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Dokumentenidentifikation DE60033932T2 06.12.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001189623
Titel METHODE UND ZUSAMMENSETZUNG ZUR INHIBIERUNG VON KARDIOVASKULÄRER ZELLPROLIFERATION
Anmelder The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University, Stanford, Calif., US
Erfinder COOKE, John P., Palo Alto, CA 94306, US;
FATHMAN, Garrison C., Portola Valley, CA 94028, US;
ROTHBARD, Jonathan B., Woodside, CA 94062, US;
UEMURA, Shiro, Kashihara, Nara 634-0064, JP;
ROBBINS, Robert C., Stanford, CA 94305, US;
KOWN, Murray H, Menlo Park, CA 94025, US
Vertreter Meyer & Partner GbR, 20354 Hamburg
DE-Aktenzeichen 60033932
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 05.06.2000
EP-Aktenzeichen 009476227
WO-Anmeldetag 05.06.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/US00/40125
WO-Veröffentlichungsnummer 2000074701
WO-Veröffentlichungsdatum 14.12.2000
EP-Offenlegungsdatum 27.03.2002
EP date of grant 14.03.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.12.2007
IPC-Hauptklasse A61K 38/03(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 38/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 38/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61L 27/34(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61L 33/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61L 33/12(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Verwendungen zur Inhibition cardiovaskulärer Zellproliferation. Die Erfindung stellt Verfahren und Verwendungen zur Verbesserung der Langlebigkeit und Qualität von arteriellen Transplantaten, zur Verbesserung der vaskulären NO-Produktion und zur Reduktion von intimaler Posttransplantat-Hyperplasie, Stenose und Restenose bereit.

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Hintergrund der Erfindung

Myointimale Hyperplasie ist eine vaskuläre Antwort auf Verletzung, die zu der Entwicklung von Venentransplantaterkrankung, Restenose nach Angioplastie und Atherosklerose beiträgt (Motwani et al., 1998). Myointimale Hyperplasie involviert die Migration und Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen (VSMC), wie auch die Aufarbeitung extrazellulärer Matrix in der Intima (DeMeyer et al., 1997, Kraiss et al., 1997). Vaskuläres Stickoxid (NO), ein endogener Regulator der vaskulären Funktion, wirkt der Entwicklung von Myointimaformierung durch Inhibierung der VSMC-Proliferation und durch Induktion von VSMC-Apoptose entgegen (Cooke et al., 1997; Best et al., 1999). Das Versagen der endogenen biologischen Prozesse, myointimale Hyperplasie zu kontrollieren, kann zu der Bildung von vaskulären Verschlüssen führen, die der Gewebefunktion ernsthaft schaden. Autologe Venentransplantation stellt ein wichtiges Werkzeug bei koronaren Bypass-Eingriffen dar. Es werden ungefähr 400.000 bis 500.000 erstmalige koronare Transplantateingriffe jedes Jahr allein in den Vereinigten Staaten durchgeführt. Obwohl die Patienten-Überlebensraten 90 % über die ersten fünf Jahre nach der Behandlung übertreffen, versagen ungefähr 20 % bis 40 % der Transplantate während dieser Zeit aufgrund von Verschlussphänomenen. So werden ungefähr 80.000 bis 100.000 Transplantat-Ersatzeingriffe jährlich in den USA benötigt, um frühzeitigen Tod zu vermeiden. Vaskuläre Verschlussphänomene führen auch zu Versagen bei anderen vaskulären Transplantaten, wie arteriell-venöser Anastomose, die für Nierendialyse verwendet wird, und bei Organtransplantaten.

Im Licht der signifikanten Kosten für die Patienten und Versicherer, die durch wiederholte Transplantateingriffe hervorgerufen werden, besteht ein Bedarf, die Langlebigkeit und Qualität der erstmaligen vaskulären Transplantate zu verbessern. Idealerweise sollte ein solches Verfahren einfach durchzuführen sein, ohne das es ausgedehnte Manipulation oder langwierige Verarbeitung erfordert. Darüber hinaus involviert das Verfahren vorzugsweise Materialien, die relativ einfach in therapeutisch effektiven Formen herzustellen sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Bei einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines isolierten vaskulären Conduits zur Inhibition von traumatisch induzierter intimaler Hyperplasie in einem Blutgefäß bereit. In Übereinstimmung mit diesem Verfahren wird ein Polymer, das aus 6 bis ungefähr 30 Aminosäure-Untereinheiten besteht, worin mindestens 50 % der Untereinheiten Arginin sind, und das mindestens sechs aufeinander folgende Arginin-Untereinheiten enthält, enthalten in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, ex vivo mit dem Transplantat in Kontakt gebracht, typischerweise mit dem Inneren des Transplantats.

Solches In-Kontakt-Bringen ist effektiv zur Reduktion des Grades an intimaler Hyperplasie in und/oder benachbart zu dem Blutgefäß, relativ zu dem Grad an intimaler Hyperplasie, die ohne das In-Kontakt-Bringen auftreten würde.

Das Hyperplasie-induzierte Trauma kann eine Inzision in das Gefäß, exzessiven oder verlängerten Druck, der auf das Gefäß angewendet wird, Transplantation eines Organs, das das Gefäß enthält, oder eine Kombination davon umfassen. Das In-Kontakt-Bringen kann vor dem Trauma (wie bei der Präparation eines Gefäßsegmentes zur Transplantation), gleichzeitig mit oder nach dem Trauma auftreten. Das Gefäß kann ein Gefäßconduit sein, das in (wie bei einem Bypasseingriff) oder auf (wie bei einer Anastomose) ein endogenes Gefäß transplantiert werden soll, oder es kann ein endogenes Gefäß sein, das ein Transplantat erhält. Auch mit eingeschlossen sind Venen-„Patches", die bei arterieller Reparatur verwendet werden. Bei bevorzugten Ausführungsarten finden die oben aufgezeichneten Eingriffe bei einem menschlichen Individuum statt.

Die Erfindung ist z.B. in einem Zusammenhang mit der Reparatur eines arteriellen Gefäßortes bei einem menschlichen Individuum nützlich. Dementsprechend wird ein isolierter Gefäßconduit, wie ein Vena-saphena-Segment oder ein Arteria-mammaria-interna-Segment, mit einem Polymer in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger wie oben beschrieben in Kontakt gebracht, und der Gefäßconduit wird dann in einen ausgewählten arteriellen Gefäßort, der eine Reparatur benötigt, transplantiert.

Bei einer Ausführungsart ist das Gefäß eine Vene, die einem arteriell-venösen Anastomose-Eingriff zum Zwecke der Dialyse unterzogen wird. Bei einer anderen Ausführungsart wird das Gefäß einer Angioplastie unterworfen. Bei einer weiteren Ausführungsart ist das Gefäß in einem transplantierten Organ enthalten, wie z.B. einem Herz oder einer Niere, wobei das In-Kontakt-Bringen vorzugsweise durch Eintauchen des Organs in eine Lösung des Polymers durchgeführt wird.

Vorzugsweise sind mindestens 70 % und mehr vorzuziehen mindestens 90 % der Untereinheiten in dem Polymer Arginin. Wenn Nicht-Arginin-Untereinheiten vorliegen, wird vorzugsweise keine Argin-Untereinheit von einer Arginin-Untereinheit durch mehr als eine Nicht-Arginin-Untereinheit getrennt. Die Nicht-Arginin-Untereinheiten sind vorzugsweise Aminosäure-Untereinheiten, die die Rate des Membrantransportes des Polymers nicht signifikant reduzieren. In bevorzugten Ausführungsarten sind die Arginin-Untereinheiten L-Arginin. In besonders bevorzugten Ausführungsarten ist das Polymer ein Arginin-Homopolymer, das vorzugsweise 7 bis 15 Argininreste enthält.

Es wird auch ein isolierter Gefäßconduit bereitgestellt, der innerhalb der Wand des Conduits ein Polymer wie oben beschrieben umfasst, das in einem Spiegel vorliegt, der effektiv ist, um den Grad an intimaler Hyperplasie nach Transplantation in und/oder benachbart zu dem Conduit zu reduzieren, relativ zu dem Grad an intimaler Hyperplasie nach Transplantation, die ohne das Polymer auftreten würde. Der Gefäßconduit kann ein venöses oder arterielles Segment sein oder es kann ein künstliches Gefäßsegment sein, das aus physiologisch kompatiblem Material hergestellt wurde. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines isolierten vaskulären Conduits für einen vaskulären Transplantationseingriff bereit, worin ein isolierter Gefäßconduit, vorzugsweise das Innere des Conduits, mit einem Argininpolymer, wie oben beschrieben, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger für eine Zeit, die ausreicht, damit das Polymer in die Wand des Gefäßconduits bis zu einem Spiegel transportiert werden kann, der effektiv für die Reduktion intimaler Hyperplasie nach Transplantation in und/oder benachbart zu dem Conduit ist, relativ zu dem Grad an intimaler Hyperplasie nach Transplantation, die ohne solches In-Kontakt-Bringen mit dem Polymer auftreten würde, in Kontakt gebracht wird. Bevorzugte Ausführungsarten des Polymers werden oben beschrieben.

Die Erfindung stellt auch ex vivo-Verfahren zur Steigerung der NO-Produktion in einem isolierten Gefäßconduit durch In-Kontakt-Bringen eines Polymers, das aus 6 bis ungefähr 30 Aminosäure-Untereinheiten besteht, worin mindestens 50 % der Untereinheiten L-Arginin sind, und das mindestens sechs aufeinander folgende Arginin-Untereinheiten enthält, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, mit dem Transplantat bereit.

In vaskulärem Gewebe wird gezeigt, dass die Polymere, wie oben beschrieben, durch die Gefäßwand und in das Cytoplasma und die Kerne der Gefäßzellen translozieren. Zusätzlich zu ihrer Nützlichkeit bei der Inhibition von myointimaler Hyperplasie sind die Oligomere als Transporter für vaskuläre Therapeutika nützlich.

Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Polymers, das aus 6 bis 30 Aminosäure-Untereinheiten besteht, worin mindestens 50 % der Untereinheiten Arginin sind und das Polymer mindestens 6 aufeinander folgende Arginin-Untereinheiten enthält, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Steigerung der NO-Produktion in einem isolierten Gefäß bereit, um eine vaskuläre proliferative Erkrankung zu verhindern oder umzukehren. Bei einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines vaskulären Conduits für einen vaskulären Transplantateingriff bereit, umfassend das In-Kontakt-Bringen eines isolierten Gefäßconduits mit einem Argininpolymer, wie in dem obigen Absatz angegeben, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, für eine Zeit, die ausreicht, damit das Polymer in die Wand des Gefäßconduits transportiert werden kann, so dass der Spiegel des Polymers in der Conduitwand effektiv ist, um den Grad der intimalen Posttransplantations-Hyperplasie in und/oder benachbart zu dem Conduit zu reduzieren, relativ zu dem Grad an intimaler Posttransplantations-Hyperplasie, die ohne solches In-Kontakt-Bringen mit dem Polymer auftreten würde.

Diese und andere Aufgaben und Eigenschaften der Erfindung werden deutlicher offensichtlich werden, wenn die folgende ausführliche Beschreibung der Erfindung in Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die 1A-F zeigen die Translokation von Biotin-markiertem Heptaarginin (R7) in kultivierte glatte Ratten-Gefäßmuskelzellen (VSMC). Jede Figur stellt drei getrennte Experimente dar. Die Zellen wurden für 30 Minuten mit Biotin-markiertem Heptalysin (bK7; 10 &mgr;M; 1A) und Biotin-markiertem Heptaarginin (bR7) bei 0,1 &mgr;M (1B) und 10 &mgr;M (1C) behandelt. Beachte die intensive Färbung in den Kernen und Cytoplasma aller Zellen in den 1B-C. 1D zeigt bR7-Translokation bei 4°C; es gibt keine offensichtliche Reduktion in der Effektivität des Transportes bei dieser Temperatur.

1E zeigt Inhibition der bR7-Translokation durch Natriumazid, was darauf hinweist, dass der Transportprozess energieabhängig ist. 1F zeigt den Mangel an Inhibition von bR7-Translokation durch Zugabe von 10 mM freiem L-Arginin zu dem Medium, was anzeigt, dass der y+-Transporter nicht in die Polymeraufnahme involviert ist.

2 zeigt Dosis-, Inkubationszeit- und Temperaturabhängigkeit der R7-Translokation bei Kaninchen-Arteria-carotis-Segment. Die Größe der R7-Translokation wird als Prozent gefärbter Kerne ausgedrückt (gefärbte Kerne/Gesamtkerne). (a) Dosisabhängigkeit von bR7-Translokation. (b-c) Zeitabhängigkeit von bR7-Translokation bei 4°C und 37°C, in Intimazellen bzw. Mediazellen. Die Daten stammen aus vier unabhängigen Experimenten. *, p < 0,05.

3 zeigt den Zeitverlauf des Verschwindens von internalisiertem Biotinsignal bei bR7-behandelten Arteriensegmenten; (a) Intimazellen, (b) Mediazellen. Gefäßsegemente, die gegenüber Biotin-markiertem L-R7 oder D-R7 (10,0 &mgr;M) ausgesetzt waren, wurden in Medium, das Serum enthielt, für bis zu 5 Tage inkubiert. Die Größe der R7-Translokation wird als Prozent gefärbter Kerne ausgedrückt. Die Daten stammen aus vier unabhängigen Experimenten. *, p < 0,05.

4 zeigt die Abhängigkeit der NO-Biosynthese von Zytokinkonzentration und L-Arginin-Erhältlichkeit. In den 4-7 wurde die extrazelluläre NO-Produktion als ihr stabiler oxidativer Metabolit, NO2, gemessen. (a) Effekt von IFN-&ggr;-Dosis auf NO-Produktion bei Ratten-VSMC, inkubiert in einem Medium, das 400 &mgr;M freies L-Arginin enthielt, stimuliert mit einer Mischung aus IFN-&ggr; (100 U/ml) und LPS (100 &mgr;g/ml). (b) Effekt von extrazellulärem freiem L-Arginin auf NO-Produktion. Die NO2-Akkumulierung in dem Kulturmedium wurde nach 24 Stunden quantifiziert. Die NO2-Produktion wurde für 105 Zellen korrigiert.

5 zeigt den Effekt von Arginin-Oligomeren auf die NO-Synthese bei Zytokinstimulierten VSMC. VSMCs wurden mit Arginin-Oligomeren für 30 Minuten vorbehandelt und dann mit einer Mischung aus IFN-&ggr; (100 U/ml) und LPS (100 &mgr;g/ml) stimuliert. Die NO-Produktion wird als ein Prozentsatz von derjenigen, die in mit Träger behandelten Zytokin-stimulierten Zellen beobachtet wird, ausgedrückt. R5, penta-L-Arginin; R7, hepta-L-Arginin; R9, nona-L-Arginin; D-r7, hepta-D-Arginin; K7, hepta-L-Lysin. *; p < 0,05 gegen mit Träger behandelte Zellen.

6 zeigt den Effekt von N-terminaler Acetylierung der Argininoligomere auf die NO-Produktion. Ratten-VSMCs wurden mit jedem Polymer für 30 Minuten vorbehandelt, dann mit einer Mischung aus IFN-&ggr; (100 U/ml) und LPS (100 &mgr;g/ml) stimuliert. Die NO-Produktion wird als ein Prozentsatz von derjenigen, die bei mit Träger behandelten Zytokin-stimulierten Zellen beobachtet wird, ausgedrückt. *; p < 0,05 gegen mit Träger behandelte Zellen.

7 zeigt den Effekt von L-NMMA auf die NO-Produktion von mit Argininoligomerbehandelten VSMC. NO-Produktion wird als ein Prozentsatz von derjenigen, die bei mit Träger behandelten Zytokin-stimulierten Zellen beobachtet wird, ausgedrückt. *; p < 0,05 gegen mit Träger behandelte Zellen.

8 zeigt repräsentative Fotomikrographen von Querschnitten von (a) Trägerbehandelten, (b) L-R7-behandelten (10,0 &mgr;M) und (c) D-R7-behandelten (10,0 &mgr;M) Venentransplantaten, die an dem 28. Tag nach der Operation entnommen wurden. Die Pfeilspitzen weisen auf die innere elastische Lamina. (Hämatoxylin Eosinfärbung, X100, Streifen = 100 &mgr;m).

9 zeigt planimetrische Messungen von Venentransplantatsegmenten, die an dem 28. Tag nach Operation entnommen wurden. (a) luminaler Bereich; (b) medialer Bereich; (c) intimaler Bereich; (d) I/M-Verhältnis. I/M stellt das Verhältnis von Intima- zu Mediabereich dar. Jede experimentelle Gruppe wurde aus 6 Tieren zusammengestellt *, p < 0,05.

10a zeigt NOx (Nitrat und Nitrit)-Produktion, die aus Venentransplantatsegmenten, die 3 Tage nach Operation entnommen wurden, gemessen wurde. Die Transplantatsegmente wurden in Medium entweder in der Abwesenheit (basal) oder Gegenwart (stimuliert) von Calciumionophor inkubiert. Jede experimentelle Gruppe besteht aus 3 Gefäßsegmenten. *, p < 0,05.

10b zeigt NO-unabhängige Effekte von hepta-Argininen auf die Zellproliferation. Ratten-VSMC wurden mit entweder L-R7 oder D-r7 (10,0 &mgr;M, 30 Minuten) inkubiert, dann mit Wachstumsmedium, das 0,5 % FBS enthielt, für 48 Stunden inkubiert. Die Zellproliferation wurde unter Verwendung von XTT-Assay gemessen; das Prozent OD von jeder Behandlungsgruppe zu der Gruppe, die mit serumfreiem Medium (DSF) behandelt wurde, wurde berechnet. Die Daten stammen aus 6 Experimenten. *, p < 0,05 gegen Wachstumsmedium (GM) Kontrollgruppe.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung I. Definitionen

Der Begriff „Poly-Arginin" oder „Poly-Arg" bezieht sich auf eine polymere Sequenz, die aus aufeinander folgenden Argininresten besteht; Poly-L-Arginin bezieht sich auf alle L-Arginine; Poly-D-Arginin bezieht sich auf alle D-Arginine. Poly-L-Arginin wird auch durch ein großes „R", gefolgt von der Anzahl von L-Argininen in dem Peptid abgekürzt (z.B. stellt R8 ein 8-mer von aufeinander folgenden L-Argininresten dar). Poly-D-Arginin wird durch ein kleines „r", gefolgt von der Anzahl von D-Argininen in dem Peptid, abgekürzt (r8 stellt ein 8-mer von aufeinander folgenden D-Argininresten dar). „Ac" weist auf eine Sequenz hin, die einen acetylierten N-terminalen Rest aufweist (z.B. AcR7), während „b" auf eine Sequenz hinweist, die einen biotinylierten N-terminalen Rest aufweist (z.B. bR7). Ein „Argininpolymer" (oder „Oligomer"), wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Arginin-Homopolymer oder ein Peptid-Copolymer, in dem Arginin der Hauptbestandteil ist (mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 70 %, und am Besten mindestens 90 % Arginin). Ein „Arginin-Homopolymer", worin alle Reste Arginin sind, kann eine Mischung aus L-Arginin- und D-Argininresten enthalten.

Ein „Gefäß", wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Blutgefäß oder irgendein Segment davon, einschließlich eines Segmentes, das als ein vaskulärer Patch verwendet wird. Aminosäurereste werden hier durch ihre vollständigen Namen oder durch Standardeinzelbuchstaben- oder drei Buchstaben-Benennung bezeichnet: A, Ala, Alanin; C, Cys, Cystein; D, Asp, Asparginsäure; E, Glu, Glutaminsäure; F, Phe, Phenylamin; G, Gly, Glycin; N, His, Histidin; I, Ile, Isoleukin; K, Lys, Lysin; L, Leu, Leukin; M, Met, Methionin; N, Asn, Aspargin; P, Pro, Prolin; Q, Gln, Glutamin; R, Arg, Arginin; S, Ser, Serin; T, Thr, Threonin; V, Val, Valin; W, Trp, Tryptophan; X, Hyp, Hydroxyprolin; Y, Tyr, Tyrosin.

II. Argininpolymere

Die vorliegende Erfindung verwendet Argininhomopolymere oder Copolymere, die Arginin als ihren Hauptbestandteil besitzen, die effizient in Gefäßgewebe transportiert werden und die intimale Hyperplasie reduzieren, wenn behandelte Gefäßsegmente, wie arterielle Segmente, venöse Segmente oder künstliche Gefäßconduits, in Gefäßorte transplantiert werden, die eine Reparatur benötigen. Die Polymere sind auch nützlich bei der Reduktion von Posttransplantations-Hyperplasie, wie GCAD (Transplantatvaskulopathie), und Inhibition intimaler Hyperplasie in Venensegmenten, die als „patches" verwendet werden, z.B. für Arterienwände, die während Endarteriektomie für atherosklerotische Plaques beschädigt wurden. Die Polymere sind auch nützlich für die Reduktion von Hyperplasie in Gefäßen, die hohen Drücken ausgesetzt waren, wie bei Angioplastie oder Blutdialyse.

Das Argininpolymer oder Copolymer enthält mindestens 6, mehr vorzuziehen mindestens 7, und bis zu 30 Aminosäurereste, wobei mindestens 50 % dieser Reste Arginin sind und mindestens 6 aufeinander folgende Reste Arginin sind. Vorzugsweise sind mindestens 70 % und mehr vorzuziehen mindestens 90 % der Reste Arginin. Nicht-Argininreste, wenn sie vorliegen, sind Aminosäureuntereinheiten (einschließlich unnatürlichen Aminosäuren), die die Rate des Membrantransports des Polypeptids nicht signifikant reduzieren. Diese werden vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Glycin, Alanin, Cystein, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Serin und Threonin besteht, und sie werden mehr vorzuziehen aus der Gruppe ausgewählt, die aus Glycin, Alanin, Cystein und Valin besteht. Nicht natürlich auftretende Aminosäuren, die Homologe von Arginin sind, können auch verwendet werden. Diese beinhalten &agr;-Amino-&bgr;-guanidinopropionsäure, &agr;-Amino-&ggr;-guanidinobuttersäure oder &agr;-Amino-&egr;-guadininocapronsäure (enthaltend 2, 3 beziehungsweise 5 Linkeratome zwischen der Hauptkette und dem zentralen Guanidinumkohlenstoff).

Bei einer bevorzugten Ausführungsart sind alle Reste Arginin. Bei weiteren Ausführungsarten ist das Polymer ein Argininhomopolymer, das 6 bis 25, mehr vorzuziehen 6 bis 15, und am Besten 7 bis 10 Argininreste enthält. Die Argininreste können L-Stereoisomere, D-Stereoisomere oder eine Kombination davon sein. Vorzugsweise weisen alle Argininreste die L-Konfiguration auf.

Die terminalen Enden des Argininpolymers können mit oder nicht mit einer Cappingstruktur versehen sein. Vorzugsweise sind die terminalen Enden nicht mit einer Cappingstruktur versehen, was bedeutet, dass der N-Terminus eine freie Aminogruppe und der C-Terminus eine freie Carbonsäure aufweist. Das Polymer kann jedoch entweder an einem oder beiden terminalen Enden mit ausgewählten terminalen Komponenten, wenn erwünscht, mit einer Cappingstruktur versehen sein, vorausgesetzt, dass die Cappinggruppen den therapeutischen Nutzen des Polymers nicht nachteilig beeinflussen. Der N-Terminus kann z.B. mit einer N-Acetyl-, N-Methyl-, N-Dimethyl-, N-Ethyl-, N-Diethyl-, N-Boc-, N-Benzylgruppe oder dergleichen mit einer Cappingstruktur versehen werden. Ähnlich kann der C-Terminus mit einer Aminogruppe der Form NR2 (freies Amino, Alkylamino oder Dialkylamino), um eine terminale Amidkomponente (CONR2) zu bilden, worin jede R-Gruppe unabhängig voneinander H oder eine lineare, zyklische oder verzweigte C1-C10-Alkylgruppe, vorzugsweise C1-C5-Alkyl, und mehr vorzuziehen C1-C2-Alkyl ist; oder einem Alkylalkohol der Form OR, um einen Carbonsäureester (CO2R) zu bilden, worin R eine lineare, zyklische oder verzweigte C1-C10-Alkylgruppe, vorzugsweise C1-C5-Alkyl, und mehr vorzuziehen C1-C2-Alkyl ist, oder dergleichen mit einer Cappingstruktur versehen werden. Vorzugsweise enthalten solche N- und C-Cappinggruppen nicht mehr als 20 Kohlenstoffatome, und vorzugsweise nicht mehr als 10 Kohlenstoffatome.

Bei einer Ausführungsart besitzt das Polymer die Formel C-Argn-Y, worin X NH2 oder eine N-terminale Cappinggruppe ist, Y COO oder eine C-terminale Cappinggruppe ist und N eine ganze Zahl von 6 bis 30 ist, so dass die Arg-Reste L-Argininreste, D-Argininreste oder Kombinationen davon sind. Bei ausgewählten Ausführungsarten ist N eine ganze Zahl von 6 bis 30, 7 bis 30, 6 bis 25, 7 bis 25, 6 bis 15, 7 bis 15, 6 bis 10 oder 7 bis 10. Vorzugsweise haben alle Argininreste eine L-Konfiguration.

Die Polymerformeln beinhalten auch alle protonierten Varianten, die auftreten können, mit assoziierten Gegenionen. Das Argininpolymer kann als ein pharmazeutisch akzeptables Salz mit einem oder mehreren Gegenionen, wie Phosphat, Chlorid, Acetat, Proprionat, Fumarat, Maleat, Succinat, Citrat, Lactat, Palmitat, Cholat, Mucat, Glutamat, Camphorat, Glutarat, Phthalat, Tartrat, Laurat, Stearat, Salicylat, Methansulfonat, Benzolsulfonat, Sorbat, Picrat, Benzoat, Cinnamat und dergleichen bereitgestellt werden.

Die Argininpolymere können durch irgendein Verfahren, das auf dem Fachgebiet erhältlich ist, hergestellt werden. Günstig können die Polymere synthetisch hergestellt werden, z.B. unter Verwendung eines Peptidsynthetisierers (PE Applied Biosystems Model 433) (siehe Beispiel 1), oder sie können rekombinant unter Verwendung eines biologischen Expressionssystems durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, synthetisiert werden.

Für die Verwendung bei dem Transport von biologichen Wirkstoffen können die Polymere der Erfindung an Verbindungen, die transportiert werden sollen, durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, konjugiert werden. Exemplarische Verfahren der Synthese, einschließlich Einschluss von spaltbaren Linkern, beispielhafte Klassen von biologischen Wirkstoffen, die transportiert werden sollen, und Verfahren und Formulierungen für die Verabreichung werden in US 6,306,993, betitelt „Method and Composition for Enhancing Transport Across Biological Membranes", beschrieben.

III. Transport von Argininpolymeren über vaskuläre Zellmembranen

In den Studien, die unten beschrieben werden, wurde der Transmembrantransport und die zelluläre Aufnahme von Oligomeren durch Inkubation von Zellen oder Gewebe mit Biotin-Oligomerkonjugaten, gefolgt durch die Behandlung mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Streptavidin und darauf folgende Inkubation mit DAB (3,3'-Diaminobenzidin), einem Substrat des Enzyms, das ein stark gefärbtes Produkt hervorruft, beurteilt.

A. Translokation von Argininpolymeren in kultivierte VSMC und Endothelialzellen

Kultivierte VSMC (vaskuläre glatte Muskelzellen) wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit biotinylierten Oligomeren von Arginin oder Lysin behandelt. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit HRP-Streptavidinkonjugat, dann mit DAB behandelt. Die Färbung durch das Oxidationsprodukt wurde unter Verwendung von Lichtmikroskopie beobachtet. Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt. Mit Polylysin (bK7; 10 &mgr;M) wurde kein internalisiertes Biotinsignal beobachtet (1A). Auf der anderen Seite wurde sogar mit der niedrigsten Konzentration von biotinyliertem Heptaarginin (bR7; 0,1 &mgr;M) internalisiertes Biotin in allen VSMCs beobachtet (1B). Die Inkubation mit 10 &mgr;M bR7 zeigte sehr intensive Färbung, nicht nur in dem Cytoplasma, sondern auch in dem Kern von allen VSMC (1C).

Wenn die Zellen gegenüber 1 % Natriumazid für 30 Minuten vor der Inkubation mit bR7 ausgesetzt wurden, wurde weder cytoplasmatische noch nukleäre Färbung beobachtet (1E), was darauf hinweist, dass die zelluläre Aufnahme der Argininpolymere ein energieabhängiger Prozess ist. Wenn die Experimente jedoch bei 4°C durchgeführt wurden, wurde keine offensichtliche Reduktion bei der Effizienz der bR7-Translokation beobachtet (1D), was mit bekannten endozytotischen Stoffwechselwegen nicht vereinbar ist. Noch wurde die Translokation von bR7 durch die Zugabe von freiem L-Arginin bis zu 10 mM inhibiert (1F). Man würde erwarten, dass hohe Konzentrationen von extrazellulärem L-Arginin um die Bindung an den y+-Transporter, von dem bekannt ist, dass er Monomere von basischen Aminosäuren transportiert (Deves 1998), konkurrieren. Da exogenes L-Arginin nicht den Effekt auf die Argininpolymere blockierte, verwenden die Letzteren nicht das Transportsystem y+, um intrazellulären Zugang zu erhalten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Transport nicht durch das basische Aminosäuretransportsystem y+ oder durch klassische endozytotische Stoffwechselwege vermittelt wird.

Die Translokation der Polymere in Endothelialzellen (EC) wurde ähnlich untersucht, wie in Beispiel 3 beschrieben wird. Es wurden keine internalisierten Biotinsignale in Kontrollkulturen, die mit Träger oder mit Biotin alleine behandelt wurden, oder in Zellen, die mit Biotin-markiertem Heptalysin (bL-K7) behandelt wurden, nachgewiesen. Internalisiertes Biotin wurde jedoch sogar bei der niedrigsten Konzentration von b-R7 (0,1 &mgr;M) in dem Cytoplasma von allen EC beobachtet. Nach der Behandlung mit 10,0 &mgr;M b-R7 für 30 Minuten wurde internalisiertes Biotin nicht nur in dem Cytoplasma, sondern auch in dem Kern von nahezu allen exponierten Endothelialzellen nachgewiesen.

Es gab keine zu beobachtenden Unterschiede bei der Verteilung oder Intensität von internalisiertem Biotin zwischen den L- oder D-Formen von Heptaarginin (R7 und r7), was darauf hinweist, dass die Polymeraufnahme durch die Chiralität der Argininreste in dem Polymer unter den Bedingungen, die getestet wurden, nicht signifikant beeinflusst wird. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass sowohl L-R7 und D-r7 für die Translokation über sowohl cytoplasmische wie auch nukleäre Membranen von VSMC und Endothelialzellen in Kultur sehr effizient sind und als ein Träger für ein zweites Molekül, Biotin, wirken.

B. Ex vivo-Translokation von Argininpolymeren

Studien, die die Arteria carotis und Jugularvene von Kaninchen verwendeten, wie in Beispiel 4 beschrieben wird, wurden durchgeführt, um die Translokation der Polymere ex vivo zu beurteilen. Die mikroskopische Untersuchung der behandelten Arteria carotis-Segmente zeigte eine konzentrationsabhängige Aufnahme von Biotin in sowohl das Cytoplasma wie auch den Kern von allen vaskulären Zellen. Nach der Inkubation für 30 Minuten bei einer Dosis von 10,0 &mgr;M bL-R7 wurde ein deutliches Biotinsignal in nahezu allen intimalen Zellen, medialen Zellen und adventitiellen Zellen beobachtet. Siehe

2A, wo die Größe der bL-R7-Translokation als Prozent gefärbter Kerne (gefärbte Kerne/Gesamtkerne) ausgedrückt wird. Jugularvenensegmente, die mit bL-R7 inkubiert wurden, wiesen ein ähnliches Färbemuster auf. Wenn die Arteria carotis und Jugularvene mit biotinylierten Polylysin (bL-K7; 10 &mgr;M) inkubiert wurden, lagen keine gefärbten Zellen vor.

Das Ausmaß und die Intensität der Färbung der Polyarginin-behandelten Gewebe, wie auch die Tiefe des Eindringens in das Gewebesegment, stieg auf eine zeitabhängige Weise an, so dass innerhalb von 30 Minuten nahezu alle vaskulären Zellen ein deutliches Biotinsignal sowohl in dem Cytoplasma wie auch in dem Kern zeigten (2B-C). Diese Ergebnisse stimmen mit der Kinetik erster Ordnung für die Argininpolymeraufnahme überein.

Wenn bR7 intraluminal instilliert wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben wird, wurden Biotinsignale durch das gesamte Gefäß hindurch nachgewiesen, einschließlich der adventitiellen Zellen (der äußersten Schicht des Gefäßes), wobei sie intensiv nach 30 Minuten intraluminaler Aussetzung gefärbt wurden. Es gab keine Unterschiede zwischen D- und L-Formen von Heptaarginin in ihrer Fähigkeit, die vaskuläre Wand zu durchdringen und in alle Zellen zu translozieren.

Es gab keine offensichtliche Reduktion bei der Geschwindigkeit oder Effizienz der bL-R7-Translokation in Gefäßgewebe, wenn die Experimente bei 4°C durchgeführt wurden (2B-C), was darauf hinweist, dass die R7-Translokation nicht von klassischer Endozytose abhängig war. Beachte, dass die Inkubationen von Argininpolymer mit Gefäßsegmenten bei niedrigen Temperaturen (z.B. gerade oberhalb des Gefrierpunktes) erwünscht sein kann, um die Gefäßsegmente vor der Transplantation zu konservieren. Um die relative Stabilität der D- und L-Formen von Heptaarginin in vivo abzuschätzen, wurde das Verschwinden des Biotinsignals über die Zeit aus vaskulären Segmenten durch mikroskopische Untersuchung beobachtet. An den Tagen 1 und 2 nach der Aussetzung war das nukleäre Restbiotin sowohl in endothelialen wie auch medialen Zellen in Gefäßsegmenten, die mit bD-r7 behandelt wurden, größer als in denjenigen, die mit bL-R7 behandelt wurden (3A-B). Am Tag 5 wurde mit keiner der Formen eine signifikant positive Färbung beobachtet, aber es wurde nicht festgestellt, ob diese Beobachtung ein Ergebnis von zellulärem Abbau der Biotinkomponente war.

IV. Effekt von Argininpolymeren auf NO-Produktion und myointimale Hyperplasie A. Steigerung der NO-Produktion in Cytokin-stimulierten VSMC

Vaskuläres Stickoxid (NO) wird aus L-Arginin durch Endothelialzellen synthetisiert und trägt zu der vaskulären Relaxation, wie auch zu dem Erhalt der normalen vaskulären Struktur bei (Lloyd 1996, Cooke 1997). Es wurde gut nachgewiesen, dass vaskuläres NO die Monozytenadhärenz und Chemotaxis (Tsao 1997), die Thrombozytenadhärenz und Aggregation (Radomski 1990; Wolf 1997) und die vaskuläre glatte Muskelzell (VSMC)-Proliferation (Garg 1989) inhibiert.

Gefäßendothel exprimiert normalerweise endotheliale NO-Synthase (eNOS). Bei Erkrankungszuständen exprimieren vaskuläre Zellen auch induzierbare NO-Synthase (iNOS). Die Unordnung bei der NO-Synthese trägt zu der Entwicklung von vaskulären proliferativen Störungen, einschließlich Atherosklerose, Restenose nach Ballonangioplastie oder anderer Verletzung, und Venentransplantaterkrankung bei (Lloyd 1996; Cooke 1997). Hinweise der letzten Zeit weisen darauf hin, dass die Erhaltung oder Steigerung der NO-Synthese einige der pathophysiologischen Prozesse, die zu den vaskulären proliferativen Erkrankungen beitragen, verhindern oder umkehren kann.

Da die intrazellulären Spiegel von L-Arginin normalerweise die Km der NOS-Enzyme weit übertreffen, ist die NO-Synthese normalerweise nicht von extrazellulärer Zufuhr abhängig (Harrison 1997). Unter bestimmten Umständen kann jedoch die lokale L-Argininkonzentration Durchsatz begrenzend werden. Solche Umstände beinhalten erhöhte Plasma- oder Gewebespiegel des endogenen NO-Synthaseantagonisten ADMA (asymmetrisches Dimethylarginin) (Boger 1998) und die durch Entzündung induzierte Expression der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) (Guoyao 1998). Diese beiden Normabweichungen sind in dem Rahmen vaskulärer Verletzung wirksam (Dattilo 1997).

Induzierbare NOS wird auch, auf eine Dosis-abhängige Weise, durch IFN-&ggr; und LPS, wie in Beispiel 5 beschrieben wird, stimuliert. Zugabe von extrazellulärem L-Arginin bestätigte, dass L-Arginin ein limitierender Faktor für die NO-Produktion in Cytokin-stimulierten VSMC ist. Diese beiden Effekte werden in 4 gezeigt.

In Übereinstimmung mit der Erfindung steigern Poly(L)-Argininoligomere die NO-Synthese in Gefäßgewebe. Wie in Beispiel 6 beschrieben wird, wurden Cytokin-stimulierte VSMC, die in physiologischen Spiegeln (100 &mgr;M) von extrazellulärem (L)-Arginin inkubiert wurden, mit (L)-Argininoligomeren verschiedener Länge behandelt, dann mit IFN-&ggr; und LPS stimuliert. Die Vorbehandlung mit L-R5 für 30 Minuten ergab keine signifikante Steigerung der NO-Produktion. Die Vorbehandlung mit L-R7 und L-R9 resultierte jedoch in Dosisabhängigen Steigerungen der NO-Produktion bei Dosierungen, die so niedrig wie 10 &mgr;M lagen (5). Der Grad der Steigerung war signifikant größer bei Zellen, die mit R9 behandelt wurden, als bei denjenigen, die mit R7 behandelt wurden (24 ± 3,8 gegen 44 ± 5,2 %, p < 0,05). Die Behandlung mit D-r7 oder K7 (Polylysin) (100 &mgr;M, 30 Minuten) steigerte nicht die NO-Produktion (5). Die N-terminale Acetylierung der L-Peptide (R5, R7 und R9), die den intrazellulären Abbau verzögert, wies keinen signifikanten Effekt auf die NO-Produktion nach 24 Stunden auf (6). Wenn die R7-behandelten Zellen darauf folgend mit dem NO-Synthaseinhibitor, L-NMMA, behandelt wurden, wurde die Steigerung der NO-Produktion aufgehoben (7).

Es wurde herausgefunden, dass die Argininoligomere auf einer Massenbasis signifikant effizienter waren, als äquivalente Mengen von freiem Argininmonomer, welches nicht signifikant durch die Wände von arteriellen und venösen Segmenten aufgenommen wird. Wenn VSMCs gegenüber R7 für 5 Minuten ausgesetzt waren, wurde eine länger andauernde Steigerung der NO-Biosynthese für 24 Stunden beobachtet. Im Gegensatz dazu steigerte die Aussetzung von VSMCs gegenüber hohen Spiegeln (1 mM) von freien L-Arginin für 5 Minuten die NO-Biosynthese nicht signifikant (Daten nicht gezeigt).

Es wird vorgeschlagen, dass die (L)-Argininoligomere die NO-Produktion durch Ergänzung von intrazellulären (L)-Argininspiegeln steigern. Um klarzustellen, ob die R7-Translokation die iNOS-Proteinexpression in Cytokin-stimulierten VSMC beeinflusst, wurde die iNOS-Proteinexpression durch Western-Blotting untersucht (Beispiel 7). Inerte Ratten-VSMC exprimierten kein nachweisbares iNOS-Protein (130 KDa). Wenn die Zellen mit IFN-&ggr; und LPS stimuliert wurden, wurde nachweisbare Expression von iNOS-Protein wie erwartet beobachtet. Die Behandlung mit R7 (10 &mgr;M, 30 Minuten Aussetzung) hatte jedoch keinen Effekt auf die Expressionsspiegel von iNOS. Daher war die Steigerung der NO-Produktion durch die L-Argininoligomere, R7 und R9, nicht durch eine Steigerung in der iNOS-Expression bedingt.

Wie oben gezeigt wurde, sind die Argininpolymere der Erfindung extrem effizient bei der Translokation in Gefäßzellen. Die zelluläre Translokation ist energieabhängig, aber beteiligt nicht klassische Endozytose, noch den basischen Aminosäuretransporter. Die Vorbehandlung von Zellen mit R7 (10 &mgr;M) rief eine signifikante Erhöhung der NO-Produktion hervor, was nicht beobachtet wurde, wenn die Zellen mit hohen Konzentrationen an freiem L-Arginin behandelt wurden (bis zu 1 mM). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die zelluläre Aufnahme der kurzen Polymere von Arginin mit einer von dem y+-Transportsystem verschiedenen Kinetik einzigartig effizient ist.

B. Effekte von D- und L-Argininpolymeren auf die NO-Produktion und eine Myointima-Bildung bei Venentransplantaten

Myointimale Hyperplasie involviert die Migration und Proliferation von VSMCs in der Intima, begleitet von der Ausarbeitung von extrazellulärer Matrix (DeMeyer 1997). Innerhalb von 24 Stunden nach einer Gefäßverletzung (z.B. Einsetzung eines Venentransplantats oder Ballonangioplastie), exprimieren VSMC iNOS (Morris 1994; Hansson 1994). Vaskuläres NO, das hauptsächlich von iNOS in dem Rahmen von Gefäßverletzung stammt, kann eine wichtige Rolle bei der Suppression von VSMC-Hyperplasie spielen (Lloyd 1996; Cooke 1997), wobei es die Monozytenadhärenz und Infiltration und VSMC-Proliferation hemmt und die VSMC-Apoptose induziert (Tsao 1996, 1997; Garg 1989).

Mit Blick auf den extrem effizienten Transport von Argininoligomeren in Gefäßzellen, wie oben gezeigt wurde, und die Steigerung von intrazellulären NO-Spiegeln durch Poly(L)-Arginin, wurde die Fähigkeit dieser Polymere, intimate Hyperplasie zu inhibieren, untersucht. Es wurden Venentransplantationen bei männlichen weißen Neuseelandkaninchen durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben wird. Nach der Exzision und vor der Transplantation wurde die Jugularvene vorsichtig gespült und in PBS (Kontrolle) oder in PBS, das entweder L-R7 oder D-r7 (10,0 &mgr;M) enthielt, für 30 Minuten eingetaucht. L-R5 und D-r5 (10,0 &mgr;M), von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie nicht über die Zellmembran translozieren, wurden auch als Kontrollen verwendet.

Alle Venentransplantate, die mit dem Träger allein behandelt wurden, entwickelten signifikante myointimale Hyperplasie 28 Tage nach der Operation (8A; Pfeilspitzen weisen auf die innere elastische Lamina). Im Gegensatz dazu wiesen Gefäßsegmente, die mit entweder L-R7 (8B) oder D-r7 (8C) behandelt wurden, wesentlich geringere Myointima-Bildung auf (intimaler Bereich: Kontrolle; 1,7 ± 0,8; L-R7; 0,5 ± 0,2; D-r7; 1,1 ± 0,4 mm2, p < 0,05). Die Behandlung mit L-R7 war effektiver als mit D-r7, wobei der intimate Bereich um mehr als 70 % gegenüber ungefähr 35 % für D-r7 reduziert wurde. Das Intima-/Media-Verhältnis (I/M) von L-R7 behandelten Venentransplantaten betrug auch signifikant weniger als sowohl bei den Kontroll- wie auch D-r7-behandelten Transplantaten (I/M: Kontrolle; 1,5 ± 0,5, L-R7; 0,4 ± 0,2, D-R7; 0,8 ± 0,2, p < 0,05). Die Behandlung unter Verwendung der kleinen Oligopeptide (R5), die schlecht über die Membranen translozieren, war für die Inhibition für Myointima-Bildung nicht effektiv, was nahe legt, dass die beobachteten inhibitorischen Effekte durch die Translokation der Heptamere von Arginin und nicht einfach durch die Verfügbarkeit von Poly-Arginin, z.B. komplexiert an der Zellmembran, zustande kam.

Die größere Aktivität des L-Polymers ist mit Proteolyse vereinbar, um L-Arginin-Monomere zu bilden, die die Bildung von NO fördern können. So wird eingeschätzt werden können, wie die Zusammensetzung des Argininpolymers modifiziert werden kann, um die Variationen in der Geschwindigkeit der Argininfreisetzung zu erreichen. Die Geschwindigkeit der Argininfreisetzung kann durch Einschluss von einem oder mehreren D-Argininresten, die die Geschwindigkeit des proteolytischen Abbaus des Polymers verlangsamen, verlangsamt werden. Zusätzlich muss D-Arg zu L-Arg konvertiert werden (siehe unten), bevor es als ein Substrat für die NO-Synthase dienen kann. Bei einer Ausführungsart weisen alle Argininreste in dem Polymer eine L-Konfiguration für eine schnellere biologische Aktivität auf.

Die Transplantate wurden nach 3 Tagen für die Beurteilung der NO-Produktion entnommen, wie in Beispiel 9 beschrieben wird. Die basale NOx-Produktion von L-R7-behandelten Venentransplantaten lag signifikant höher als diejenige von sowohl den Kontroll- wie auch den D-r7-behandelten Transplantaten, wie in 10A gezeigt wird (Kontrolle; 35 ± 6, L-R7; 80 ± 14, D-r7; 48 ± 8 nM/mg Gewebe/h, p < 0,05). Es gab keinen signifikanten Unterschied bei der basalen NOx-Produktion zwischen D-r7-behandelten und mit Träger behandelten Venentransplantaten.

Calciumionophor-Stimulation von eNOS beeinflusste die NOx-Produktion durch die Venentransplantate nicht signifikant (10A). Die Transplantatsegmente wurden in Medium entweder in der Abwesenheit (basal) oder der Gegenwart (stimuliert) von Calciumionophor inkubiert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Hauptanteil von NO durch die Calcium-unabhängige induzierbare Form von NO-Synthase (eher als durch die endotheliale Isoform) erzeugt wurde und dies ist mit vorangehenden Berichten über die iNOS-Expression in VSMC nach Venentransplantation vereinbar.

Da D-Arginin kein Substrat für die NO-Synthase ist, war sein inhibitorischer Efffekt auf die myointimale Hyperplasie überraschend. Dem Effekt von D-r7 konnte NO-Produktion nach Epimerisierung von D- zu L-Arginin zugrunde liegen (Wang et al., 1999; D'Aniello et al., 1993). Es ist auch bekannt, dass D-Arginin zu D-Citrullin und NO durch eine nichtenzymatische Reaktion, die Wasserstoffperoxidase involviert, oxidiert werden kann (Nagase et al., 1997).

Alternativ könnte/n ein NO-unabhängiger Mechanismus/Mechanismen der Polyargininwirkung vorliegen. Sowohl L-R7- wie auch D-r7-Behandlung inhibierte die Proliferation von VSMC in vitro. Da nicht stimulierte VSMC weder konstitutive noch induzierbare NO-Synthase exprimieren, scheint dieser inhibitorische Effekt von NO unabhängig zu sein. Ein möglicher von NO unabhängiger Effekt der Argininpolymere könnte durch eine kationische Wechselwirkung mit Nukleinsäure vermittelt sein; Argininreiche Sequenzen werden in RNA-Bindungsproteinen oft gefunden.

Es wurden die direkten zytostatischen Eigenschaften von Argininoligomeren untersucht, wie in Beispiel 10 beschrieben wird. Ratten-VSMC wurden mit entweder L-R7 oder D-r7 (10,0 &mgr;M, 30 Minuten) inkubiert, dann mit Wachstumsmedium, das 0,5 % FBS enthielt, für 48 Stunden inkubiert. Zellproliferations-Assays enthüllten, dass in der Abwesenheit von NOS-Enzym die VSMC-Proliferation durch Vorbehandlung mit entweder L-R7 oder D-r7 im Vergleich mit der Trägerinkubation signifikant inhibiert wurde. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen L-R7- und D-r7-Behandlungsgruppen bei diesem NO-unabhängigen zytostatischen Effekt (10B).

C. Effekte von L-Argininpolymeren auf GCAD beim Herz-Transplantations-Modell

Transplantatvaskulopathie (GCAD) wird durch diffuse neointimale Hyperplasie in den Koronararterien des transplantierten Herzens charakterisiert. Wie oben diskutiert wurde, limitiert Stickoxid (NO) die Entwicklung von Neointima-Bildung durch Inhibition von vaskulärer glatter Muskelzellproliferation.

Bei dieser Studie wurden PVG-Ratten-Spenderherzen (n = 48) heterotopisch in das Abdomen von ACI-Empfängern transplantiert. Die Spenderherzen erhielten entweder intrakoronares PBS oder intrakoronares 50 &mgr;M (L)-Argininpolymer (L-R5 oder L-R9) für 30 Minuten. (D-Argininpolymere wurden in dieser Studie nicht eingeschlossen). Jede dieser Gruppen wurde weiter in 60- und 90-Tag-Studientiere aufgeteilt (je n = 6). Prozent luminale Verengung, Intima zu Media-Verhältnis (I/M) und Prozent betroffene Gefäße wurden bestimmt, wie in Beispiel 11 unten beschrieben wird. Die Transfektionseffizienz wurde durch Infusion von biotinyliertem R5 und R9, wie in den vorangehenden Studien, und durch Berechnung des Prozentsatzes von Biotin-positiven Kernen geteilt durch die Gesamtanzahl von Kernen, bestimmt.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 unten gezeigt. Wie die Daten zeigen, zeigte das R5-Oligomer minimale Transfektion von koronaren Gefäßen und im Grunde keinen Unterschied bei der GCAD im Vergleich zu PBS-Kontrollen sowohl nach 60 wie auch 90 Tagen. Die R9-Gruppen zeigten jedoch beide deutliche Transfektionen der Intima und Media der koronaren Gefäße und eine signifikante Reduktion bei der GCAD (p-Werte < 0,05) an den postoperativen Tagen 60 und 90.

Tabelle 1: Transplantationsstudie

5. Isolierter Gefäßconduit

Bei einer weiteren Ausführungsart stellt die Erfindung einen isolierten Gefäßconduit bereit, wie ein arterielles Segment, venöses Segment oder ein künstliches Gefäßsegment, das so hergestellt wird, dass es ein Polymer von Arginin, wie hier beschrieben wird, enthält. Jeder geeignete Conduit kann verwendet werden. Wie hier verwendet, bezeichnet „isoliert" ein Conduit, das vor der Transplantation außerhalb des Patientenkörpers vorliegt.

Beispielhafte arterielle Conduits beinhalten Segmente der Arteria mammaria interna (IMA), Arteria thoracica interna und Arteria gastroepiploica. Venöse Segmente können aus verschiedenen Quellen hergestellt werden, vorzugsweise aus einer kutanen Vene von einem Arm oder Bein eines Patienten, wie einer Saphena-Vene. Vorzugsweise ist das Gefäßsegment eine autologe Saphena-Vene oder ein Arteria mammaria interna-Segment. Es können jedoch auch venöse und arterielle Segmente von anderen menschlichen Spendern (Allotransplantate) verwendet werden, wie auch Gefäßsegmente, die von anderen Tieren (Xenotransplantate), wie Schweinen, erhalten werden. Günstigerweise wird das Segment von dem Patienten erhalten, der das Gefäßconduit-Transplantat erhalten soll. Zusätzlich kann der Gefäßconduit auch als ein künstliches Gefäßsegment bereitgestellt werden, das aus einem physiologisch kompatiblen Material, wie „DACRONTM", PTFE oder anderen Nicht-Gewebe-Transplantatmaterialien hergestellt wird, und das vorzugsweise z.B. durch Carboxylierung, Sulfonierung oder Phosphorylierung hergestellt oder derivatisiert wird, um negativ geladene Gruppen für die Adsorption des positiv geladenen Argininpolymers zu enthalten. Das künstliche Gefäßsegment kann auch teilweise porös in seiner inneren Wand sein, um eine Reservoir-Region bereitzustellen, aus der das Argininpolymer allmählich diffundieren kann, nachdem der Conduit in den Patienten transplantiert wurde. Obwohl intimate Hyperplasie innerhalb künstlicher Segmente nicht auftreten würde, können sie an den anastomotischen Verbindungen, an denen die terminalen Enden des künstlichen Segments an das Gefäßsystem des Patienten grenzen, besonders problematisch sein. Deshalb kann solche intimale Hyperplasie, benachbart zu dem transplantierten Gefäßconduit, durch das Argininpolymer inhibiert werden.

Für die Transplantation kann der Gefäßconduit von jeder passenden Länge, z.B. 3 bis 12 Inches (7,6-30,5 cm) Länge, lang sein. Es können eine Vielzahl von Gefäßsegmenten von dem gleichen Individuum verwendet werden, einschließlich sowohl arteriellen wie auch venösen Segmenten.

Das Argininpolymer wird vorzugsweise in einer sterilen, physiologisch geeigneten Flüssigkeit aufgelöst, die die Störung der physikalischen und biologischen Funktion des Gefäßconduits minimiert. Beispielhafte Flüssigkeiten beinhalten Serum-freie Kulturmedien, wie Serum-freies Dulbecco's Minimal Essentielles Medium (DMEM), wässrige Lösungen, wie 0,9 % (G/V) Kochsalzlösung (NaCl), und andere sterile flüssige Medien oder Lösungen, die bei Gefäßtransplantateingriffen verwendet werden. Das Polymer wird in einer Konzentration bereitgestellt, die den erwünschten Effekt erreicht. Typischerweise liegt die Polymerkonzentration bei von 0,01 &mgr;M bis 100 &mgr;M, vorzugsweise 1 &mgr;M bis 50 &mgr;M oder 1 &mgr;M bis 25 &mgr;M, obwohl die Konzentrationen über oder unter diesen Bereichen auch verwendet werden können.

Der Gefäßconduit wird mit der Argininpolymer enthaltenden Flüssigkeit für eine Zeit, die ausreicht, damit das Argininpolymer in die Wand des Gefäßes aufgenommen werden kann, in Kontakt gebracht, so dass eine Reduktion an intimaler Hyperplasie nach der Transplantation erhalten wird. Z. B. kann der Gefäßconduit in die Lösung eingetaucht werden, so dass das Argininpolymer sowohl die inneren wie auch äußeren Wände des Gefäßes durchdringt. Alternativ kann die Polymerlösung in das Gefäß eingebracht werden, wobei beide Enden durch Ligation, Klammerung oder dergleichen verschlossen werden, so dass nur die intraluminale Wand gegenüber dem Polymer ausgesetzt ist. Normalerweise wird die Polymerflüssigkeit mit dem Gefäßsegment für von 60 Sekunden bis 120 Minuten in Kontakt gebracht, typischer zwischen 5 und 45 Minuten und vorzugsweise für eine Zeit, die weniger als 30 Minuten beträgt. Im Allgemeinen ist eine geringere Kontaktzeit bei höheren Konzentrationen von Argininpolymer notwendig. Der Schritt des In-Kontakt-Bringens kann bei jeder geeigneten Temperatur durchgeführt werden, typischerweise bei einer Temperatur von 4°C bis 37°C und günstig bei Umgebungsraumtemperatur.

Bevor oder nachdem der Gefäßconduit mit der Argininpolymerlösung in Kontakt gebracht wird, kann das Gefäßsegment in den gleichen Arten von Flüssigkeiten, die oben erwähnt werden, ohne das Argininpolymer gelagert werden. Vorzugsweise werden die venösen und arteriellen Gefäßsegmente ex vivo so kurz wie möglich erhalten, um dabei zu helfen, den Abbau ihrer Funktion zu vermeiden.

Der Ort, an den der Gefäßconduit transplantiert werden soll, kann durch konventionelle Verfahren vorbereitet werden, z.B. für einen koronaren Bypass oder einen Femoropoplietalen arteriellen Bypasseingriff des Knies oder unterhalb des Knies. Beschädigtes oder nekrotisches Gewebe wird entfernt und der Ort wird chirurgisch für die Befestigung des neuen Gefäßconduits vorbereitet, vorzugsweise während der Zeit, in der der Gefäßconduit mit dem Argininpolymer in Kontakt gebracht wird. Nach dem Transplantationseingriff kann der Patient periodisch überwacht werden, um die physiologische Akzeptanz des Transplantates zu bestätigen und den Grad von Blutfluss durch das transplantierte Gefäß über die Zeit zu beurteilen.

VI. Behandlungsverfahren

Wie oben gezeigt wird, sind die Polymere, die hier beschrieben werden, nützlich bei der Reduktion von Hyperplasie nach Plastik und nach Transplantation. Demgemäß wird ein Verfahren beschrieben, bei dem eine oder beide der Gefäßregionen, die einem ankommenden Gefäßconduit benachbart sind, mit einer Lösung eines Argininpolymers, wie hier beschrieben wird, in Kontakt gebracht werden, um intimale Hyperplasie nach Transplantation in diesen Bereichen zu inhibieren. Z. B. wird, nachdem ein nekrotisches Gefäßsegment (Läsion) entfernt worden ist (durchtrennt wurde), der verbleibende Gefäßbereich stromabwärts von dem Exzisionsort (distal zum Herzen) an einem Punkt mehrere Zentimeter (z.B. 4 cm) von dem proximalen Ende von dem stromabwärts liegenden (distalen) Bereich abgeklemmt, der abgeklemmte Bereich wird mit Argininpolymerlösung gefüllt und das proximale Ende wird dann abgeklemmt, um eine „Wurst" zu schaffen, die die Polymerlösung enthält. Nachdem die Argininpolymerlösung in dem abgeklemmten Bereich für eine geeignete Zeit inkubiert wurde, wird die proximale Klammer entfernt und die Argininpolymerlösung wird wahlweise entfernt, gefolgt von der Entfernung der verbleibenden Klammer.

Ein ähnliches Verfahren kann in dem vaskulären Bereich stromaufwärts des Exzisionsortes durchgeführt werden, wo der Gefäßconduit transplantiert werden soll. Durch In-Kontakt-Bringen der inneren Wände der distalen und proximalen vaskulären Bereiche, die dem Transplantationsort benachbart sind, bei den Patienten bevor der Gefäßconduit in den Patienten transplantiert wird, kann die Schutzzone gegen intimale Hyperplasie um den Transplantationsort herum ausgedehnt werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit des Erfolges gesteigert wird. Dieses Verfahren ist besonders für künstliche Gefäßplastiken nützlich, um intimale Hyperplasie an den anastomotischen Verbindungen zu inhibieren.

Die Inhibition der intimalen Hyperplasie bei einem Gefäß erstreckt sich auf die Verwendung der Polymere, die hier beschrieben werden, um „Patches" von Arterienwänden zu reparieren, z.B. Venen-Patches, die verwendet werden, um Arterien zu reparieren, die einer Endarteriektomie für atheroskierotische Plaques unterzogen wurden. Solche Patches, wenn sie nicht behandelt werden, machen häufig intimate Hyperplasie durch.

Eine andere Anwendung, bei der die Materialien, die hier beschrieben werden, Anwendung finden, besteht bei dem vaskulären Zugangsmodell von Nierendialyse, wo eine operativ gebildete arteriell-venöse Anastomose oder ein Shunt einen Zugang zu der Arterie und Vene, die für die Dialyse verwendet wird, bereitstellt. Während der Dialyse, ist die Geschwindigkeit des Blutflusses, die Turbulenz und die Belastung einer venösen Verbindung viel höher als in einer normalen Vene Wiederholte Aussetzung gegenüber diesen Drücken führt häufig zu Hyperplasie und Stenose innerhalb der Vene, was Dialysezugangs-Versagen hervorruft (siehe z.B., Überblicke durch Himmelfarb, 1999 und Woods et al., 1997). Unter diesen Umständen müssen wiederholte Operationen an frischen Gefäßsegmenten durchgeführt werden. In Übereinstimmung mit dem vorliegenden Verfahren wird bei dem Anastomose-Eingriff das Venensegment, das transplantiert werden soll, gegenüber einer Argininpolymerlösung ausgesetzt, typischerweise durch Infusion in das abgeklemmte Segment, bevor die Fixierung an der Zielarterie stattfindet. Diese Behandlung reduziert signifikant Hyperplasie und verlängert die brauchbare Lebenszeit der Anastomose, wodurch der Bedarf für weitere Operationen reduziert wird.

Das Verfahren und die Verwendungen der Erfindung können auch bei der Prävention von Vaskulopathie oder chronischer Abstoßung von transplantierten Organen verwendet werden. Die Verhinderung von GCAD bei einem Herz-Transplantationsmodell wird oben gezeigt. Vorzugsweise wird das Organ, wie ein Herz oder eine Niere, von dem Spender in eine Argininpolymerlösung entnommen. Zurzeit verwendete Konservierungs/Transportmedien, wie CardiopleginTM, könnten mit dem Polymer ergänzt werden. Das Polymer wird in einer Konzentration bereitgestellt, die den erwünschten Effekt erreicht. Typischerweise liegt die Polymerkonzentration bei von 0,01 &mgr;M bis 100 &mgr;M, vorzugsweise 1 &mgr;M bis 50 &mgr;M oder 1 &mgr;M bis 25 &mgr;M, obwohl Konzentrationen über oder unterhalb dieser Bereiche verwendet werden können. Das Organ, das transplantiert werden soll, wird mit der Argininpolymer enthaltenden Flüssigkeit für eine Zeit, die ausreicht, damit das Argininpolymer in die vaskulären Gewebe des Organs aufgenommen werden kann, in Kontakt gebracht, so dass eine Reduktion an intimaler Hyperplasie nach der Transplantation erreicht wird.

Das Transplantationsverfahren, das hier beschrieben wird, überlegt auch die Verwendung in Zusammenhang mit anderen verbessernden Verfahren, die den Erfolg der Transplantation erleichtern könnten. Z. B. kann der Patient auf eine Arginin-reiche Diät gesetzt werden, um vaskuläre NO-Spiegel zu steigern, wie in U.S.-Patenten Nr. 5,428,070, 5,852,058, 5,861,168 und 5,891,459 durch J. P. Cooke und Mitarbeiter gelehrt wird. Zusätzlich können anti-thrombotische Medikamente wie Heparin kurz bevor und nach der Transplantation verabreicht werden, um die Möglichkeit einer Thrombusbildung reduzieren zu helfen.

VII. Formulierungen

Zusammensetzungen und Verfahren, die hier beschrieben werden, haben einen Nutzen in dem Bereich von menschlichen und veterinärmedizinischen vaskulären Behandlungen. Die intrinsischen biologischen Effekte der betreffenden Oligomere bei der Steigerung der NO-Synthese und/oder Inhibition der intimalen Hyperplasie sind nützlich bei der Verhinderung oder Behandlung vaskulärer Erkrankung oder Verletzung, insbesondere bei der Behandlung vaskulärer proliferativer Störungen, wie postoperativer Restenose. Zusätzlich sind die Polymere auf dem Gebiet der intrazellulären Abgabe von therapeutischen Wirkstoffen, die begrenzten Zelleintritt in unkonjugierter Form zeigen, nützlich.

Die Stabilität der Oligomere kann durch die Zusammensetzung und Stereochemie der Hauptkette und Seitenketten kontrolliert werden. Für Polypeptide sind D-Isomere im Allgemeinen resistent gegenüber endogenen Proteasen und weisen daher längere Halbwertszeiten im Serum und innerhalb von Zellen auf. Für die Verwendung der betreffenden Oligomere bei der Inhibition von intimaler Hyperplasie werden Oligomere, die L-Arginin in vivo erzeugen, z.B. L-Argininoligomere, bevorzugt. Wie oben gezeigt wird, waren jedoch auch D-Argininoligomere, die nicht einfach zu Arginin abgebaut werden, in diesem Bereich effektiv.

Die Zusammensetzungen beinhalten typischerweise einen konventionellen pharmazeutischen Träger oder Arzneiträger und können zusätzlich andere medizinische Wirkstoffe, Träger, Adjuvantien und dergleichen beinhalten.

Vorzugsweise wird die Zusammensetzung bei ungefähr 5 bis 75 Gewichtsprozent einer Verbindung oder Verbindungen der Erfindung liegen. Wie oben angemerkt wurde, können Medien, die für Herztransplantationen verwendet werden, einen cardioplegischen Wirkstoff, wie CardiopleginTM, eine Mischung aus Magnesiumaspartat, Procain und Sorbitol, oder ähnliche Zusammensetzungen enthalten (siehe z.B. Isselhard et al., 1980). Geeignete Arzneiträger können auf die besondere Zusammensetzung oder den Verabreichungsweg durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, zugeschnitten sein.

Flüssige Zusammensetzungen können durch Auflösen oder Dispersion des Polymers (ungefähr 0,5 % bis ungefähr 20 %) und optional pharmazeutischer Adjuvantien in einem Träger, wie z.B. wässriger Kochsalzlösung (z.B. 0,9 % G/V Natriumchlorid), wässriger Dextrose, Glycerol, Ethanol und dergleichen hergestellt werden, um eine Suspension oder vorzugsweise eine Lösung zu bilden. Wie oben diskutiert wurde, kann die Polymerlösung verwendet werden, um ein Gefäß oder Organ, das als Plastik dienen oder transplantiert werden soll, vor der Operation einzutauchen.

Die Polymere können an ein Gefäß auch postoperativ oder nach einem Angioplastieeingriff abgegeben werden. Vorrichtungen für die Abgabe eines Medikamentes an das Lumen eines Gefäßes sind auf dem Fachgebiet bekannt und beinhalten z.B. perforierte oder poröse Katheterballons, die das Medikament enthalten. Solch eine Abgabevorrichtung kann auch in einen biokompatiblen polymeren Träger, wie ein PluronicTM Hydrogel, der das Medikament enthält, inkorporiert sein.

Die Polymere, die hier beschrieben werden, werden in einer therapeutisch effektiven Menge verabreicht, sprich einer Dosierung, die ausreicht, um eine Behandlung hervorzurufen, wobei sie abhängig von dem Individuum und dem Zustand, der behandelt werden soll, variieren wird. Typischerweise liegt eine therapeutisch effektive tägliche Dosis bei von 0,1 bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag der Medikamentenverabreichung. Die meisten Zustände reagieren auf die Verabreichung einer Gesamtdosierung zwischen ungefähr 1 und ungefähr 30 mg/kg Körpergewicht pro Tag, oder zwischen ungefähr 70 mg und 2.100 mg pro Tag für eine 70 kg Person.

Die verabreichten Dosierungen werden im Allgemeinen effektiv sein, um picomolare bis micromolare Konzentrationen der therapeutischen Zusammensetzung an den Ort abzugeben. Geeignete Dosierungen und Konzentrationen werden von Faktoren, wie der therapeutischen Zusammensetzung oder dem Medikament, dem Ort der beabsichtigten Abgabe und dem Verabreichungsweg abhängen, die alle empirisch gemäß den Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, abgeleitet werden können.

Für bestimmte Anwendungen kann auch z.B. die Abgabe an einen Ort von Angioplastie, das Oberflächengebiet von Gewebe, das behandelt werden soll, berücksichtigt werden. Für die Abgabe an den Ort von Gefäßverletzung, können in vivo-Modelle, wie in Edelmann, 1995, beschrieben, verwendet werden. Weitere Anleitung kann aus Studien erhalten werden, die experimentelle Tiermodelle für die Beurteilung von Dosierungen verwenden, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind.

Verfahren für die Herstellung solcher Dosierungsformen sind demjenigen, der auf dem Fachgebiet bewandert ist, bekannt oder sie sind ihm offensichtlich; siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences (19. Ausgabe, Williams & Wilkins, 1995). Die Zusammensetzung, die verabreicht werden soll, wird auf jeden Fall eine Menge der aktiven Verbindung/der Verbindungen in einer pharmazeutisch effektiven Menge für eine Erleichterung des Zustandes, der behandelt wird, enthalten, wenn sie in Übereinstimmung mit den Lehren dieser Erfindung verabreicht wird. Die Zusammensetzungen für die Verwendung bei den Methoden, die hier beschrieben werden, können auch in Kits eingeschlossen sein und/oder mit Instruktionen für die Verwendung abgepackt sein.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung veranschaulichen, aber nicht begrenzen.

Materialien und Methoden Zellkultur

Ratten-VSMCs wurden aus der Mediaschicht der thorakalen Aorta von Sprague-Dawley-Ratten durch das Explantationsverfahren hergestellt. Die Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Gibco BRL, Gaithersburg, MD), das 10 % fötales Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und 100 &mgr;g/ml Streptomycin enthielt, bei 37°C unter einer befeuchteten Atmosphäre, die 5 % CO2 enthielt, kultiviert. Nach subkonfluierendem Wachstum wurden die Zellen mit MEM Select Amine Kit (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) kultiviert, um sie mit spezifischen Konzentrationen von extrazellulärem freiem L-Arginin zu behandeln. Die Experimente wurden unter Verwendung von kultivierten Zellen bei Passagespiegeln von 5-10 durchgeführt.

Histologischer Nachweis von internalisierten Biotin-markierten Oligomeren

Nach der Inkubation mit Biotin-markierten Oligomeren, wurden die vaskulären Segmente gewaschen, dann in OCT-Verbindung (Miles Scientific) gefroren. Die Gefrierschnitte, 5 &mgr;m dick, wurden mit Aceton für 10 Minuten fixiert. Internalisiertes Biotin wurde unter Verwendung des Färbeverfahrens, das in Beispiel 2 beschrieben wird, nachgewiesen. Methyl Grün wurde für nukleäre Gegenfärbung verwendet.

Um die Effizienz der nukleären Translokation zu quantifizieren, wurden sowohl die Anzahl der DAB-positiven Kerne und Gesamtkerne in der Intima und Media unabhängig voneinander bei X400-Vergrößerung mit einem Videobild-Analysesystem (Automatrix) gezählt. Die Frequenz der nukleären Translokation würde als das Prozent gefärbter Kerne, definiert als das Verhältnis der Anzahl von DAB-positiven Kernen zu dem aller Kerne, in der Intima und Media ausgedrückt. Jedes Protokoll wurde 4-mal wiederholt.

NO2-Messung

Extrazelluläre NO-Produktion wurde als sein stabiler oxidativer Metabolit, Nitrit (NO2) gemessen. Am Ende jeder Inkubation wurden Proben des Mediums (80 &mgr;l) abgenommen und die NO2-Messung wurde unter Verwendung der Griess-Reaktion, erleichtert durch einen kommerziellen colorimetrischen Assay (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), durchgeführt. Die Werte der NO2-Produktion wurden mit der relativen Zellzahl, beurteilt durch ein Zellproliferations-Kit II (XTT) (Boehringer Mannheim, Deutschland), korrigiert.

Statistische Analyse

Alle Werte wurden als Mittel ± Standardabweichung ausgedrückt. Die Mittelwerte wurden unter Verwendung einer Varianzanalyse verglichen und p-Werte geringer als 0,05 wurden als statistisch signifikant akzeptiert.

Rekombinantes Ratten-rekombinantes Interferon-&ggr;, E. coli Lipopolysaccharid (0111:B4) und L-NMMA (NG-Monomethyl L-Arginin) wurde von Sigma Chemical (St. Louis, MO) erworben. Ein monoklonaler anti-iNOS-Antikörper wurde von Transduction Laboratories (Lexington, KY) erworben und Ziegen-anti-Maus-IgG-Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, wurde von Kierkegaard und Perry Laboratories (Gaithersburg, MD) erhalten.

Experimentelle Protokolle wurden durch das Administrative Panel on Laboratory Animal Care of Stanford University zugelassen und wurden in Übereinstimmung mit dem „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", herausgegeben durch das National Institute of Health (NIH Publication No. 80-23, überarbeitet 1985), durchgeführt.

Beistiel 1: Peptidsynthese

Die Peptide wurden unter Verwendung von Festphasentechniken und kommerziell erhältlichen Fmoc-Aminosäuren, Harzen und Reagenzien (PE Biosystems, Foster City, und Bachem, Torrence, CA) auf einem Applied Biosystems 433 Peptid-Synthetisierer, wie zuvor beschrieben (Hill 1994) synthetisiert.

Beispiel 2: Translokation von Biotin-markierten Peptiden in VSMCs

Ratten-VSMCs wurden auf gläsernen Mikroskop-Objekttrager-Kammern (Nunc Inc., Naperville, IL) gezüchtet. Subkonfluierende Zellen wurden gewaschen und in serumfreies Medium platziert. Nach zwei Stunden wurden die Zellen mit bR7 oder bK7 (0,1 &mgr;M, 1,0 &mgr;M, 10 &mgr;M,) bei 37°C für 30 Minuten behandelt. Um die Rolle der Endozytose bei der zellulären Aufnahme der Peptide zu beurteilen, wurden Experimente bei 4°C und auch in der Gegenwart von Natriumazid (1,0 %) für 30 Minuten vor der Aussetzung gegenüber den Peptiden durchgeführt. Um die Verwicklung des basischen Aminosäure-Transportsystems y+ in die Translokation von Peptiden in die Zellen zu beurteilen, wurden Experimente in der Gegenwart von einem Überschuss an extrazellulärem L-Arginin (10 mM) durchgeführt.

Nach 30 Minuten Inkubation mit den Peptiden wurden die Zellen 3-mal mit Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, für 5 Minuten bei –20°C in Ethanol/Aceton fixiert, 3-mal in PBS gewaschen, für 30 Minuten mit einem Peroxidasesuppressor (ImmunoPure, Rockford, IL) inkubiert, um endogene Peroxidaseaktivität und unspezifische Bindung zu blockieren, gewaschen und dann mit 5 &mgr;g/ml Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiertem Streptavidin (Pierce, Rockford, IL) für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden 3-mal mit PBS gewaschen und ein Substrat aus HRP, DAB (Sigma, St. Louis, IL) wurde zu den Zellen zugegeben. Die Reaktion wurde durch Waschen in destilliertem Wasser nach einer 60-sekündigen Inkubation mit DAB beendet. Die Zellpräparate wurden durch konventionelle Lichtmikroskopie beobachtet (siehe 1). Dieses experimentelle Protokoll wurde 3-mal wiederholt.

Beispiel 3: In vitro Translokationsstudie

Spontan transformierte menschliche Nabelvenenendothelialzellen (ECV304, ATCC) wurden in Medium M199 (Irvine Scientific), das 10 % fötales Rinderserum (FBS), 100 IU/ml Penicillin und 100 &mgr;g/ml Streptomycin (Gibco BRL) enthielt, kultiviert. Konfluierende Zellen wurden gewaschen und in serumfreies Medium platziert. Nach zwei Stunden wurden die Zellen in Gegenwart von mit Biotin markierten Peptiden, wie bL-R7 oder bD-R7 oder bL-K7 (0,1, 1,0 und 10,0 &mgr;M) inkubiert. Nach 30 Minuten Inkubation wurden die Zellen 3-mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, in Ethanol/Aceton fixiert; in PBS gewaschen; für 30 Minuten mit Peroxidasesuppressor (ImmunoPure, Pierce) inkubiert, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren, und dann mit 5 &mgr;g/ml Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiertem Streptavidin (Pierce) für 30 Minuten inkubiert. Substrat von HRP, Diaminobenzidin (DAB, Sigma) wurde zu den Zellen zugegeben. Die Reaktion wurde durch Waschen in destilliertem Wässer nach einer 60-sekündigen Inkubation beendet. Dieses Experiment wurde 3-mal wiederholt.

Beispiel 4: Ex vivo Translokationsstudie

Es wurden sowohl Arteria carotis- wie auch Jugularvenensegmente von männlichen weißen Neuseelandkaninchen verwendet. Um die Dosisabhängigkeit der R7-Translokation zu testen, wurden Gefäßsegmente für 30 Minuten mit entweder bL-R7- oder bD-R7-Lösung (0,1, 1,0 und 10,0 &mgr;M) in serumfreiem Dulbecco's Minimal Essentiellem Medium (DMEM) (Gibco BRL) inkubiert. Um die Inkubationszeitabhängigkeit zu testen, wurden Gefäßsegmente mit 10,0 &mgr;M Biotin-markierter R7-Lösung für 10 Sekunden, 60 Sekunden, 5 Minuten, 10 Minuten und 30 Minuten inkubiert. Darüber hinaus wurden, um die Fähigkeit von R7 zu bestimmen, durch die Gefäßwand zu dringen, vaskuläre Segmente an einem Ende ligiert, es wurde R7 enthaltendes Medium eingeführt und das andere Ende ligiert, um nur die luminale Oberfläche gegenüber R7 zu exponieren. Die luminale Oberfläche des Gefäßsegmentes wurde gegenüber bL-R7 oder bD-R7 (10,0 &mgr;M) für 30 Minuten exponiert. Um die Temperaturabhängigkeit der Translokation zu testen, wurden vaskuläre Segmente mit 10,0 &mgr;M Biotin-markierten R7-Lösungen bei 37°C oder 4°C inkubiert. Um den Zeitverlauf des Verschwindens von transloziertem R7 zu bestimmen, wurden Gefäßsegmente mit Biotin-markierten R7-Lösungen (10,0 &mgr;M) bei 37°C für 30 Minuten inkubiert und dann in DMEM mit 10 % FBS bis zu 5 Tagen reinkubiert. Die Gefäßsegmente wurden an den Tagen 1, 2 und 5 nach anfänglicher Inkubation entnommen.

Beispiel 5: Stimulierung von Zellen mit Interferon-&ggr; und LPS

Die Zellen wurden in einer Dichte von 5 × 103 pro Vertiefung auf Platten mit 96 Vertiefungen plattiert. Für Experimente, die den Effekt von extrazellulärer L-Argininkonzentration auf die NO-Synthese von Zytokin-stimulierten VSMC beurteilten, wurden subkonfluierende Zellen zweimal mit Arginin-freiem Medium gewaschen, dann für 24 Stunden mit Medium, das die erwünschte Konzentration von L-Arginin (0,10 &mgr;M, 100 &mgr;M, 1 mM, 10 mM) enthielt, inkubiert. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die Zellen dann mit einer Mischung aus IFN-&ggr; (100 U/ml) und LPS (100 &mgr;g/ml) in dem Medium, das die gleiche Dosis von L-Arginin enthielt, für weitere 24 Stunden behandelt und die Nitrit (NO2)-Akkumulierung in dem Kulturmedium wurde quantifiziert.

In dem Medium der nicht stimulierten VSMC wurde kein nachweisbares NO2 gemessen.

Wenn die Zellen mit einer Mischung aus IFN-&ggr; (100 U/ml) und LPS (100 &mgr;g/ml) stimuliert wurden, wurde eine signifikante Menge NO2 in dem Medium nachgewiesen (14,7 ± 0,3 &mgr;M/105 Zellen/24 Stunden). Der Effekt von IFN-&ggr; auf die NO-Biosynthese war dosisabhängig (4A).

Die Zellen wurden mit IFN-&ggr; (100 U/ml) und LPS (100 &mgr;g/ml) für 24 Stunden stimuliert, um die Dosisabhängigkeit auf die Substratverfügbarkeit zu beurteilen. Zunahmen im extrazellulären L-Arginin führten zu einem progressiven Anstieg bei der NO2-Synthese durch mit Zytokin stimulierte VSMC über den Bereich von 0 bis 10 mM (4B).

Beispiel 6: Effekt von Argininoligomeren auf NO-Produktion bei VSMC

Subkonfluierende Zellen wurden mit Medium, das 100 &mgr;M Arginin enthielt, für 24 Stunden vorinkubiert. Die Zellen wurden dann vorübergehend mit jedem Argininpolymer für 30 Minuten vorbehandelt. Nach der Translokation wurden die Zellen mit einer Mischung aus IFN-&ggr; (100 U/ml) und LPS (100 &mgr;g/ml) in einem Medium, das 100 &mgr;M L-Arginin enthielt, für weitere 24 Stunden inkubiert. Bei einigen Experimenten wurde L-NMMA (1 mM), ein Stickoxidsynthaseinhibitor, zu dem Medium hinzugegeben.

Beispiel 7: Assay für iNOS-Proteinexpression

Um die Effekte der Argininpolymertranslokation auf iNOS-Expression zu klären, wurden iNOS-Proteinkonzentrationen von Ratten-VSMC durch Western-Blotting analysiert. Die Proben wurden von nicht stimulierten Zellen, Zellen, die mit IFN-&ggr; (100 U/ml) und LPS (100 &mgr;g/ml) stimuliert worden waren oder R7 (10 &mgr;M) vorbehandelten Zellen, die mit IFN-&ggr; und LPS stimuliert worden waren, analysiert. Behandelte Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, und die gesamten Zelllysate wurden in 150 &mgr;l Lysepuffer, der 150 mM NaCl, 50 mM Tris/Cl, pH 8,0, 1 % NP40 und 0,1 % SDS enthielt, abgenommen. Die Proben wurden für 5 Minuten bei 14.000 Umdrehungen, 4°C, zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen und der Überstand wurde gesammelt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit der Lowry-Methode gemessen. Zelllysate, die 50 &mgr;g Protein enthielten, wurden für 5 Minuten gekocht und auf einem 8,0 % SDS-Polyacrylamidminigel getrennt. Eluierte Proteine wurden auf Nitrozellulosemembran elektrogeblottet (HyBond, Amersham, England). Die Blots wurden für 1 Stunde in 5 % fettfreier Trockenmilch/0,05 % Tween® in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) inkubiert, um die unspezifische Bindung des Antikörpers zu blockieren. Die Blots wurden für 3 Stunden mit primären monoklonalen Antikörpern gegen iNOS-Protein, verdünnt 1:2.500 om TBS/Tween®, inkubiert. Die Blots wurden dann mit Peroxidase-markierten Ziegen-Anti-Maus-IgG in demselben Puffer für 1 Stunde inkubiert. Peroxidase-markiertes Protein wurde mit einem verstärkten Chemilumineszenz-Nachweissystem (Amersham, England) auf Röntgenfilm sichtbar gemacht.

Beispiel 8: Effekt der Behandlung mit Argininoligomeren auf Venentransalantatsegmente A. Operatives Vorgehen

Männliche weiße Neuseelandkaninchen (3,0-3,5 kg), an die eine Standarddiät verfüttert wurde, wurden mit einer Mischung aus Ketamin (40 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) intramuskulär anästhesiert. Die linke externe Jugularvene wurde durch eine longitudinale Halsinzision freigelegt. Die Jugularvene wurde exzidiert, sanft gespült und in PBS (Kontrolle) oder PBS, das entweder L-R7 (10,0 &mgr;M) oder D-r7 (10,0 &mgr;M) enthielt, für 30 Minuten eingetaucht. L-R5 und D-r5 (10,0 &mgr;M), von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie nicht über die Zellmembran translozieren, wurden als Kontrollen verwendet.

Die rechte Arteria carotis communis wurde freigelegt und an sowohl dem proximalen wie auch distalen Enden abgeklemmt. Das behandelte Venensegment wurde mit PBS gewaschen und dann auf eine reverse End-zu-Seit-Weise in die Arteria carotis unter Verwendung von fortlaufenden 8-0 Polypropylennähten anastomisiert. Die Arteria carotis communis wurde ligiert und zwischen den zwei Anastomosen herausgeschnitten und die Wunde wurde mit 3-0 Nylonnaht geschlossen.

B. Gefäßmorahometrie

Die Venentransplantatsegmente wurden an dem 28. Operationstag entnommen. Die Transplantatsegmente wurden in 10 % gepuffertem Formalin mit sanftem intraluminalen Druck fixiert, um die physiologische Transplantatkonfiguration zu erhalten. Der Mittelteil der Paraffinproben wurde in Teilstücke geschnitten (5 &mgr;m) und mit Hämatoxylin/Eosin für lichtmikroskopische Untersuchung gefärbt (8A-C). Drei Schnitte von jedem Transplantat, genommen in 0,5 mm Intervallen, wurden durch Planimetrie durch einen Beobachter, der gegenüber der Behandlungsgruppe blind war, analysiert. Die Querschnittbereiche des Lumens, der Intima und Media wurden unter Verwendung des Image-Analyst-Programms (Automatrix) digitalisiert. Das Verhältnis von Intima zu Media (I/M)-Bereich wurde berechnet.

Beispiel 9: Ex vivo Nox-Produktion von Venentransplantat

Venentransplantate wurden drei Tage nach Operation entnommen, wie in Beispiel 7 beschrieben wird. Venentransplantatsegmente wurden in 1 ml Hanks-gepufferter Kochsalzlösung (HBSS, Irvine Scientific), die Ca2+ (1,0 mM) und L-Arginin (100 &mgr;M, Sigma) enthielt, bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Die NOx (Nitrat und Nitrit)-Produktion wurde entweder in der Abwesenheit (basal) oder Gegenwart (stimuliert) von Calciumionophor (A23187, 10,0 &mgr;M, Sigma) gemessen. Es wurden Proben des Mediums (80 &mgr;l) gesammelt und die NOx-Messung wurde unter Verwendung der Griess-Reaktion, erleichtert durch einen kommerziellen colorimetrischen Assay (Cayman Chemical), durchgeführt.

Beispiel 10: VSMC Proliferations-Assay

Aortale Ratten-VSMC wurden bis zu 50 %iger Konfluenz auf Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen gezüchtet. Die VSMC wurden dann gewaschen und mit serumfreiem DMEM für 48 Stunden inkubiert, um ruhende, sich nicht teilende Zellen zu erhalten. Danach wurden die VSMCs mit Träger, L-R7 (10,0 &mgr;M) oder D-R7 (10,0 &mgr;M), für 30 Minuten behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen gewaschen und weiter mit Serum, das DMEM (0,5 %, FBS) enthielt, inkubiert. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Inkubation geerntet. Die Zellzählung wurde mit einem kommerziellen Zellproliferations-Assay-Kit unter Verwendung von Spectrophotometer (XTT, Boehringer Mannheim) durchgeführt. Als eine negative Kontrolle wurden Zellen, die mit Träger behandelt und mit DSF inkubiert wurden, verwendet. Als ein Index der Zellproliferation wurde das OD-Verhältnis von jeder Behandlungsgruppe zur negativen Kontrollgruppe als ein Index der Zellproliferation berechnet.

Beispiel 11: Herz-Transplantations-Studie

PVG-Ratten-Spenderherzen (n = 48) wurden heterotopisch in das Abdomen von ACI-Empfängern transplantiert. Die Spenderherzen erhielten entweder intrakoronares PBS oder intrakoronares 50 &mgr;M (L)-Argininpolymer (L-R5 oder L-R9) für 30 Minuten. Jede Gruppe wurde weiter in 60 und 90 Tage Studientiere eingeteilt (je n = 6).

Gewebequerschnitte (5 &mgr;) wurden mit EVG (Elastica-van Gieson) Zubereitung gefärbt und die Gefäße wurden unter Verwendung von computerisierter Morphometrie für die Analyse von % luminaler Verengung, Intima zu Media-Verhältnis (I/M) und % betroffener Gefäße beurteilt. Die Transfektionseffizienz wurde durch Infusion von biotinylierten R5 und R6, wie in den vorangehenden Beispielen, und Berechnung des Prbzentsatzes von Biotinpositiven Kernen, geteilt durch die Gesamtanzahl von Kernen bestimmt. Die Ergebnisse werden im Teil IV C oben beschrieben.


Anspruch[de]
Ein Verfahren zur Herstellung eines isolierten Gefäßconduits, der für die Inhibition von traumatisch bedingter intimaler Hyperplasie in einem Blutgefäß oder irgendeinem Segment davon geeignet ist, einschließlich eines Segmentes, das als ein Gefäßpatch verwendet wird, umfassend:

Das In-Kontakt-Bringen eines isolierten Gefäßconduits mit einem Polymer, das aus 6 bis 30 Aminosäureuntereinheiten in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger besteht, wobei mindestens 50% der Untereinheiten Arginin sind und das Polymer mindestens sechs aufeinander folgende Argininuntereinheiten enthält.
Ein Verfahren, wie es in Anspruch 1 beansprucht wird, wobei mindestens 70% der Untereinheiten des Polymers Arginin sind, wobei optional mindestens 90% der Untereinheiten in dem Polymer Arginin sind. Ein Verfahren, wie es in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht wird, wobei keine Argininuntereinheit von einer anderen solchen Untereinheit durch mehr als eine Nicht-Arginin-Untereinheit getrennt ist. Ein Verfahren, wie es in einem der vorangehenden Ansprüche beansprucht wird, wobei die Arginin-Untereinheiten L-Arginin sind. Ein Verfahren, wie es in einem der vorangehenden Ansprüche beansprucht wird, wobei die Nicht-Argininuntereinheiten natürliche oder nicht-natürliche Aminosäureuntereinheiten sind, die die Rate des Membrantransportes des Polymers nicht signifikant reduzieren, wobei zum Beispiel die Nicht-Arginin-Untereinheiten aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Glycin, Alanin, Cystein, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Serin, Threonin, &agr;-Amino/3-guanidinoproprionsäure, &agr;-Amino-&ggr;-guanidinobuttersäure und &agr;-Amino-&egr;-guanidinocapronsäure besteht. Ein Verfahren, wie es in einem der vorangehenden Ansprüchen beansprucht wird, wobei das Trauma eine Inzision in das Transplantat oder das Gefäß, das das Transplantat erhält, das Transplantat eines Organs, das das Transplantat enthält, oder eine Kombination davon umfasst. Ein Verfahren, wie es in einem der vorangehenden Ansprüchen beansprucht wird, wobei das isolierte Gefäß:

(a) ein Gefäßconduit ist, der für die Transplantation in oder auf ein endogenes Gefäß geeignet ist, oder

(b) in einem Organ enthalten ist, das transplantiert werden soll; wobei das In-Kontakt-Bringen optional das Eintauchen des Organs in eine Lösung aus dem Polymer umfasst.
Ein Verfahren, wie es in einem der vorangehenden Ansprüche beansprucht wird, wobei das isolierte Gefäß:

(c) eine Vene ist, die gerade einem arteriell-venösen Anastomoseneingriff zum Zweck einer Dialyse unterzogen wird, oder

(d) ein Gefäß ist, das für die Verwendung bei einem Bypass-Eingriff geeignet ist.
Die Verwendung eines Polymers, das aus 6 bis 30 Aminosäureuntereinheiten besteht, wobei mindestens 50% der Untereinheiten Arginin sind und das Polymer mindestens sechs aufeinander folgende Argininuntereinheiten enthält, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Inhibition von traumatisch bedingter intimaler Hyperplasie in einem Blutgefäß. Eine Verwendung, wie sie in Anspruch 9 beansprucht wird, wobei das Polymer durch irgendeines der Merkmale gemäß den Ansprüchen 2 bis 5 charakterisiert wird. Eine Verwendung, wie sie in Anspruch 9 oder Anspruch 10 beansprucht wird, wobei das Trauma durch irgendeines der Merkmale gemäß dem Anspruch 6 charakterisiert wird. Eine Verwendung, wie sie in einem der Ansprüche 9 bis 11 beansprucht wird, wobei das Gefäß irgendeines der Gefäße gemäß Anspruch 8 ist. Die Verwendung eines Polymers, das aus 6 bis 30 Aminosäureuntereinheiten besteht, wobei mindestens 50% der Untereinheiten Arginin sind und das Polymer mindestens sechs aufeinander folgende Argininuntereinheiten enthält, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Steigerung der NO-Produktion in einem isolierten Blutgefäß, wobei das Gefäß dazu geeignet ist, eine vaskuläre proliferative Erkrankung zu verhindern oder rückgängig zu machen. Ein Verfahren zur Steigerung der NO-Produktion in einem isolierten Blutgefäßconduit, um eine vaskuläre proliferative Erkrankung zu verhindern oder rückgängig zu machen, umfassend das In-Kontakt-Bringen des isolierten Blutgefäßes mit einem Polymer, wie es in Anspruch 1 dargestellt wird, ex vivo, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei das Polymer wahlweise ein L-Argininhomopolymer ist, das 7 bis 15 L-Argininreste enthält. Ein Verfahren zur Herstellung eines Gefäßconduits für einen Gefäßtransplantationseingriff, umfassend:

Das In-Kontakt-Bringen eines isolierten Gefäßconduits mit einem Argininpolymer, wie es in Anspruch 1 dargestellt wird, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, für einen Zeitraum, der ausreicht, damit das Polymer in die Wand des Gefäßconduits transportiert werden kann, so dass die Menge des Polymers in der Conduitwand für die Reduktion des Ausmaßes an nach Transplantation folgender intimaler Hyperplasie in und/oder in Nachbarschaft zu dem Conduit wirksam ist, relativ zu dem Ausmaß an nach Transplantation folgender intimaler Hyperplasie, die in der Abwesenheit eines solchen Kontaktes mit dem Polymer auftreten würde.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei der Kontakt auf das In-Kontakt-Bringen der Polymer enthaltenden Flüssigkeit mit dem Inneren des Gefäßconduits beschränkt ist. Ein Verfahren oder eine Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 oder 15 oder 16, wobei das Polymer ein Argininhomopolymer ist, wobei das Polymer wahlweise ein L-Argininhomopolymer ist, das z.B. 7 bis 15 L-Argininreste enthält. Ein isoliertes Gefäßconduit, das innerhalb der Gefäßwand ein Polymer, wie in Anspruch 1 dargestellt, enthält, das in einer Menge vorliegt, die für die Reduktion des Ausmaßes an nach Transplantation folgender intimaler Hyperplasie in und/oder in Nachbarschaft zu dem Conduit wirksam ist, relativ zu dem Ausmaß an nach Transplantation folgender intimaler Hyperplasie, die in der Abwesenheit eines solchen Kontaktes mit dem Polymer auftreten würde. Der Gefäßconduit aus Anspruch 18, wobei das Polymer ein Argininhomopolymer ist, wobei das Polymer wahlweise ein L-Argininhomopolymer ist, das z.B. 7 bis 15 Argininreste enthält.






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