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Dokumentenidentifikation DE602004005392T2 06.12.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001522312
Titel Biologisch stabile flüssige Zusammensetzung von FVIII, vWF oder FVIII/vWF-Komplex menschlichen Ursprungs
Anmelder Grifols, S.A., Barcelona, ES
Erfinder Grancha Gamon, Salvador, 08400 Granollers (Barcelona), ES;
Jorquera Nieto, Juan Ignacio, 08480 Ametlla del Valles (Barcelona), ES;
Ristol Debart, Pere, Sabadell, ES;
Massot Riera, Marta, 08012 Barcelona, ES
Vertreter Klunker, Schmitt-Nilson, Hirsch, 80797 München
DE-Aktenzeichen 602004005392
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PL, PT, RO, SE, SI, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 24.09.2004
EP-Aktenzeichen 043801885
EP-Offenlegungsdatum 13.04.2005
EP date of grant 21.03.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.12.2007
IPC-Hauptklasse A61K 38/37(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft eine flüssige Zusammensetzung, in der die Stabilität der biologischen Aktivität des Faktors VIII (FVIII) oder des von Willebrand-Faktors (vWF) oder des Faktor VIII/von Willebrand-Faktor-Komplexes (FVIII/vWF) aufrecht erhalten wird, was es ihr ermöglicht, therapeutisch verwendet zu werden.

FVIII (Gerinnungsfaktor VIII) ist ein Plasmaprotein, das für den Ablauf des intrinsischen Wegs der Blutgerinnung wesentlich ist. Ein Mangel oder Fehler bei diesem FVIII führt zu einer Verschlechterung des Gerinnungsmechanismus, bekannt als Hämophilie A, eine mit dem Chromosom X verknüpfte Erbkrankheit. Der von Willebrand-Faktor (vWF) ist ein Plasmaprotein, das für die Plättchenanhaftung an beschädigten Gefäßoberflächen verantwortlich ist, und daher führen quantitative oder qualitative Fehler von vWF (von Willebrand-Krankheit) zu einer Verschlechterung der primären Blutungsstillung. Zusätzlich wirkt vWF als ein FVIII-Transporteur im Plasma. (Physiological and clinical aspects of Von Willebrand factor; Haematologica Vol 86, suppl. 4, November 2001).

Der FVIII/vWF-Komplex im natürlichen Zustand hat ein Verhältnis von 1:100 zwischen FVIII:vWF, d. h., es gibt ein Molekül FVIII für näherungsweise jeweils 100 Moleküle vWF, und daher gelten die Stabilitätsergebnisse des FVIII/vWF-Komplexes für gereinigte vWF-Konzentrate.

Gereinigte FVIII-Konzentrate werden in der klinischen Praxis zur Behandlung von Hämophilie A verwendet. FVIII-Konzentrate, die einen hohen Gehalt an vWF haben, können auch therapeutisch zur Behandlung der von Willebrand-Krankheit verwendet werden.

Die Stabilität von Proteinen, insbesondere jenen mit labiler biologischer Aktivität, wie FVIII, ist ein Hauptproblem für therapeutische Präparate davon. Dieses Problem wurde bisher durch Lyophilisieren des Produkts gelöst, und daher sind therapeutische Präparate der Konzentrate von FVIII, vWF oder FVIII/vWF in einer lyophilisierten Form erhältlich, um ihre biologische Aktivität aufrecht zu erhalten. Zur Zeit wird nirgendwo in der Welt ein therapeutisches Konzentrat von FVIII, vWF oder FVIII/vWF in einer flüssigen endgültigen Formulierung vermarktet (W. Wang et al./International Journal of Pharmaceutics 259/2003; 1-15).

Lyophilisierung ist ein Prozess, der kostspielig ist und der zusätzlich die Ausbeute an dem Produkt verringert. Dementsprechend würde eine flüssige Formulierung eine größere Einfachheit der Verabreichung erlauben, weil sie die Rekonstitution der lyophiliserten Substanz vermeiden würde. Die Möglichkeit, Patienten ein flüssiges Produkt (gebrauchsfertig), das bereits in eine geeignete Injektionseinrichtung eindosiert ist, zugänglich zu machen, kann auch einen psychologischen Nutzen hinsichtlich der Wahrnehmung, die der Patient von seiner Krankheit und seiner Abhängigkeit von dem Produkt hat, mit sich bringen.

Wie oben angegeben wird, trotz der hierin nachstehend angegebenen Literaturstellen, zur Zeit kein therapeutisches Konzentrat von FVIII, vWF oder des FVIII/vWF-Komplexes irgendwo in der Welt in der flüssigen Formulierung vermarktet.

Es gibt frühere Literaturstellen, die die Stabilisierung von FVIII betreffen:

  • – Das spanische Patent ES 2 111 579 betrifft die Formulierung eines FVIII mit Arginin und einem Detergens und/oder einem organischen Polymer. Diese Formulierung sieht nicht den Zusatz von Albumin als einen Stabilisator vor, wobei damit eine spezifische Aktivität von größer als 1000 IU/mg erzielt wird. Dieser FVIII ist in einer lyophilisierten endgültigen Form.
  • – Das US-Patent 5 399 670, das die Formulierung mit Arginin mit dem Ziel, die Rekonstitution des lyophilisierten FVIII-Konzentrats zu vereinfachen, betrifft.
  • – Das spanische Patent 2 097 120, das die Verwendung von Kohlehydraten betrifft, um FVIII während der Verfahrensschritte zu stabilisieren. Dieser FVIII ist ebenfalls in einer lyophilisierten endgültigen Form.
  • – Das US-Patent 5 925 738 betrifft die stabile flüssige Formulierung von Plasmaproteinen, insbesondere Gerinnungsfaktoren und spezifisch FVIII und FIX, obwohl es auch vWF betrifft. Allgemein ist das Ziel eine Stabilität zwischen 4°C und 37°C von bis zu drei Jahren, wobei 50% der Aktivität beibehalten werden. Die Mehrzahl der Beispiele betrifft FIX, dessen Stabilität nicht mit derjenigen des FVIII/vWF-Komplexes vergleichbar ist, weil unterschiedliche Moleküle beteiligt sind. Die mit FVIII ausgeführten Tests werden bei 37°C durchgeführt, da ihr Gegenstand nicht die Stabilität des endgültigen Produkts, sondern seine Verwendung in Pumpen zur kontinuierlichen Kurzzeit-Infusion (Stunden oder Tage) ist. In jenen Tests hat die wässrige Formulierung von FVIII nach fünf Tagen mehr als 50% ihrer Aktivität verloren. Daher sorgt die flüssige Formulierung (in Wasser) nicht für eine ausreichende Stabilität, dass sie als ein therapeutisches Produkt vermarktet werden kann, was eine Gebrauchsfähigkeitsdauer von mehr als sechs Monaten oder bevorzugt mehr als einem Jahr erfordert.
  • – PCT WO 96/30041 betrifft die Stabilisierung von r-VIII SQ und FIX in Lösung. Diese Stabilisierung wird durch den Zusatz eines Kohlehydrats und die Verringerung des Sauerstoffgehalts der Lösung oder durch den Zusatz eines Antioxidationsmittels und/oder durch Lagerung in einer sauerstoffarmen Atmosphäre oder in einem inerten Gas ausgeführt. Diese Formulierung wurde entwickelt und patentiert hinsichtlich r-VIII SQ, was ein Protein ist, das durch Gentechnologie gewonnen wurde, indem ein Hauptteil der von dem entsprechenden Gen abgeleiteten Sequenz eliminiert wurde. Die angeführten Daten demonstrieren eine Stabilität für 12 Monate bei 25°C und für 18 Monate bei 7°C. Weil r-VIII SQ ein genetisch modifiziertes Molekül ist, wären jene Ergebnisse nicht mit einem natürlichen menschlichen FVIII plasmatischer Herkunft oder mit dem FVIII/vWF-Komplex vergleichbar. r-VIIISQ wird "in vitro" in nicht-menschlichen Zellen synthetisiert, während menschlicher FVIII plasmatischer Herkunft "in vivo" in der menschlichen Leber synthetisiert wird. Dies bedeutet, dass es zwischen jenen Molekülen signifikante Unterschiede gibt, wie Veränderungen im Gehalt an Zuckern in dem Molekühl, die sich in pharmakokinetischen Unterschieden, wie der Plasma-Halbwertszeit, widerspiegeln. Zusätzlich beinhaltet r-FVIII SQ die Deletion eines Teils (fast 40%) des Moleküls. Manche Autoren haben bei der Verwendung von Faktoren VIII rekombinanter Herkunft ein größeres Auftreten der Entwicklung von Inhibitoren berichtet. Dies unterscheidet diese rekombinanten Faktoren, wie r-VIII SQ, mehr, wenn möglich, von natürlichem menschlichen FVIII. Daher muss berücksichtigt werden, dass das Molekül von menschlichem FVIII plasmatischer Herkunft ein von r-VIII SQ verschiedenes Molekül ist und dass, weil sie verschiedene Moleküle sind, ihre Stabilität nicht verglichen werden kann. Man muss auch im Kopf behalten, dass vWF bei r-VIII SQ fehlt.
  • EP 710 114 betrifft die Formulierung von r-VIII SQ, bei einer minimalen Konzentration von 1000 IU/ml, für ihre subkutane, intramuskuläre oder intradermale Verabreichung. Es ist dasselbe Molekühl wie in dem vorherigen Fall beteiligt, und daher sind die Ergebnisse nicht mit FVIII, vWF oder dem FVIII/vWF-Komplex menschlicher Herkunft vergleichbar.
  • – PCT WO 01/03726 (EP 1 194 161) verknüpft das Vorliegen spezifischer Konzentrationen an zweiwertigen Metallionen mit einer Verbesserung der Stabilität von r-VIII SC in Lösung, spezifisch Zn2+ und Cu2+, wobei auch das Vorliegen eines grenzflächenaktiven Mittels (Tween) und von Histidin berücksichtigt werden. Dieses Patent stellt einen weiteren Versuch zur Stabilisierung von rVIII SQ dar, der vom Gegenstand der vorliegenden Erfindung abweicht.

Es gibt daher keinen Stand der Technik zur Stabilisierung von natürlichem menschlichen FVIII, vWF oder FVIII/vWF-Komplex plasmatischer Herkunft, der die Aufrechterhaltung der biologischen Aktivität in einer flüssigen Formulierung für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um ihre Verwendung als ein therapeutisches Produkt zu erlauben, d. h., die in Lösung für mehr als sechs Monate stabil ist, erlaubt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine flüssige Formulierung bereitzustellen, die eine ausreichende Stabilisierung der Aktivität von FVIII, vWF oder das FVIII/vWF-Komplexes (minimale Wiedererlangung von FVIII und vWF von näherungsweise 50%) für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um ihre thera peutische Verwendung zu ermöglichen (mehr als sechs Monate bei 5°C), erlaubt.

Von den Erfindern ausgeführte Untersuchungen haben die negative Auswirkung eines starken Antioxidationsmittels, wie NAC (N-Acetyl-cystein), auf die Aktivität von vWF und die Tatsache, dass sein Ersatz durch einen Chelatbildner für Metalle die Aktivität von vWF aufrecht erhält und auch die Schutzwirkung auf FVIII beibehält, ans Licht gebracht.

Zusätzlich haben die ausgeführten Untersuchungen gezeigt, dass bei Zusatz eines Protease-Inhibitors (wie Antithrombin) und eines spezifischen Liganden (Heparin) eine Verbesserung der Stabilität des FVIII/vWF-Komplexes erzielt wird.

Daher wurde herausgefunden, dass bei einer Grundformulierung, die unter anderem: Albumin, Aminosäuren, grenzflächenaktive Mittel, Antioxidationsmittel, wie Vitamin C, enthält und/oder in einer sauerstoffarmen Atmosphäre aufbewahrt wird; durch den Zusatz eines Chelatbildners für Metalle, wie EDTA (2-100 mmol/l), eines Protease-Inhibitors, wie eines Serin-Protease-Inhibitors (Serpin) und insbesondere Antithrombin (0,01–1 IU/IU FVIII), und eines spezifischen Liganden, wie Heparin (0,1–10 U/ml), eine ausreichende Stabilität des FVIII/vWF-Komplexes in einer flüssigen Formulierung erzielt wird, um ihre Verwendung als ein therapeutisches Produkt zu erlauben.

So stellt die vorliegende Erfindung eine biologisch stabile flüssige Zusammensetzung von FVIII oder von vWF oder eines FVIII/vWF-Komplexes menschlicher Herkunft bereit, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie ein Konzentrat von FVIII oder von vWF oder eines FVIII/vWF-Komplexes menschlicher Herkunft mit einem spezifischen Liganden, der aus Heparin und Natriumheparin ausgewählt ist, einen Chelatbildner für Metalle und bevorzugt einen Protease-Inhibitor, aufweist.

Beispiele

FVIII-Koagulierungsmittel (FVIII:C) ist in internationalen Einheiten und seine Konzentration in internationalen Einheiten/Milliliter (IU FVIII/ml) ausgedrückt. Die vWF-Aktivität ist als Ristocetin-Cofaktor (RCo), IU/ml, ausgedrückt.

Beispiel 1:

Stabilitätsergebnisse (Prozentsatz der Wiedererlangung der Aktivität), bei 5 und 25°C, eines FVIII/vWF-Komplexes (25 und 100 IU FVIII/ml) formuliert mit: Albumin 5%, Arginin 200 mmol/l, Histidin 25 mmol/l, Cl2Ca 5 mmol/l, bei zwei verschiedenen Konzentrationen (25 IU/ml und 100 IU/ml).

Die Ergebnisse zeigen eine gute Korrelation zwischen der FVIII-Wiedererlangung, die bei 5°C und bei 25°C erhalten wurde, wobei man in der Tabelle beobachtet, dass eine Aufbewahrungsdauer von einer Woche bei 25°C (Bedingung der beschleunigten Stabilitätsstudie) einer Aufbewahrungsdauer von einem Monat bei 5°C (Zieltemperatur) äquivalent ist.

Beispiel 2:

Ein FVIII/vWF-Komplex (25 IU FVIII/ml), der formuliert ist mit:

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Schutzwirkung eines starken Reduktionsmittels, wie NAC, auf die FVIII:C-Aktivität durch den Zusatz eines Chelatbildners für Metalle ersetzt werden kann. Die Anwesenheit von NAC bringt einen größeren Verlust an vWF-Aktivität mit sich. Von Heparin wird beobachtet, dass es als ein Schutzmittel der vWF-Aktivität wirkt.

Bei der Formulierung B1, bei einer FVIII-Konzentration von 25 IU/ml, und die EDTA und Natriumheparin enthält, die bei 25°C 8 Wochen lang stabil ist, ist es dank der Ergebnisse von Beispiel 1 möglich, eine Gebrauchsfähigkeitsdauer bei 5°C von mindestens 8 Monaten zu extrapolieren.

Beispiel 3

Ein FVIII/vWF-Komplex (25 IU FVIII/ml), der formuliert ist mit:

ergibt die folgenden Stabilitätsergebnisse:

In einer Lösung, die einen Chelatbildner für Metalle und Heparin enthält, bringt die Anwesenheit eines starken Reduktionsmittels (NAC) einen Verlust an vWF:RCo-Aktivität, ohne großen Nutzen für FVIII:C, mit sich, während es bei den Formulierungen B2, C2 und D2, bei einer Konzentration von FVIII von 25 IU/ml, die EDTA und Natriumheparin enthalten, möglich ist, eine Gebrauchsfähigkeitsdauer bei 5°C von mindestens 8 Monaten zu extrapolieren.

Beispiel 4:

Ein FVIII/vWF-Komplex (25 IU FVIII/ml), der formuliert ist mit: Glycin 280 mmol/l, Arginin 350 mmol/l, Histidin 25 mmol/l, CaCl2 50 mmol/l, Albumin 5%, Vitamin C 100 mmol/l, Tween 80 50 ppm, pH 5,10, und einer variablen Konzentration an EDTACaNa2 und Natriumheparin:

ergibt die folgenden Stabilitätsergebnisse:

Bei einer FVIII-Konzentration von 25 IU/ml ergibt der kombinierte Zusatz von Heparin und eines Metall-Chelatbildungsmittels (EDTA) für die oben beschriebenen Formulierungen einen hohen Grad an Stabilität hinsichtlich der Aktivität von vWF. Es ist möglich, eine Gebrauchsfähigkeitsdauer bei 5°C von mindestens 8 Monaten zu extrapolieren.

Beispiel 5:

Eine Untersuchung der vorgeschlagenen Rezeptur (Glycin 280 mmol/l, Arginin 350 mmol/l, Histidin 25 mmol/l, CaCl2 50 mmol/l, Heparin 1 U/ml, EDTACaNa2 50 mmol/l, Albumin 5%, Vitamin C 100 mmol/l, Tween 80 50 ppm, pH der Formulierung 6,3) bei 200 IU FVIII/ml in sechs unabhängigen Produktchargen ergibt die folgenden Stabilitätsergebnisse (8 Wochen bei 25°C):

  • SD = Standardabweichung

Wenn die Konzentration an Produkt erhöht wird (von 25 auf 200 IU FVIII/ml) wird eine geringere Stabilität beobachtet. Die Überwachung der Entwicklung der Aktivität während der Untersuchung umfasst, zusätzlich zu den Probenahmen am Anfang und am Ende, Probenahmen bei 2, 4 und 6 Wochen Stabilität. Unter Verwendung aller Daten, die von den sechs untersuchten Chargen gewonnen wurden, ist es möglich, das Gesamtverhalten der Aktivitäten von FVIII:C und vWF:RCo abzuschätzen, wobei es zu einer Kinetik erster Ordnung passt. Aus dieser Analyse ist es möglich, abzuschätzen, dass nach sechs Wochen bei 25°C, was sechs Monaten bei 5°C entspricht, Wiedererlangungen in der Größenordnung von 50% der Aktivität (FVIII und vWF) erhalten werden würden.

Beispiel 6:

Untersuchung der Schutzwirkung eines Protease-Inhibitors. Die vorgeschlagene Rezeptur wurde bei 200 IU FVIII/ml an 6 unabhängigen Produktchargen getestet.

Glycin 280 mmol/l, Arginin 350 mmol/l, Histidin 25 mmol/l, CaCl2 50 mmol/l, Albumin 5%, Vitamin C 100 mmol/l, Tween 80 50 ppm, pH der Formulierung 6,3; Heparin 1 IU/ml, EDTACaNa2 50 mmol/l, und Antithrombin (0,05 IU/IU FVIII), was die folgenden Stabilitätsergebnisse (8 Wochen bei 25°C) ergab.

  • SD = Standardabweichung

Der Zusatz eines Protease-Inhibitors (Antithrombin) erhöht die Stabilität des Produkts sowohl hinsichtlich Faktor VIII als auch hinsichtlich der Aktivität des Ristocetin-Cofaktors (vWF). Eine Analyse parallel zu derjenigen, die in Beispiel 5 durchgeführt wurde, macht es möglich, nach 12 Wochen bei 25°C, was 12 Monaten bei 5°C entspricht, 50% Wiedererlangung an Aktivität (FVIII und vWF:RCo) abzuschätzen

Durch die obigen Beispiele wird man erkennen, dass bei einer geringen Konzentration an Produkt (25 IU FVIII/ml) der Zusatz eines Chelatbildners für Metalle (EDTA) und von Heparin für eine größere Stabilität des FVIII/vWF-Komplexes sorgt. Diese Stabilisierung verbessert sich mit dem Zusatz eines Protease-Inhibitors (Antithrombin) selbst bei hohen Konzentrationen an FVIII- und vWF-Aktivität.


Anspruch[de]
Biologisch stabile flüssige Zusammensetzung von FVIII oder von vWF oder eines FVIII/vWF-Komplexes menschlicher Herkunft, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Konzentrat von FVIII oder von vWF oder eines FVIII/vWF-Komplexes menschlicher Herkunft mit einem spezifischen Liganden, der aus Heparin und Natriumheparin ausgewählt ist, einen Chelatbildner für Metalle, und bevorzugt einen Protease-Inhibitor, aufweist. Biologisch stabile flüssige Zusammensetzung von FVIII oder von vWF oder eines FVIII/vWF-Komplexes menschlicher Herkunft nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Chelatbildner für Metalle in einer Konzentration von 2 bis 104 mmol/l des Konzentrats verwendet wird. Biologisch stabile flüssige Zusammensetzung von FVIII oder von vWF oder eines FVIII/vWF-Komplexes menschlicher Herkunft nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Chelatbildner für Metalle EDTA ist. Biologisch stabile flüssige Zusammensetzung von FVIII oder von vWF oder eines FVIII/vWF-Komplexes menschlicher Herkunft nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Chelatbildner für Metalle EDTACaNa2 (Natrium- und Calcium-Salz von EDTA) ist. Biologisch stabile flüssige Zusammensetzung von FVIII oder von vWF oder eines FVIII/vWF-Komplexes menschlicher Herkunft nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand in einer Konzentration von 0,1–10 U/ml des Konzentrats enthalten ist. Biologisch stabile flüssige Zusammensetzung von FVIII oder von vWF oder eines FVIII/vWF-Komplexes menschlicher Herkunft nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand Natriumheparin ist. Biologisch stabile flüssige Zusammensetzung von FVIII oder von vWF oder eines FVIII/vWF-Komplexes menschlicher Herkunft nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Protease-Inhibitor in einer Konzentration von größer als 0,01 IU/IU FVIII vorliegt. Biologisch stabile flüssige Zusammensetzung von FVIII oder von vWF oder eines FVIII/vWF-Komplexes menschlicher Herkunft nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Protease-Inhibitor in einer Konzentration von 0,01 bis 1 IU/IU FVIII vorliegt. Biologisch stabile flüssige Zusammensetzung von FVIII oder von vWF oder eines FVIII/vWF-Komplexes menschlicher Herkunft nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Protease-Inhibitor ein Serin-Protease-Inhibitor (Serpin) ist. Biologisch stabile flüssige Zusammensetzung von FVIII oder von vWF oder eines FVIII/vWF-Komplexes menschlicher Herkunft nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Serin-Protease-Inhibitor Antithrombin ist.






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