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Dokumentenidentifikation DE69935438T2 29.11.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001114175
Titel FERMENTATIONSMEDIUM UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON ALPHA, OMEGA-ALKANDICARBONSÄUREN
Anmelder General Electric Co., Schenectady, N.Y., US
Erfinder MOBLEY, David Paul, Schenectady, NY 12308, US;
SHANK, Gary Keith, Rocky Hill, CT 06067, US
Vertreter Luderschmidt, Schüler & Partner, 65189 Wiesbaden
DE-Aktenzeichen 69935438
Vertragsstaaten BE, DE, ES, FR, GB, IT, NL
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 27.05.1999
EP-Aktenzeichen 999245293
WO-Anmeldetag 27.05.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/11751
WO-Veröffentlichungsnummer 2000015829
WO-Veröffentlichungsdatum 23.03.2000
EP-Offenlegungsdatum 11.07.2001
EP date of grant 07.03.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.11.2007
IPC-Hauptklasse C12P 7/44(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 1/16(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12R 1/74(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung unter Regierungsvertrags-Nr. 93-COOP-1-9547 gemacht, anerkannt durch das Landwirtschaftsministerium. Das Ministerium hat gewisse Rechte an dieser Erfindung.

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biofermentationsherstellung von &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäuren. Insbesondere stellt die Erfindung ein Medium und ein Verfahren zur Verfügung, welches ausgezeichnete spezifische Herstellung von &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäuren bei niedrigen Kosten unter Verwendung eines Hefebiokatalysators erreicht.

STAND DER TECHNIK

Langkettige &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäuren (d.h. Alkandicarbonsäuren mit Kohlenstoffzahlen von neun und größer) werden als Rohmaterialien in der Synthese einer Vielzahl von chemischen Produkten und Polymermaterialien verwendet. Zum Beispiel wird Dodecandisäure als ein Comonomer mit Bisphenol A verwendet, um ein Copolyestercarbonat herzustellen, ein besonders erwünschter technischer Thermoplast, der hohe Schlagfestigkeit, das Markenzeichen von Polycarbonatharz, beibehält, während er niedrige Schmelzviskosität hat. Diese Eigenschaft resultiert in besserer Formproduktivität als herkömmliches Polycarbonatharz, was die Herstellung von leichten, festen, dünnwandigen Kunststoffteilen erlaubt.

Disäuren mit Kohlenstoffzahlen größer als vier (hier im Folgenden als Disäuren bezeichnet), werden derzeit nahezu ausschließlich durch nichtbiologische Umsetzungsprozesse hergestellt. Dodecandisäure wird über Nickel katalysierte cyclische Trimerisierung von Butadien, gefolgt von Hydrierung zu Cyclododecan, Luftoxidation zu einer Mischung aus Cyclododecanon und Cyclododecanol und anschließende Salpetersäureoxidation zu Dodecandisäure hergestellt. Diese Arten von chemischen Verfahren zur Herstellung von Disäuren haben eine Anzahl von Einschränkungen und Nachteilen. Jedes Verfahren ist auf die Herstellung von Disäuren mit spezifischen Kohlenstofflängen eingeschränkt, basierend auf den verwendeten Ausgangsmaterialien. Zum Beispiel beginnt das Dodecandisäureverfahren mit Butadien, wodurch die Produkte dieses Reaktionsprozesses auf Säuren mit Kettenlängen im Vielfachen von vier beschränkt sind. In der Praxis wird durch dieses Verfahren lediglich eine einzige Disäure, Dodecandisäure, hergestellt. Zusätzlich basieren die Prozesse auf nicht erneuerbaren petrochemischen Ausgangssubstanzen und der Multireaktions-Umsetzungsprozess erzeugt unerwünschte Nebenprodukte, die in Ausbeuteverlusten, Schwermetallabfällen und Stickstoffoxiden resultieren, die in einem Reduktionsofen zerstört werden müssen.

Biologische Umsetzungsprozesse zur Herstellung von Disäuren haben eine Anzahl von potentiellen Vorteilen relativ zu den bestehenden nichtbiologischen Umsetzungsprozessen. Primär ist unter diesen die Verwendung von erneuerbaren Rohmaterialien als Ausgangsmaterialien und die Möglichkeit, die Disäure ohne das Erzeugen von gefährlichen chemischen Nebenprodukten herzustellen, was teure Abfallbeseitigungsprozesse erfordert. Ein weiterer wichtiger Vorteil, der durch Verwendung eines biologischen Prozesses erreicht wird, ist, dass ein solcher Prozess leicht für die Herstellung einer breiten Vielzahl von Disäuren unter Verwendung des gleichen Biokatalysators und der gleichen Ausrüstung angepasst werden kann. Da derzeitige organische chemische Synthesen nur für die Herstellung einer einzelnen Disäure geeignet sind, würde die Synthese von verschiedenen unterschiedlichen Disäuren die Entwicklung eines neuen Syntheseschemas für jede Disäure erfordern. Auf der anderen Seite kann ein Hefebiokatalysator verwendet werden, um Disäuren mit variierenden Längen unter Verwendung der gleichen Ausrüstung, Medien und Protokolle herzustellen, einfach indem man der Hefe ein anderes Substrat zur Verfügung stellt.

Verschiedene natürlich auftretende Hefen sind dafür bekannt, Disäuren herzustellen, wenn Fettsäuren, Fettsäureester oder Alkane als Substrate zur Verfügung gestellt werden. Hefen, die zur Art Candida gehören, wie zum Beispiel C. albicans, C. cloacae, C. guillermondii, C. intermedia, C. lipolytica, C. maltos, C. parapsilosis, C. zeylenoides und C. tropicalis, wurden als Disäure erzeugend berichtet. Diese Hefen haben eine Anzahl von Einschränkungen, was ihre Verwendung für die kommerzielle Herstellung von Disäuren jedoch verhindert. Sie erzeugen eine uneffiziente Gesamtausbeute an Disäure relativ zu dem Fettsäure- oder dem Alkanausgangsmaterial und sie erzeugen auch eine relativ große Menge an unerwünschten Nebenprodukten.

In Hefe werden n-Alkansubstrate in die Zelle transportiert, durch ein spezifisches Cytochrom P450-System zu Fettsäurealkoholen hydroxyliert und dann weiter durch eine Alkohol-Oxidase und eine Aldehyd-Oxidase oxidiert, um eine Fettsäure zu bilden. Fettsäuren werden in der gleichen Art und Weise oxidiert, um die korrespondierende Disäure zu bilden. Sowohl Fettsäuren als auch Disäuren können abgebaut werden, jedoch über den peroxisomalen Oxidationsweg, nachfolgend auf die Aktivierung mit einem Acyl-CoA-Ester. Dies führt zur Verkürzung der Kette um Einheiten von zwei. Demzufolge werden in Hefen hergestellte Disäuren oftmals um verschiedene Grade gekürzt.

Es wurden genetisch modifizierte Stämme von Candida tropicalis entwickelt, welche einige dieser Hindernisse für kosteneffektive kommerzielle Produktion von Disäuren überwindet. US-Patent 5 254 466 offenbart die genetische Modifizierung eines C. tropicalis-Stamms. In diesem Stamm Hefe ist der beta-Oxidationspfad blockiert, was in der Herstellung von im Wesentlichen reiner Disäure ohne die unerwünschte Umsetzung des Substrats zu kürzerkettigen Disäuren und Biomasse resultiert und in einer im Wesentlichen quantitativen Ausbeute bezüglich des Ausgangsmaterials. Ein spezieller Organismus, der für die Oxidation blockiert ist, ist C. tropicalis H5343 (ATCC Nr. 20962).

EP-A-0316702 offenbart ein Verfahren für die Umsetzung von Fettsäureestermischungen, die zumindest etwas Ester von Laurinsäure enthalten, durch Fermentierung zu Dicarbonsäuren mit einer gleichen Anzahl an Kohlenstoffatomen, basierend auf der Fettsäureeinheit, und verwendet einen Mikroorganismus, der eine höhere Umsetzungsgeschwindigkeit für C12-Verbindungen als für die höheren Homologen davon aufweist. Dies wird erreicht durch Ausführung der Umsetzung in der Gegenwart eines Candida tropicalis-Mikroorganismusstamms DC2-C2009 (DSM 4277) und/oder den Mutanten und/oder Varianten davon, welche die Fähigkeit haben, Methyllaurat bei einer höheren Umsetzungsgeschwindigkeit als seine höheren Homologen zu alpha, omega-Dicarbonsäuren umzusetzen.

C. tropicalis wurde, wie in US-Patent 5 620 878 beschrieben, weiter modifiziert. Diese Referenz offenbart Verstärkung der Gene, welche Cytochrom P450-Monooxygenase und NADPH-Reduktase codieren, was in erhöhter 4-Hydroxylaseaktivität resultiert und demzufolge erhöhter spezifischer Produktivität (Gramm Disäure/Liter/Std.) von Disäuren. Der spezielle Organismus mit verstärkten Cytochrom P450-Monooxygenase- und NADPH-Reduktase-Bestandteilen ist als C. tropicalis AR40 (ATCC Nr. 20987) bekannt, hinterlegt von Henkel Corporation, Plymouth Meeting, Pa, USA am 9. März 1990.

Die bekannten genetisch modifizierten Stämme zeigen bestimmte Vorteile gegenüber zuvor erhältlichen Hefestämmen für die Herstellung von Disäuren. Diese Technologie hat in Organismen resultiert, die dazu fähig sind, die großen Mengen an dem Produkt herzustellen, die notwendig sind, um ein kommerziell geeignetes Verfahren zu entwickeln. Die beschriebene Herstellung unter Verwendung dieser Verfahren gemäß Stand der Technik beinhaltet jedoch die Verwendung von bevorzugten Fermentationsmedien, die relativ teure Bestandteile enthalten. Die Kosten des Mediums in dem Biofermentationsprozess sind zu hoch für praktische Verwendung bei der Disäureherstellung im großen kommerziellen Maßstab. Zum Beispiel beschreibt die bevorzugte Ausführungsform von US-Patent 5 620 878 ein Medium aus 3 g/l Pepton, 6 g/l Hefeextrakt, 6,7 g/l Hefestickstoffbasis (Difco), 3 g/l Natriumacetat, 7,2 g/l K2HPO4·3H2O, 9,3 g/l KH2PO4 und 75 g/l Glukose. Dies sind Bestandteile, die für die Laborpraxis geeignet sind, nicht aber für Fermentation im industriellen Maßstab.

Demzufolge verbleibt eine Notwendigkeit für ein preiswertes vollständiges Biofermentationsmedium, welches ausreichend Nahrungsunterstützung für den Hefebiokatalysator zur Verfügung stellt, um hohe spezifische Produktivität von Disäuren aus geeigneten Fettsäuren oder Alkanausgangsmaterial zu erlauben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Demzufolge haben die Erfinder ein ökonomisches Fermentationsmedium und Verfahren für die Herstellung von &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäuren entwickelt. Die Erfindung ist ein Biofermentationsmedium zur Herstellung von &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäuren, welches das Wachstum der Hefe unterstützt, aufweisend (a) Maissirup, welches eine Glukosekonzentration von etwa 30 bis etwa 60 g/l zur Verfügung stellt, (b) eine organische Stickstoffquelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus eingeweichter Maisflüssigkeit mit einer Konzentration von etwa 4 bis etwa 15 g/l und Brauhefeextrakt mit einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 5 g/l, (c) eine Quelle für anorganischen Stickstoff, (d) eine Quelle für Phosphat, (e) gegebenenfalls eine Quelle für Spurenelemente, (f) eine &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäure produzierende Hefekultur und (g) ein Substrat, das die Hefe zu einer &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäure umsetzen kann. Durch die Verwendung der preiswerten alternativen Nahrungsmittelquellen zur Unterstützung des Hefewachstums stellt die Erfindung ein Medium zur Verfügung, welches ermöglicht, wichtige Disäuren kommerziell in großer Menge unter Verwendung eines biologischen Umsetzungsprozesses herzustellen, der keine petrochemischen Ausgangsmaterialien erfordert oder einen gefährlichen Abfallstrom erzeugt. Die Erfindung stellt ein Medium und ein Verfahren zur Verfügung, welches, obwohl weit weniger kostenintensiv als Medien gemäß Stand der Technik, in einer Disäureproduktion resultiert, die zumindest so hoch wie die Verfahren gemäß Stand der Technik mit Hefezellen ist.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung stellt Kulturmedien für das Wachstum und die Pflege von C. tropicalis AR40 und ähnliche Hefestämme zur Verfügung. Diese Medien beinhalten Nahrungsquellen, die einen reichen Nahrungsbrei zur Verfügung stellen, der gutes Wachstum von Hefezellen vorantreibt, der aber auch sowohl weniger teuer als die im Stand der Technik berichteten Medien ist, als auch in hoher spezifischen Disäureproduktivität durch die Hefezellen resultiert.

Ein Fermentationsmedium für Disäure erzeugende Hefen gemäß Stand der Technik beinhaltet eine Kohlenstoffquelle, wie zum Beispiel Glukose, eine organische Stickstoffquelle, wie zum Beispiel Hefeextrakt, Salze, Puffer und eine Quelle von Aminosäuren, Vitaminen und Spurenmineralien, wie zum Beispiel Hefestickstoffbasis (Difco). Siehe Tabelle 1. Diese Medien sind, während sie im Laboratorium erfolgreich sind, nicht geeignet für die kommerzielle Produktion von Disäuren aufgrund der hohen Kosten ihrer Bestandteile.

Tabelle 1 Repräsentatives Medium gemäß Stand der Technik1
  • 1Picataggio et al. Bio/Technologiy, 10:894–898 (1992).

Überraschenderweise haben die Erfinder gefunden, dass Ersatz durch Ernährungsquellen mit geringeren Kosten weder die Brauchbarkeit der Hefekultur reduziert, noch die spezifische Produktion der gewünschten Disäuren reduziert.

Das erfindungsgemäße Medium verwendet Maissirup als Hauptkohlenstoffquelle. Der unraffinierte Maissirup in Medium OPT1 und OPT2, siehe Tabellen 2 und 3, ist eine sehr viel preiswertere Quelle für Glukose als die hochreine Glukose, die in typischen Medien gemäß Stand der Technik für Disäure produzierende Hefe verwendet wurde. Wir glauben auch, dass unraffinierter Maissirup ein bevorzugter Inhaltsstoff ist, da er auch Spurennahrungsmittel enthält, was hochgereinigte Glukose nicht tut, obwohl raffinierter Maissirup oder modifizierter Maissirup an ihre Stelle gesetzt werden können. Die spezifischen Spurennahrungsmittel, die für die verbesserten Ergebnisse relativ zu reiner Glukose verantwortlich sind, die man mit unraffiniertem Maissirup erkenne kann, sind unbekannt. Unraffinierter Maissirup enthält geringe Mengen an Mineralien und Metallsalzen, wie zum Beispiel Kalzium, Magnesium und Eisen, aber die spezifische Rolle von diesen ist unbekannt. Zusätzlich haben die Erfinder entdeckt, dass, wenn das erfindungsgemäße Medium verwendet wird, eine wirksame Konzentration von 40 g/l Glukose eine ausreichende Energiequelle zur Verfügung stellt, während etwa 75 g/l Glukose im Stand der Technik beschrieben ist. Die Substitution reduziert wesentlich die Kosten der Kohlenhydratquelle in dem Medium.

Während Medien gemäß Stand der Technik standardisierte und/oder ergänzte Hefeextrakte enthalten, die halb gereinigt sind und zur Standardlaboratoriumsverwendung als eine Quelle von Aminosäuren gedacht sind, stellen eingeweichte Maisflüssigkeit und Brauhefeextrakt diese Nährstoffe im erfindungsgemäßen Medium zur Verfügung. Typische Stickstoff- und Spurennahrungsmittelquellen gemäß Stand der Technik sind Difco-Hefeextrakt, ein standardisierter Hefeextrakt, enthaltend Aminosäuren, Vitamine, Mineralien und Spurenelemente, und Difco-Hefestickstoffbasis, eine vorbereitete Laboratoriumsmediumsformulierung, enthaltend Ammoniumsulfat, Salze von Phosphat, Magnesium, Natrium und Kalzium, zusammen mit Aminosäuren, Vitaminen und Spurenelementen. Dies sind relativ teure Nahrungsquellen, da sie sorgfältig kontrollierte Mengen an Inhaltsstoffen, wie zum Beispiel B-Vitamine, enthalten. Das erfindungsgemäße Medium enthält weniger definierte Bestandteile, die gleiche Ernährung für weniger Gesamtkosten zur Verfügung stellen kann. Bevorzugte Medien enthalten Maissirup, um eine Glukosekonzentration von etwa 30 bis etwa 60 g/l zur Verfügung zu stellen, eine organische Stickstoffquelle (eingeweichte Maisflüssigkeit, etwa 4–15 g/l, oder Brauhefeextrakt, etwa 1–5 g/l), eine anorganische Stickstoffquelle, eine Phosphatquelle und gegebenenfalls eine Spurenelementquelle.

Das erfindungsgemäß verwendete Medium kann mit jeder Disäure erzeugenden Hefe verwendet werden und einer großen Vielzahl von Substraten. Jede Fettsäure, Fettsäureester oder Alkansubstrat, gesättigt oder ungesättigt kann verwendet werden. Das Substrat hat wünschenswerterweise 6–22 Kohlenstoffatome, obwohl Fettsäuren wünschenswerterweise 10–22 Kohlenstoffatome haben. Bevorzugte Substrate sind Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Leinsäure, Palmitolsäure und die Methylester davon, sowie Dodecan, Tridecan und Tetradecan.

Die folgenden Beispiele beschreiben erfindungsgemäße Medien und ihre Verwendung bei der Herstellung von &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäuren. Ein Vergleichsbeispiel unter Verwendung des Mediums, enthaltend die Bestandteile wie in Tabelle 1 aufgelistet (mit Glukose bei 60 g/l), ist ebenfalls enthalten. Dieses Vergleichsbeispiel demonstriert, dass das erfindungsgemäße Medium Wachstum und spezifische Produktion von &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäuren zumindest genauso gut wie Medien gemäß Stand der Technik unter den gleichen Bedingungen unterstützt.

BEISPIELE 1. OPT1-Medium

Die eingeweichte Maisflüssigkeit, Ammoniumsulfat und Phosphatsalze, wie in Tabelle 2 angegeben, in Mengen die ausreichen, um die angegebenen Endkonzentrationen zu ergeben, werden in deinoisiertem Wasser gelöst und durch Erwärmen auf 121°C bei 15 psig sterilisiert. Der unraffinierte Maissirup als eine 50%ige Glukoselösung wird getrennt durch Erwärmen in der gleichen Art und Weise sterilisiert. Konzentrierte Lösungen der verbleibenden Mineralsalze und der Spurenelemente werden individuell hergestellt und getrennt filtersterilisiert. Die Maissirup-, Salz- und Spurenelementlösungen werden zu der gekühlten Lösung, enthaltend eingeweichte Maisflüssigkeit, zugegeben, um die angegebenen Konzentrationen zu ergeben. Das resultierende Medium wird dann auf einen pH von 6,5 gebracht. Der unraffinierte Maissirup, der in den Medien OPT1 und OPT2 verwendet wird, ist Cargill CLEARSWEETTM unraffinierter 95% Dextrose-Maissirup. Die eingeweichte Maisflüssigkeit ist Cargill Heavy Steepwater.

Tabelle 2. OPT1-Medium
  • * Spurenelementlösung enthält 500 mg/l H3BO3, 400 mg/l MnSO4&bgr;H2O, 400 mg/l ZnSO4&bgr;7H2O, 200 mg/l FeCl3&bgr;6H2O, 200 mg/l NaMoO4&bgr;2H2O, 100 mg/l KJ und 40 mg/l CuSO4&bgr;5H2O.

2. OPT2-Medium

OPT2-Medium enthält die Bestandteile, die in Tabelle 3 aufgeführt sind, und wird wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, wobei der Brauhefeextrakt die eingeweichte Maisflüssigkeit ersetzt. Der in diesem Medium verwendete Brauhefeextrakt ist AmberexTM 1003.

Tabelle 3. OPT2-Medium
  • * Spurenelementlösung ist wie in Tabelle 2 beschrieben.

3. Biofermentative Herstellung von 1,14-Tetradecandisäure mit C. tropicalis AR40, gewachsen auf OPT1-Medium

C. tropicalis AR40 wird unter sterilen Bedingungen auf Medium OPT1 in einem gerührten, durchlüfteten Fermenter mit einem Anfangsflüssigkeitsvolumen von 2,51 wachsen lassen. Das sterile Kulturmedium wird mit einer 10% Impfung von C. tropicalis AR40 geimpft und bei 30°C, pH 6,5 mit einer Belüftungsrate von 1 vvm (Luft) für 18 Stunden wachsen lassen. Zu dieser Zeit, nachdem das Wachstum der Zellen maximale Zelldichte erreicht hat, wird die Umsetzungsphase durch Beginn der Zugabe von Methylmyristat-Substrat begonnen. Zur gleichen Zeit wird der pH der Kultur mit 6N Natriumhydroxid auf 8,2 angehoben. Der pH wird für die ersten 30 Stunden der Umsetzungsphase auf 8,2 gehalten und danach durch kontrollierte Zugabe von Natriumhydroxidlösung auf 8,7. Während der Umsetzungsphase wird unraffinierter Maissirup kontinuierlich in das Kulturmedium mit einer Geschwindigkeit von 2,0 g Glukose/l/Stunde zugegeben. Das Substrat wird mit einer Geschwindigkeit zugegeben, die ausreicht, um einen Überschuss an Substrat bezüglich der Umsetzungsgeschwindigkeit des Substrats zu Disäureprodukt zur Verfügung zu stellen. Über den 49stündigen Umsetzungszeitraum wird die 1,14-Tetradecandisäure mit einer mittleren Geschwindigkeit von 0,76 g/l/Std. hergestellt.

4. Biofermentative Herstellung von 1,14-Tetradecandisäure mit C. tropicalis AR40, gewachsen auf OPT1-Medium.

Die in Beispiel 3 beschriebene Fermentierung wird mit den folgenden geringen Unterschieden wiederholt. Der pH wird für die ersten 32,5 Stunden der Umsetzung auf pH 8,2 und danach auf 8,7 kontrolliert. Während der Umsetzungsphase wird unraffinierter Maissirup mit einer Geschwindigkeit von 1,8 g Glukose/l/Std. zugegeben. Über einen 50stündigen Umsetzungszeitraum wird 1,14-Tetradecandisäure mit einer mittleren Geschwindigkeit von 0,99 g/l/Std. hergestellt.

5. Biofermentative Herstellung von 1,14-Tetradecandisäure mit C. tropicalis AR40, gewachsen auf OPT2-Medium.

Die in Beispiel 4 beschriebene Fermentierung wird wiederholt, wobei OPT2-Medium das OPT1-Medium ersetzt und bei leicht geändertem pH. Der pH wird für die ersten 29,5 Stunden auf pH 8,1 und danach auf 8,7 kontrolliert. Über einen 50stündigen Umsetzungszeitraum wird 1,14-Tetradecandisäure mit einer mittleren Geschwindigkeit von 0,84 g/l/Std. hergestellt.

6. Vergleichsweise biofermentative Herstellung von 1,14-Tetradecandisäure mit C. tropicalis AR40, gewachsen auf einem repräsentativen Medium gemäß Stand der Technik.

Biofermentierung wird vier getrennte Male unter Verwendung des gleichen Biokatalysators und unter im Wesentlichen den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 4 ausgeführt, mit der Ausnahme, dass das verwendete Medium das in Tabelle 1 mit Glukose von 60 g/l beschriebene Medium gemäß Stand der Technik ist. Auch wird für diese Beispiele gemäß den Verfahren im Stand der Technik analysenreine Glukose nicht nur während des Zellwachstums als Kohlenstoffquelle verwendet, sondern auch während der Umsetzungsphase. Während der Umsetzung wird die Glukose mit einer Geschwindigkeit von 1,8 ± 0,3 g/l/Stunde zugegeben und das Substrat wird in den Fermenter mit einer Geschwindigkeit zugegeben die ausreicht, um einen Überschuss an Substrat bezüglich der Geschwindigkeit der Umsetzung des Substrats zu Disäure zur Verfügung zu stellen. Die Disäureherstellungsgeschwindigkeit für diese Experimente liegt im Bereich von 0,58 bis 0,80 g/l/Std, Die mittlere Disäureherstellungsgeschwindigkeit der vier Experimente über 50 Stunden Umsetzung ist 0,69 g/l/Std.


Anspruch[de]
Biofermentationsmedium für die Herstellung von &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäuren, welches das Wachstum von Hefe unterstützt, aufweisend:

a) Maissirup, welcher eine Glukosekonzentration von 30 bis 60 g/l bereitstellt;

b) eine organische Stickstoffquelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus eingeweichter Maisflüssigkeit mit einer Konzentration von 4 bis 15 g/l und Brauhefeextrakt mit einer Konzentration von 1 bis 5 g/l;

c) eine Quelle von anorganischem Stickstoff;

d) eine Phosphatquelle;

e) gegebenenfalls eine Quelle für Spurenelemente;

f) eine &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäure produzierende Hefekultur ausgewählt aus C tropicalis AR4D (ATCC Nr. 20987) und;

g) ein Substrat, dass die Hefe zu einer &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäure umwandeln kann, wobei das Substrat 6 bis 22 Kohlenstoffatome hat und ausgewählt ist aus Fettsäuren, Fettsäureestern und Alkanen.
Biofermentationsmedium nach Anspruch 1, wobei der Maissirup eine Glukosekonzentration von 40 g/l bereitstellt und die organische Stickstoffquelle eingeweichte Maisflüssigkeit mit einer Konzentration von 9 g/l ist. Biofermentationsmedium nach Anspruch 1, wobei der Maissirup eine Glukosekonzentration von 40 g/l bereitstellt und die organische Stickstoffquelle Brauhefeextrakt mit einer Konzentration von 3 g/l ist. Biofermentationsmedium nach Anspruch 1, wobei der Maissirup nicht raffinierter Maissirup ist. Verfahren zur Herstellung von &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäuren, bei welchen man ein Substrat, das 6 bis 22 Kohlenstoffatome hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fettsäuren, Fettsäureestern und Alkanen in einem Biofermentationsmedium nach Anspruch 1 mittels Hefe biofermentiert. Verfahren zur Herstellung von &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäuren nach Anspruch 5, wobei das Substrat eine Fettsäure mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist. Verfahren zur Herstellung von &agr;,&ohgr;-Alkandicarbonsäuren nach Anspruch 5, wobei das Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Oleinsäure, Palmitoleinsäure, Laurinsäuremethylester, Myristinsäuremethylester, Palmitinsäuremethylester, Stearinsäuremethylester, Oleinsäuremethylester, Palmitoleinsäuremethylester, Dodecan, Tridecan und Tetradecan.






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