapeutischen Eigenschaften von Knoblauch wieder auf, und er ist der Gegenstand einer wachsenden Zahl von biochemischen und klinischen Untersuchungen. Ein ausgiebiger Überblick über die vorteilhaften Eigenschaften von Knoblauchextrakten findet sich in WO99/21008.

Knoblauch-Präparate sind kommerziell erhältlich in der Form von Knoblauchöl, -extrakten, -pillen oder -tabletten. Die Herstellungsverfahren solcher Knoblauchpräparate sind gewöhnlich unbekannt, und die Zusammensetzung und Menge ihrer Wirkstoffe sind nicht definiert.

Die im Knoblauch vorhanden aktiven Prinzipien haben sich als schwefelhaltige Verbindungen erwiesen. Die prinzipielle Komponente eines aus Dampfdestillaten von Knoblauchextrakten erhaltenen farblosen Öls ist Allicin, eine ungewöhnliche Schwefel-Verbindung der Formel C6H10S2O (Thio-2-propen-1-sulfinsäure-S-allylester) (Cavallito et al., (1944) J. Am. Chem. Soc. 66, 1944–1954). Allicin ist eine chemisch instabile, farblose bis strohfarbene Flüssigkeit. Diese Flüssigkeit ist wahrscheinlich für den Geruch und einen Großteil der biologischen Aktivität von Knoblauch verantwortlich.

Allicin ist zwar für den Knoblauchgeruch verantwortlich, eine Knoblauchknolle riecht jedoch nur wenig oder überhaupt nicht, bis sie aufgeschnitten oder zerdrückt wird. Die intakte Knoblauchzehe enthält kein Allicin, aber stattdessen seine geruchlose Vorstufe Alliin (+)(S-Allyl-L-cysteinsulfoxid). Diese wird durch eine in der Knoblauchpflanze befindliche und als Alliinlyase oder Alliinase bezeichnete C-S-Lyase in Allicin, Pyruvat und Ammoniak umgewandelt (Stoll und Seebeck, 1949 Helv. Chim. Acta 32: 197–205). Alliin und Alliinase finden sich in verschiedenen Kompartimenten der Knoblauchzehe, und beim Schneiden oder Zerdrücken der Zehe wird das Enzym freigesetzt, so dass es mit der Allicin-Vorstufe in Kontakt kommt.

Allicin ist instabil und zersetzt sich zu einer Anzahl verschiedener Verbindungen, von denen einige wahrscheinlich pharmazeutisch verwendet werden. Eine Liste verschiedener Verbindungen ist in Dr. Duke's Phytochemical and Ethnobotanical Database for Allium sativum angegeben. Die interessierenden Haupt-Verbindungen sind neben Alliin und Allicin die (E/Z) Ajoene und verschiedene Dithiine.

Trotz der eindrucksvollen Wirkung von Knoblauch wurden die Untersuchungen durch verschiedene Faktoren, wie das Fehlen kontrollierter Verfahren und geeigneter Doppelblindstudien limitiert, und die Verwendung von Präparaten mit unbekannten Mengen und chemischer Identifikation des Wirkstoffs eingeschränkt. Allicin zeigt die vorteilhaften Eigenschaften, die dem Knoblauch zugeschrieben werden, und somit wäre es geeignet, Allicin in kontrollierten und bekannten Mengen zur Verwendung als Wirkstoff pharmazeutischer Zusammensetzungen zu produzieren. Allicin ist jedoch bei Einwirkung von Luft eine sehr labile und flüchtige Verbindung, und Verfahren, die man heute für seine Herstellung kennt, sind nicht zufrieden stellend. Die chemische Synthese umfasst viele Schritte und ist kompliziert, arbeitsintensiv, teuer und sehr ineffizient.

Die Verwendung eines enzymatischen Verfahrens scheint zur Herstellung von Allicin Beschreibungen zufolge "interessant" zu sein, siehe WO97/39115. Aufgrund der so genannten "Selbstmord"-Natur des Enzyms, d.h., dass es durch sein eigenes Reaktionsprodukt Allicin rasch und irreversibel inaktiviert wird, schlugen die Erfinder von WO97/39115 jedoch die Verwendung einer immobilisierten Form der Alliinase vor, die nicht durch Allicin inaktiviert wird.

Die vorliegende Erfindung bietet ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Allicin, das einfach und billig ist. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man ökonomisch reines Allicin mit pharmazeutischer Qualität synthetisieren. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Serienproduktion der Ajoene und Dithiine bereit, weil man Allicin in großem Volumen produzieren kann. Vorherige Verfahren beruhten auf der Produktion von synthetischem Allicin.

Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Allicin bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte.

  • (a) das mechanische Behandeln einer natürlichen Alliinasequelle, die aus einer Pflanze der Gattung Allium erhalten wurde, damit man daraus Alliinase freisetzt;
  • (b) das Zusammenbringen der mechanisch behandelten Alliinasequelle mit einer wässrigen Alliinlösung, die Alliin in einer größeren Konzentration enthält als in Rohknoblauch, wodurch das Alliin durch die aus der Alliinasequelle freigesetzte Alliinase enzymatisch in Allicin umgewandelt wird.

Das Verfahren des ersten Aspektes kann zudem umfassen:

  • (c) das Extrahieren des resultierenden Allicins in einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel mit einem niedrigen Siedepunkt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pentan, Hexan und Ether.

Alliin existiert in rohem Knoblauch in einer Konzentration von etwa 0,4 bis 0,9% und variiert signifikant je nach den Wachstumsbedingungen der Knoblauchknollen, die von Jahr zu Jahr variieren können.

Alliin wird vorzugsweise in dem erfindungsgemäßen Verfahren bei einer Mindestkonzentration von 1 %, stärker bevorzugt 5%, noch stärker bevorzugt 10% und am stärksten bevorzugt bei einer Mindestkonzentration von 15% verwendet.

Alliin ist in Wasser frei löslich und kann daher in dem erfindungsgemäßen Verfahren in hohen Konzentrationen verwendet werden. Vorzugsweise wird Alliin in einer Höchstkonzentration von 50%, stärker bevorzugt 40%, noch stärker bevorzugt 30% und am stärksten bevorzugt bei einer Höchstkonzentration von 25% verwendet.

Vorzugsweise wird Alliin bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bei einer Konzentration zwischen 10% und 30%, stärker bevorzugt bei einer Konzentration zwischen 15 und 25% verwendet. Noch stärker bevorzugt wird Alliin in dem erfindungsgemäßen Verfahren bei einer Konzentration von etwa 20% verwendet. Die Verwendung von Alliin bei einer Konzentration von etwa 20% in dem erfindungsgemäßen Verfahren führt zur Herstellung einer Allicinlösung mit einer Konzentration von etwa 1 %.

Sowohl die L-Form als auch die R-Form von Alliin werden durch Alliinase in Allicin umgewandelt. Die L-Form wird bei einer etwas schnelleren Geschwindigkeit als die R-Form umgewandelt.

Die beiden Formen von Alliin erfordern eine aufzulösende Derivatisierung. Die Anwesenheit von Allicin in dem Reaktionsgemisch stört jedoch die Reaktion, die ein Derivatisierungsmittel verwendet. Die Beobachtung, dass der HPLC-Peak von Alliin bei fortschreitender Umwandlung von Alliin in Allicin vollständig verschwindet, führt zur Schlussfolgerung, dass beide Isomere von Alliin während der Reaktion in Allicin umgewandelt werden. Unter einigen Bedingungen erscheint der Alliin-Peak zudem als zwei teilweise aufgelöste Peaks, deren Summe gleich den Spuren ist, die nur einen Peak zeigen. Die 4 zeigt eine Reihe von Spuren, die das Wachstum des Alliicin-Peaks und das gleichzeitige Verschwinden des Alliin-Peaks veranschaulichen.

Schritt c) Die Extraktion mit einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel mit niedrigem Siedepunkt ist bei der Herstellung von reinem Allicin notwendig. In Fällen, bei denen einige andere natürlich vorkommende Verbindungen als Allicin toleriert werden können, wird die Lösung jedoch auf etwa 1 % Allicin zur Aufbewahrung unter –20°C verdünnt, wo sie für mehrere Monate stabil bleibt. Im Extraktionsschritt verhindert die Zugabe eines nicht-polaren organischen Lösungsmittels mit niedrigem Siedepunkt das Vorhandensein von Allicin, was zur Denaturierung des Allinase-Enzyms führt.

Der Extraktionsschritt hat den Vorteil, dass das Allicin aus dem zerdrückten Pflanzenmaterial gereinigt wird, wodurch die potentielle Anwesenheit von Bakterien in der Allicin-Lösung vermieden wird. Der Extraktionsschritt bewirkt auch, dass die Ausbeute von Allicin von einer bestimmten Menge Alliin und Knoblauch leicht erhöht wird.

Die natürliche Quelle für Alliinase, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist die Substanz, die aus einer Pflanze der Gattung Allium erhalten wird, vorzugsweise aus deren Knollenabschnitt. Am stärksten bevorzugt ist Knoblauch, Allium sativum, der leicht erhältlich und billig ist und der auch eine relativ hohe Konzentration Alliinase hat. Jede Knoblauchart, die hinreichende Mengen Alliinase enthält, kann verwendet werden, beispielsweise Allium macrostemon oder Allium ampeloprasum. Es kann frischer und/oder getrockneter Knoblauch verwendet werden, jedoch enthält frischer Knoblauch höhere Mengen Alliinase. Die natürliche Alliinase-Quelle kann erfindungsgemäß in ihrer rohen Form verwendet werden, obschon trockene oder gefrorene Formen ebenfalls annehmbar sind.

Die natürliche Pflanzenquelle für Alliinase, gewöhnlich rohe Knoblauchknollen oder -zehen, die vorzugsweise geschält und gesäubert sind, wird mechanisch so behandelt, dass das Alliinase-Enzym freigesetzt wird, das in der Struktur der natürlichen Alliinasequelle vorhanden ist. Diese mechanische Behandlung kann beispielsweise Zerdrücken oder Zerschneiden der Alliinase-Quelle sein. Andere geeignete Verfahren, die die Alliinase freisetzen, werden ebenfalls vorgeschlagen. Ein derzeit bevorzugtes Verfahren beinhaltet die Verwendung eines Mischers mit einer rasch rotierenden Klinge, die die Alliinasequelle in einem sehr kurzen Zeitraum aufbrechen kann. Man kann jeden geeigneten Industrie- oder Haushalts-Mixer verwenden. Ein Vorteil beim Mixen ist, dass die Knoblauchzehen auf sehr kleine Stücke reduziert werden, wohingegen die Bestandteile des Gemischs sorgsam gemischt werden.

Alternativ kann der Knoblauch zerkleinert und dann zur Alliinlösung gegeben werden, gefolgt von schnellem Rühren. Dies ist jedoch nicht so effizient, wie die langsame und kontinuierliche Zugabe von Knoblauch zum Mixer, und erzeugt eine geringere Ausbeute an Allicin. Die höchsten Ausbeuten von Allicin beruhen scheinbar auf der Zugabe von Knoblauch in regelmäßigen Abständen zusammen mit raschem Mixen und Rühren. Die Allinase im Knoblauch reagiert sehr schnell mit dem Alliin, bevor sie durch die Anwesenheit von Allicin gehemmt wird, und die Hemmung steigt mit zunehmender Menge Allicin, wie es durch die Reduktion der Reaktionsrate mit Lösungen, die hohe Mengen Allicin enthalten, in der 1 gezeigt wurde.

Die Produktion von Allicin erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 25 und 45°C. Die Produktion von Allicin erfolgt stärker bevorzugt bei einer Temperatur zwischen etwa 30 und 40°C und am stärksten bevorzugt bei einer Temperatur von 35°C.

Die regelmäßige Zugabe von Knoblauch erfolgt vorzugsweise über einen Zeitraum von mindestens einer Std. und stärker bevorzugt über einen Zeitraum zwischen etwa 1 und 2 Std., und am stärksten bevorzugt über einen Zeitraum von etwa 90 min.

Die Alliinlösung kann hergestellt werden durch Lösen von kristallinem Alliin in Wasser, vorzugsweise reinem destilliertem Wasser. Alternativ kann das Alliin in situ durch Oxidation gebildet werden, beispielsweise durch Verwendung von Wasserstoffperoxid, einer Lösung von Desoxyalliin der geeigneten Stärke (Iberyl et al., (1990). Plant Medica 56). Die Konzentration der Alliinlösung kann vorzugsweise bis zu 20% w/v betragen. Eine übliche Konzentration, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist etwa 10% w/v. Das Schaubild in 4 zeigt, wie die aus Alliin erzeugte Alllicinmenge je nach der in der Lösung vorhandenen Alliinmenge variiert.

Erfindungsgemäß wird die mechanische behandelte Alliinasequelle mit einer wässrigen Alliinlösung zusammengebracht. Dies kann entweder erfolgen durch mechanische Behandlung vor dem Kontaktschritt oder stärker bevorzugt durch Ausüben der mechanischen Behandlung der Alliinasequelle in der Alliinlösung, so dass sie beim Freisetzen der Alliinase für eine unmittelbare Reaktion mit dem Alliin verfügbar ist. Handelt es sich bei der natürlichen Alliinasequelle um rohe Knoblauchzehen, ist der bevorzugte Modus der mechanischen Behandlung bei dieser Ausführungsform das rasche Mixen, das vorzugsweise für mindestens 30 sec, vorzugsweise mindestens 1 min und am stärksten bevorzugt mindestens 5 min. ausgeführt wird. Bei bevorzugten Aspekten dieser Ausführungsform erfolgt das Mischen über den gesamten Kontaktschritt.

Bei dieser Ausführungsform kann man die Alliinasequelle, wie Knoblauchzehen, in mehr als einer Stufe zur Lösung zugeben. Somit kann nach der Durchführung des Kontaktschritts für einen ersten Zeitraum ein weiterer Abschnitt oder Abschnitte der Alliinasequelle zur Lösung gegeben werden und mechanisch behandelt werden (beispielsweise mit einem Mixer gemischt werden), damit die Alliinase daraus freigesetzt wird, und der Kontaktschritt für eine Sekunde oder einen weiteren Zeitraum durchgeführt werden. Der Knoblauch wird vorzugsweise langsam in mehreren Stufen beispielsweise alle 5 min über einen längeren Zeitraum beispielsweise über einen Zeitraum von bis zu 3 Std. stärker bevorzugt weniger als 2 Std. dazu gegeben.

Wird die mechanische Behandlung vor dem Kontaktschritt durchgeführt, ist es in den meisten Fällen nötig, dass man das mechanisch behandelte Material mit der Alliinlösung in einem relativ kurzen Zeitraum in Kontakt bringt, bevor die freigesetzte Alliinase signifikant durch Allicin inaktiviert wird, das gleichzeitig mit der Alliinase freigesetzt wird. Gewöhnlich wird das Material zu der Alliinlösung zugegeben, und dann sofort mechanisch behandelt, so dass die Allinase freigesetzt wird, und die freigesetzte Allinase mit dem Alliin in Kontakt kommen kann. Wird das Material vor dem Kontakt mit der Alliinlösung mechanisch behandelt, kann jegliches Alliin, das in dem Material zugegen ist, mit der Alliinase reagieren, die durch die mechanische Behandlung freigesetzt wird, so dass Allicin produziert wird, die das Allinase-Enzym hemmt.

Die mechanisch behandelte Allinasequelle wird mit der Alliinlösung solange und bei einer solchen Temperatur zusammengebracht, dass das Alliin durch die enzymatische Wirkung der Alliinase in Allicin umgewandelt wird. Somit kann beispielsweise die mechanisch behandelte Alliinasequelle mit der Alliinlösung für einen Zeitraum von 2 bis 4 Std. und bei einer Temperatur zwischen etwa 20°C und etwa 40°C, vorzugsweise Umgebungstemperatur, d.h. etwa 25°C zusammengebracht werden. Eine höhere Allicinkonzentration wird erzeugt, wenn die Allinasequelle allmählich über einen bestimmten Zeitraum zugegeben wird, statt dass die ganze Allinasequelle auf einmal hinzu gegeben wird.

Die Menge der verwendeten Alliinasequelle ist vorzugsweise die Menge, die zum Umwandeln des gesamten Alliins in der Lösung zu Allicin nötig ist. Ist die Alliinasequelle Knoblauch, kann dies mit einem ungefähr gleichen Gewicht von rohem Knoblauch in Alliiin in der Lösung erzielt werden. Das Alliin wird in Allicin und die Abbauprodukte Brenztraubensäure, Ammoniak und Kohlendioxid umgewandelt, mit einem Umwandlungsverhältnis für Alliin zu Allicin von etwa 3:1. Dies wird durch das in der 4 veranschaulicht Schaubild veranschaulicht. Zudem zeigt das Schaubild der 3 die Bildung der Brenztraubensäure während der Umwandlung von Alliin in Allicin.

Das in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens gebildete Allicin wird zu einem nicht-polaren organischen Lösungsmittel mit niedrigem Siedepunkt extrahiert. Dieser Extraktionsschritt kann gleichzeitig mit mindestens einem Teil des Kontaktschritts (b) erfolgen oder alternativ nach Beendigung des Kontaktschritts erfolgen. Somit wird in einer erfindungsgemäßen Ausführungsform die mechanische behandelte Alliinasequelle (entweder vorher hergestellt oder in situ gebildet) mit einem Gemisch aus dem nichtpolaren Lösungsmittel mit niedrigem Siedepunkt und der Alliinlösung zusammengebracht. Das Lösungsmittel, das aufgrund seiner nicht-polaren Struktur nicht mit Wasser mischbar ist, bildet eine gesonderte Schicht. Beim Mixen wird diese über die gesamte Alliin-Wasser-Schicht zu feinen Tröpfchen dispergiert. Das Allicin ist in der Lösungsmittelschicht löslich und wird sofort aus der Reaktion entfernt, wodurch die Lebensdauer des Enzyms zum Umwandeln von mehr Alliin in Allicin gesteigert wird. Die Lösung kann in zwei Schichten getrennt werden, und das Allicin wird durch Verdampfen unter Vakuum aus dem Lösungsmittel gewonnen, so dass im Wesentlichen reines Allicin gewonnen wird, das dann wie erfordert verdünnt und stabilisiert wird.

Bei einer alternativen Ausführungsform wird das entstandene Produkt aus Schritt (b), das das gebildete Allicin enthält, mit dem organischen Lösungsmittel vereinigt, woraufhin die Extraktion des Allicins in das Lösungsmittel erfolgt. Bei dieser alternativen Ausführungsform sollte die resultierende Lösung aus Schritt (b) des Verfahrens aufgrund der instabilen Natur des Allicin-Produkts vorzugsweise unmittelbar nach der Beendigung des Kontaktschritts mit dem Lösungsmittel zusammengebracht werden.

Allicin ist bei Konzentrationen über 0,5%iger Lösung in Wasser extrem instabil. Allicin ist jedoch bei einer Konzentration von 0,5% Lösung bei –40°C verhältnismäßig stabil, vorausgesetzt die Lösung wurde zur Entfernung der Verunreinigungen filtriert. Die bevorzugte Konzentration von Allicin in Lösung nach der Umwandlung aus Alliin beträgt etwa 2%. Die Stabilität von Allicin wird in der Anwesenheit einer leicht sauren Lösung erhöht. Nach der Extraktion mit einem Lösungsmittel zur Gewinnung von reinem Allicin muss das Allicin bei oder unter –70°C gehalten werden, und der Abbau des Allicinproduktes beginnt sofort. Daher möchte man das Allicin zur Steigerung seiner Stabilität möglichst rasch verdünnen, und wo möglich vorzugsweise in 1 bis 2 min. In dieser Ausführungsform bildet das Lösungsmittel sofort eine gesonderte Schicht. Das Gemisch kann dann sorgfältig gemischt werden, beispielsweise durch Mixen, so dass das Lösungsmittel über die Alliin-Wasser-Schicht zu kleinen Tröpfchen dispergierf wird. Das Allicin ist in der Lösungsmittelschicht löslich, und wird sofort aus der Reaktion entfernt. Die Lösung kann sich in zwei Schichten trennen und das Allicin wird aus dem Lösungsmittel durch Verdampfen unter Vakuum gewonnen, so dass im Wesentlichen reines Allicin erhalten wird, das dann bei Bedarf verdünnt und stabilisiert wird.

Man kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und wenn eine hinreichende Menge der Alliinasequelle eingesetzt wird (in einem oder mehreren Stufen, wenn nötig) einen Großteil des in der Alliinlösung vorhandenen Alliins in Allicin umwandeln. Das Schaubild in 2 zeigt die Bildung von Allicin für eine bestimmte Menge Alliin bei steigender Zugabe von Knoblauch. Unter geeigneten HPLC-Bedingungen können Alliin und Allicin gleichzeitig beobachtet werden, so dass die Umwandlung genau überwacht werden kann. Dies ermöglicht die genaue Bestimmung des Endpunktes der Umwandlung, und so kann der Operator des Verfahrens die nächste(n) Stufe(n) des Verfahrens zeitlich korrekt abstimmen, wobei er die schlechte Stabilität von Allicin in Lösung berücksichtigt. Die Umwandlung von Alliin in Allicin kann durch Bereitstellen eines leichten Überschusses von Alliin in der Reaktionslösung unterstützt werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Allicin sehr rasch produziert, wobei der Großteil des Alliins gewöhnlich in weniger als 30 min in Allicin umgewandelt wird. Das resultierende Verfahren lässt sich somit als Batch-Verfahren mit einer kurzen Zyklus-Dauer durchführen, was eine Lösung mit einer Konzentration von bis zu 1,0% v/v Allicin erzeugt. Eine Lösung dieser Stärke ist instabil. Wird das Allicin in ein Lösungsmittel nicht in situ oder direkt nach der Beendigung des Kontaktschritts extrahiert, sollte es folglich vorzugsweise auf weniger als 0,5% w/v, beispielsweise etwa 0,15% w/v verdünnt werden. Die verdünnte Lösung kann weiter stabilisiert werden durch Einstellen des pH-Wertes auf etwa 4,5, wobei ein bekanntes Verfahren verwendet wird, beispielsweise ein geeigneter Puffer, wie Zitronensäure. Das Batch-Verfahren kann alternativ eingestellt so werden, dass eine Lösung mit einer Konzentration von bis zu 0,5% v/v Allicin erzeugt wird, die leicht bei –20°C aufbewahrt werden kann.

In Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das durch die Reaktion produzierte Allicin in ein geeignetes nicht-polares Lösungsmittel extrahiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pentan, Hexan und Ether. Das verwendete Lösungsmittel sollte einen möglichst niedrigen Siedepunkt aufweisen, vorzugsweise etwa 45°C oder niedriger, damit eine rasche Entfernung unter Vakuum bei Raumtemperatur möglich ist, in Wasser unmischbar sein, und eine möglichst niedrige Wasserlöslichkeit haben, wohingegen es die Eigenschaft hat, dass es selektiv Allicin und keinen anderen in der Lösung vorhandenen Bestandteil lösen kann. Bei der Herstellung von Material für die pharmazeutische Verwendung wird die Auswahl des Lösungsmittels durch die EC-Richtlinien beeinflusst, die die restlichen Lösungsmittel beeinflussen (CPMP/ICH/283/95). Diese Lösungsmittel sind in der MCA Euro Direct Veröffentlichung Nr. 283/95 veröffentlicht, die 64 Lösungsmittel mit Konzentrationsgrenzen aufführt, und die zugelassene tägliche Aufnahme, und diese sollten bei der Auswahl eines geeigneten Lösungsmittels berücksichtigt werden.

Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist besonders geeignet, wenn reines Allicin erforderlich ist, beispielsweise für die nachfolgende Produktion von Ajoen für den pharmazeutischen Gebrauch.

Die Produktion von Allicin aus reinem Alliin und frischem Knoblauch ergibt ein Material, das identisch zu dem ist, das man in der Natur vorfindet; jede Verunreinigung, wie Brenztraubensäure, findet sich in der Natur als Ergebnis der normalen Alliinreaktion.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Produktion von Allicin in signifikanten Mengen und in Stärken, die vorher aus Rohknoblauch oder anderen veröffentlichten oder bekannten Verfahren nicht erzielbar waren. Zur Gewährleistung der Reinheit des Allicinproduktes sollte ein hochreines Ausgangsmaterial (Alliin) verwendet werden, und zwar entweder als kristalliner Feststoff oder hochreine Lösung. Die Verwendung von unreinen Ausgangsmaterialien führt zu einem gefärbten Produkt, das die Ausbeute stark reduziert. Somit ist es ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung, dass das Alliin in Schritt (b) durch ein Verfahren synthetisiert wird, in dem reines Desoxyalliin mit einem Oxidierungsmittel, wie Wasserstoffperoxid, oxidiert wird. Desoxyalliin kann mit dem von Iberl, Miller und Knobloch (1990) (Planta Med 56; 320–326) beschriebenen Verfahren synthetisiert werden, wobei das Verfahren durch die Substitution von Allylchlorid anstelle von Allylbromid modifiziert werden kann. Der Kontrolle der Temperatur über die gesamte Reaktion sollte besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden, wenn die Temperatur zu niedrig ist, die Reaktion zum Beenden zu lang dauert, und wenn die Temperatur zu hoch ist, wird die Allinase-Enzymaktivität zerstört und jegliches rasch produzierte Allicin zersetzt sich. Das erfindungsgemäße Verfahren gewährleistet, dass die verschiedenen Verunreinigungen, die aufgrund der Synthese von Allicin vorhanden sind, insbesondere Allylchlorid, Essigsäure, Natriumchlorid und Wasserstoffperoxid, in den relevanten Stufen der Synthese vermieden werden. Der Austausch von Allylchlorid gegen Allylbromid führt zur Produktion von Natriumchlorid statt Natriumchlorid während des Umwandlungsverfahrens. Man möchte ebenfalls das Vorhandensein von überschüssigem Wasserstoffperoxid, wenn möglich vermeiden, da Wasserstoffperoxid während der Kristallisation von Alliin zur Explosion neigt.

Das erfindungsgemäß produzierte Allicin ist im Wesentlichen das Gleiche wie das natürlich produzierte in Knoblauch und kann als Nahrungsmitteladditiv oder Würzmittel verwendet werden, damit der Knoblauch beispielsweise Öl, Butter, Käse und dergleichen Geschmack verleiht, oder als natürliches Nahrungsmittel-Konservierungsmittel in der Fleisch- und Milchindustrie.

Das Allicin-Präparat in einer reinen und konsistenten Form ermöglicht, dass es zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen für den Gebrauch beim Menschen und in der Veterinärmedizin, wie beispielsweise aber nicht eingeschränkt auf Viren-, Bakterien-, Pilz- und Parasiteninfektionen, hohe Cholesterin- und Blutlipidspiegel, hoher Blutdruck und Thrombose, verwendet werden kann. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können durch ein beliebiges Standard-Verfahren hergestellt werden. Die Erfindung hat den Vorteil der Flexibilität der Lösungskonzentration aufgrund der hohen Stärke der produzierten Allicin-Lösung, die dann auf eine erforderliche Konzentration verdünnt werden kann.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann verwendet bei, aber nicht eingeschränkt auf, die Behandlung von Bakterieninfektionen, die durch Bakterien der Gattungen Staphylococcus, Streptococcus, Vibrio und Bacillus verursacht werden, Pilzinfektionen, die beispielsweise durch Candida albicans verursacht werden, gegen Amöben und bei der Behandlung beispielsweise von Herzerkrankung und Arteriosklerose. Neuere Studien haben veröffentlichte Berichte über die antibakterielle Wirksamkeit von Allicin bestätigt.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das Allicin aus der Lösungsmittel-Schicht produziert und in Ajoen umgewandelt, wobei bekannte Verfahren verwendet werden (Iberl, Winkler und Knobloch, siehe oben), die die Bedingungen steuern, unter denen sich das Allicin zersetzt. Die Lösung, die das Allicin enthält, beeinflusst das entstandene Abbauprodukt. 2-Propanol oder Ethanol ergibt mindestens 60% (E/Z) Ajoen. Die spezifische Steuerung der Umwandlungsbedingungen kann ein Verhältnis von bis zu 90:10 E-Ajoen:Z-Ajoen, oder umgekehrt ergeben. Zudem kann die Produktion von 2-Vinyl-1-2-diithin durch die spezifische Steuerung der Umwandlungsbedingungen gesteuert werden.

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Produktion von reinem Allicin und Ajoen. Diese gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen ergeben Verbindungen von Zusammensetzungen pharmazeutischer Qualität für die Behandlung von Virus-, Bakterien-, Pilz- und Parasiteninfektionen, hohen Cholesterin- und Blutlipidspiegeln, hohem Blutdruck und Thrombose, ist aber nicht darauf eingeschränkt.

Bei noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung im Wesentlichen reines Allicin oder Ajoen bereit, hergestellt gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren, das als Nahrungsmitteladditiv, Würzmittel oder Konservierungsmittel verwendet werden soll.

Nachstehend werden die erfindungsgemäßen Ausführungsformen lediglich besipielsweise erläutert.

Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Umwandlung von reinem Alliin in Allicin durch die Wirkung des Enzyms Alliinase, das beispielsweise in frischem Knoblauch vorkommt. Das so erzeugte Allicin kann dann als solches in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Ether, Pentan oder Hexan extrahiert werden, so dass man reines Allicin erhält oder weiter verarbeitet werden, so dass es in Ajoen oder Diathiin umgewandelt wird.

In den Beispielen werden die folgenden Materialien und Methoden verwendet.

Materialien

L-Cystein wurde von Forum Chemicals komplett mit einem Koscher-Zertifikat des Herstellers erhalten. Der Knoblauch stammte aus örtlichen Geschäften, sowie in Massen von Großhändlern und Massen-Importeuren. Der importierte Knoblauch stammte aus Spanien und Frankreich. Sämtliche anderen Chemikalien und Lösungsmittel wurden auf normale Weise von den üblichen UK-Lieferanten für Feinchemikalien geliefert.

HPLC

Die Analyse der verschiedenen Verbindungen erfolgte mit einem Hewlett Packard 1100-Chromatographen mit einer isokratischen Pumpe und variablem Wellenlängen-Detektor. Die Chromatographiesäulen waren Genisis C18-Umkehrphase, 250mm Länge × 4,6 mm Innendurchmesser, 5 Å Partikelgröße, mit eine geeigneten Schutzsäule und wurden von Jones Chromatography geliefert. Die mobile Phase war 50% Methanol/50% Wasser. Die normale Detektionswellenlänge war 210 nM.

Beispiel 1 Verfahren zur Herstellung von reinem kristallinen Desoxyalliin

Die Synthese von Desoxyalliin beruhte auf dem von Iberl, Miller und Knobloch (1990) (Planta MEd 56; 320–326) beschriebenen Verfahren, aber modifiziert und im Wesentlichen verbessert durch die Substitution von Allylchlorid anstelle von Allylbromid, wobei besonders auf die Steuerung der Temperatur über die gesamte Reaktion geachtet wurde.

2 kg L-Cysteinhydrochlorid-Monohydrat wurde in 2 Liter destilliertem Wasser gelöst, und bei 20–25°C gerührt. Eine Lösung von Natriumhydroxid, bestehend aus 1,6 kg in 2 Litern destilliertem Wasser, wurde tropfenweise zum gerührten Reaktionsgemisch über einen Zeitraum von 2 bis 4 Std. gegeben. 1 Liter Allylchlorid wurde dann langsam zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und die Temperatur wurde zwischen 25 und 30°C gehalten. Zum Beenden wurde das Reaktionsgemisch für eine weitere Std. gerührt.

Das Reaktionsgemisch wurde auf 4°C gekühlt, dann wurde tropfenweise Eisessig dazu gegeben. Während der Zugabe der Säure trennte sich ein weißer Feststoff aus der Lösung, und die Lösung wurde sehr dick und schwierig zu rühren. Bei der Beendigung der Zugabe der Säure wurde der Feststoff durch Filtration getrennt und getrocknet.

Die Reinigung des getrockneten Kuchens wurde durch Lösen des getrockneten Kuchens in 4 Liter destilliertem Wasser gelöst, während die Lösung unter 45°C gehalten wurde. Das gereinigte Desoxyalliin begann dann zu kristallisieren, und das Gemisch wurde auf –20°C gekühlt, so dass die Kristallisation beendet wurde.

Der Feststoff wurde abfiltriert und getrocknet. Der resultierende Kuchen wurde viermal mit 0,5 Liter kaltem Methanol bei –20°C gewaschen. Nach jedem Waschen wurde der Feststoff getrocknet, so dass so viel Wasser wie möglich entfernt wurde. Der weiße Feststoff wurde weitere viermal mit 5 Liter Diethylether gewaschen und dann getrocknet, und schließlich wurde der Feststoff unter Vakuum getrocknet. Die Reaktion ergab 1,61 kg reines Material, eine Ausbeute zwischen 90 und 99%.

Beispiel 2 Verfahren zur Herstellung von Alliin

Das auf die oben beschriebene Weise produzierte Desoxyalliin wurde als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Alliin verwendet. Zwei verschiedene Verfahren der Alliin-Produktion je nach dem erforderlichen Endgebrauch des Alliins werden eingesetzt. Die Anfangsstufen der Synthese sind identisch. Das Desoxyalliin wird gelöst und durch Wasserstoffperoxid oxidiert, so dass Alliin gebildet wird. Die Steuerung der Temperatur ist entscheidend und die Reaktionsrate und Temperatur wird durch die Rate der Zugabe von Wasserstoffperoxid gesteuert. Das so erzeugte Alliin ist ein racemisches Gemisch aus zwei Isomeren, wie bestimmt durch das HPLC-Verfahren von Iberl, Müller und Knobloch ((1990), siehe oben), wobei ein Derivatisierungsmittel verwendet wird.

a) Alliiin-Flüssigkeit

6 Liter Wasser wurden in einem 10 Liter-Rundbodenkolben vorgelegt, und 1 kg Desoxyalliin wurde unter Rühren zugegeben. 500 ml Wasserstoffperoxid (30% w/v) wurde tropfenweise zugegeben, und die Temperatur während der Zugabe zwischen 22 und 26°C gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde für 3 weitere Std. bei Raumtemperatur gerührt, so dass die Beendigung der Reaktion gewährleistet war.

Desoxyalliin hat eine Retentionszeit von 3,4 min, L-Cystein 2,6 min, und Alliin 2,9 min. Dies ermöglicht, dass die Reaktion eingehend mittels HPLC verfolgt werden kann, um den Endpunkt zu bestimmen. Eine Mindestmenge von Wasserstoffperoxid wurde in der Reaktion verwendet, und das erzeugte Alliin kann entweder direkt zur Herstellung verwendet werden oder umkristallisiert werden, so dass reines festes Alliin erzeugt wird.

b) Festes kristallines Alliin

1 kg Desoxyalliin, hergestellt gemäß dem Beispiel 1, wurde in 1 Liter Wasser und 2 Litern Methanol gerührt. 0,5 Liter Wasserstoffperoxid wurden tropfenweise zugegeben, während die Temperatur zwischen 24–26°C gehalten wurde. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch für weitere 4 Std. gerührt, so dass die Beendigung der Reaktion gewährleistet war. Die Lösung wurde gekühlt und auf –20°C gekühlt, so dass das Alliin kristallisiert wurde. Der weiße Feststoff wurde filtriert und dreimal mit 1 Liter kaltem Methanol (–20°C) gewaschen. Insgesamt wurden 3 Liter Methanol zur Entfernung des Wassers zugegeben. Der weiße Feststoff wurde zudem mit 2 Litern Diethylether gewaschen, um Spuren von Methanol zu entfernen. Das feste Material wurde unter Vakuum getrocknet, so dass ein Gewicht von 0,95 kg erhalten wurde.

Das so hergestellte reine Alliin wurde als Standard für die HPLC-Überwachung verschiedener Reaktionen verwendet.

Beispiel 3 Verfahren zur Herstellung einer Allicinlösung, die 1% Allicin enthält, Batch-Größe 0,5 Liter

Allicin wird aus dem durch das in (d) eingehend beschriebene Verfahren hergestellte Alliin produziert, und zwar durch das einfache Verfahren der Lösung in destilliertem Wasser oder Verwendung einer bestimmten Menge des oben produzierten flüssigen Alliins und Zugabe einer kleinen Menge frischen Knoblauchs in der Form einer geschälten vollständig ganzen Zehe. Das Gemisch wird dann in einem Mixer für bis zu 5 min, gewöhnlich 2 min, vereinigt, so dass die Knoblauchzehe vollständig aufgebrochen wird und das Knoblauchenzym Alliinase freigesetzt wird. Die Umwandlung des vorhandenen Alliins durch das Enzym Alliinase erfolgt rasch, wobei etwa 50% des Alliins umgewandelt werden. Weitere Zugaben von Knoblauch führen zu einer weiteren Umwandlung von Alliin in Allicin. Das von Iberl, Müller und Knobloch (1990) beschriebene HPLC-Verfahren mit einem Derivatisierungsmittel zeigte, dass beide Isomere von Allin in Allicin umgewandelt wurden, und im Wesentlichen das gesamte vorhandene Alliin konnte in Allicin umgewandelt werden. Die Aktivität des Enzyms sank zwar nach der Zugabe, jedoch blieb eine gewisse Aktivität für bis zu 24 Std., wie durch 1 demonstriert, wobei mit der Zeit ohne weitere Zugabe des Enzyms das Allicin anstieg und das Alliin sank. Die Aufbewahrung des Reaktionsgemischs bei 20°C stoppte die Reaktion nicht vollständig.

Die so produzierte Lösung kann eine Stärke bis zu 2% Allicin haben, und zwar je nach der Ausgangsstärke der Alliin-Lösung, die eine sofortige Verdünnung erfordert auf unter 0,5%, gewöhnlich 0,15% (15000 ppm), damit sie stabil bleibt. Die Steuerung des pH-Wertes auf etwa 4,5 steigert die Stabilität.

a) Aus festem kristallinen Alliin:

20 g L-Alliin wurden in 800 ml destilliertem Wasser gelöst, und 24 g Knoblauchzehen wurden langsam über einen Zeitraum von 3 Std. zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und 200 ml Wasser wurden zugegeben, so dass das Lösungsvolumen auf 1 Liter gebracht wurde. Dies wurde unter +4°C aufbewahrt.

b) Aus Desoxyalliin:

Eine alternative Form dieser Erfindung ist für das Allicin, das durch die Wirkung des Enzyms auf das direkt bei der Bildung zu entfernende Alliin produziert wird. Dies wird durch die Zugabe eines geeigneten unmischbaren organischen Lösungsmittels, wie Diethylether oder Hexan, zum Anfangsgemisch vor der Zugabe von Knoblauch und dem Mixen erzielt. Beim Mixen bildet das unmischbare Lösungsmittel eine Emulsion mit der Alliinlösung, und das Alllicin wird direkt bei der Bildung durch die kleinen Tröpfchen des Lösungsmittels absorbiert, so dass es dem Enzymkontakt entzogen wird. Das Ziel davon ist die Bewahrung und Ausweitung der Aktivität des Enzyms, so dass die Zugabe von weniger Knoblauch erforderlich ist. Beim Beenden der Umwandlung von Alliin in Allicin kann sich das Reaktionsgemisch trennen, das Lösungsmittel, das das Allicin enthält, wird entfernt, und das reine Allicin wird als strohfarbene ölige Flüssigkeit durch Verdampfen des Lösungsmittels unter Vakuum gewonnen. Eine sofortige Verdünnung ist erforderlich, damit der Abbau von Allicin verhindert wird. 5 g Alliin ergibt 1,5 g reines Allicin, ein Umwandlungsverhältnis von 3,3:1.

50 g Desoxyalliin, hergestellt gemäß dem oben aufgeführten Verfahren, wurde in 225 ml destilliertem Wasser gerührt, und 25 ml Wasserstoffperoxid wurde langsam zugegeben. Nach 4 Std. wurde das Desoxyalliin in Alliin umgewandelt, so dass eine 14% (w/v) Lösung erhalten wurde. Diese Alliinlösung wurde durch die Zugabe von ganzen Knoblauchzehen in 1 % Allicin umgewandelt, filtriert und auf 1,6 Liter aufgefüllt, sodass eine 1 %ige Lösung wie oben hergestellt wurde.

Beispiel 4 Verfahren zur Herstellung von reiner Allicin-Flüssigkeit

10 g L-Alliin wurde zu 200 ml destilliertem Wasser zugegeben, und 12 g frische Knoblauchzehen wurden wie oben (in Beispiel 3) beschrieben zugegeben. Nach dem Ende der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie 50 ml Diethylether, extrahiert. Die Etherschicht wurde getrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, so dass eine strohfarbene Flüssigkeit erhalten wurde, die 1 g Allicin ergab. Dies wurde in destilliertem Wasser (100 ml) gelöst, und die 1% Allicinlösung wurde bei –20°C aufbewahrt.

Beispiel 5 Verfahren zur Herstellung von Ajoenen und Dithiinen

1 g Allicin wie vorstehend hergestellt (in Beispiel 4) wurde in 10 ml 40% Wasser-Aceton-Lösung gelöst, und die Lösung wurde für 4 Std. zwischen 63–64°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 30 ml 50% Wasser-Methanol verdünnt, und 5 Mal mit 10 ml n-Pentan gewaschen. Das Pentan wurde für eine weitere Verarbeitung bereit gehalten. Die untere Wasser-Aceton-Methanol-Schicht wurde dann mit Ammoniumsulfat gesättigt und mit 20 ml Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethanschicht wurde getrennt, mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, so dass man rohes Ajoen erhielt.


Anspruch[de]
Verfahren zur Herstellung von Allicin, das folgende Schritte umfasst:

(a) das mechanische Behandeln einer natürlichen Alliinasequelle, die aus einer Pflanze der Alliumgattung erhalten wurde, um daraus die Alliinase freizusetzen;

(b) das Kontaktieren der mechanisch behandelten Alliinasequelle mit einer wässrigen Alliinlösung, die Alliin in einer Konzentration von mindestens 1 % enthält, wobei das Alliin enzymatisch durch die aus der Alliinasequelle freigesetzten Alliinase in Allicin überführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend.

(c) das Extrahieren des sich ergebenden Allicins in ein nicht-polares organisches Lösungsmittel, ausgewählt aus Pentan, Hexan und Ether.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Alliin in einer Konzentration von mindestens 5% verwendet wird. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Alliin in einer Konzentration von mindestens 10% verwendet wird. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Alliin in einer Konzentration von mindestens 15% verwendet wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Alliin in einer Konzentration von höchstens 50% verwendet wird. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Alliin in einer Konzentration von höchstens 40% verwendet wird. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Alliin in einer Konzentration von höchstens 30% verwendet wird. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Alliin in einer Konzentration von höchstens 25% verwendet wird. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Pflanze der Alliumgattung um Allium sativum handelt. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das mechanische Behandeln in Schritt (a) Zermahlen, Zerschneiden oder Vermengen umfasst. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in Schritt (b) das Kontaktieren der Alliinasequelle mit der wässrigen Alliinquelle in mehreren Stufen in regelmäßigen Intervallen durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 12, wobei in Schritt (b) das Kontaktieren der Alliinasequelle mit der wässrigen Alliinquelle mit schnellem Vermengen und Rühren kombiniert wird. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Schritt (b) bei einer Temperatur zwischen 25°C und 45°C durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Schritt (b) bei einer Temperatur zwischen 30°C und 40°C durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Schritt (b) bei einer Temperatur von 35°C durchgeführt wird. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Schritt (b) in einem Zeitraum von mindestens 1 Stunde durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Schritt (b) in einem Zeitraum zwischen 1 und 2 Stunden durchgeführt wird. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Schritt (b) in einem Zeitraum von 90 Minuten durchgeführt wird. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die wässrige Alliinquelle durch Lösen von kristallinem Alliin in destilliertem Wasser bereitgestellt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die wässrige Alliinquelle durch Oxidation einer Deoxyalliinlösung bereitgestellt wird. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die wässrige Alliinlösung in einer Konzentration von bis zu 20% w/v bereitgestellt wird. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die wässrige Alliinlösung in einer Konzentration von 10% bereitgestellt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 23, wobei der Schritt (c) nach Beendigung des Schrittes (b) durchgeführt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 23, wobei der Schritt (c) gleichzeitig mit mindestens einem Teil des Schrittes (b) durchgeführt wird. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Konzentration des Allicins in der Lösung nach Beendigung des Schrittes (b) 2% beträgt. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei nach Beendigung des Schrittes (c) oder des Schrittes (b), wenn der Schritt (c) nicht durchgeführt wird, das Allicin auf eine Konzentration von weniger als 0,5% w/v verdünnt wird. Verfahren nach Anspruch 27, wobei nach Beendigung des Schrittes (c) oder des Schrittes (b), wenn der Schritt (c) nicht durchgeführt wird, das Allicin auf eine Konzentration von 0,15% w/v verdünnt wird.






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