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Dokumentenidentifikation DE69233676T2 15.11.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001231265
Titel Rezeptor Protein Tyrosin-Kinase (FLK-1)
Anmelder The Trustees of Princeton University, Princeton, N.J., US
Erfinder Lemischka, Ihor R., Princeton, New Jersey 08540, US
Vertreter Grünecker, Kinkeldey, Stockmair & Schwanhäusser, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69233676
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 02.04.1992
EP-Aktenzeichen 020040028
EP-Offenlegungsdatum 14.08.2002
EP date of grant 31.01.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 15.11.2007
IPC-Hauptklasse C07K 14/715(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C07K 14/52(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 16/28(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 9/12(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Rezeptor-Tyrosin-Kinase, auf Nukleinsäuren, die eine Kinase kodieren, und Vektoren umfassend diese Nukleinsäuren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das hematopoietische System von Säugetieren umfasst rote und weiße Blutkörperchen. Diese Zellen sind die gereiften Zellen, die aus primitiveren, durch ihre Abstammung beschränkten Zellen entstammen. Die Zellen des hematopoietischen Systems wurden von Dexter und Spooncer in der Zeitschrift Annual Review of Cell Biology 3, 423–441 (1987) beschrieben.

Die roten Blutkörperchen oder Erythrozyten entstammen primitiveren Zellen, die in bezug auf Dexter und Spooncer als „Erythroid burst-forming units" (BFU-E) bezeichnet werden. Die unmittelbaren Nachkommen der Erythroid burst-forming units werden als „Erythroid colonyforming units" (CFU-E) bezeichnet.

Die weißen Blutkörperchen enthalten die reifen Zellen des lymphoiden und myeloiden Systems. Die lymphoiden Zellen schließen B- und T-Lymphozyten mit ein. Die B- und T-Lymphozyten resultieren von früheren Vorläuferzellen, die gemäß Dexter und Spooncer als PreT- und preB-Zellen bezeichnet werden.

Das myeloide System umfasst eine Anzahl von Zellen einschließlich Granulozyten, Blutplättchen, Monozyten, Macrophagen und Megakaryozyten. Die Granulozyten können weiter in neutrophile Zellen, eosinophile Zellen, basophile Zellen und Mastzellen eingeteilt werden.

Jede der reifen hematopoietischen Zellen ist auf eine bestimmte Funktion spezialisiert. Beispielsweise sind Erythrozyten für den Sauerstoff und Kohlendioxidtransport zuständig. T- und B-Lymphozyten sind für Zell- bzw. Antikörper-vermittelte Immunantworten verantwortlich. Blutplättchen sind in die Blutgerinnung involviert. Granulozyten und Macrophagen agieren grundsätzlich als Fänger und Hilfszellen in der Immunantwort gegen invasierende Organismen und ihre Nebenprodukte.

Im Zentrum des hematopoietischen Systems liegen eine oder mehrere totipotente hematopoietische Stammzellen, die eine Serie von Differenzierungsschritten durchlaufen, was zu Vorläuferzellen führt, die durch ihre Abstammung immer weiter eingeschränkt sind. Die reiferen Vorläuferzellen sind darauf beschränkt, eine oder zwei Abstammungslinien zu bilden. Einige Beispiele von abstammungsbeschränkten Vorläuferzellen werden durch Dexter und Spooncer erwähnt und schließen Granulozyten/Macrophagen Kolonie-bildende Zellen (GM-CFC), Megakaryozyten Kolonie-bildende Zellen (Meg-CFC), eosinophile Kolonie-bildende Zellen (Eos-CFC) und basophile Kolonie-bildende Zellen (Bas-CFC) mit ein. Andere Beispiele von Vorläuferzellen werden oben diskutiert.

Das hematopoietische System funktioniert mit Hilfe einer genau kontrollierten Produktion der verschiedenen reifen Zelllinien. Die totipotenten Stammzellen besitzen die Fähigkeit sich einerseits zu erneuern und andererseits sich in festgelegte Vorläuferzellen für alle hematopoietischen Zelllinien zu differenzieren. Diese primitivsten der hematopoietischen Zellen sind sowohl notwendig wie auch ausreichend für die vollständige und permanente hematopoietische Wiederherstellung eines durch Strahlung geschwächten hematopoietischen Systems in Säugetieren. Die Fähigkeit von Stammzellen, das gesamte hematopoietische System wieder aufzubauen, ist die Basis der Therapie durch Knochenmarktransplantation.

Es ist bekannt, dass Wachstumsfaktoren eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Wirkungsweise des hematopoietischen Systems von Säugetieren spielen. Die Rolle von Wachstumsfaktoren ist komplex, und gleichwohl zum jetzigen Zeitpunkt nicht gut verstanden. Ein Grund für diese Unsicherheit ist, dass vieles was über hematopoietische Wachstumsfaktoren bekannt ist, aus in vitro Experimenten hervorgeht. Solche Experimente reflektieren nicht notwendigerweise die Realität in vivo.

Zusätzlich kann in vitro, unter der Voraussetzung, dass Knochenmarkszellen dem Medium zugesetzt werden, die Blutbildung in der Abwesenheit von zugefügten Wachstumsfaktoren etabliert werden. Die Beziehung zwischen stromalen und hematopoietischen Wachstumsfaktoren in vivo ist nicht verstanden. Nichts desto trotz zeigen hematopoietische Wachstumsfaktoren in vivo eine hohe Aktivität.

Von dem was über sie bekannt ist, scheinen hematopoietische Wachstumsfaktoren eine Vielzahl von Aktivitäten aufzuweisen. An einem Ende des Spektrums stehen Wachstumsfaktoren wie Erythropoietin, von dem angenommen wird, dass es ausschließlich die Proliferation von reifen erythroiden Vorläuferzellen fördert. In der Mitte des Spektrums sind Wachstumsfaktoren, wie IL-3, von denen angenommen wird, dass sie das Wachstum und die Entwicklung von frühen Stammzellen sowie eine Anzahl von Vorläuferzellen erleichtern. Einige Beispiele von Vorläuferzellen, die durch IL-3 induziert werden, schließen solche mit ein, die auf Granulozyten/Macrophagen, eosinophile Zelllinien, Megakaryozyten, erythroide Zellinien und Mastzelllinien beschränkt sind.

An dem anderen Ende des Spektrums befindet sich der hematopoietische Wachstumsfaktor, der zusammen mit dem korrespondieren Rezeptor, in einer Serie von Artikeln der Zeitschrift Cell der Ausgabe vom 5. Oktober 1990 diskutiert wurde. Der Rezeptor ist das Produkt des W Locus, c-kit, das ein Mitglied der Klasse von Rezeptor Protein Tyrosin Kinasen ist. Von dem Liganden für c-kit, auf den mit verschiedenen Namen, wie z. B. Stammzellfaktor (stem cell factor, SCF) und Mastzellwachstumsfaktor (mast cell growth factor, MGF) Bezug genommen wird, nimmt man an, dass er für die Entwicklung von frühen hematopoietischen Stammzellen essentiell ist sowie für Zellen wichtig ist, die auf erythroide Zellinien und Mastzelllinien in Mäusen beschränkt sind; siehe z. B. Copeland et al., Cell 63, 175–183 (1990).

Es erscheint daher, dass es Wachstumsfaktoren gibt, die ausschließlich reife Zellen beeinflussen. Es scheint ebenfalls Wachstumsfaktoren zu geben, die beiderseits reife Zellen und Stammzellen beeinflussen. Die Wachstumsfaktoren, die beide Zelltypen beeinflussen, können möglicherweise eine kleine Anzahl oder eine große Anzahl an reifen Zellen beeinflussen.

Weiterhin scheint es eine inverse Beziehung zu geben zwischen der Fähigkeit eines Wachstumsfaktors, reife Zellen zu beeinflussen, und der Fähigkeit des Wachstumsfaktors, Stammzellen zu beeinflussen. Beispielsweise wird angenommen, dass der c-kit Ligand, der eine kleine Anzahl an reifen Zellen beeinflusst, wichtiger in der Erneuerung und Entwicklung von Stammzellen ist als IL-3, von dem berichtet wird, dass er die Proliferation von vielen reifen Zellen stimuliert (siehe oben).

Vor der vorliegenden Beschreibung gab es keine Berichte über Wachstumsfaktoren, die ausschließlich Stammzellen ohne einen Effekt auf reife Zellen beeinflussen. Die Entdeckung von solchen Wachstumsfaktoren wäre von besonderer Signifikanz.

Wie oben erwähnt, ist c-kit eine Protein Tyrosin Kinase (pTK). Es wird immer offensichtlicher, dass Protein Tyrosin Kinasen eine wichtige Rolle als zelluläre Rezeptoren für hematopoietische Wachstumsfaktoren spielen. Andere Rezeptor pTKs schließen die Rezeptoren des Kolonie stimulierenden Faktors 1 (colony stimulating factor 1,CSF-1) und PDGF mit ein.

Die pTK-Familie kann durch die Anwesenheit verschiedener konservierter Aminosäureregionen in der katalytischen Domäne erkannt werden. Diese konservierten Regionen werden durch Hanks et al. in Science 241, 42–52 (1988) zusammengefasst, siehe 1 beginnend auf Seite 46, und durch Wilks in Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86, 1603–1607 (1989), siehe 2 auf Seite 1605.

Weitere Protein Tyrosin Kinasen, die Rezeptoren hematopoietischer Wachstumsfaktoren darstellen werden benötigt, um die Selbsterneuerung der totipotenten hematopoietischen Stammzellen in einer effektiveren Weise zu stimulieren und die Entwicklung aller Zellen des hematopoietischen Systems beiderseits in vitro und in vivo zu stimulieren. Neue Rezeptoren hematopoietischer Wachstumsfaktoren, die nur auf primitiven Stammzellen vorhanden sind, jedoch nicht auf reifen Vorläuferzellen vorkommen, werden Insbesondere benötigt. Liganden für die neuen Rezeptoren sind auch wünschenswert, die als hematopoietischer Wachstumsfaktoren fungieren. Nukleinsäuresequenzen, die die Liganden kodieren, werden benötigt, um rekombinante Rezeptoren und Liganden herzustellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese und andere Ziele, die einem Fachmann offensichtlich sind, werden durch die Bereitstellung von isolierten Säugetier-Nukleinsäuremolekülen, welche Rezeptor-Tyrosin-Kinase kodieren, exprimiert in primitiven hematopoietischen Zellen und nicht exprimiert in reifen hematopoietischen Zellen, erreicht. Auch eingeschlossen sind die Rezeptoren, kodiert durch solche Nukleinsäuremoleküle; die Nukleinsäuremoleküle, welche solche Rezeptor Protein Kinasen kodieren, welche die in 2 (flk-1) gezeigten Sequenz aufweisen; und Rezeptor-Tyrosin-Kinasen mit den Aminosäure-Sequenzen, gezeigt in 2 (flk-1).

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

1a.11a.3 zeigt die cDNA und Aminosäuresequenzen muriner flk-2. Die Aminosäurereste erscheinen direkt unter den Nukleotiden im offenen Leseraster. Die Aminosäuren 1–27 bilden die hydrophobe Leitsequenz. Die Aminosäuren 28–544 bilden die extrazelluläre Rezeptordomäne. Die Aminosäuren 545–564 bilden die Transmembranregion. Die verbleibenden Aminosäuren bilden die intrazelluläre katalytische Domäne. Die in der intrazellulären Domäne folgenden Aminosäurereste sind katalytische Sub-Domänen, die durch Hanks (siehe oben) identifiziert wurden: 545–564, 618–623, 811–819, 832–834, 857–862, 872–878. Die Sequenz bei den Resten 709–785 ist eine kennzeichnende Sequenz, die charakteristisch für flk-2 ist. Die Protein Tyrosin Kinasen haben grundsätzlich eine kennzeichnende Sequenz in dieser Region.

1b zeigt die cDNA und Aminosäuresequenzen eines Teils der humanen flk-2 aus der extrazellulären Domäne. Die Aminosäuren 1–110 der humanen flk-2 korrespondieren zu den Aminosäuren 42–152 von muriner flk-2.

1c zeigt die cDNA und Aminosäuresequenzen eines Teils humaner flk-2 aus der intrazellulären (Kinase) Domäne. Die Aminosäuren 1–94 der humanen flk-2 korrespondieren zu den Aminosäuren 751–849 von muriner flk-2.

22.3 zeigt die cDNA und Aminosäuresequenzen von flk-1. Die Aminosäurereste 763–784 bilden die Transmembranregion von flk-1.

3 zeigt die zeitliche Antwort der Bindung zwischen einer murinen stromalen Zelllinie (2018) und APtag-flk-2 wie auch APtag-flk-1. APtag ohne Rezeptor (SEAP) wird als Kontrolle verwendet. Siehe Beispiel 8.

4 zeigt die Dosis-Antwort auf die Bindung zwischen stromalen Zellen (2018) und APtag-flk-2 sowie APtag-flk-1. APtag ohne Rezeptor (SEAP) wird als Kontrolle verwendet. Siehe Beispiel 8.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Rezeptoren

Die Erfindung betrifft in einer Ausführungsform ein isoliertes Säugetier-Nukleinsäuremolekül aus Säugetieren, das eine Rezeptor Protein Tyrosin Kinase kodiert, die in primitiven hematopoietischen Zellen aus Säugetieren exprimiert wird und nicht in reifen hematopoietischen Zellen exprimiert wird.

Das Nukleinsäuremolekül kann ein DNA-, cDNA- oder RNA-Molekül sein. Das Säugetier, in dem das Nukleinsäuremolekül existiert, kann jedes Säugetier sein, wie z. B. eine Maus, Ratte, Kaninchen oder Mensch.

Das Nukleinsäuremolekül kodiert eine Rezeptor-Tyrosin-Kinase (pTK). Mitglieder der pTK-Familie können an den konservierten Aminosäure-Regionen in der katalytischen Domäne erkannt werden. Beispiele von pTK-Konsensus-Sequenzen wurden von Hanks et al. in Science 241, 42–52 (1988) bereitgestellt; siehe beispielsweise 1 beginnend auf Seite 46, und durch Wilks in Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86, 1603–1607 (1989); siehe insbesondere 2 auf Seite 1605. Ein Methioninrest an Position 205 in der konservierten Sequenz WMAPES ist charakteristisch für pTKs, die Rezeptoren sind.

Der Artikel von Hanks et al. identifiziert elf katalytische Sub-Domänen, die pTK-Konsensus-Reste und -Sequenzen beinhalten. Die pTKs der vorliegenden Erfindung werden die meisten oder alle dieser Konsensus-Reste und -Sequenzen aufweisen.

Einige besonders stark konservierte Reste und Sequenzen werden in Tabelle 1 gezeigt.

TABELLE 1

Eine pTK der Erfindung kann alle dreizehn dieser hochkonservierten Reste und Sequenzen beinhalten. Als ein Ergebnis natürlicher oder synthetischer Mutationen können pTKs der Erfindung weniger als alle dreizehn hochkonservierten Reste und Sequenzen beinhalten, sowie z. B. 11, 9 oder 7 solcher Sequenzen, solange die Bedingungen von Anspruch 1 erfüllt sind.

Die Rezeptoren der Erfindung gehören grundsätzlich zur gleichen Klasse der pTK-Sequenzen, zu denen c-kit gehört. Es wurde jedoch überraschend festgestellt, eine neue funktionelle Klasse von Rezeptor pTKs exisitert. Die neue funktionelle Klasse von Rezeptor pTKs wird in primitiven hematopoietischen Zellen exprimiert, jedoch nicht in reifen hematopoietischen Zellen.

Zum Zweck dieser Patentanmeldung ist eine primitive hematopoietische Zelle totipotent, d. h. fähig, alle hematopoietischen Blutzellen in vivo wieder zu bilden. Eine reife hematopoietische Zelle ist nicht selbsterneuernd und besitzt begrenzte proliferative Fähigkeiten, z.B. eine begrenzte Fähigkeit zur Entwicklung multipler Zelllinien. Zum Zweck dieser Patentanmeldung sind reife hematopoietische Zellen grundsätzlich zur Entwicklung von nur einer oder zwei Zelllinien in vitro oder in vivo fähig.

Es sollte selbstverständlich sein, dass das hematopoietische System komplex ist und viele intermediäre Zellen zwischen primitiven totipotenten hematopoietischen Stammzellen und den oben definierten vollkommen entwickelten reifen hematopoietischen Zellen enthält. Sowie sich die Stammzelle in eine immer reifere, durch ihre Abstammung beschränkte Zelle entwickelt, verliert diese immer mehr ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung.

Die Rezeptoren der vorliegenden Erfindung, wie in diesem Patent beschrieben, können und können auch nicht in diesen intermediären Zellen exprimiert werden. Die notwendige und hinreichende Bedingung, welche Mitglieder der neuen Klasse von Rezeptoren definiert, ist, dass sie in den primitiven totipotenten Stammzellen oder in Zellen vorhanden sind und nicht in auf eine oder zumeist zwei Zelllinien beschränkten reifen Zellen.

Ein Beispiel der neuen Klasse an Rezeptor pTKs, wird fötale Leberkinase 2 (flk-2) genannt, nach dem Organ in dem es gefunden wurde. In der Mitte der Trächtigkeit (Tag 14) gibt es ungefähr eine totipotente Stammzelle pro 104 Zellen in der fötalen Leber von Mäusen. Zusätzlich zur fötalen Leber wird flk-2 ebenfalls in der fötalen Milz, fötalem Thymus, adultem Hirn und adultem Knochenmark exprimiert.

Beispielsweise wird flk-2 in individuellen multipotenten CFU-Blast-Kolonien exprimiert, die fähig sind, zahlreiche Kolonien vielfältiger Abstammung nach erneutem Ausplattieren zu erzeugen. Es ist daher wahrscheinlich, dass flk-2 im gesamten primitiven (d. h. selbsterneuernden) Anteil der hematopoietischen Hierarchie exprimiert werden. Diese Entdeckung stimmt damit überein, dass flk-2 in der Weiterleitung möglicher Signale zur Selbsterneuerung aus der Umgebung wichtig ist.

Es ist besonders wichtig, dass die Expression von flk-2 mRNA in der primitivsten thymozytischen Untereinheit stattfindet. Sogar in nahe miteinander verbundenen unreifen Untereinheiten, die sich in der Expression des IL-2-Rezeptors unterscheiden, segregiert die flk-2-Expression zu der primitiveren Untereinheit, der ein IL-2-Rezeptor fehlt. Man nimmt an, dass die früheste thymozytische Untereinheit nicht entwickelt ist. Daher kann die Thymozyte, die flk-2 exprimiert multipotent sein. Flk-2 ist die erste Rezeptor Tyrosin Kinase von der bekannt ist, dass sie in der T-lymphoiden Zelllinie exprimiert wird.

Die mRNA fötaler Leber wandert relativ zu den ribosomalen Banden 285 und 185 auf Formaldehyd-Agarose-Gel bei ungefähr 3,5 kb, während die Nachricht des Gehirns erheblich größer ist. In adulten Geweben wandert flk-2 mRNA sowohl vom Hirn wie auch vom Knochenmark bei etwa 3,5 kb.

Die vorliegende Erfindung betrifft einen zweiten Rezeptor, der fötale Leberkinase 1 (flk-1) genannt wird und kein Mitglied der gleichen Klasse an Rezeptoren wie flk-2 ist, da flk-1 in ein paar mehr reifen hematopoietischen Zellen gefunden werden kann. Die Aminosäuresequenz von flk-1 ist in 2 gezeigt.

Die vorliegende Erfindung schließt den flk-1 Rezeptor ein, wie auch DANN, cDNA und RNA, kodierend flk-1.Die DNA-Sequenz von flk-1 ist ebenfalls in 2 gezeigt. Flk-1 kann in den gleichen Organen wie flk-2 gefunden werden, sowie auch in fötalem Hirn, Magen, Niere, Lunge, Herz und Darm; und in adulter Niere, Herz, Milz, Lunge, Muskeln und Lymphknoten.

Es ist bekannt, dass die Rezeptor Protein Tyrosin Kinasen der Erfindung in einfach zu bestimmende Domänen aufgeteilt werden können. Die zur pTK korrespondierende DNA-Sequenz kodiert, beginnend mit ihrem 5'-Ende, eine hydrophobe Leitsequenz, der eine hydrophile extrazelluläre Domäne folgt, die an einen spezifischen Liganden bindet und durch diesen aktiviert wird. Unmittelbar stromabwärts der extrazellulären Rezeptor-Domäne ist eine hydrophobe Transmembranregion. Auf die Transmembranregion folgt unmittelbar eine basische katalytische Domäne, die in Bezug auf die oben diskutierten Artikel von Hanks et al. und Wilks identifiziert werden kann.

Die vorliegende Erfindung schließt die extrazelluläre Rezeptor-Domäne ein, der die Transmembranregion und die katalytische Domäne fehlt. Vorzugsweise ist die hydrophobe Leitsequenz ebenfalls aus der extrazellulären Domäne entfernt.

Diese Regionen und Domänen können von einem durchschnittlichen Fachmann einfach visuell dadurch identifiziert werden, dass die Aminosäuresequenz einer vermutlichen pTK kontrolliert und mit bekannten pTKs verglichen wird. In Bezug auf 1a wird beispielsweise die Transmembranregion von flk-2, die die extrazelluläre Rezeptor-Domäne von der katalytischen Domäne abtrennt, durch die Nukleotide 1663 (T) bis 1722 (C) kodiert. Diese Nukleotide korrespondieren zum Aminosäurerest 545 (Phe) bis 564 (Cys). Die Aminosäure-Sequenz zwischen der Transmembranregion und der katalytischen Sub-Domäne (Aminosäuren 618–623), die durch Hanks et al. als Sub-Domäne I (z. B. GXGXXG) identifiziert wurde, ist charakteristisch für Rezeptor Protein Tyrosin Kinasen.

Die extrazelluläre Domäne kann ebenfalls durch allgemein anerkannte Kriterien für extrazelluläre Aminosäure-Sequenzen identifiziert werden. Die Bestimmung von geeigneten Kriterien ist einem Fachmann bekannt und wurde z. B. von Hopp et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78, 3824–3828 (1981); Kyte et al., J. Mol. Biol. 157, 105–132 (1982); Emini, J. Virol. 55, 836–839 (1985); Jameson et al., CA BIOS 4, 181–186 (1988) und Karplus et al. Naturwissenschaften 72, 212–213 (1985) beschrieben. Die anhand dieser Kriterien vorhergesagten Aminosäure-Domänen liegen exponiert an der Oberfläche, was charakteristisch für extrazelluläre Domänen ist.

Wie weiter unten genauer diskutiert, können Nukleionsäure-Moleküle, die die Rezeptoren der Erfindung kodieren, in bekannte Vektoren zur Verwendung in Standardtechniken für rekombinante DNA verwendet werden. Standardtechniken für rekombinante DNA sind solche wie z. B. in Sambrook et al. beschrieben, "Molecular Cloning", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) und von Ausubel et al., Hrsg., "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York (1987). Die Vektoren können zirkulär (z. B. Plasmide) oder nicht zirkulär sein. Zur Klonierung und Expremierung in einem Wirt sind Standardvektoren verfügbar. Der Wirt kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Prokaryotische Wirte sind bevorzugt E. coli. Bevorzugte eukaryotische Wirte schließen Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen mit ein. Bevorzugte Säugetierzellen schließen z. B. CHO-, COS- und humane Zellen mit ein.

Funktionelle Äquivalente

Die Erfindung schließt funktionelle Äquivalente der pTK Rezeptoren und Rezeptor-Domämen, wie oben beschrieben, ein, ebenso wie Nukleinsäuresequenzen, die diese kodieren. Ein Protein wird dann als funktionelles Äquivalent eines anderen Proteins für eine bestimmte Funktion betrachtet, wenn das äquivalente Protein immunologisch kreuzreaktiv mit den Rezeptoren der Erfindung ist und die gleiche Funktion wie diese besitzt. Das Äquivalent kann z. B. ein Fragment des Proteins oder eine Substitutions-, Additions- oder Deletionsmutante des Proteins sein. Die Äquivalente, eingeschlossen in der Erfindung sind diejenigen, die in Ansprüchen 1(ii) und 1(iii) definiert sind.

Beispielsweise ist es möglich, Aminosäuren in einer Sequenz durch äquivalente Aminosäuren zu ersetzen. Gruppen von Aminosäuren, von denen bekannt ist, dass sie gewöhnlicherweise zueinander äquivalent sind, sind:

  • (a) Ala(A) Ser(S) Thr(T) Pro(P) Gly(G);
  • (b) Asn(N) Asp(D) Glu(E) Gln(Q);
  • (c) His(H) Arg(R) Lys(K);
  • (d) Met(M) Leu(L) Ile(I) Val(V); und
  • (e) Phe(F) Tyr(Y) Trp(W).

Substitutionen, Additionen und/oder Deletionen können solange in den Rezeptoren durchgeführt werden, wie die entstehenden äquivalenten Antikörper immunologisch mit den nativen Antikörpern kreuzreaktiv sind und die gleiche Funktion wie diese besitzen.

Die äquivalenten Rezeptoren werden gewöhnlicherweise im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die nativen Rezeptoren besitzen. Eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen mit einer anderen Sequenz gleich ist, sich jedoch von der anderen Sequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen und/oder Deletionen unterscheidet, wird als äquivalente Sequenz angesehen. Vorzugsweise sind weniger als 25%, noch bevorzugter weniger als 10% und am meisten bevorzugt weniger als 5% der Anzahl an Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz der nativen Rezeptoren substituiert, addiert oder deletiert.

Äquivalente Nukleinsäuremoleküle schließen Nukleinsäuremoleküle mit ein, die die oben definierten äquivalenten Rezeptoren kodieren. Äquivalente Nukleinsäuremoleküle schließen ebenfalls Nukleinsäuresequenzen mit ein, die sich von nativen Nukleinsäuresequenzen in einer Art unterscheiden, die keinen Effekt auf die korrespondierenden Aminosäuresequenzen ausübt.

ISOLATION VON NUKLEINSÄUREMOLEKÜLEN UND PROTEINEN Isolation von Nukleinsäuremolekülen, die Rezeptoren kodieren

Um Nukleinsäuremoleküle herzustellen, die Stammzellenrezeptoren aus Säugetieren kodieren, wird eine Quelle an Stammzellen bereitgestellt. Geeignete Quellen schließen fötale Leber, Milz oder Thymuszellen oder adulte Knochenmarks- oder Hirnzellen mit ein.

Beispielsweise können geeignete fötale Leberzellen aus Mäusen am Tag 14 der Trächtigkeit erhalten werden. Fötale Thymuszellen aus Mäusen können am Tag 14–18 der Trächtigkeit, vorzugsweise am Tag 15, erhalten werden. Geeignete fötale Zellen anderer Säugetiere können zu den Zeiten erhalten werden, die mit der Trächtigkeit von Mäusen korrespondiert.

Die gesamte RNA wird mit Hilfe von Standardtechniken aus Gewebe präpariert, das Stammzellrezeptoren beinhaltet. Die gesamte RNA wird zur direkten cDNA-Synthese verwendet. Standardverfahren zur Isolierung von RNA und zu Synthese von cDNA werden in Standardhandbüchern der Molekularbiologie bereitgestellt, sowie in Sambrook et al., "Molecular Cloning," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) und in Ausubel et al., (Hrsg.), "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Associates/Wiley Interscience, New York (1990).

Die cDNA des Rezeptors wird durch bekannte Verfahren amplifiziert. Zum Beispiel kann die cDNA als ein Template für die Amplifikation mittels der Polymerase Kettenreaktion (PCR) verwendet werden, siehe Saiki et al., Science, 239, 487 (1988) oder Mullis et al., US-Patent 4,683,195. Die Sequenzen der Oligonukleotid-Primer für die PCR-Amplifikation werden aus der Sequenz bekannter Rezeptoren hergeleitet, wie z. B. aus den in 1 und 2 angegebenen Sequenzen für flk-2 bzw. flk-1, vorzugsweise flk-2. Die Oligonukleotide werden durch bekannte Standardverfahren hergestellt. Geeignete Verfahren schließen solche mit ein, die von Caruthers in der Zeitschrift Science 230, 281–285 (1985) beschrieben werden.

Um die gesamte, für die Rezeptoren der vorliegenden Erfindung proteinkodierenden Regionen zu isolieren, ist das stromaufwärts gelegene Oligonukleotid komplementär zur Sequenz am 5'-Ende, vorzugsweise das ATG Startkodon umgebend und mindestens 5–10 Nukleotide stromaufwärts des Start Kodons. Das stromabwärts gelegene Oligonukleotid ist komplementär zur Sequenz am 3'-Ende, optional das Stopkodon umgebend. Eine Mischung von stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Oligonukleotiden wird in der PCR-Amplifikation verwendet. Die Bedingungen werden gemäß Standardverfahren für jedes einzelne Primer-Paar optimiert. Das PCR-Produkt wird mittels Elektrophorese auf die korrekte Größe der cDNA analysiert, die zu der Sequenz zwischen den Primern korrespondiert.

Alternativ kann die kodierende Region in zwei oder mehr überlappenden Fragmenten amplifiziert werden. Die überlappenden Fragmente werden so entworfen, dass sie eine Schnittstelle mit einschließen, die eine Zusammenstellung der intakten cDNA aus den Fragmenten erlauben.

Die die Rezeptoren der Erfindung kodierende amplifizierte DNA kann in einer großen Anzahl an Klonierungsvektoren in einer großen Anzahl an Wirtszellen repliziert werden. Die Wirtszelle kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Die DNA kann aus natürlichen Quellen erhalten werden und optional, modifiziert werden, oder zum Teil oder vollständig synthetisiert werden.

Der Vektor, in dem die DNA gesplicet wird, kann Segmente chromosomaler, nichtchromosomaler und synthetischer DNA-Sequenzen beinhalten. Einige geeignete prokaryotische Klonierungsvektoren schließen Plasmide von E. coli mit ein, wie z.B. colE1, pCR1, BpR322, pMB9, pUC, pKSM und RP4. Prokaryotische Vektoren schließen ebenfalls Derivate von Phagen-DNA mit ein, sowie M13 und andere filamentöse einzelsträngige DNA-Phagen.

Isolierung von Rezeptoren

Die DNA, die die Rezeptoren der Erfindung kodiert, wird in einen geeigneten Vektor eingeschleust und in einem geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt exprimiert. Um Proteine in Bakterien zu exprimieren, speziell in E. coli, sind Vektoren bekannt. Solche Vektoren schließen die PATH-Vektoren mit ein, die durch Dieckmann und Tzagoloff in J. Biol. Chem. 260, 1513–1520 (1985) beschrieben werden. Diese Vektoren enthalten den DNA-Sequenzen, die Anthranilat Synthase (TrpE) kodieren, gefolgt von einem Polylinker am Carboxy-Terminus. Andere Systeme von Expressionsvektoren basieren auf beta-Galactosidase (pEX); lambda-PL; Maltose Bindungsprotein (mMAL); und Glutathion S-Transferase (pGST) – siehe Gene 67, 31 (1988) und Peptide Research 3, 167 (1990).

In Hefe verwendbare Vektoren sind erhältlich. Ein geeignetes Beispiel ist das 2&mgr; Plasmid.

Geeignete Vektoren zur Verwendung in Säugetierzellen sind ebenfalls bekannt. Solche Vektoren schließen gut bekannte Derivate mit ein, die von SV-40, Adenovirus, von Retrovirus abgeleiteten DNA-Sequenzen und Vektoren abstammen, die aus einer Kombination von Plasmiden und Phagen DNA abgeleitet sind.

Weitere eukaryotische Expressionsvektoren sind im Stand der Technik bekannt (z. B. P. J. Southern und P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327–341 (1982); S. Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1, 854–864 (1981); R. J. Kaufmann und P. A. Sharp, "Amplification And Expression Of Sequences Cotransfected with A Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene," J. Mol. Biol. 159, 601–621 (1982); R. J. Kaufmann und P. A. Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601–664 (1982); S. I. Scahill et al., "Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4654–4659 (1983); G. Urlaub und L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216–4220 (1980).

Verwendbare Expressionsvektoren, geeignet in der vorliegenden Erfindung, beinhalten mindestens eine Sequenzen zur Kontrolle der Expression, die operativ mit der zu exprimierenden DNA-Sequenz oder dem Fragment verbunden ist. Die Kontrollsequenz wird in den Vektor eingesetzt, um die Expression der klonierten DNA-Sequenz zu kontrollieren und zu regulieren. Beispiele verwendbarer Sequenzen zur Kontrolle der Expressions sind das lac-System, das trp-System, das tac-System, das trc-System, die großen Operator- und Promotor-Regionen des Lambda-Phagen, die Kontrollregion des fd-coat-Proteins, der glycolytische Promotor aus Hefe, z. B., der Promotor für 3-Phosphoglycerat-Kinase, die Promotoren von Säurephosphatase aus Hefe (yeast acid phosphatase), z. B., Pho5, die Promotoren des alpha-mating Faktors aus Hefe, und Promotoren, die aus Polyoma, Adenovirus, Retrovirus und Simianvirus abgeleitet sind, z. B., die frühen und späten Promotoren oder SV40, und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen kontrollieren sowie deren Viren oder Kombinationen davon.

Vektoren, die die Rezeptor kodierende DNA und Kontrollsignale enthalten, werden in einer Wirtszelle zur Expression des Rezeptors insertiert. Einige zur Expression verwendbare Wirtszellen schließen gut bekannte prokaryotische und eukaryotische Zellen mit ein. Einige geeignete prokaryotische Wirtszellen schließen z. B. mit ein, E. coli, wie z.B. E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI und E. coli MRCI, Pseudomonas, Bacillus, wie z.B. Bacillus subtilis und Streptomyces. Geeignete eukaryotische Zellen schließen Hefe und andere Pilze, Insekten, tierische Zellen wie z.B. COS-Zellen und CHO-Zellen, humane Zellen und Pflanzenzellen in Gewebekulturen mit ein.

Die humanen Homologe der oben beschriebenen Mausrezeptoren werden mit Hilfe einer ähnlichen Strategie isoliert. RNA, die die Rezeptor kodiert, wird aus einer Quelle von humanen Zellen gewonnen, die mit primitiven Stammzellen angereichert ist. Geeignete humane Zellen schließen fötale Milz, Thymus- und Leberzellen, und Nadelschnurblut sowie auch adulte Hirn- und Knochenmarkszellen mit ein. Die humanen fötalen Zellen werden vorzugsweise an dem Tag der Schwangerschaft gewonnen, der vergleichbar ist zur Mitte der Trächtigkeit in Mäusen: Die Aminosäuresequenzen der humanen flk-Rezeptoren sowie deren kodierende Nukleinsäuresequenzen sind homolog zu den Aminosäure- und Nukleotidsequenzen der Mausrezeptoren.

In der vorliegenden Anmeldung wird die Sequenz eines ersten Proteins, wie z. B. eines Proteins oder eine Liganden, oder eines Nukleinsäuremoleküls, das das Protein kodiert, als homolog zu einem zweiten Protein oder einem Nukleinsäuremolekül angesehen, falls die Aminosäure oder die Nukleotidsequenz des ersten Proteins oder des Nukleinsäuremoleküls mindestens etwa 30% homolog, vorzugsweise mindestens 50% homolog, und am meisten bevorzugt mindestens etwa 65% homolog zu der entsprechenden Sequenz des zweiten Proteins oder des Nukleinsäuremoleküls ist. Im Falle von Proteinen, die eine hohe Homologie besitzen, ist die Aminosäure oder die Nukleotidsequenz des ersten Proteins oder des Nukleinsäuremoleküls mindestens etwa 75% homolog, vorzugsweise mindestens etwa 85% homolog und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95% homolog zu der Aminosäure oder der Nukleotidsequenz des zweiten Proteins oder des Nukleinsäuremoleküls.

Kombinationen aus Oligonukleotid-Paaren aus Maus werden als PCR-Primer verwendet, um das humane Homolog aus den Zellen zu amplifizieren, um Sequenzunterschiede zu bestimmen. Der Rest der Prozedur zur Bestimmung der humanen flk-Homologe ist ähnlich zu den Prozeduren, die oben für die Gewinnung der Maus flk-Rezeptoren beschrieben wurden. Die nicht ganz perfekte Homologie zwischen den humanen flk-Homologen und den Oligonukleotiden aus Maus wird bei der Bestimmung der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen mit in Betracht gezogen.

Assay zur Expression von Rezeptoren auf Stammzellen

Um die Expression von flk-1-Rezeptoren auf der Oberfläche von primitiven hematopoietischen Stammzellen zu demonstrieren, werden Antikörper generiert, die den Rezeptor erkennen. Der Rezeptor kann dabei das vollständige Protein, so wie es in der Natur vorkommt, oder ein antigenes Fragment des vollständige Proteins sein. Vorzugsweise umfasst das Fragment den vorhergesagten extrazellulären Anteil des Moleküls.

Antigene Fragmente können durch Verfahren aus dem Stand der Technik identifiziert werden. Fragmente, die antigene Sequenzen beinhalten, können auf der Basis von allgemein anerkannten Kriterien für potentielle Antigenizität und/oder Exposition ausgewählt werden. Solche Kriterien schließen die Hyrophilizität und den relativen antigenen Index mit ein, wie er durch die Analyse der Oberflächenexposition von Proteinen bestimmt wurde. Die Bestimmung von geeigneten Kriterien sind einem Fachmann bekannt und wurden z. B. beschrieben durch Hopp et al., in Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78, 3824–3828 (1981); Kyte et al., J. Mol. Biol. 157, 105–132 (1982); Emini, J. Virol. 55, 836-839 (1985); Jameson et al., CA BIOS 4, 181–186 (1988); und Karplus et al., Naturwissenschaften 72, 212–213 (1985). Aminosäuredomänen, von denen anhand dieser Kriterien vorhergesagt wurde, dass sie an der Oberfläche liegen, werden vorzugsweise gegenüber Domänen ausgewählt, von denen vorhergesagt wird, dass sie mehr hydrophob oder versteckt sind.

Die Proteine und Fragmente der als Antigene zu verwendenden Rezeptoren können durch Verfahren aus dem Stand der Technik hergestellt werden. Solche Verfahren schließen die Isolierung oder Synthese von DNA mit ein, die die Proteine und Fragmente kodieren, sowie die Verwendung der NDA zur Herstellung der oben beschriebenen rekombinanten Proteine.

Fragmente von Proteinen und DNA, die diese Fragmente kodieren, können chemisch durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, aus individuellen Aminosäuren und Nukleotiden synthetisiert werden. Geeignete Verfahren für die Synthese von Proteinfragmenten werden durch Stuart und Young in "Solid Phase Peptide Synthesis," Second Edition, Pierce Chemical Company (1984) beschrieben. Geeignete Verfahren zur Synthese von DNA-Fragmenten werden von Caruthers in Science 230, 281–285 (1985) beschrieben.

Falls das Rezeptorfragment ein Epitop definiert, dieses aber zu kurz ist, um antigen zu sein, kann es für die Herstellung von Antikörpern mit einem Trägermolekül verbunden werden. Einige geeignete Trägermoleküle schließen keyhole limpet hemocyanin, Ig-Sequenzen, TrpE und humanes oder bovines Serumalbumin mit ein. Die Konjugation kann durch Verfahren ausgeführt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Ein solches Verfahren ist die Kombinierung eines Cystein-Restes des Fragments mit einem Cystein-Rest des Trägermoleküls.

Die Antikörper sind vorzugsweise monoklonal. Monoklonale Antikörper können durch Verfahren hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Diese Verfahren schließen die immunologischen Verfahren mit ein, die beschrieben wurden durch Kohler und Milstein in Nature 256, 495–497 (1975) und Campbell in "Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" in Burdon et al., Hrsg., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985); wie auch durch die rekombinanten DNA-Verfahren, die durch Huse et al. in Science 246, 1275–1281 (1989) beschrieben wurden.

Polyklonale oder monoklonale Antiseren, von denen gezeigt wurde, dass sie mit Rezeptor kodierten nativen Proteinen reaktiv sind, z. B. mit flk-1 kodierten Proteinen, und auf der O-berfläche von lebensfähigen Zellen exprimiert werden, werden verwendet, um Antikörper positive Zellen zu isolieren. Ein Verfahren zur Isolierung solcher Zellen ist Durchflusszytometrie, siehe z. B. Loken et al., Europäische Patentanmeldung 317, 156. Die erhaltenen Zellen werden durch Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, in mit Hilfe von Wirten eingepflanzt, die mit Hilfe von Strahlung geschwächt wurden, und auf Stammzellen geprüft; siehe z. B. Joran et al., Cell 61, 953–963 (1990).

Kriterien für eine neue Stammzell Rezeptor Tyrosin Kinase, die in Stammzellen exprimiert wird

Zusätzliche neue cDNAs von Rezeptor Tyrosin Kinasen werden durch die Amplifikation von cDNAs aus Stammzellpopulationen durch die Verwendung von Oligonukleotiden als PCR-Primer gewonnen; siehe oben. Beispiele geeigneter Oligonukleotide sind PTK1 und PTK2, die durch Wilks et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1603–1607 (1989) beschrieben werden. Eine neue cDNA wird auf der Basis eines Screenings mittels differenzieller Hybridisierung mit Proben ausgewählt, die bekannte Kinasen repräsentieren. Nur die bei geringer Stringenz hybridisierenden cDNA-Klone werden ausgewählt und sequenziert. Die Anwesenheit des Aminosäure-Triplets DFG bestätigt, dass die Sequenzen eine Kinase darstellen. Der Erkennungsrest Methionin im WMAPES-Motiv ist Anzeichen für eine wie oben beschriebene Rezeptor ähnliche Kinase. Erhaltene potentiell neue Sequenzen werden mit verfügbaren Sequenzen durch die Verwendung von Datenbanken, wie Genbank, verglichen, um deren Einzigartigkeit zu bestätigen. Gen-spezifische Oligonukleotide werden wie oben beschrieben auf der Basis der erhaltenen Sequenzen hergestellt. Die Oligonukleotide werden verwendet, um mit Stammzellen angereicherte oder reduzierte Populationen auf Expression zu analysieren. Solche Zellpopulationen sind in Mäusen beschrieben, z. B. durch Jordon et al., in Cell 61, 953–956 (1990); Ikuta et al., in Cell 62, 863–864 (1990); Spangrude et al. in Science 241, 58–62 (1988); und Szilvassy et al., in Blood 74, 930–939 (1989). Beispiele solcher humaner Zellpopulationen werden als CD33CD34+ von Andrews et al. im Journal of Experimental Medicine 169, 1721–1731 (1989) beschrieben. Andere humane Stammzellpopulationen werden z. B. in Civin et al., Europäische Patentanmeldung 395,355 und in Loken et al., Europäische Patentanmeldung 317,156 beschrieben.

BEISPIELE Beispiel 1. Zellen enthaltend Maus flk-1 und flk-2 Liganden Murine stromale Zelllinie 2018

Um stromale Zelllinien zu etablieren werden fötale Leberzellen mit Hilfe von Collagen vereinzelt und in einer Mischung von Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) und 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum bei 37°C wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Standardverfahren immortalisiert. Ein geeignetes Verfahren schließt das Einschleusen von DNA, die eine wachstumsregulierende oder Oncogen-kodierende Sequenz kodiert, in eine Wirtszelle mit ein. Die DNA kann mit Hilfe der Transduktion in einen rekombinanten viralen Partikel oder durch Transfektion in einen Plasmid eingeschleust werden. Siehe z. B. Hammerschmidt et al., Nature 340, 393–397 (1989) und Abcouwer et al., Biotechnology 7, 939–946 (1989). Retroviren sind die bevorzugten viralen Vektoren, obwohl SV40 und Epstein-Barr-Virus ebenfalls als Donor für die das Wachstum verstärkenden Sequenzen dienen kann. Ein geeigneter Retrovirus ist der ecotrope Retrovirus, der ein temperatursensitives SV40 T-Antigen (tsA58) und ein G418 Resistenzgen beinhaltet, das von McKay in Cell 66, 713–729 (1991) beschrieben wurde. Nach mehreren Tagen bei 37°C wird die Temperatur des Mediums auf 32°C gesenkt. Die Zellen werden mit G418 (0,5 mg/ml) ausgewählt. Die ausgewählten Zellen werden expandiert und aufbewahrt.

Eine stromale Zelllinie aus Maus, die durch dieses Verfahren hergestellt wurde, wird 2018 genannt und wurde am 30. Oktober 1991 bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA (ATCC); Hinterlegungsnummer CRL 10907 hinterlegt.

Beispiel 2. Zellen die Liganden von humanem flk-1 und flk-2 enthalten

Humane fötale Leber (18, 20 und 33 Wochen nach Abbruch der Schwangerschaft), Milz (18 Wochen nach Abbruch der Schwangerschaft) oder Thymus (20 Wochen nach Abbruch der Schwangerschaft) wird zum Zeitpunkt des Abbruchs der Schwangerschaft entfernt und in einer ausgeglichenen Salzlösung aufbewahrt. Nach Zerkleinerung in 1 mm große Fragmente und Pressen durch ein Drahtnetz wird das Gewebe einmal in Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS) gewaschen.

Das zerrissene Gewebe wird bei 200 xg 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wird in 10–20 ml einer Trypsin-EDTA-Lösung in einer Reinheit für Gewebekulturen (Flow Laboratories) resuspendiert. Das resuspendierte Gewebe wird in einen sterilen Kolben überführt und mit einem Rührer bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gerührt. Zu einer finalen Konzentration von 10% wird 1 ml hitzeinaktiviertes fötales bovines Kälberserum (Hyclone) zugegeben, um die Trypsin-Aktivität zu inhibieren. Aus einer Stammlösung (10 mg/ml in HBSS) wird Collagenase Typ IV (Sigma) bis zu einer finalen Konzentration von 100 &mgr;g/ml zugegeben, um die stromalen Zellen zu zerreißen. Das Gewebe wird bei Raumtemperatur für weitere 2,5 Stunden gerührt; durch Zentrifugation (400 xg, 15 Minuten) gesammelt; und in "stromalem Medium" resuspendiert, das Iscove's Modifikation von DMEM beinhaltet, dem 10% hitzeinaktiviertes fötales Kalbsserum zugesetzt wird sowie 5% hitzeinaktiviertes humanes Serum (Sigma), 4 mM L-Glutamin, 1x Natriumpyruvat (100fache Stammlösung, Sigma), 1x nicht-essentielle Aminosäuren (100fache Stammlösung, Flow) und eine Mischung der Antibiotika Kanomycin, Neomycin, Penicillin, Streptomycin. Vor dem Resuspendieren des Pellets im stromalen Medium wird das Pellet einmal mit HBSS gewaschen. Es ist angemessen, die Zellen in 60 ml Medium zu suspendieren. Die Anzahl von Kulturen hängt von der Menge des Gewebes ab.

Beispiel 3. Isolierung stromaler Zellen

Resuspendierte Zellen (Beispiel 2), die bei 37°C mit 5% Kohlendioxid inkubiert werden, beginnen innerhalb von 10–48 Stunden an der Plastikplatte zu haften. Konfluente Monolayer-Schichten können innerhalb von 7–10 Tagen beobachtet werden, abhängig von der Anzahl der im anfänglichen Impfmaterial ausplattierten Zellen. Nicht-haftende und hochrefraktile Zellen, die an der Schicht aus stromalen Zellen als Kolonien haften, werden getrennt durch Pipettieren entfernt und eingefroren. Nicht-haftende Zellen sind wahrscheinlich Quellen für Populationen selbst erneuernder Stammzellen, die flk-2 enthalten. Die haftenden Schichten stromaler Zellen werden für zukünftige Studien in Aliquots eingefroren oder zum Wachstum in Kulturen expandiert.

Für die Bindung von APtag-flk-2 Fusionsprotein an fötalen Milzzellen wurde ein unerwartet hoher Wert beobachtet. Zwei fötale Milzzelllinien werden in "stromalem Medium" wachsen gelassen, welches in Beispiel 2 beschrieben wird.

Nicht-haftende fötale Stammzellen binden an die stromalen Zellen und bilden Kolonien (colony forming unit – CFU). Stromale Zellen und CFU werden durch die Verwendung von sterilen Glaszylindern isoliert und in Kultur expandiert. Ein Klon, Fsp 62891 genannt, enthält den flk-2 Liganden. Fsp 62891 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA am 21. November 1991 unter der Hinterlegungsnummer CRL 10935 hinterlegt.

Fötale Leber- und fötale Thymuszellen werden auf ähnliche Art präpariert. Jede dieser beiden Zelltypen produziert Liganden von flk-1 und, im Falle der Leber, etwas flk-2. Eine solche fötale Thymuszelllinie F.thy 62891 genannt, und eine solche Leberzelllinie, FL 62891 genannt, wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA am 21. November 1991 bzw. am 2. April 1992 unter den Hinterlegungsnummern CRL 10936 bzw. CRL 11005 hinterlegt.

Stabile humane Zelllinien werden aus fötalen Zellen mit dem gleichen temperatursensitiven immortalisierenden Virus hergestellt, der verwendet wurde, um die in Beispiel 1 beschriebene murine Zelllinie herzustellen.

Beispiel 4. Isolierung humaner stromaler Zellklone

Hoch refraktile Zellen überwachsen Flecken von stromalen Zellen, vermutlich, weil die stromalen Zelle Faktoren produzieren, die die Bildung der CFUs erlauben. Um stromale Zellklone zu isolieren, werden sterile Glaszylinder, die mit Vakuumschmiermittel beschichtet wurden, über den CFUs positioniert. Eine Trypsin-EDTA-Lösung (100 ml) wird zugegeben, um die Zellen abzulösen. Die Zellen werden zu 5 ml stromalen Mediums zugegeben und jeder (Klon) in einer einzelnen Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen ausplattiert.

Beispiel 5. Plasmid (APtag) zur Expression sekretierbarer alkalischer Phosphatase (SEAP)

Plasmide, die sekretierbare alkalische Phosphatase exprimieren, werden von Flanagan und Leder in Cell 63, 185–194 (1990) beschrieben. Die Plasmide enthalten einen Promotor, z.B. den LTR-Promotor; einen Polylinker, enthaltend HindIII und BglII; DNA, die SEAP kodiert; ein Poly-A-Signal; und ein Ampicillin-Resistenzgen, und eine Replikationsstelle.

Beispiel 6. Plasmid zur Expression von APtag-flk-2 und APtag-flk-1 Fusionsproteinen

Plasmide, die Fusionsproteine von SEAP und den extrazellulären Anteil von entweder flk-1 oder flk-2 exprimieren, werden in Übereinstimmung mit den Protokollen exprimiert, die von Flanagan und Leder in Cell 63, 185–194 (1990) und Berger et al., Gene 66, 1–10 (1988) beschrieben wurden. Kurz beschrieben wird ein HindIII-Bam HI-Fragment hergestellt, das den extrazellulären Anteil von flk-1 oder flk-2 enthält, und in die HindIII-BglII-Schnittstelle des in Beispiel 5 beschriebenen Plasmids insertiert.

Beispiel 7. Produktion von APtag-flk-1 oder -flk-2 Fusionsprotein

Die Plasmide aus Beispiel 6 können in COS-7-Zellen mittels DEAE-Dextran transfiziert (wie in Current Protocols in Molecular Biology, Unit 16.13, "Transient Expression of Proteins Using Cos Cells," 1991 beschrieben); und werden mit einem selektierbaren Marker, wie z.B. pSV7neo, in NIH/3T3-Zellen durch Kalzium-Präzipitation cotransfiziert. Die NIH/3T3-Zellen werden mit 600 &mgr;g/ml G418 in 100 mm Platten selektiert. Über 300 Klone werden auf die Sekretion plazentaler alkalischer Phosphatase-Aktivität gescreent. Der Assay wird durch Erhitzen eines Teils des Überstandes auf 65°C für 10 Minuten durchgeführt, um Phosphatase-Aktivität im Hintergrund zu inaktivieren, und durch die Messung des OD405 nach der Inkubation mit 1 M-Diethanolamin (pH 9,8), 0,5 mM MgCl2, 10 mM L-Homoarginin (ein Phosphatase-Inhibitor), 0,5 mg/ml BSA und 12 mM p-Nitrophenylphosphat. Humane plazentale alkaline Phosphatase wird verwendet, um eine Standardkurve zu erstellen. Die APtagflk-1-Klone (F-1AP21-4) produzieren bis zu 10 &mgr;g alkalischer Phosphatase-Aktivität/ml und die APtag-flk-2-Klone (F-2AP26-0) produzieren bis zu 0,5 &mgr;g alkalischer Phosphatase-Aktivität/ml.

Beispiel 8. Assay zur Bildung von APtag-flk-1- oder APtag-flk-2-Zellen

Die Bindung von APtag-flk-1 oder APtag-flk-2-Zellen, die den geeigneten Liganden enthalten, wird mit Hilfe von Standardverfahren geprüft. Siehe beispielsweise Flanagan und Leder, Cell 63: 185–194 (1990). Zellen (z. B. stromale Zellen aus Maus, humane fötale Leber-, Milz- oder Thymus-, oder verschiedene Kontrollzellen) läßt man bis zum Gleichgewicht in Platten mit 6 Vertiefungen wachsen wäscht sie mit HBHA ("Hank's balanced salt solution" mit 0,5 mg/ml BSA, 0,02% NaN3, 20 mM HEPES, pH 7,0). Die Überstände von transfizierten COS- oder NIH/3T3-Zellen, die entweder Aptaq-flk-1-Fusionsprotein, APtag-flk-2 Fusionsprotein, oder APtag ohne einen Rezeptor (als Kontrolle) enthalten, werden zu den Zell-Monolayer-Schichten zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Plattform inkubiert. Die Konzentration des Aptag-flk-1 Fusionsproteins, APtag-flk-2 Fusionsproteins, oder APtag ohne einen Rezeptor beträgt 60 ng/ml an alkalischer Phosphatase, was mittels der Standardkurve für alkalische Phosphatase bestimmt (siehe oben) wurde. Die Zellen werden dann siebenmal mit HBHA gewaschen und in 350 &mgr;l 1%iger Triton X-100TM, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) lysiert. Die Lysate werden in ein Mikrofugen-Röhrchen überführt, zusammen mit weiteren 150 &mgr;l Waschlösung mit der gleichen Lösung. Nach kräftigen Vortexen werden die Proben 5 Minuten in einer Mikrofuge zentrifugiert, bei 65°C für 12 Minuten erhitzt, um zelluläre Phosphatase zu inaktivieren und auf Phosphatase-Aktivität wie vorher beschrieben geprüft. Die Ergebnisse der Experimente, die entworfen wurden, um die Zeit und Dosis-Antworten der Bindung zwischen stromalen Zellen zu zeigen, die die Liganden für flk-2 und flk-1 (2018) und APtag-flk-2, APtag-flk-1 und APtag ohne Rezeptor (als Kontrolle) enthalten, werden in den 3 bzw.4 gezeigt.

Beispiel 8A. Plasmide zur Expression von flk1/fms und flk2/fms Fusionsproteinen

Plasmide, die Fusionsproteine des extrazellulären Anteils von entweder flk-1 oder flk-2 und den extrazellulären Anteil von c-fms (ebenfalls bekannt als Kolonie stimulierender Faktor-1 Rezeptor) exprimieren, werden in einer ähnlichen Art hergestellt, wie unter Beispiel 6 beschrieben, (Plasmide zur Expression von APtag-flk-2 und APtag-flk-1 Fusionsproteinen). Kurz gesagt, wird ein Hind III – Bam HI Fragment hergestellt, das den extrazellulären Anteil von flk1 oder flk2 enthält, und in die Hind III – Bgl II Schnittstelle eines pLH Expressionsvektors insertiert, der den intrazellulären Anteil von c-fms enthält.

Beispiel 8B. Expression von flk1/fms oder flk2/fms in 3T3-Zellen

Die Plasmide aus Beispiel 11 werden in NIH/3T3-Zellen mit Hilfe von Kalzium transfiziert. Der intrazelluläre Anteil von c-fms wird über Western Blot-Technik detektiert.

Beispiel 9. Klonierung und Expression einer cDNA, die für den Liganden für flk-1 und flk-2 Rezeptoren aus Maus kodiert

cDNA, die den Mausliganden für flk-1 und flk-2 exprimiert, wird über bekannte Verfahren hergestellt. Siehe z. B. Seed, B., und Aruffo, A. PNAS 84: 3365–3369 (1987); Simmons, D. und Seed, B. J. Immunol. 141:2797–2800; und D'Andrea, A. D., Lodish, H. F. und Wong, G. G. Cell 57:277–285 (1989).

Die Protokolle werden unten in Reihen aufgeführt: (a) RNA Isolation; (b) poly-A RNA Herstellung; (c) cDNA-Synthese; (d) cDNA-Größenfraktionierung; (e) Vermehrung der Plasmide (Vektor); (f) Isolierung von Plasmid DNA; (g) Herstellung des Vektors pSV SportTM (BRL Gibco) zur Klonierung; (h) Kompilierung von Puffern für die oben genannten Schritte; (i) Transfektion von cDNA, die Liganden in COS 7-Zellen kodiert; (j) Panning-Prozedur; (k) Expressionsklonierung von flk-1 oder flk-2 Liganden durch Etablierung einer autokrinen Schleife.

9a. Guanidinthiocyanat/LiCl-Protokoll zur RNA Isolation

Für jeden ml der gewünschten Mischung werden 0,5 g Guanidinthiocyanat (GuSCN) in 0,55 ml 25%igem LiCl gelöst (die Stammlösung wird durch einen 0,45 mikron Filter filtriert). 20 &mgr;l Mercaptoethanol wird zugesetzt. (Die erhaltene Lösung hält sich nicht länger als eine Woche bei Raumtemperatur.)

Die 2018 stromalen Zellen werden zentrifugiert, und 1 ml der oben beschriebenen Lösung wird bis zu einer Menge von 5 × 107 Zellen angereichert. Mit Hilfe eines Polytrons werden die Zellen aufgetrennt, bis die Mischung nicht mehr viskos ist. Für Präparationen in kleinem Maßstab (<108 Zellen) wird die aufgetrennte Mischung auf 1,5 ml eine 5,7 M CsCl-Lösung geschichtet (RNase frei; 1,26 g CsCl wird zu jedem ml einer 10 mM EDTA-Lösung (pH 8) zugesetzt) und, falls notwendig, mit RNase-freiem Wasser überschichtet. Die Mischung wird in einem SW55-Rotor bei 50 krpm für 2 Stunden zentrifugiert. Bei Präparationen in großem Maßstab werden 25 ml der Mischung auf 12 ml CsCl in einem SW28-Röhrchen geschichtet, wie oben überschichtet und bei 24 krpm für 8 Stunden zentrifugiert. Der Inhalt des Röhrchens wird vorsichtig mit einer sterilen Pasteur-Pipette abgesaugt, die mit einer Vakuumflasche verbunden ist. Ist das CsCl-Interface passiert, wird mit der Pipettenspitze ein Band rund um das Röhrchen gekratzt, um einem Kriechen der Schicht an der Wand des Röhrchens hinunter vorzubeugen. Die verbleibende CsCl-Lösung wird abgesaugt. Das verbleibende Pellet wird in Wasser aufgenommen aber nicht wieder aufgelöst. 1/10 Volumen an Natriumazetat und drei Volumina an Ethanol werden zur Mischung zugesetzt und zentrifugiert. Das Pellet wird, falls notwendig, in Wasser bei 70°C resuspendiert. Die Konzentration der RNA wird auf 1 mg/ml eingestellt und eingefroren.

Es sollte festgehalten werden, dass kleine RNA-Moleküle (z. B. 5S) nicht ausfallen. Für kleinere Mengen an Zellen werden die Volumina verkleinert und die Mischung wird mit GuSCN in RNase-freiem Wasser auf einem Gradienten überschichtet (eine Präzipitierung ist nicht effizient, falls die RNA verdünnt vorliegt).

9b. Poly-A RNA Herstellung (Alle erwähnten Puffer werden unten getrennt aufgeführt)

Eine Einwegsäule aus Polypropylen wird durch Waschen mit 5M NaOH und anschließendem Spülen mit RNase-freiem Wasser präpariert. Für jedes Milligramm an gesamter RNA werden ungefähr 0,3 ml (endgültiges gepacktes Bett) an Oligo dT Zellulose zugesetzt. Die Oligo dT Zellulose wird durch Resuspendieren von ungefähr 0,5 ml trockenem Pulver in 1 ml einer 0,1 M NaOH-Lösung hergestellt und in die Säule transferiert, oder durch Filtrieren einer 0,1 M NaOH-Lösung durch eine kürzlich verwendete Säule. Die Säule wird mit verschiedenen Säulenvolumina an RNase-freiem Wasser gewaschen, bis der pH-Wert neutral ist, und mit 2–3 ml des Auftragpuffers gespült. Das Säulenbett wird in ein steriles 15 ml Röhrchen durch die Verwendung von 4–6 ml an Ladungspuffer überführt.

Die gesamte RNA der 2018 Zelllinie wird für 2–3 Minuten auf 70°C erhitzt. LiCl wird aus der RNase-freien Stammlösung bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,5 M zur Mischung zugesetzt. Die Mischung wird im 15 ml-Röhrchen mit Oligo-dT-Zellulose kombiniert, die für 10 Minuten gevortexed oder geschüttelt wird. Die Mischung wird in die Säule gegossen und mit 3 ml Ladungspuffer gewaschen, und anschließend mit 3 ml mittlerem Waschpuffers. Die mRNA wird direkt in ein SW55-Röhrchen mit 1,5 ml einer Lösung von 2 mM EDTA und 0,1% SDS eluiert, wobei die ersten zwei oder drei Tropfen verworfen werden.

Die eluierte mRNA wird durch Zusetzen 1/10 Volumen einer 3M-Natriumazetatlösung und Auffüllen des Röhrchens mit Ethanol präzipitiert. Der Inhalt des Röhrchens wird gemischt, für 30 Minuten bei 20°C gekühlt und bei 50 krpm bei 5°C für 30 Minuten zentrifugiert. Nach Dekantierung des Ethanols und Lufttrocknen des Röhrchens wird das mRNA-Pellet in 50-100 &mgr;l an RNase-freiem Wasser resuspendiert. 5 &mgr;l der resuspendierten mRNA wird auf 70°C in MOPS/EDTA/Formaldehyd erhitzt und auf einem RNase-freien 1 %igen Agarosegel untersucht.

9c. cDNA-Synthese

Das verwendete Verfahren ist eine Variation des durch Gubler und Hoffman beschriebenen Verfahrens in Gene 25, 263–270 (1983)

1. Erster Strang

4 &mgr;g an mRNA wird in ein Mikrofugen-Röhrchen gegeben, auf etwa 100°C für 30 Sekunden erhitzt, und auf Eis abschreckt. Das Volumen wird auf 70 &mgr;l mit RNase-freiem Wasser eingestellt. 20 &mgr;l an RT1-Puffer, 2 &mgr;l an RNase-Inhibitor (Boehringer 36 u/&mgr;l), 1 &mgr;l an 5 &mgr;g/&mgr;l Oligo dT (Collaborative Research), 2,5 &mgr;l an 20 mM dXTP's (ultrapure – US Biochemicals), 1 &mgr;l an 1 M DTT und &mgr;l an RT-XL (Life Sciences, 24 &mgr;/&mgr;l) werden zugesetzt. Die Mischung wird bei 42°C für 40 Minuten inkubiert, und durch Erhitzen bei 70°C für 10 Minuten inaktiviert.

2. Zweiter Strang

320 &mgr;l an RNase-freiem Wasser, 80 &mgr;l an RT2-Puffer, 5 &mgr;l an DNA Polymerase I (Boehringer, 5 &mgr;/&mgr;l), 2 &mgr;l RNase H (BRL 2 &mgr;/&mgr;l) werden zur Lösung zugesetzt, die den ersten Strang enthält. Die Lösung wird bei 15°C für eine Stunde inkubiert und bei 22°C für eine weitere Stunde. Nach Zugabe von 20 &mgr;l einer Lösung von 0,5 M EDTA, pH 8,0, wird die Lösung mit Phenol extrahiert und durch die Zugabe von NaCl zu 0,5 M linearem Polyacrylamid (Träger) bis zu einem Wert von 20 &mgr;g/ml und Auffüllen des Röhrchens mit EtOH präzipitiert. Das Röhrchen wird für 2–3 Minuten in einer Mikrofuge zentrifugiert, gevortexed, um präzipitiertes Material von der Röhrchenwand zu entfernen, und für eine weitere Minute zentrifugiert.

3. Adaptoren

Adaptoren stellen spezifische Restriktionsschnittstellen zur Verfügung, um die Klonierung zu erleichtern und sind von BRL Gibco, New England Biolabs, etc. erhältlich. Die rohen Adaptoren werden bei einer Konzentration von 1 &mgr;g/&mgr;l resuspendiert. MgSO4 wird bis zu einer finalen Konzentration von 10 mM zugegeben, gefolgt von einer 5fachen Volumeneinheit an EtOH. Das resultierende Präzipitat wird mit 70° EtOH gespült und in TE bei einer Konzentration von 1 &mgr;g/&mgr;l resuspendiert. Zu der Kinase werden 25 &mgr;l an resuspendierten Adaptoren zu 3 &mgr;l 10X Kinase-Puffer und 20 Einheiten an Kinase zugegeben. Die Mischung wird bei 37°C über Nacht inkubiert. Die präzipitierte cDNA wird in 240 &mgr;l TE (10/1) resuspendiert. Nach Zugabe von 30 &mgr;l eines 10X Niedrigsalz-Puffers, 30 ml eines 10X Ligations-Puffers mit 0,1 mM ATP, 3 &mgr;l (2,4 &mgr;g) an kinasierter 12-mer Adaptersequenz, 2 &mgr;l (1,6 &mgr;g) an kinasierter 8-mer Adaptersequenz, und 1 &mgr;l an T4 DNA Ligase (BioLabs, 400 &mgr;/&mgr;l oder Boehringer, 1 Weiss'sche Einheit ml), die Mischung wird bei 15°C über Nacht inkubiert. Die cDNA wird mit Phenol extrahiert und wie oben beschrieben präzipitiert, mit der Ausnahme, dass der zusätzliche Träger ausgelassen wird, und in 100 &mgr;l an TE resuspendiert.

9d cDNA-Größenfraktionierung

Eine Lösung mit 20% KOAc, 2 mM EDTA, 1 &mgr;g/ml Ethidiumbromid-Lösung und eine Lösung aus 5% KOAc, 2 mM EDTA, 1 &mgr;g/ml Ethidiumbromid-Lösung werden hergestellt. 2,6 ml der 20%igen KOAc-Lösung werden zur hinteren Kammer eines kleinen Gradientenerzeugers zugegeben. Luftblasen werden dadurch vom Röhrchen entfernt, das die beiden Kammern miteinander verbindet, dass man die 20%ige Lösung in die vordere Kammer fließen lässt und die Lösung durch Kippen des Gradientenerzeugers zwingt, in die hintere Kammer zurückzufließen. Der Durchgang zwischen den Kammern wird geschlossen und 2,5 ml einer 5%igen Lösung wird in die vordere Kammer zugegeben. Jegliche Flüssigkeit im Röhrensystem von einem vorherigen Lauf wird dadurch entfernt, dass man die 5%ige Lösung zum Ende des Röhrensystems und dann in seine Kammer zurückkehren lässt. Der Apparat wird auf einen Rührer gestellt und, bei schnellem Rühren, werden der obere Hahn, der die beiden Kammern verbindet und der vordere Stopphahn geöffnet. Ein Polyallomer 5W55-Röhrchen wird von Grund an mit der KOAc-Lösung gefüllt. Der Gradient wird mit 100 &mgr;l einer cDNA-Lösung überschichtet und für 3 Stunden bei 50 k rpm bei 22°C zentrifugiert. Um Fraktionen des Gradienten zu sammeln, wird das SW55-Röhrchen nahe am Boden des Röhrchens mit einem Butterfly-Infusionsset durchbohrt (mit entferntem Luer-Rädchen). Drei 0,5 ml-Fraktionen und anschließend sechs 0,25 ml-Fraktionen werden in einem Mikrofugen-Röhrchen gesammelt (ungefähr 22, bzw. 11 Tropfen). Die Fraktionen werden durch Zugabe linearen Polyacrylamids auf 20 &mgr;g/ml und durch das Auffüllen des Röhrchens mit Ethanol bis zur Spitze präzipitiert. Die Röhrchen werden gekühlt, in einer Mikrofuge für 3 Minuten zentrifugiert, gevortexed und wiederum für 1 Minute zentrifugiert. Die erhaltenen Pellets werden mit 70% Ethanol gespült und wiederum zentrifugiert, wobei darauf geachtet wird, die Pellets nicht bis zur Vollständigkeit austrocknen zu lassen. Jede 0,25 ml Fraktion wird in 10 &mgr;l TE resuspendiert und 1 &mgr;l wird auf einem 1 %igen Agarose-Minigel analysiert. Die ersten drei und die letzten sechs Fraktionen, die kein Material enthalten, das kleiner als 1 kb ist, werden gesammelt.

9e. Vermehrung der Plasmide

SupF-Plasmide werden in nicht-supprimierenden bakteriellen Wirtszellen selektiert, die ein zweites Plasmid enthalten, p3, das Amber-mutiertes Ampicillin und Resistentelemente des Wirkstoffs Tetracyclin enthält. Siehe Seed, Nucleid Acids Res., 11, 2427–2445 (1983). Das p3-Plasmid ist von RP1 abgeleitet, ist 57 kb lang, und ist ein stabil erhaltenes, in einer einzelnen Kopie vorliegendes Episom. Die Ampicillin-Resistenz dieses Plasmids kehrt sich bei einer hohen Rate um, so dass Amp-Plasmide gewöhnlich nicht in p3-enthaltenden Stämmen eingesetzt werden können. Die Selektion auf Tetracyclin-Resistenz allein ist beinahe genau so gut wie die Selektion auf Ampicillin-Tetracylin-Resistenz. Wie auch immer, spontanes Erscheinen von Mutationen chromosomaler Suppressor tRNA stellt einen unvermeidbaren Hintergrund in diesem System dar (Häufigkeit bei etwa 10–9). Kolonien, die aus spontanen Suppressormutationen entstehen, sind gewöhnlich größer als Kolonien, die von Plasmidtransformationen ausgehend entstehen. Suppressorplasmide werden in Luria Broth (LB) Medium selektiert, das 12,5 &mgr;g/ml Ampicillin und 7,5 &mgr;g/ml Tetracyclin enthält. Für Plasmidpräparationen in vergrößertem Maßstab wird M9 Casamino-Aminosäure-Medium, welches Glycerol (0,8%) enthält, als Kohlenstoffquelle bereit gestellt. Die Bakterien wachsen bis zur Sättigung.

Alternativ wird pSV SportTM (BRL, Gaithersberg, Maryland) verwendet, um von SV40 abgeleitete Sequenzen zur Replikation, Transkription, Initiierung und Terminierung in COS 7-Zellen bereit zu stellen, sowie solche Sequenzen, die zur Replikation und Ampicillin-Resistenz in E. coli notwendig sind.

9f. Isolation des Vektors DNA/Plasmid

Ein Liter an gesättigten bakteriellen Zellen wird in J6-Flaschen bei 4,2k rpm für 25 Minuten abzentrifugiert. Die Zellen werden in 40 ml 10 mM EDTA, pH 8 resuspendiert. 80 ml 0,2M NaOH und 1 % SDS werden zugegeben und die Mischung wird verwirbelt bis sie klar und viskos ist. 40 ml 5M KOAc, pH 4,7 (2,5M KOAc, 2,5M HOAc) werden zugegeben, und die Mischung wird mäßig stark geschüttelt, bis die Größe der Klumpen ungefähr 2–3 mm beträgt. Die Flasche wird bei 4,2k rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird durch ein Käsetuch in eine 250 ml-Flaschen gegossen, welche dann mit Isopropylalkohol aufgefüllt und bei 4,2 k rpm für 5 Minuten zentrifugiert wird. Die Flasche wird sanft entwässert und mit 70%igem Ethanol gespült, wobei darauf geachtet wird, dass das Pellet nicht zerteilt wird. Nach Umdrehen der Flasche und Entfernung der Spuren an Ethanol wird die Mischung in 3,5 ml Tris-Base/EDTA (20 mM/10 mM) resuspendiert. 3,5 ml an resuspendiertem Pellet und 0,75 ml an 10 mg/ml Ethidiumbromid werden zu 4,5 g CsCl zugesetzt. VTi80-Röhrchen werden mit der Lösung gefüllt und für mindestens 2,5 Stunden bei 80k rpm zentrifugiert. Die Banden werden bei sichtbarem Licht mit einer 1 ml Spritze und einer Nadel mit 20er-Nadelgröße oder kleineren Nadeln extrahiert. Die Spitze des Röhrchens wird mit einer Schere abgeschnitten und die Nadel wird aufwärts in das Röhrchen mit einem Winkel von etwa 30 Grad in Bezug auf das Röhrchen bei einer Position von etwa 3 mm neben der Bande eingeführt, wobei die Nadel aufwärts gerichtet ist. Nachdem die Bande entfernt ist, wird der Inhalt des Röhrchens in Bleiche gegeben. Die extrahierte Bande wird in einem 13 ml-Sarstedt-Röhrchen gelagert, das danach bis zur Spitze mit n-Butanol aufgefüllt wird, das mit 1 M NaCl Extrakt gesättigt ist. Falls die Menge an DNA groß ist, kann die Extraktionsprozedur wiederholt werden. Nach Absaugen des Ethanols in eine Falle, die 5M NaOH enthält um Ethidium zu zerstören, wird ein etwa gleiches Volumen an 1 M-Ammoniumazetat und ungefähr zwei Volumina an 95%igem Ethanol zur DNA zugegeben, die dann bei 10k rpm für 5 Minuten zentrifugiert wird. Das Pellet wird vorsichtig mit 70% Ethanol gespült und mit einem Tupfer oder Gefriertrockner getrocknet.

9g. Herstellung eines Vektors zur Klonierung

20 &mgr;g des Vektors werden in einer 200 &mgr;l Reaktion mit 100 Einheiten an BstXl (New York Biolabs) bei 50°C über Nacht in einem gut thermostatisierten, zirkulierenden Wasserbad geschnitten. Kaliumazetat-Lösungen (5 und 20%) werden im 5W55-Röhrchen wie oben beschrieben hergestellt. 100 &mgr;l des verdauten Vektors werden zu jedem Röhrchen zugegeben und für 3 Stunden bei 50k rpm und bei 22°C zentrifugiert. Unter 300 nm UV-Licht wird beobachtet, dass die gewünschte Bande bei 2/3 der Länge des Röhrchens wandert. Ein Ausschweifen der Bande nach vorne deutet eine Überladung des Gradienten an. Die Bande wird mit einer 1 ml-Spritze entfernt, an die Nadel mit 20-er Nadelgröße befestigt ist. Nach Zugabe linearem Polyacrylamids und Präzipitieren des Plasmids durch Zugabe von drei Volumeneinheiten an Ethanol wird das Plasmid in 50 &mgr;l TE resuspendiert. Probeligationen werden mit einer konstanten Menge an Vektor und steigenden Mengen an cDNA durchgeführt. Ligationen in großem Maßstab werden auf der Basis dieser Versuchslegationen durchgeführt. Gewöhnlich wird für die gesamte cDNA-Präparation 1–2 &mgr;g an geschnittenem Vektor benötigt. 9h. Puffer Ladepuffer: 0.5M LiCl; 10 mM Tris pH 7,5; 1 mM EDTA; 0.1% SDS. Mittlerer Waschpuffer: 0.15M LiCl; 10 mM Tris pH 7,5; 1 mM EDTA; 0.1% SDS. RT1-Puffer: 0.25M Tris pH 8,8 (8,2 at 42); 0.25M KCl; 30 mM MgCl2. RT2-Puffer: 0.1 M Tris pH 7,5; 25 mM MgCl2; 5M KCl; 0.25 mg/ml BSA; 50 mM Dithiothreitol (DTT). 10X Niedrigsalz: 60 mM Tris pH 7,5; 60 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 2,5 mg/ml BSA; 70 mM DME. 10X Ligationszusätze: 1 mM ATP; 20 mM DTT; 1 mg/ml BSA 10 mM Spermidin. 10X Kinasierungs-Puffer: 0.5M Tris pH 7,5; 10 mM ATP; 20 mM DTT; 10 mM Spermidin; 1 mg/ml BSA 100 mM MgCl2.

9i. Transfektion von cDNA, die Liganden in COS 7-Zellen kodiert

COS 7-Zellen werden 1:5 auf 100 mm-Platten in Dulbecco's modifizierten Eagles-Medium (DME)/10% fötalem Kälberserum (FCC) aufgeteilt und über Nacht wachsen gelassen. 3 ml Tris/DME (0,039M Tris, pH 7,4 in DME), die 400 &mgr;g/ml DEAE-Dextran enthalten (Sigma, D-9885) wird für jede 100 mm-Platte an zu transfizierenden COS 7-Zelle hergestellt. 10 &mgr;g der Plasmid-DNA-Präparation werden pro Platte dazugegeben. Das Medium wird von den COS 7-Zellen entfernt und die DNA/DEAE-Dextranmischung wird zugegeben. Die Zellen werden für 4,5 Stunden inkubiert. Das Medium wird von den Zellen entfernt und durch 3 ml DME ersetzt, das 2% fötales Kälberserum (FCS) und 0,1 mM Chloroquin enthält. Die Zellen werden für 1 Stunde inkubiert. Nach Entfernen des Chloroquins und Ersetzen mit 1,5 ml 20% Glycerol in PBS, werden die Zellen bei Raumtemperatur für 1 Minute stehen gelassen. 3 ml Tris/DME werden zugegeben und die Mischung wird abgesaugt und zweimal mit Tris/DME gewaschen. 10 DME/10% FCS werden zugegeben und die Mischung wird über Nacht inkubiert. Die transfizierten COS 7-Zellen werden 1:2 auf frische 100 mm-Platten (DME)/10% FCS aufgeteilt und wachsen gelassen.

9i. Panning-Prozedur für COS 7-Zellen, die einen Liganden exprimieren 1) Antikörper beschichtete Platten:

Bakteriologische 100 mm-Platten werden für 1,5 Stunden mit anti-humaner plazentaler alkalischer Phosphatase aus Kaninchen (Dako, Kalifornien) beschichtet, die 1:500 in 10 ml 50 mM Tris.HCl, pH 9,5 verdünnt ist. Die Platten werden dreimal mit 0,15 M NaCl gewaschen und mit 3 mg BSA/ml PBS über Nacht inkubiert. Die Blockerlösung wird abgesaugt und die Platten werden sofort verwendet oder zur späteren Verwendung eingefroren.

2) Panning-Zellen

Das Medium der transfizierten COS 7-Zellen wird abgesaugt und 3 ml PBS/0,5 mM ED-TA/0,02% Natriumazid werden zugegeben. Die Platten werden bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, um die Zellen abzulösen. Die Zellen werden kräftig mit einer Pasteur-Pipette zerrieben und in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt. Die Platte wird mit weiteren 2 ml PBS/EDTA/Azid-Lösung gewaschen, die dann zum Zentrifugenröhrchen hinzugegeben wird. Nach Zentrifugieren bei 200 xg für 5 Minuten werden die Zellen in 3 ml Aptaq-flk-1 (F-1AP21-4) oder flk-2 (F-2AP26-0) Überstand von transfizierten NIH/3T3-Zellen (siehe Beispiel 7.) resuspendiert, und für 1,5 Stunden auf Eis inkubiert. Die Zellen werden wiederum bei 200 xg für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und die Zellen werden in 3 ml PBS/EDTA/Azid-Lösung resuspendiert. Die Zellsuspension wird vorsichtig auf 3 ml PBS/EDTA/Azid/2% Ficoll geschichtet und bei 200 xg für 4 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und die Zellen werden in 0,5 ml PB/EDTA/Azid-Lösung resuspendiert. Die Zellen werden zu den mit Antikörper beschichteten Platten, die 4 ml PBS/EDTA/Azid/5% FBS enthalten, zugegeben und bei Raumtemperatur 1 bis 3 Stunden stehen gelassen. Nicht-haftende Zellen werden durch zweimaliges oder dreimaliges sanftes Waschen mit 3 ml PBS/5% FBS entfernt.

3) Hirt'scher Überstand

0,4 ml 0,6%iges SDS und 10 mM EDTA werden zu den gepannten Platten gegeben, die 20 Minuten stehen gelassen werden. Die viskose Mischung wird mit Hilfe einer Pipette in ein Mikrofugenröhrchen gegeben. 0,1 ml 5M NaCl wird zum Röhrchen zugegeben, gemischt und auf Eis für mindestens 5 Stunden abgekühlt. Das Röhrchen wird für 4 Minuten zentrifugiert, und der Überstand vorsichtig entfernt. Der Inhalt des Röhrchens wird mit Phenol einmal extrahiert, oder zweimal, wenn das erste Interface nicht sauber ist. 10 mg linearen Polyacrylamids (oder ein anderer Träger) wird zugegeben und das Röhrchen wird bis zur Spitze mit Ethanol aufgefüllt. Das erhaltene Präzipitat wird in 0,1 ml Wasser oder TE resuspendiert. Nach Zugabe von 3 Volumina an EtOH/NaOAc, werden die Zellen wieder präzipitiert und in 0,1 ml Wasser oder TE resuspendiert. Die dadurch enthaltene cDNA wird in jeglichen geeigneten E. coli Wirt mit Hilfe der Elektroporation transfiziert. Geeignete Wirtszellen werden in verschiedenen Katalogen beschrieben und schließen MC1061/p3 oder Electromax DH10B-Zellen von BRL-Gibco mit ein. Die cDNA wird durch konventionelle Verfahren extrahiert.

Die oben aufgeführte Panning-Prozedur wird so lange wiederholt bis ein reiner E. coli Klon erhalten wird, der die cDNA als ein einziges rekombinantes Plasmid beinhaltet, und fähig ist, Säugetierzellen zu transfizieren und einen positiven Panning-Assay zu erzielen. Normal sind drei Wiederholungen ausreichend.

9k. Expressionsklonierung von flk-1 oder flk-2 Liganden durch Etablierung einer autokrinen Schleife

Zellen die flk1/fms oder flk2/fms exprimieren (Beispiel 10) werden mit 20–30 &mgr;g einer cDNA-Bibliothek von entweder flk1 Liganden oder flk2 Liganden exprimierenden stromalen Zellen transfiziert. Die cDNA-Bibliothek wird wie oben beschrieben hergestellt (a-h). Die Zellen werden mit 1 &mgr;g pLTR neo cDNA kotransfiziert. Anschließend an auf die Transfektion werden die Zellen 1:2 übergeimpft und in 800 &mgr;g/ml an G418 in Dulbecco's Medium (DME) kultiviert, das mit 10% CS ergänzt ist. Ungefähr 12 Tage später werden die Zellkolonien übergeimpft und auf Platten ausplattiert, die mit Poly-D-Lysin (1 mg/ml) und humanem Fibronectin (15 &mgr;g/ml) beschichtet sind. Das Kulturmedium wird als Serum-freies Medium definiert, welches eine Mischung (3:1) aus DME und Ham's F12 Medium ist. Die Zusätze zum Medium sind 8 mM NaHCO3, 15 mM HEPES pH 7,4, 3 mM Histidin, 4 &mgr;M MnCl2, 10 &mgr;M Ethanolamin, 0,1 &mgr;M Selensäure, 2 &mgr;M Hydrocortison, 5 &mgr;g/ml Transferrin, 500 &mgr;g/ml bovines Serum Albumin/Linolensäurekomplex, und 20 &mgr;g/ml Insulin (Ref. Zhan, X, et al. Oncogene 1: 369–376 (1987)). Die Kulturen werden am nächsten Tag wieder gefüttert und jeden dritten Tag, bis ausschließlich die Zellen verbleiben, die fähig sind, unter den definierten Kulturbedingungen zu wachsen. Die verbleibenden Zellkolonien werden expandiert und auf die Gegenwart des Liganden durch einen Assay zur Bindung von APtag-flk1 oder APtag-flk2 an die Zellen getestet (wie in Beispiel 8 beschrieben). Die DNA würde aus den Zellen gewonnen werden, die die Anwesenheit von flk1 oder flk2 und der Sequenz zeigen.

Beispiel 10. Expression der Liganden cDNA

Die cDNA wird sequenziert und in einer geeigneten Wirtszelle, wie z. B. einer Säugetierzelle, vorzugsweise COS-, CHO- oder NIH/3T3-Zellen exprimiert. Die Anwesenheit des Liganden wird dadurch bestätigt, dass die Bindung des Liganden an APtag-flk2 Fusionsprotein (siehe oben) gezeigt wird.

Beispiel 11. Chemisches Crosslinking von Rezeptor und Ligand

Crosslinking-Experimente werden an intakten Zellen unter Verwendung einer Modifikation des Verfahrens durchgeführt, das bei Blume-Jensen et al., EMBO J., 10, 4121–4128 (1991) beschrieben wurde. Die Zellen werden in 100 mm Gewebekulturplatten bis zur Subkonfluenz kultiviert und einmal mit PBS-0,1% BSA gewaschen.

Um chemisches Crosslinking des löslichen Rezeptors an den membrangebundenen Liganden zu untersuchen, werden stromale Zellen der 2018 stromalen Zelllinie mit konditioniertem Medium (CM) von transfizierten 3T3-Zellen inkubiert, die den löslichen Rezeptor Flk2-APtag exprimieren. Crosslinking-Studien von löslichen Liganden an den membrangebundenen Rezeptor werden durch Inkubieren von konditioniertem Medium aus 2018 Zellen mit transfizierten 3T3-Zellen durchgeführt, die ein Flk2-fms-Funsionskonstrukt exprimieren.

Die Bindung wird für 2 Stunden entweder bei Raumtemperatur mit CM, das 0,02% Natriumazid enthält, um einer Rezeptorinternalisierung vorzubeugen, oder bei 4°C mit CM (und Puffern) ergänzt mit Natriumvanadat, um eine Rezeptordephosphorylierung vorzubeugen. Die Zellen werden zweimal mit PBS-0,1% BSA und viermal mit PBS gestoppt.

Crosslinking wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur in PBS durchgeführt, das 250 mM Disuccinimidyl-Suberat (DSS; Pierce) enthält. Die Reaktion wird mit Tris-HCL, pH 7,4 auf eine finale Konzentration von 50 mM gequenscht.

Die Zellen werden in Puffern, die die Löslichkeit erhöhen gelöst: 0,5% Triton-X100TM, 0,5% Deoxycholinsäure, 20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM PMFS, 50 mg/ml Aprotinin, 2 mg/ml Bestatin, 2 mg/ml Pepstatin und 10 mg/ml Leupeptin. Die lysierten Zellen werden umgehend in 1,5 ml Nalgen-Röhrchen überführt und durch Rollen von Anfang bis Ende für 45 Minuten bei 4°C gelöst. Die Lysate werden dann in einer Mikrofuge bei 14000 g für 10 Minuten zentrifugiert. Die gelösten gecrosslinkten Rezeptorkomplexe werden dann aus den Lysaten durch Inkubieren der Überstände mit 10%iger (v/v) Lectin-SepharoseTM 6MB Beads aus Weizenkeimen (Pharmacia) bei 4°C für 2 Stunden oder über Nacht gewonnen.

Die Beads werden einmal mit Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) gewaschen und in 2X SDS-Polyacrylamid nicht-reduzierendem Probenpuffer resuspendiert. Die gebundenen Komplexe werden von den Beads durch 5-minütiges Erhitzen bei 95°C eluiert. Die Proben werden auf 4–12%igen Gradientengelen (NOVEX) unter nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen (0,35 M 2-Mercaptoethanol) analysiert und anschließend auf PVDF-Membrane für 2 Stunden durch die Verwendung einer Novex-Blotting-Apparatur überführt. Die Blotts werden in TBS-3% BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt, gefolgt von einer Inkubation mit einem geeigneten Antikörper.

Gecrosslinkte Flk2-APtag- und Flk2-fms-Rezeptoren werden durch die Verwendung polyklonaler Antikörper aus Kaninchen detektiert, die gegen humane alkalische Phosphatase bzw. fms-Protein eingesetzt werden. Der Kern des Verfahrens wird gemäß den im ABC-Kit (Pierce) angegebenen Instruktionen ausgeführt. Der Kit basiert auf der Verwendung eines biotinylierten sekundären Antikörpers und eines Avidin-biotinylierten Meerrettich-Peroxidasekomplexes zur Detektion.

ZUSÄTZLICHE AUSFÜHRUNGSMÖGLICHKEITEN

Die Erfindungbefindet sich, so wie beansprucht, in Übereinstimmung mit der oben aufgeführten Beschreibung und den leicht verfügbaren Referenzen und Startmaterialien. Nichts desto weniger haben die Anmelder die unten aufgeführten Zelllinien bei der American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA (ATCC) hinterlegt:

2018, ATCC Hinterlegungsnummer CRL 10907, am 30. Oktober 1991 hinterlegt.

Fsp 62891, ATCC Hinterlegungsnummer CRL 10935, am 21. November 1991 hinterlegt.

F.thy 62891, ATCC Hinterlegungsnummer CRL 10936, am 21. November 1991 hinterlegt.

FL 62891, ATCC Hinterlegungsnummer CRL 11005, am 2. April 1992 hinterlegt.

Diese Hinterlegungen wurden unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages zur internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren und den darunter fallenden Regelungen gemacht (Budapester Vertrag). Diese sichern die Erhaltung einer lebenden Kultur für 30 Jahre zu, ausgehend vom Datum der Hinterlegung. Die Organismen werden von ATCC gemäß den Fristen des Budapester Vertrages verfügbar gemacht und unterliegen einer Übereinkunft zwischen den Anmeldern und der ATCC, welche die uneingeschränkte Verfügbarkeit nach Veröffentlichung des zugehörigen US-Patents gewährleistet.. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Stämme ist nicht als eine Lizenz gedacht, um die Erfindung in Zuwiderhandlung der unter der Autorität einer jeden Regierung im Zusammenhang mit diesen Patentrechten erteilten Rechten zu praktizieren.

SEQUENZPROTOKOLL


Anspruch[de]
Rezeptor Protein Tyrosin-Kinase mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus

(i) der Sequenz, gezeigt in 2,

(ii) funktionalen Äquivalenten der Sequenz, dargestellt in 2, wobei weniger als 25% der Anzahl von Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz von 2 substituiert, addiert oder deletiert sind, und

(iii) Fragmenten von irgendwelchen der oben genannten Sequenzen, welche Rezeptor Protein Tyrosin-Kinase-Aktivität beibehalten.
Die Rezeptor Protein Tyrosin-Kinase gemäß Anspruch 1, welche menschliche flk-1 ist. Die Rezeptor Protein Tyrosin-Kinase gemäß Anspruch 1, welche Maus flk-1 ist. Ein Nukleinsäuremolekül, welches eine Rezeptor Protein Tyrosin-Kinase kodiert, entsprechend irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3. Das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 4, wobei das Nukleinsäuremolekül DNA ist. Das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 5, wobei das Nukleinsäuremolekül cDNA ist. Das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 4, wobei das Nukleinsäuremolekül RNA ist. Ein Vektor umfassend ein Nukleinsäuremolekül kodierend eine Rezeptor Protein Tyrosin-Kinase entsprechend irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3. Der Vektor gemäß Anspruch 8, wobei der Vektor in der Lage ist, in einem Wirt kloniert zu werden. Der Vektor gemäß Anspruch 9, wobei der Wirt ein prokaryontischer Wirt ist. Der Vektor gemäß Anspruch 9, wobei der Wirt ein eukaryontischer Wirt ist. Der Vektor gemäß irgendeinem der Ansprüche 8 bis 11, der in der Lage ist, das Nukleinsäuremolekül in einem Wirt zu exprimieren. Der Vektor gemäß Anspruch 12, der in der Lage ist, flk-1 in einem Wirt zu exprimieren.






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

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